UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ,
BRASIL
FORTALEZA 2017
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ,
BRASIL.
Monografia apresentada à coordenação do curso de Ciências Biológicas do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito para obtenção de título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Diego Veras Wilke.
FORTALEZA 2017
IVNA MARIA BASTOS VASCONCELOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DE EXTRATOS OBTIDOS DE ACTINOMICETOS RECUPERADOS DE SEDIMENTOS DO LITORAL DO CEARÁ,
BRASIL.
Monografia apresentada à coordenação do curso de Ciências Biológicas do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção de título de Bacharel em Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Diego Veras Wilke. Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Prof. Dr. Diego Veras Wilke (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Erika Freitas Mota
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________ Profa. Dra. Denise Cavalcante Hissa
À minha avó, Sônia, pelo exemplo de mansidão, carisma e generosidade.
AGRADECIMENTOS
À Profa Dra Letícia Veras Costa Lotufo, por todo o aprendizado, por ter me inserido no mundo dos produtos naturais e por ser uma grande admiração como pessoa, professora e pesquisadora.
Ao Prof. Dr. Diego Veras Wilke, pelo entusiasmo em ensinar, pela gentil orientação, paciência, simpatia, disponibilidade e apoio dado para a realização desse trabalho.
À Profa Dra Paula Christine Jimenez, com quem orgulhosamente divido uns genes, é inegável minha admiração e inspiração, pelo incentivo, conversas e ensinamentos acadêmicos e de vida.
À banca examinadora composta por Profa. Dra. Erika Freitas Mota, de quem fui aluna e tenho grande apreço, e Profa. Dra. Denise Cavalcante Hissa, pelo tempo, pelas valiosas colaborações, reflexões, críticas.
Ao pessoal do ECOTOX, por terem me acolhido nos meus primeiros passos: Karine, Bianca, Evila, Evelyne, Alysson, Arenice, Isabelle, Paula Abreu, Rafael, Andressa, Luana, Marcionilia, Lívia, Renan, especialmente ao Elthon e a Larissa, por toda amizade e apoio contaste, pela dedicação em me ensinar e me acompanhar tão carinhosamente.
À Profa Dra Otilia Pessoa, à Ceiça, Paty, Alison, Chaguinha, do LAFIPLAM, pelo disponibilidade e auxílio na realização de extrações, técnicas e análises químicas.
Às meninas do LaBBMar, Luciana, Erlania, Kayanny, Andrea, Alexia, Thais, Katharine, Carol, Giovanna e Heitor, pelo convívio harmonioso, amizade e momentos de confraternização.
A todos os amigos que o curso de Ciências Biológicas me deu, pessoas que certamente vou levar para a vida; especialmente a turma de 2011.1, que superamos a cada semestre mais unidos. Aos professores, servidores e funcionários da UFC, pessoas que contribuíram de alguma forma para a lapidação desse curso e de novos profissionais.
Aos amigos do Colégio Batista, os quais não se deixaram distanciar pelos anos que se passaram, especialmente as meninas do GS; à Anna, Lara e Amanda, tenho muito a agradecer pelo carinho, conselhos, histórias, farras e momentos de alegria.
Às amigas Fernanda Nóbrega, Nathalia, Nayara, pessoas por quais tenho muita consideração e afeto, pelos momentos de descontração e saídas.
Ao Léo, que não me deixa notar a distância física, por ser meu cúmplice e topar comigo as ideias mais doidas, pelo companheirismo, incentivo, carinho e cuidado; e por toda a sua família, pelo acolhimento que recebo e por serem pessoas tão iluminadas.
Aos meu avós, Terezinha e Almir, Sônia e Haroldo (in memoriam), pelos ensinamentos de vida, a tia Roselita, aos tios Haroldo Jorge, Almir Filho, Marco e Elis, e primos.
Aos meus pais, Haroldo e Rosamir, por todo o amor, incentivo e cuidado depositados em mim. Minha gratidão a vocês é imensurável. Ao César e Raissa, com quem dividi minha infância e o resto dos dias.
A todos os demais familiares e amigos, que sempre me acolhem com muito carinho e torcem pelo meu sucesso.
Aos órgãos CNPq e CAPES, pelas bolsas de Iniciação Científica, concedidas para a realização desse trabalho e a oportunidade do intercambio pelo programa Ciência sem Fronteiras, me proporcionando crescimento acadêmico e pessoal.
RESUMO
Produtos naturais têm um importante papel na descoberta de novas drogas para o tratamento de neoplasias malignas. A diversidade de organismos no ambiente marinho tem inspirado pesquisadores há algumas décadas para identificar novos produtos naturais que poderiam eventualmente ser desenvolvidos em medicamentos. As actinobactérias, também presentes nesse ambiente, apresentam uma capacidade incomparável de produzir diversos compostos bioativos. O litoral do Ceará tem sido prospectado para o potencial farmacológico encontrado em invertebrados marinhos, mas há poucos dados sobre os microrganismos desse ambiente. Este estudo objetivou a avaliação da citotoxicidade de extratos orgânicos derivados de actinomicetos isolados de sedimentos da costa do Ceará. Os sedimentos foram coletados em 4 praias do litoral cearense. Em condições estéreis, as amostras foram tratadas para favorecer o crescimento de actinomicetos e as colônias com fenótipos desse grupo de bactérias foram isoladas. Confirmada a pureza, os isolados foram cultivados em meio líquido, de onde foi preparado o extrato bruto com acetato de etila (EtOAc). Em seguida, o potencial antitumoral foi avaliado através da atividade citotóxica in vitro dos extratos - utilizando o ensaio de MTT em uma linhagem de tumor coloretal (HCT-116), inicialmente em uma única concentração (50μg/mL), para uma avaliação qualitativa inicial. Os extratos que inibiram em mais de 75% o crescimento celular, foram considerados ativos e tiveram os valores da concentração inibitória média (CI50) determinados novamente através do ensaio de MTT utilizando-se de múltiplas concentrações. Um total de 96 estirpes foram isoladas. Dentre estas, 68 foram avaliados quanto à citotoxicidade. Na primeira análise, 31 extratos foram considerados ativos e 40% destes apresentaram CI50 menores que 1,0 μg/mL. Os extratos provenientes de estirpes BRA-028 e BRA-011 apresentaram as menores CI50, com valores de 20 ng/mL e 44 ng/mL, respectivamente. Das 12 estirpes que foram identificados, 9 pertencem ao gênero
Streptomyces, 3 ao gênero Micromonospora. Estes resultados destacam o potencial
farmacológico de microrganismos marinhos, além de serem fortes indícios de que o litoral do Ceará reserva imenso potencial para a exploração sustentável de compostos naturais com relevância biomédica.
ABSTRACT
Natural products play an important role in the discovery of new drugs for the treatment of malignant neoplasms. The diversity of organisms in the marine environment has inspired researchers for decades to identify new natural products that could eventually be developed into drugs. Actinobacteria, also present in this environment, have an incomparable ability to produce various bioactive compounds. The coast of Ceará has been prospected for the pharmacological potential in marine invertebrates, but few data are available on the microorganisms in that environment. This study focused on the evaluation of the cytotoxicity from derived organic extracts isolated from actinomycetes in sediment from the Coast of Ceará. Sediments were collected in 4 beaches from Ceará. Under sterile conditions, samples were treated to favor the growth of actinomycetes and the colonies with phenotypes of this group were isolated. Confirmed the purity, the isolates were cultured in liquid medium, from which the crude extract was prepared with ethyl acetate (EtOAc). Then, the antitumor potential was assessed by the in vitro cytotoxic activity of the extracts - using the MTT assay in a colorectal tumor line (HCT-116), initially in a single concentration (50 μg / mL), for an initial qualitative analysis. The extracts that reduced cell growth by more than 75% were considered active and had the mean inhibitory concentration (IC50) values determined again by MTT assay using multiple concentrations. A total of 96 strains were isolated. Of these, 68 strains were evaluated for cytotoxicity. In the first analysis, 31 extracts were considered active and 40% of them had IC50 lower than 1.0 μg / mL. The extracts from the 028 and BRA-011 strains had the lowest IC50, with values of 20 ng / mL and 44ng / mL, respectively. Of the 12 strains that were identified, 9 belong to the genus Streptomyces, 3 to the genus
Micromonospora. These results highlight the pharmacological potential of marine
microorganisms, as well as strong indications that the coast of Ceará reserves immense potential for the sustainable exploitation of natural compounds with biomedical relevance.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Desenho esquemático do planejamento experimental do presente estudo mostrando as etapas em sequência...
