Para detectar a presença de outras proteínas de defesa ligantes à matriz de quitina de amostras de vicilinas purificadas foram feitos ensaios inibitórios contra enzimas do tipo serínicas, de homogenatos intestinais de larvas de C. capitata. Também foram realizados ensaios de hemaglutinação para detectar a presença de lectinas.
4.5.1 – Ensaio de Inibição das Atividades Proteolíticas no Homogenato Intestinal de Larvas de C. capitata
4.5.1.1– Preparação do Homogenato Intestinal de C. capitata
Larvas de terceiro instar de C. capitata foram mergulhados em solução de NaCl 150 mM e mantidos no gelo até a dissecação. Esta foi realizada a frio com auxílio de uma lupa esterioscópica. Após a exposição do trato intestinal, o intestino foi seccionado e transferido para tubo de microcentrífuga contendo 200 ȝL do tampão tetraborato de sódio 50 mM, pH 7,5 (TBS) e mantido em gelo até a retirada de 100 intestinos por tubo. Estes permaneceram estocados a -20ºC até sua utilização nos ensaios.
Os intestinos obtidos como acima descrito foram homogeneizados em Potter durante 5 minutos em banho de gelo, após a homogeneização, foram adicionados 800ȝL de tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi centrifugada a 12000 x g por 15 minutos a 4 ºC. O precipitado foi desprezado e o sobrenadante,
denominado homogenato intestinal de larvas (HIL). Os homogenatos foram utilizados imediatamente nos ensaios.
4.5.1.2 – Preparo de Azocaseína 1,0%
Um grama de azocaseína foi pesado e dissolvido em 100 mL de tampão Tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5. A suspensão foi aquecida e deixada em ebulição por 5 minutos. Após o resfriamento, o pH da solução foi reajustado e o volume completado para 100 mL com água destilada. Essa solução foi armazenada a -20 °C até sua utilização.
4.5.1.3 – Ensaio de inibição da atividade azocaseinolítica
A inibição da atividade azocaseinolítica de homogenatos intestinais de larvas de C. capitata foi determinada pré-incubando-se por 15 minutos a 37 °C alíquotas de 50 ȝL das soluções (4 mg/ mL) de vicilinas com 50 ȝL de homogenatos. Após o tempo de pré-incubação foram adicionados 400 ȝL de tampão tetraborato de sódio 50 mM pH 7,5 e 500 ȝL de azocaseina 1,0% a 37°C por 60 minutos. A reação foi parada com a adição de 300 ȝL de TCA 20%. Os tubos foram deixados em repouso por 15 minutos e centrifugados por mais 15 minutos a 13000 x g. alíquotas de 400 ȝL do sobrenadante foram alcalinizadas com o mesmo volume de NaOH 2N. O efeito das vicilinas sobre a atividade proteolítica a pH 7,5 foi determinada pela medida da absorbância dos peptídeos diazotizados produzidos a 440 nm. O ensaio controle foi realizado na ausência de vicilinas nas mesmas condições acima descritas. Os ensaios foram realizados em triplicata e provas em branco foram feitas.
4.5.2 – Ensaio de Hemaglutinação
4.5.2.1 – Tratamento de Eritrócitos com Papaína
Uma solução estoque de papaína a 1% em solução salina foi preparada e mantida a 4 °C por 24 horas com agitação ocasional. A solução foi estocada em alíquotas de 3 mL de papaína a –20 °C. Quando necessário, foi diluído na proporção 1:10 (v/v) com tampão SORENGEN (3 partes de NaH2PO4 0,067 M e 1 parte de KH2POH, 0.067 M).
A solução de papaína foi adicionada ao sangue, previamente lavado, na proporção de 1:1 (v/v). A mistura foi incubada por 30 minutos a 37°C, com agitação ocasional. Em seguida foi centrifugado a 2.500 x g, por 5 minutos e seu precipitado foi lavado 6 vezes com solução salina gelada. O hematócrito foi realizado e as hemáceas foram diluídas a 4% em solução salina.
4.5.2.2 – Ensaio de Hemaglutinação de EvV
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em placas de ELISA com fundo em “V” por meio de diluição seriada (1/2, 1/4, 1/8, etc...). Em cada poço foram adicionados 25 PL de NaCl 0,15 M, 25 PL da amostra e 25 PL da suspensão de eritrócitos humanos a 4%. A placa foi deixada em descanso à temperatura ambiente; após 30 minutos a aglutinação foi observada, e o título expresso em unidades de hemaglutinação (UH), que foi definido como inverso da maior diluição da amostra que tenha apresentado nítida aglutinação (MOREIRA & PERRONE, 1977).