Figura 2 - Mapa do litoral do Estado do Ceará (parcialmente mostrado),
indicando os locais de coleta (pontos vermelhos)...
Figura 3 - Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de sedimento...
Figura 4 - Desenho esquemático do método de obtenção dos extratos brutos das bactérias recuperadas dos sedimentos das praias do Ceará...
Figura 5 - Distribuição das 96 estirpes isoladas quanto ao método de pré-tratamento da amostra do sedimento marinho e em relação ao meio de cultura em que foram crescidos na etapa inicial. M1, método I, sedimento seco foi carimbado em placa de cultura; M2, método 2, porção do sedimento foi diluído em água do mar estéril e aquecido a 55ºC e estriado em placas de ágar. SCA, amido-caseína, SWA, água do mar, TMA, ágar minerais traços..
Figura 6 - Citotoxicidade dos extratos das bactérias isoladas do sedimento das praias de Pecém, Taíba, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Mucuripe, em células tumorais HCT-116, pelo ensaio do MTT, por 72h. Os dados correspondem a média ± erro padrão da média experimento em duplicata... Figura 7 – Gráfico da proporção de extratos brutos ativos de acordo com a
concentração inibitória média (CI50) menor que 1,00µg/mL... 22 23 31 24 26 29 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Moléculas de fontes marinhas aprovadas para o uso clínico ou em fase de testes para o tratamento de diversas doenças (GERWICK et al, 2013)... 16
Tabela 2 - Relação da quantidade de estirpes isoladas de cada localidade de acordo com o método de processamento e ao tipo de meio de cultura...
29 Tabela 3 - Potência da atividade citotóxica dos extratos obtidos de actinomicetos
recuperados dos sedimentos das praias de Pecém, Taíba, Mucuripe e Paracuru, e do sedimento dragado do Mucuripe. Estão apresentados os valores de concentração inibitória média (CI50) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) obtidos a partir da 2 experimentos independentes em duplicata, determinado por regressão não-linear no programa GraphPad Prism 6.0. (N.D.: Não determinado)... 32
Tabela 4 - Identificação taxonômica de acordo com amplificação e sequenciamento de 16S rDNA das amostras selecionadas e respectivos valores de concentração inibitória média (CI50)... 34
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AcOEt Acetato de etila BLAST
CI50 DMSO DNA DOX
Basic Local Alignment Search Tool (Programa)
Concentração inibitória média Dimetilsufóxido Desoxyribonucleic Acid Doxorrubicina HCT-116 IC MTT NaCl
Human Colon Tumor (Linhagem Celular)
Intervalo de confiança
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil brometo de tetrazolio Cloreto de sódio NB-1 PCR RNA RPMI Nível de Biossegurança-1
Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid
Roswell Park Memorial Institute (Meio de cultura de celulas)
SCA SWA TMA
Starch casein agar Seawater agar Agar trace minerals
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 OBJETIVOS... 21 2.1 Objetivo geral... 21 2.2 Objetivos específicos... 21 3 MATERIAIS E MÉTODOS... 21 3.1 Planejamento experimental... 21 3.2 Coleta do material... 22
3.3 Processamento das amostras... 23
3.3.1 Método do carimbo (M1)... 24
3.3.2 Método de diluição(M2)... 24
3.4 Isolamento e manutenção dos microrganismos... 25
3.7 Manutenção da cultura celular... 26
3.8 Teste de atividade citotóxica (Ensaio do MTT)... 27
3.9 Análise dos dados... 27
3.10 Identificação molecular dos microrganismos selecionados... 28
4 RESULTADOS... 28
4.1Isolamento dos microrganismos... 28
4.2 Avaliação da atividade citotóxica in vitro dos extratos... 30
4.3 Identificação molecular dos microrganismos selecionados... 33
5 DISCUSSÃO... 34
6 CONCLUSÃO... 39
REFERÊNCIAS... 40
ANEXO I- Composição dos meios de cultura para microrganismos... 48
14 1. INTRODUÇÃO
As neoplasias malignas, segundo a Organização Mundial da Saúde, estão entre as enfermidades que mais causam óbitos no mundo. Em 2012, foram responsáveis por 8,2 milhões de mortes, e até 2030, estima-se 27 milhões de novos casos. O câncer é caracterizado como um conjunto de mais de 100 doenças, podendo afetar quaisquer células do corpo, que têm em comum o crescimento desordenado e cuja manifestação é bastante variável (INCA, 2016).
O objetivo primário da quimioterapia é destruir as células cancerosas, preservando as normais. Agentes antineoplásicos que têm como característica o desencadeamento da morte por apoptose das células tumorais são chamados de citotóxicos. O principal efeito desses quimioterápicos é exercido sobre a divisão celular, na qual atuam em diversos alvos, com interferência direta no metabolismo celular, seja na duplicação do DNA, na síntese de RNA, na síntese proteica ou nas fases do ciclo celular, como também na consequente parada de vias metabólicas. Compostos que atuem interferindo diretamente no ciclo celular, bloqueando uma sequência metabólica e, com isto, impedindo a divisão ou amadurecimento celular levando a célula à morte possuem potencial anticâncer (MADIGAN et al, 2010; ALMEIDA et al, 2005).
Apesar de haver uma grande quantidade de fármacos disponíveis para o tratamento dos cânceres, e da possível cura, a elevada taxa de mortalidade pode ser justificada pela dificuldade de detecção nos estágios iniciais, o que aumenta a probabilidade de cura, bem como a inexistência de fármacos que sejam totalmente efetivos em todos os pacientes. Portanto, a busca por compostos ideais que apresentem altas seletividade e potência terapêutica, aliados a mínimo efeitos colaterais e baixo índice de resistência faz-se imprescindível para avanços no tratamento oncológico.
Do período de 1981 a 2014, compostos antitumorais foram a classe mais explorada, como maior número de produtos naturais isolados. Aproximadamente 60% de todos os quimioterápicos aprovados atualmente para o tratamento do câncer possuem, em alguma instância, origem em fontes naturais (NEWMAN & CRAGG, 2014).
A grande diversidade de organismos existentes na natureza, tais como plantas, animais, fungos e microrganismos, é responsável pela grande variedade de estruturas químicas encontradas. Isso é impacto da evolução na seleção e conservação de mecanismos de defesa para repelir ou destruir predadores. Além das clássicas fontes terrestres como as plantas e microrganismos, a prospecção de compostos com atividade biológica oriundas do
15 ambiente marinho vem ganhando destaque (CRAGG et al, 1997; FAULKNER, 2000; AMADOR et al, 2003; MOLINSKY et al, 2009).
Os mares e oceanos representam 2/3 do planeta, cobrindo a maior parte da superfície terrestre. Este ambiente abriga representantes de 34 dos 36 filos existentes, reunindo cerca de 300.000 espécies descritas entre plantas e invertebrados, sem contar os milhões de microrganismos, sendo alguns estritamente marinhos (DONIA & HAMANN, 2003; SOARES-GOMES & FIGUEIREDO, 2009). A mistura complexa de sais; a enorme variedade de organismos vivos liberando seus metabólitos ao meio e a imensa vastidão, com uma média de profundidade de 4000 m, justificam esse ecossistema como fonte favorável de compostos bioativos. Além do que, a comunicação entre os organismos através de substâncias químicas com alta solubilidade em água assume fundamental importância ecológica (HESTER & HARRISON, 2000; BHAKUNI & HAWAT, 2005).
Devido ao difícil acesso, o ambiente marinho foi por muito tempo inexplorado. Com o avanço de técnicas e equipamentos, por volta das décadas de 50 e 70, foi dado início às pesquisas com produtos naturais com importância farmacológica oriundos do ambiente marinho (COSTA-LOTUFO et al., 2009). O marco inicial da prospecção desse ambiente foi o isolamento de arabinonucleosídeos, espongotimidina e espongouridina, obtidos da esponja caribenha Cryptotethya crypta (Tethyidae) por Bergman e colaboradores em 1951. Esses nucleosídeos serviram de protótipo para o desenvolvimento de uma nova classe de análogos - Ara-A e Ara-C – utilizados hoje na clínica, respectivamente como antiviral e anticâncer (KÖNING & WRIGHT, 1996; SCHWARTSMANN et al., 2001).
Nas décadas seguintes, os estudos de bioprospecção de produtos naturais marinhos progrediram exponencialmente. Até o ano de 2013, cerca de 22.000 novas moléculas foram isoladas de organismos marinhos. Além dos arabinonucleosideos já citados, atualmente também o antitumoral trabectedina (Yondelis®) e o analgésico neuropático ziconotídeo (Prialt®) encontram-se em uso clínico e, juntamente com outros na fase de estudos clínicos, são mostrados na Tabela 1 (GERWICK et al, 2013).
16
Produtos naturais marinhos possuem uma extraordinária diversidade de alvos moleculares com seletividade marcante, o que aumenta o potencial farmacológico e terapêutico dessas moléculas. A grande maioria dos alvos identificados apresenta-se como relevantes no tratamento do câncer e é exatamente no estudo e na terapêutica dessa doença que se pode visualizar o maior impacto das substâncias de origem marinha (HAEFNER, 2003).
Apesar de toda essa riqueza química e propriedades farmacológicas encontradas nos produtos marinhos, o verdadeiro produtor das moléculas identificadas ainda não é nitidamente esclarecida (NEWMAN & CRAGG, 2004). Contudo, sabe-se que estes possuem relevância nas funções de defesa química dos organismos hospedeiros, visto que foram encontradas abundantemente em organismos sésseis ou com capacidade restrita de locomoção; animais de corpo mole e carentes de estruturas físicas de defesa. Dessa forma, as esponjas, juntamente com ascídias, moluscos, briozoários, cnidários e algas têm seus potenciais bastante explorados. Mesmo diante de todo potencial relatado, vale ressaltar que menos de 3% do total estimado de organismos marinhos já tenha sido estudado (BURKHARD, 2003; NAGLE et al,
Composto Origem Uso Composto Origem Uso
Citarabina* Esponja Antitumoral Zalypsis Molusco Antitumoral
Vidarabina* Esponja Antiviral SGN-75 Molusco Antitumoral
Trabectedina* Ascidia Antitumoral ASG-5ME Molusco Antitumoral Ziconotídeo* Molusco Analgésico Elisidepsina Molusco Antitumoral Mes. Eribulina* Esponja Antitumoral Glembatumumab v. Molusco Antitumoral Etilesteres o-3* Peixe Hipertriglicerid. E7974 Esponja Antitumoral Brentuximab v.* Molusco Antitumoral PM01183 Ascidia Antitumoral Soblidodina Bacteria Antitumoral Sintadotina Bacteria Antitumoral Aplidina Ascidia Antitumoral Mariozomib Bactéria Antitumoral DMXBA Verme Esquizofrenia Briostatina 1 Briozoário Antitumoral Alzheirmer Plinabulina Fungo Antitumoral Pseudopterosina Coral Cicatrização Tabela 1- Moléculas de fontes marinhas aprovadas para o uso clínico ou em fase de testes para o tratamento de diversas doenças.
17 2004; THAKUR & MÜLLER, 2004).
Embora vários estudos mostrem que tais grupos de invertebrados são uma importante fonte de novos compostos de interesse da biomedicina, é comprovado ser bastante dispendioso a obtenção de suprimentos adequados quantitativamente e, principalmente, renováveis destes compostos a partir da natureza. Além disso, a complexidade estrutural dos produtos marinhos, muitas vezes, tem inviabilizado a sua síntese química, seja para fins experimentais ou comerciais (JENSEN & FENICAL, 2000).
A maioria dos invertebrados não exibe um padrão característico de metabólitos secundários. Há fortes indícios de que a maior parte destes metabólitos são oriundos de produtos do metabolismo dos microrganismos a eles associados ou que foram obtidos na dieta. Isso, portanto, tem levado a uma significativa expansão das pesquisas com microrganismos do ambiente marinho (KELECON, 2002; PEREIRA, 2008 ).
Embora se estime que apenas 1 a 2% da microbiota associada seja cultivável, ainda assim, tem-se uma grande significância histórica dos microrganismos como fonte de fármacos. A descoberta da penicilina, por Alexander Fleming em 1929, culminou na busca de microrganismos terrestres produtores de metabólitos secundários com propriedades farmacológicas. Nos últimos 60 anos, entre 30.000 e 50.000 produtos naturais foram descobertos a partir de microrganismos; mais de 10.000 destes compostos apresentam atividade biológica e mais de 80% destas moléculas apresentam atividade antitumoral e antibiótica (FENICAL, 1993; FENICAL & JENSEN, 2006). Atualmente, cerca de 120 entre os mais importantes medicamentos utilizados são derivados de microrganismos (DEMAIN, 2006; JENSEN & FENICAL, 2000).
Os microrganismos marinhos desenvolveram um metabolismo único e capacidades fisiológicas que não apenas garantiram sua sobrevivência em ambientes extremos, mas também proporcionaram potencial para a produção de metabólitos nunca antes observados em organismos terrestres (FENICAL, 1993; ZHANG et al., 2000). Visto que um espécime pode ser capaz de excretar uma gama de compostos bioativos diferentes, quando submetida a condições químicas e físicas adversas, e aliado ao avanço de técnicas genômicas e de análise de vias metabólicas, faz-se imensurável o seu valor biotecnológico. Amplamente distribuídos por todo o ambiente marinho, estima-se que são encontrados 106 microrganismos/mL na água do mar e 109 microrganismos/mL no sedimento marinho, tornando os oceanos um ambiente microbiológico bastante complexo (FENICAL & JENSEN, 2006).
18 Desde quando começaram a ser exploradas, na década de 50, bactérias da ordem Actinomycetales têm se destacado na bioprospecção de compostos com atividade farmacológica, observando-se que aproximadamente 40% dos metabólitos bioativos isolados de microrganismos até 2010 são provenientes desse grupo (BERDY, 2012).
Apesar da uma grande variedade morfológica, as actinobactérias terrestres e marinhas têm um padrão de crescimento comum, apresentando-se filamentosas e com produção de esporos que aparecem na superfície da colônia (BULL, 1992). Este grupo de bactérias gram-positivas constituem uma proporção considerável dos microrganismos do solo (104 – 106 esporos de actinomicetos por grama de solo) e abundantemente distribuída nos mais diversos ambientes, como solos, água doce ou salgada, associados a organismos ou dispersos no sedimento (CLAESSEN et al., 2006).
No meio marinho, são distinguidas duas localidades: a zona litorânea e costeira, e sedimentos de profundidade. Weyland (1969) observou que a população de actinobactérias assim como outros microrganismos é mais densa no mar raso do que em águas profundas. Também, Bull e colaboradores (2005) descobriram que as actinobactérias costumam representar até 9% nos sedimentos marinhos.
As actinobactérias apresentam alto teor de guanina e citosina compondo o DNA. Uma incomparável capacidade de produzir diversos metabólitos secundários é bem característica desse grupo (DAS et al., 2008). Em 2001, Watve e colaboradores estimaram que desde o descobrimento da estreptotricina em 1942 e da estreptomicina dois anos depois, a ordem Actinomicetales tem aproximadamente 3000 compostos antibióticos conhecidos (90% destes provenientes do gênero Streptomyces). Dois terços dos antibióticos disponíveis comercialmente foram originalmente isolados de espécies desse gênero (GUIMARÃES et al., 2010). O grupo tem um enorme potencial biossintético que permanece incontestado entre outros grupos microbianos. A imensa diversidade, juntamente com a sua notabilidade, é a razão fundamental para atrair pesquisadores para descobrir novos metabólitos (MANIVASAGAN, 2013).