4.6 – PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA VICILINA DE E. velutina 4.6.1 – Obtenção de soro pré-imune
Os Coelhos de três meses de idade foram imobilizados e sangrados através de corte na extremidade da orelha feito com bisturi cirúrgico, para obtenção do soro pré-imune. Após a coleta de 5 mL de sangue este material foi deixado em repouso por 16 horas a 5 °C . O soro foi separado do coágulo formado, centrifugado para clarificar e reservado a -20 °C.
4.6.2 – Imunização
Após a obtenção do soro pré-imune, amostras de EvV foram preparadas a uma concentração de 1 mg/mL em solução salina, NaCl 150 mM. Este material foi emulsificado em adjuvante completo de Freund (ACF) na proporção 1:1 (solução de EvV: adjuvante). Após 30 dias, novas aplicações de antígenos emulsificados em adjuvante incompleto de Freund (AIF) foram realizadas regularmente. O protocolo utilizado para imunização do coelho com obtenção de anticorpos policlonais foi seguindo o método descrito por Thorpe (1994):
1° dia – imunização subcutânea do antígeno + ACF (0,5 mL) 30° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL)
60° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 1° sangria 90° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 2° sangria 120° dia – imunização subcutânea do antígeno + AIF (0,5 mL) + 3° sangria A obtenção e estocagem do soro após imunização seguiram o mesmo procedimento do soro pré-imune. Reforços foram aplicados semanalmente e antissoros obtidos regularmente.
4.6.3 – Isolamento de imunoglobulinas do tipo G (IgG)
As amostras de antissoros obtidas foram passadas em uma coluna de proteína A-Sepharose previamente equilibrada com tampão NaH2PO40,02M pH 8,0, 150 mM NaCl. O material não adsorvido foi eluído com tampão de equilíbrio. A eluição de IgGs adsorvidas na coluna foi realizada com tampão Na2HPO4 50mM, Acido cítrico 25mM, pH 3,0. As IgG isoladas foram neutralizadas com NaOH 0,1M, dialisadas contra água e liofilizadas. Soluções estoques de IgG foram preparadas em PBS pH 7,5, BSA 2% na concentração de 10 mg/mL. Os anticorpos assim obtidos foram utilizados para o imunoblot. O título do anticorpo foi estabelecido pela técnica de “dot-blot”.
4.7 – ANÁLISE DE EvV ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
4.7.1 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e desnaturante
A eletroforese das amostras foi feita segundo o método desenvolvido por Laemmli (1970). Foram utilizadas placas de vidro de dimensões 10 x 14 cm, espaçadores de 1,0 mm e solução estoque de acrilamida/bisacrilamida (30%/ 0,8%, w/w) dissolvidas em água destilada em volume para 100 mL. Esta solução foi filtrada em papel de filtro Whatman n°1 e estocada em frascos escuros a 5 0C. O gel de separação foi preparado numa concentração de 15% contendo: 1,2 mL de água destilada, 1,3 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8, 50 Pl de SDS 10%, 2,5 mL de solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 25 Pl de persulfato de amônio e 2,5 Pl de TEMED. O gel de concentração foi preparado com 1,5 mL de água destilada, 0,625 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 6,8, 25 Pl de SDS 10%, 0,330 mL de
solução estoque de acrilamida/bisacrilamida, 12,5 Pl de persulfato de amônio e 2,5 Pl TEMED. Às frações protéicas contendo 15 Pg de proteínas, foi adicionada tampão de amostra constituído de Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10% v/v, e 0,01% de azul de bromofenol. O tampão de corrida continha trizma base 25 mM, glicina 192 mM e SDS 10%. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de 20 mA por aproximadamente 2 horas e após o marcador de corrida (azul de bromofenol) atingir o final do gel, a eletroforese foi parada.
4.7.2 – Eletroforese em Gel de Poliacrilamida descontínuo e não desnaturante
A metodologia estabelecida por Laemmli (1970) foi modificada para a análise de EvV. O protocolo do item 4.7.1 foi repetido, sem a adição de SDS. A eletroforese foi realizada sob corrente constante de 20 mA por aproximadamente 2 horas e após o marcador de corrida (azul de bromofenol) atingir o final do gel, o tempo de corrida foi estendido por mais 3 horas.
4.7.3 – Coloração com Coomassie Blue
Após a eletroforese o gel foi corado segundo procedimento descrito por Weber e Osborne (1969). A solução corante foi preparada usando-se Comassie Blue R-250 a 1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água destilada. O descoloração foi feito com uma solução contendo ácido acético 10% e etanol 30%.