Na quimioterapia antineoplásica, esse grupo contribui com a produção de antibióticos anticancerígenos como bleomicina B2, actinomicina D, antraciclina (como a daunorubicina e doxorrubicina) e pentostatina, largamente empregadas no tratamento de diversos tipos de tumores (PUPO et al, 2006). Outro exemplo de antraciclina, a retamicina, mostrou-se promissora como agente quimioterápico, devido à menor toxicidade e uma forte inibição de carcinomas e sarcomas, reduzindo entre 76% e 79% o crescimento desses tipos de tumores (PAMBOUKIAN, 2003). Outra novidade é apresentada pelo antibiótico antitumoral
19 mitomicina, pois, ao ser absorvido sistemicamente, ocorre pouca ou nenhuma toxicidade sistêmica (KATZUNG, 2006).
Como no meio ambiente marinho as condições são extremamente diferentes das terrestres, os actinomicetos marinhos têm diferentes características daqueles homólogos terrestres e, portanto, podem produzir diferentes tipos de compostos bioativos (LAM, 2006). Um resultado marcante na bioprospecção de produtos naturais marinhos foi a descoberta da molécula salinosporamida A, isolada a partir do actinomiceto de gênero Salinispora, restritamente marinho. Tal composto classifica-se como beta-lactona e atua como um potente inibidor seletivo e irreversível do proteassomo 20S. Rapidamente entrou em testes clínicos contra linfoma e mieloma múltiplo, levando apenas 3 anos após sua descoberta - o que normalmente pode levar de 10 a 15 anos (FENICAL et at 2009).
O Brasil possui uma costa contínua de litoral com uma extensão de 8.500 km. A área oceânica é de aproximados 3,6 milhões de km²- os quais, somados aos cerca de 900mil km² de extensão que o Brasil reivindica - totalizam cerca de 4,5 milhões de km², o que representa quase metade da parte terrestre do território nacional. Devido à importância estratégica e à necessidade de desvendar a diversidade biológica, o potencial biotecnológico e os incalculáveis bens naturais, este território recebeu a denominação de “Amazônia Azul”, por ser comparável à “Amazônia Legal Brasileira”. Contudo, ainda são poucos ainda os estudos relacionados ao ambiente marinho brasileiro (MARINHA DO BRASIL, 2016).
A costa cearense encontra-se em uma posição bastante favorável à prospecção de compostos de interesse biomédicos, pois o estado se encontra na região nordestina. A proximidade com a linha do Equador permite ao estado uma localização favorável a maior diversidade de organismos e, consequentemente, uma maior concentração de metabólitos secundários do que os que vivem em latitudes mais altas (BLACKBURN & GASTON,1996; ROHDE, 1992). No litoral do Ceará, existem diferentes ecossistemas costeiros os quais se encontram sujeitos a amplas variações de fatores ambientais, como temperatura do ar e da água, exposição ao sol, intensidade e frequência dos ventos, taxas de oxigênio intersticial, granulométrica do substrato, declive do terreno e ação das ondas. A faixa litorânea cearense é considerada heterogênea, variando de acordo com a hidrodinâmica local (MATTHEWS-CASCON & LOTUFO, 2006). Suas praias são amplamente utilizadas como áreas de lazer, pesca e zonas portuárias, gerando impactos ambientais, direta e indiretamente, ao longo da zona costeira.
20 Somente no ano de 2003, estudos de bioprospecção de produtos naturais marinhos foram introduzidos no estado do Ceará, a partir de uma triagem dos extratos das espécies de ascídias mais abundantes da costa cearense, em que Jimenez e colaboradores revelaram que seis das dez espécies testadas apresentaram-se promissoras como fonte de compostos com atividade citotóxica. A partir do extrato do zoantídeo Protopalythoa variabilis, coletado na Praia de Paracuru, Wilke e colaboradores (2009) isolaram α-aminoacidos lipídicos com potente atividade citotóxica em quatro linhagens de células tumorais testadas. Ainda no estudo de invertebrados marinhos, no ano de 2011, a partir do extrato obtido da esponja
Monanchora arbuscula, por Ferreira e colaboradores, foram isolados alcalóides que
apresentaram forte atividade citotóxica contra a linhagem de célula tumoral de leucemia promielocítica, levando estas células a morte por apoptose. Este estudo mostrou que o extrato de nove das vinte e duas espécies de esponjas coletadas no parque estadual marinho Pedra da Risca do Meio, na capital cearense, apresentava interessante atividade citotóxica, enquanto o extrato de dezenove destas inibiram a divisão de ovos de ouriço-do-mar.
A identificação de derivados e estaurosporinas, substância tipicamente relacionada ao metabolismo secundário de actinomicetos, isolados de extratos da ascidia Eudistoma
vanammei, coletada na praia da Taíba, motivou os estudos prospectivos de sua microbiota
associada (JIMENEZ et al, 2013). O isolamento de microrganismos associados à ascídia, com a avaliação da atividade citotóxica em três linhagens celulares tumorais, levou a identificação de um actinomiceto do gênero Streptomyces, em cujo extrato, com melhor resultado, demonstrou a presença de estaurosporina. O fracionamento bioguiado desse extrato, entretanto, levou ao isolamento de ditiolpirolona, com potente atividade citotóxica, bloqueando a citocinese de células metastáticas de próstata, com consequente apoptose destas (ABREU et al, 2013). Numa segunda investida em 2012, da microbiota associada a outro exemplar da ascídia, foi recuperada um estirpe pertencente ao gênero Micromonospora, em cujo extrato foram encontrados 4 novos derivados de antraciclinas, moléculas conhecidas pelo seu potencial anticâncer (SOUZA et al, 2012).
Estudos com invertebrados marinhos presentes no litoral do Ceará, apesar de mostrarem uma fonte de novos compostos de interesse farmacológico, enfrentam como maior dificuldade o baixo rendimento. Isto tem implicações negativas, tanto na limitação para a determinação e caracterização das substâncias e nos estudos de atividade biológica, como na quantidade de organismos retirados do ambiente natural, gerando um déficit na população da espécie e em suas respectivas relações ecológicas. Vale ressaltar, portanto, que estudos com microrganismos presentes no sedimento são uma rota alternativa para tentar suprimir tais
21 limitações, pela perspectiva de sustentabilidade que está associada à possibilidade de fermentação para produção de material suficiente para as etapas do desenvolvimento de fármacos (LOTUFO et al, 2009).
Vendo que esse é um campo ainda pouco conhecido, mas muito promissor, o presente trabalho propõe o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais marinhos, no sentido de promover a avaliação do potencial anticâncer de actinomicetos presentes no sedimento de praias da costa do Ceará. Os estudos nesta área são considerados estratégicos por envolver o conhecimento da biodiversidade num sentido amplo, além de fontes renováveis de substâncias com importância biomédica.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a atividade citotóxica de extratos obtidos de linhagens de actinomicetos isolados do sedimento de 4 praias do estado do Ceará.
2.2 Objetivos específicos
Isolamento e cultivo de linhagens de actinomicetos presentes no sedimento de praias do litoral cearense.
Avaliação do potencial citotóxico in vitro de extratos orgânicos obtidos das bactérias isoladas contra uma linhagem de câncer de colorretal.
Determinação da concentração inibitória media dos extratos que forem considerados ativos.
Identificação a nível molecular das bactérias selecionadas.
3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Planejamento experimental
Inicialmente, as amostras de sedimento de 5 localidades, em 4 praias do litoral cearense, foram coletadas, devidamente armazenadas, e preparadas para processamento no Laboratório de Ecotoxicologia Marinha (Fig. 1). O plaqueamento foi realizado com o objetivo
22 de isolar os actinomicetos. Confirmada a pureza, foram então cultivados em meio líquido para a preparação do extrato bruto. Em seguida, a atividade citotóxica dos extratos em células tumorais in vitro foi avaliada. Finalmente foram determinados os valores da concentração inibitória média (CI50) dos extratos ativos na triagem inicial. Algumas estirpes que foram ativas, tiveram o DNA extraído para a identificação molecular.
3.2 Coleta do material
Uma amostra de cerca de 20g de sedimento marinho foi coletada, com o auxílio de uma espátula estéril, em 5 pontos do litoral cearense, transportadas em um tubo Falcon estéril, e conservado a -20ºC até o seu devido processamento, no Laboratório de Ecotoxicologia Marinha (ECOTOX), no Instituto de Ciências do Mar.
As coletas foram realizadas manualmente por mergulho autônomo na Praia da Pedra Rachada (03º23’S 39º54’O), pertencente ao município de Paracuru; Praia da Taíba (03º30'21,23''S; 38º53' 40,16''O), Praia do Pecém (3°32'2''S; 38°47'58''O), ambas pertence ao
Figura 1 - Desenho esquemático do planejamento experimental do presente estudo mostrando as etapas em sequência.
23 município de São Gonçalo do Amarante; e no Mucuripe, na capital Fortaleza, em dois pontos de coleta, na praia (3°43'23.4"S 38°29'24.6"W) e uma amostra foi retirada do sedimento dragado do Porto do Mucuripe (03°43'17.70''S; 38°29'23.84''W). As localidades são mostradas no mapa a seguir (Fig. 2).
Figura 2 - Mapa do litoral do Estado do Ceará (parcialmente mostrado), indicando os locais de coleta (pontos vermelhos).
3.3 Processamento das amostras
Para garantir a esterilidade, os sedimentos coletados foram processados em câmara de fluxo laminar unidirecional (NB-1). Foram submetidos a dois tratamentos distintos com o objetivo de selecionar as cepas de bactérias actinomicetos, como descrito na Figura 3.
Figura 3 - Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de sedimento.
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Figura 3 - Desenho esquemático dos métodos de pré-tratamento das amostras de sedimento.
3.3.1- Método do carimbo (M1)
Esse método tem como princípio selecionar as bactérias resistentes a desidratação, onde uma fina camada dos sedimentos coletados foi espalhada em placas de Petri estéreis e mantidas em capela de fluxo laminar por 48h com o fluxo ligado. Após esse período, com o auxílio de uma esponja previamente esterilizada, o sedimento foi homogeneizado e carimbado em placas de Petri contendo os meios de cultura sólidos utilizados para o isolamento de bactérias SWA (água do mar e ágar), TMA (água do mar, solução de metais traços e ágar) e SCA (amido-caseína e ágar); todos os meios utilizados foram produzidos com água do mar filtrada e a estes foram adicionados antifúngico (cicloheximida) na concentração de 100µg/mL.
3.3.2- Método de diluição (M2)
No segundo método, os sedimentos previamente decantados foram diluídos em água do mar sintética na proporção de 1:5 (m/v). O volume de 1mL dessa solução foi aquecido em banho-maria a 55°C por 10 min. Após essa etapa, com o auxílio de uma pequena alça, o homogeneizado foi estriado em placas de Petri contendo os meios de cultura SWA, TMA e
25 SCA utilizados para o isolamento das bactérias e adicionados na mesma forma do método anterior. Essa segunda metodologia objetivou selecionar as estirpes mais resistentes ao aquecimento.
Após o plaqueamento das amostras, as placas foram armazenadas em estufa B.O.D. a 28ºC por 7 dias, podendo lá permanecer por até 90 dias.
3.4 Isolamento e manutenção dos microrganismos
A seleção das linhagens de bactérias foi realizada por suas características fenotípicas (cor, brilho, forma, textura, etc), típicas de actinomicetos. A morfologia macroscópica de colônias desse grupo é bem descrita na literatura, que, em meio de cultivo sólido, apresenta-se em aspecto opaco, não-leitoso, com superfícies e bordas irregulares, ou não, e, principalmente, a esporulação, podendo apresentar pigmentos (BALDACCI et al, 1953).
Linhagens com as respectivas características de actinobactérias foram inoculadas em uma nova placa contendo um meio mais rico (A1), composto por água do mar, peptona, amído e extrato de levedura e ágar. O isolamento foi feito a partir da técnica de estrias por esgotamento. As placas sofreram repiques sucessivos até que as estirpes estivessem completamente puras.
Confirmada a pureza, foram crescidas em meio A1 líquido. Deste, retirou-se 10mL e adicionou-se ao mesmo volume de solução glicerol 50%, diluído em água destilada previamente autoclavada para a criopreservação das estirpes puras. Em seguida, a solução foi aliquotada em frascos criogênicos de 2mL e estocados em freezer a temperatura de -80ºC.
Nesse momento, as cepas congeladas em congelador a -80ºC foram nomeadas com o código BRA- seguido pela numeração subsequente do banco de microrganismos do Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia Marinha (LaBBMar), no Núcleo de Desenvolvimento de Medicamentos, vinculado à Universidade Federal do Ceará. Em seguida, as bactérias também foram catalogadas no inventário eletrônico do LaBBMar.
3.5 Obtenção dos extratos brutos
Para a obtenção dos extratos brutos, cepas de bactérias purificadas foram inoculadas em erlenmeyers de 500mL contendo 100mL de meio de cultura A1 líquido. As culturas foram mantidas sob agitação a 200rpm, 28ºC por 7 dias.
26 extraídos com acetato de etila (EtOAc), na proporção de 1:1, sob agitação por um período de duas horas. Em um funil de separação, o conteúdo de cada erlenmeyer foi filtrado e a biomassa resultante foi descartada.
Em seguida, os extratos líquidos foram concentrados em evaporador rotativo para a eliminação do solvente e a obtenção do extrato bruto. Após a secagem em estufa, estiveram prontos para os testes de rastreamento de atividade citotóxica.
3.6 Manutenção da cultura celular
As células da linhagem HCT-116 (carcinoma de cólon humano) foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro e cultivadas em recipientes de plásticos para culturas (Corning, 25cm2, volume de 50mL), contendo 5mL de meio de cultura RPMI 1640 (Gibco), suplementado com soro fetal bovino (10%). A cada 3 dias, foram feitas passagens para novo recipiente contendo novo meio RPMI 1640. Para a soltura das células, utilizou-se 1mL de Tripsina 1X. As culturas foram mantidas em incubadoras a 37ºC e atmosfera de 5% de CO2. Figura 4 - Desenho esquemático do método de obtenção dos extratos brutos das bactérias recuperadas dos sedimentos das praias do Ceará.
27 3.7 Teste de atividade citotóxica (Ensaio do MTT)
O teste do MTT foi usado para a avaliação da atividade citotóxica. Seu princípio consiste na análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células viáveis, baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetiltiazol-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H tetrazolina bromida (MTT), um composto de cor amarela, em formazan, um composto insolúvel de coloração púrpura. Essa reação ocorre pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente nas mitocôndrias ativas das células vivas (MOSMANN, 1983).
Para uma análise qualitativa inicial, os extratos foram avaliados quanto ao efeito antiproliferativo na linhagem celular tumoral de câncer coloretal humano – HCT-116. Vinte e quatro horas antes da realização dos ensaios, as células tumorais foram incubadas em placas com 96 cavidades a um inóculo de 5,0 x 104 células/mL. Os extratos brutos foram diluídos em solvente DMSO, dimetilsufóxido, e então inseridos nos poços, em duplicatas, em concentração única de 50µg/mL. Como controle positivo, utilizou-se o quimioterápico doxirrubicina. Após 72h de incubação a 37ºC e 5% de CO2, o sobrenadante foi descartado e 150µL da solução de MTT 10% em meio RPMI 1640 foi adicionado a cada poço e reincubado por mais 3h. Após esse período, adicionou-se 150µL de DMSO e foi agitado até a completa solubilização do MTT. A leitura da absorbância foi feita no espectrofotômetro, no comprimento de onda de 565nm.
Os extratos que inibiram o crescimento celular em mais de 75% foram considerados ativos e submetidos a uma análise quantitativa, para a obtenção das respectivas concentrações inibitórias médias (CI50) frente a células da linhagem HCT-116, no ensaio de MTT, a concentrações seriadas entre 0,016 e 50μg/mL.
3.8 Análise dos dados
Para as amostras testadas em duplicatas de concentração única, o valor do percentual de inibição do crescimento celular foi obtido a partir da normalização dos valores de absorbância, relativas ao controle.
O cálculo da CI50 e dos respectivos intervalos de confiança (IC 95%) foi realizado a partir da regressão não-linear dos dados normatizados utilizando o programa GraphPad Prism (GraphPad Software versão 6.0).
28 3.9 Identificação molecular dos microrganismos selecionados
As estirpes selecionadas foram crescidas em erlenmeyers contendo 50mL do meio de cultura A1, e, em seguida, sua biomassa foi concentrada para a extração do DNA de cada amostra de acordo com kit comercial para extração de DNA total DNeasy® da Qiagen, segundo o protocolo do fabricante. Para a confirmação da extração de DNA e de sua pureza, o material genético extraído foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1%, coradas com brometo de etídeo e visualizadas em transluminador.
A amplificação parcial da região da subunidade ribossômica 16S do DNA foi realizada através de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se primers universais para identificação taxonômica para o domínio Bacteria (Foward: F243 {5'-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3'} e Reverse: R513 {5'-CCGCGGCTGCTGGCACGTA-3'}). Os produtos obtidos da PCR foram utilizados para o sequenciamento parcial do rDNA 16S. Uma vez obtidas as sequências de DNA, estas foram comparadas em banco genético utilizando-se o programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). A busca no BLAST alinha as sequências de rDNA 16S obtidas numa base de dados de sequências conhecidas a fim de encontrar o pareamento taxonômico mais aproximado (ALTSCHUL et al, 1997). Este programa encontra-se disponível na página web para o Centro Nacional para Informações em Biotecnologia dos Estados Unidos (National Center for Biotechnology Information), no endereço eletrônico http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
4 RESULTADOS
4.1 Isolamento dos microrganismos
Um total de 96 estirpes foram isoladas com base em suas características semelhantes às de actinomicetos, a partir das amostras dos sedimentos das 4 praias do litoral cearense, sendo 10 provenientes do sedimento da praia da Taíba; 11 do Pecém; 26 de Paracuru; 17 da praia do Mucuripe e 32 do sedimento dragado do Porto do Mucuripe.
Na Tabela 2, observa-se a relação da quantidade de estirpes isoladas de acordo com a praia referindo-se ao método que foi processado e ao meio de cultura em que foi recuperado.
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Mucuripe-Draga Mucuripe-Praia Pecém Taíba Paracuru
M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2
SWA 4 5 5 7 - 5 - 8 4 3
SCA 5 9 - 2 4 2 - - 1 10
TMA 3 6 2 1 - - 1 1 3 5
As amostras de sedimento marinho coletadas nesse estudo foram submetidas a dois métodos de pré-tratamento. O método da diluição, M2, baseado no aquecimento a 55ºC das amostras, foi o mais eficiente no isolamento das bactérias. Promoveu o isolamento de 67% das linhagens, correspondendo ao total de 64 microrganismos. O M1, em que as amostras foram desidratadas, mantidas por 48h secando, rendeu o isolamento de 32 das 96 estirpes.
O meio de cultura Sea Water Agar, composto apenas de água do mar filtrada e diluída e ágar, se mostrou mais favorável ao isolamento dos microrganismos, com mais de 42% do total, um valor de 41 estrias. Seguido pelo meio SCA com 33 estirpes isoladas (34%) e pelo TMA com 22 (22%), de um total de 96, como mostrado na Figura 5.
Figura 5 – Distribuição das 96 estirpes isoladas quanto ao método de pré-tratamento da amostra do sedimento marinho e em relação ao meio de cultura em que foram crescidos. M1, método 1; M2, método 2. SCA, amido-caseína, SWA, água do mar, TMA, ágar minerais traços.
Tabela 2 - Relação da quantidade de estirpes isoladas de cada localidade de acordo com o método de processamento e ao tipo de meio de cultura.
Fonte: elaborado pelo autor.
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4.2 Avaliação da atividade citotóxica in vitro dos extratos
Das 96 estirpes isoladas, 68 amostras foram escolhidas aleatoriamente e então cultivadas em meios líquidos, extraídas com EtOAc e avaliadas quanto à sua citotoxicidade. Destes, 31 inibiram o crescimento celular em pelo menos 75%, e foram consideradas ativas, conforme mostrado na Figura 6.
31 Figura 6 - Citotoxicidade dos extratos das bactérias isoladas do sedimento das praias de Pecém, Taíba, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Mucuripe, em células tumorais HCT-116, pelo ensaio do MTT, por 72h. Os dados correspondem a média ± erro padrão da média do experimento em duplicata.
32 Na Tabela 3, são mostrados os valores de CI50 para os 31 extratos ativos variaram de 0,02 a 42,13µg/mL, sendo o extrato proveniente da linhagem BRA-028, do sedimento dragado do Mucuripe, o mais citotóxico, seguidos pelos extratos das BRA-011 e BRA-148, com CI50 de 0,04 e 0,066µg/mL, respectivamente. 12 extratos apresentaram CI50 menores que 1,0µg/mL, como mostrado na Figura 7.
AMOSTRA CI50 IC (95%) R2 AMOSTRA CI50 IC (95%) R2 BRA-011 0,04 (0,02-0,09) 0,7340 BRA-149 14,99 (12,92-17,38) 0,9880 BRA-016 22,13 (15,71-31,18) 0,9068 BRA-152 >50 N.D. BRA-018 0,98 (0,508-1,89) 0,8413 BRA-220 12,54 (8,333-18,86) 0,9503 BRA-021 0,30 (0,12-0,86) 0,9645 BRA-222 >50 N.D. BRA-022 30,51 (11,74-79,28) 0,7301 BRA-227 0,8873 (0,474-1,66) 0,9271 BRA-024 7,80 (5,71-10,62) 0,9311 BRA-228 0,14 (0,06-0,33) 0,9179 BRA-028 0,02 (0,0037-0,13) 0,6190 BRA-230 0,33 (0,06-1,74) 0,5989 BRA-029 3,149 (1,654-5,995) 0,8568 BRA-231 2,94 (1,69-5,14) 0,8621 BRA-040 0,9223 (0,105-8,09) 0,4881 BRA-232 26,53 (9,38-75,06) 0,5641 BRA-031 32,50 (21,73-44,28) 0,8367 BRA-233 23,70 (11,96-46,97) 0,5520 BRA-068 0,3149 (0,235-0,423) 0,9584 BRA-234 3,283 (2,114-5,1) 0,9570 BRA-090 0,19 (0,08-0,45) 0,8809 BRA-235 1,20 (0,35-4,18) 0,8638 BRA-092 0,2481 (15,61-39,43) 0,8081 BRA-244 10,77 (5,002-23,17) 0,8781 BRA-094 33,76 (1,99-63,36) 0,9486 BRA-280 >50 N.D.
Tabela 3 - Potência da atividade citotóxica dos extratos obtidos de actinomicetos recuperados dos sedimentos das praias de Pecém, Taíba, Mucuripe e Paracuru , e do sedimento dragado do Mucuripe. Estão apresentados os valores de concentração inibitória média (CI50) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) obtidos a partir de 2 experimentos independentes em duplicata, determinado por regressão não-linear no programa GraphPad Prism 6.0.
33 BRA-147 11,71 (10,23-13,42) 0,9873 BRA-286 33,12 (22,54-48,68) 0,8472 BRA-148 0,066 (0,025-0,176) 0,8112
4.3 Identificação molecular dos microrganismos selecionados
Quando selecionados, os microrganismos isolados foram identificados a nível de gênero, através de uma abordagem molecular envolvendo amplificação parcial de seus 16S rDNA com primers universais, sequenciamento da região amplificada e posterior comparação das sequências na base de dados BLAST. Das 12 estirpes que foram identificadas aleatoriamente, 9 pertencem ao gênero Streptomyces e 3 ao gênero Micromonospora, como mostrado na tabela abaixo.
Fonte: elaborado pelo autor.
Fonte: elaborado pelo autor.
Figura 7 – Gráfico da proporção de extratos brutos ativos de acordo com a concentração inibitória média (CI50) menor que 1,00µg/mL.
34 Tabela 4 - Identificação taxonômica de acordo com amplificação e sequenciamento de 16S rDNA das amostras selecionadas e respectivos valores de concentração inibitória média (CI50).
AMOSTRA IDENTIFICAÇÃO CI50 LOCAL DE COLETA
BRA-011 Streptomyces sp. 0,50 Mucuripe
BRA-012 Streptomyces sp. 22,13 Mucuripe
BRA-016 Streptomyces sp. 22,13 Mucuripe
BRA-018 Micromonospora
sagamiensis
0,98 Mucuripe
BRA-021 Streptomyces sp. 0,30 Pecém
BRA-022 Micromonospora sp. 30,51 Pecém
BRA-024 Micromonospora
echinospora.
7,80 Pecém
BRA-028 Streptomyces sp. 0,02 Mucuripe-Draga
BRA-029 Streptomyces sp. 3,15 Mucuripe-Draga
BRA-031 Streptomyces sp. 32,50 Mucuripe-Draga
BRA-090 Streptomyces sp. 0,19 Paracuru
BRA-148 Streptomyces sp. 0,21 Paracuru
5. DISCUSSÃO
A busca por compostos com potencial farmacológico provenientes do ambiente marinho vem ganhando foco em pesquisas em todo o mundo, e a prospecção é a etapa inicial desse processo. A relevância de actinomicetos marinhos nesse aspecto é relativamente recente, contudo já tem mostrado resultados bastante promissores. Estudos com microrganismos marinhos do litoral cearense, visando a bioprospecção de substâncias citotóxicas, são ainda iniciais. Nessa perspectiva, o presente trabalho se desenvolveu a partir da triagem para a atividade antitumoral de extratos de actinomicetos isolados dos sedimentos provenientes das praias de Taíba, Pecém, Paracuru, Mucuripe e do sedimento dragado do Porto do Mucuripe.
As 96 estirpes isoladas foram selecionadas por meio de suas características fenotípicas de actinomicetos que apresentavam, baseado no estudo de Shirling e Gottlieb (1966). A morfologia macroscópica de colônias desse grupo é bem descrita na literatura, que, em meio de cultivo sólido, apresenta-se em aspecto opaco, não-leitoso, superfícies e bordas irregulares, ou não, e principalmente a esporulação, podendo apresentar pigmentos (BALDACCI et al, 1953).
A aplicação de pressões seletivas adequadas durante o processamento de amostras para o isolamento de grupos de actinomicetos, sejam estas sedimentos, tecidos de organismos ou
35 fluidos, tem como objetivo reduzir a ocorrência de microrganismos indesejáveis e assim viabilizar placas com culturas menos contaminadas. Da mesma forma, a adição de antifúngicos aos meios de isolamento aumenta a seleção de membros da ordem Actinomycetales, por diminuir as possíveis interações interespecíficas, bem como a competição por recursos, além de garantir tempo e espaço necessários para o seu crescimento (GOODFELLOW e WILLIAM, 1983; GONTANG et al, 2007). Esse tipo de abordagem, entretanto, é limitado aos microrganismos que podem ser cultivados.
A aplicação de técnicas de pré-tratamento, como dessecação e exposição ao calor seco, favorecem significativamente o crescimento de bactérias do grupo actinomicetos, que são em sua maioria formadores de esporos bastante resistentes (SUBRAMANI e ALBERSBERG, 2013). A utilização do tratamento térmico dificulta o crescimento de bactérias Gram-negativas, podendo ser justificado pela estrutura da parede celular destas, que possui uma delgada camada de peptideoglicano. Ao contrário de Gram-positivas, como actinomicetos, além da presença de esporos, possuem uma camada espessa, composta quase que completamente por peptidioglicano, responsável pela manutenção da célula e sua rigidez, as Gram-negativas são menos resistentes e mais suceptíveis ao calor (MADIGAN et al, 2010).
A elevada proporção de 2:1, em relação ao método do aquecimento, pode ser interpretada devido ao favorecimento do crescimento de actinomicetos, Gram-positivos, produtores de esporos, serem mais resistentes ao calor que as espécies gram-negativas, reduzindo a competição entre estas (EMBLEY, 1994). Também, a alta razão de guanina e citosina compondo o DNA desse grupo de bactérias lhes confere maior termoestabilidade do material genético. Por isso, este método é bastante adotado para otimizar o isolamento de estirpes desse grupo (OZCAN et al, 2013).
Estudos recentes dependentes do cultivo e metagenômicos sugerem que os actinomicetos são membros nativos do ambiente marinho. O nutriente marinho específico para os microrganismos marinhos obrigatórios, incluindo os actinomicetos, como os membros de Salinispora, é o sódio (MALDONADO et al, 2005). Portanto, a composição dos três meios de culturas utilizados na etapa inicial do trabalho foi preparada com água do mar filtrada.
O isolamento pelo meio SWA era esperado, uma vez que possui concentrações relativamente baixas de nutrientes que, em geral, favorecem o isolamento de actinomicetos, também por reduzirem naturalmente o crescimento de outros tipos de bactérias menos resistentes ao estresse nutricional e que fugiam ao interesse deste trabalho. Em geral, para o isolamento de actinomicetos marinhos obrigatórios de diferentes fontes marinhas, os meios de nutrientes pobres funcionam melhor do que os meios ricos em nutrientes, além de
36 desfavorecerem o crescimento de outros grupos de microrganismos que são dependentes de meios com nutrientes mais abundantes (OLSON et al, 2000; JENSEN et al, 2005 e GONTANG et al, 2007).
Dentre os 6 tipos de combinação possíveis de meio de cultura com método de pré-tratamento, a combinação do método M2 de aquecimento, com o meio de cultivo SWA foi responsável pelo maior número de estirpes recuperadas, sendo 27 das 96, aproximadamente 28%. O estudo de Jesen e colaboradores (2005) mostra que, quando aplicados métodos em combinação, por exemplo “secagem/carimbo” e “diluição/aquecimento” (um seguido do outro para a mesma placa), a proporção de actinomicetos isolado quase duplica (JENSEN et al, 2005).
Foram avaliados 5 pontos que ilustram o perfil da costa cearense em relação aos impactos ambientais, de natureza e intensidades diferentes, a que são submetidos. A praia do Mucuripe, dentre as praias analisadas nesse trabalho, é a que mais sofre ação antrópica direta por conta da intensa rede hoteleira e a presença do Porto no local, com qualidade da água bem poluída. Nesta localidade, foram recuperados 17 estirpes de actinomicetos. As praias de Pecém, Taíba e Paracuru, menos alteradas que as da capital, foram isoladas 11, 10 e 26 estipes, respectivamente.
O sedimento dragado do Porto do Mucuripe, de onde vieram 32 das bactérias recuperadas, a maioria destes, correspondendo a quase 34% do total, é o que apresenta características mais peculiares. As áreas portuárias sofrem forte influência antropogênica, com a geração de resíduos e poluentes. A alteração de fatores físicos e químicos, como temperatura, pH, salinidade, substratos orgânicos e os elementos tóxicos interferem na comunidade microbiana. Um dos fatores que pode ter influenciado a maior disponibilidade de actinomicetos nesse ponto é a leve acidificação nas águas de lastro. A água do mar é ligeiramente alcalina, com pH entre 7,4 e 8,5. O valor de pH ótimo para o crescimento do grupo de bactérias desejado varia entre 6,0 e 8,0 (ARAÚJO, 2007). Além de alterar a diversidade de outros grupos, um leve decaimento do pH não influencia negativamente o crescimento de actinomicetos. Mais estudos, entretanto, são necessários para melhores conclusões.
Também, estudos com a microbiota do solo mostram que a aplicação de pesticidas, produtos químicos e poluentes no solo tem ocasionado mudanças na diversidade de microrganismos, podendo ocasionar benefícios ou prejuízos, dependendo da composição da molécula e da sua persistência (ARAÚJO, 2007; MONTEIRO et al, 2006). Por exemplo, em um trabalho avaliando o efeito do glifosato sobre a microbiota do solo, Araújo et al (2003)
37 observaram que, com a aplicação do produto, houve aumento do número de fungos e actinomicetos, enquanto outros grupos de bactérias não foram afetados. É provável que tal resultado possa ser extrapolado para áreas portuárias, onde há uma elevada concentração de poluentes. Entranto, há a carência de mais estudos sobre essa relação com a microbiota marinha.
O sedimento da praia do Paracuru também rendeu um considerável número de estirpes isoladas. Entretanto, dentre todas as praias, nesta os esforços empregados na recuperação foram mais acentuados. Os estudos nessa praia foram continuados por Guimarães (2013) para os resultados serem avaliados em sua dissertação. Também, por ter sido trabalhada posteriormente às demais praias, as técnicas de processamento e isolamento já eram mais bem dominadas no laboratório.
O câncer colorretal é um tumor maligno gastrointestinal bem frequente no Brasil, e o terceiro mais comumente diagnosticado no mundo em ambos os sexos (PARKIN et al, 2015). A linhagem de células HCT-116, proveniente desse tipo de carcinoma, é altamente proliferativa, ocupando rapidamente a superfície de crescimento. Apresenta morfologia do tipo epitelial e suas populações são descritas por Brattain (1981) como “células poligonais de forma compacta”. São amplamente utilizadas em estudos para a avaliação de citotoxicidade devido à elevada sensibilidade aos efeitos quimioterápicos (RAJPUT et al, 2008).
Dos 68 extratos preparados com acetato de etila a partir dos caldos de cultura das estirpes isoladas, 31 foram considerados ativos por inibirem o crescimento das células HCT-116 em mais de 75%. Quando estes foram submetidos a uma análise quantitativa, para a obtenção das respectivas concentrações inibitórias médias frente à mesma linhagem de células, no ensaio de MTT, apresentaram valores de CI50 que variaram de 0,02 a 42,13µg/mL. Dentre os extratos ativos, 40% se destacam pela alta potência que pode ser reconhecida pelas CI50 menores que 1,00µg/mL em escalas de nanogramas/mL. O extrato da estirpe BRA-028, proveniente do sedimento dragado do Mucuripe, foi o mais citotóxico, com valor de 0,02µg/mL, seguidos pelos extratos das BRA-011 e BRA-148, com CI50 de 0,04 e 0,066µg/mL, respectivamente.
Extratos brutos aqui testados são preparações onde há um pool de moléculas diversas com concentrações variadas, proveniente do metabolismo celular de bactérias, retiradas a partir de um solvente. Como os resultados mostrados foram bastante promissores, outros pesquisadores do grupo trabalharam paralelamente na identificação e isolamento de compostos ativos presentes no extrato bruto de bactérias isoladas neste estudo. Guimarães (2013), em sua dissertação, desrreplicou o extrato da BRA-090, recuperada da praia do
38 Paracuru. Foram identificadas moléculas do grupo de cromomicinas. Esses compostos são bastante conhecidos por sua ação antibiótica antitumoral, sendo algumas classes utilizadas como quimioterápicos contra diversas linhagens de células tumorais. Nesse estudo, foi mostrado a indução de alterações no ciclo celular, possivelmente, autofagia e morte celular em células de melanoma metastático. As células tumorais cujas vias de apoptose foram suprimidas, por exemplo, se tornam mais resistentes a morte celular. Portanto, o processo de autofagia, quando intensificado, acaba sendo uma estratégia interessante para destruir células mais resistentes a apoptose (GUIMARAES, 2013). A produção de cromonicinas tem sido relatada para vários actinomicetos terrestres e marinhos do gênero Streptomyces (MENENDEZ et al, 2006; XIONG, 2012).
Em ambas BRA-021 e BRA-028, recuperadas da praia do Pecém e do sedimento dragado do porto do Mucuripe, respectivamente, foi encontrado uma substância citotóxica bastante conhecida, piericidina, cujo mecanismo de ação está relacionado com a interferência no transporte de elétrons através da membrana interna de mitocôndrias, especificamente bloqueando a atividade do complexo I. Muitos casos de isolamentos de diversas formas de piericidinas, produzidas também por espécies de Streptomyces, foram relatados (TAKAHASHI E TAMURA, 1966; FENICAL E JESEN, 1993). Também, estaurosporinas foram encontradas no extrato da BRA-148, na Praia de Paracuru. Estes compostos são alcaloides que possuem alta afinidade com o receptor ATP-ligante, sendo um potente inibidor da Proteína Quinase-C. São amplamente empregadas como ferramenta de pesquisa e foram isoladas pela primeira vez a partir do caldo de fermentação de uma Streptomyces (JIMENEZ, 2009). Os dados do nosso grupo ainda não foram publicados.
Como observado na identificação taxonômica das respectivas estirpes BRA-021, BRA-028, BRA-090 e BRA-148, em cujos extratos já foram isolados compostos ativos purificados, todas são pertencentes ao gênero Streptomyces.
As actinobactérias são componentes ativos de comunidades microbianas marinhas e formam uma população estável e persistente em vários ecossistemas marinhos (MANIVASAGAN, 2013). Têm um papel significativo no ambiente marinho, além da produção de antibióticos. São relatados por contribuir para a degradação e reciclagem de compostos orgânicos (GOODFELLOW e HAYNES, 1984). Além disso, desempenham função na mineralização de matéria orgânica, imobilização de nutrientes minerais, fixação de nitrogênio, melhoria dos parâmetros físicos e proteção ambiental (DAS et al, 2006).
O gênero Streptomyces é representado na natureza pelo maior número de espécies entre todos os gêneros de actinomicetos e com mais de 500 espécies descritas (MADIGAN,
39 2010). Estudos independentes da cultura têm demonstrado que membros dos generos Dietzia,
Rhodococcus, Micromonospora (HELMKE e WEYLAND, 1984; HEALD et al, 2001), Streptomyces (MORAN et al, 1995) certamente existem nos oceanos (WARD e BORA, 2006).
Através do desenvolvimento de conjuntos de iniciadores seletivos para amplificação por PCR de 16S rRNA das famílias Actinomycetales, Micromonosporaceae, Streptomycetaceae, Streptosporangiaceae e Thermomonosporaceae e do gênero Dactylosporangium, a aplicação desses primers em amostras ambientais mostrou a ocorrência frequente desses grupos de actinobactérias e também revelou sequências que podem ser atribuídas a novos grupos de actinobactérias (MONCIARDINI et al, 2002).
Actinobactérias do gênero Micromonospora, também encontradas nesse estudo, ocorrem como saprófagas abundantes no solo e na água. Espécies de Micromonospora são mais conhecidas por sintetizar antibióticos, especialmente aminoglicosídeos. Seu impacto na medicina é considerável, e de fato Streptomyces e Micromonospora produzem muitos dos antibióticos conhecidos. Também desse gênero são produzidos antibióticos antitumorais (lomaiviticinas A e B, tetrocarcina A, complexo LL-E33288, etc) e antibióticos de antraciclina. Outras moléculas biologicamente ativas sintetizadas por espécies de
Micromonospora são a vitamina B12 e compostos antifúngicos. O antimicrobiano alcalóide,
diazepinomicina, foi identificado de uma espécie marinha (HIRSCH, 2009).
Ambas as famílias Streptomycetaceae e Micromonosporaceae já haviam sido encontradas na costa cearense através de estudos da microbiota associadas a invertebrados marinhos, mais especificamente na espécie da ascídia Eudistoma vanammei, coletada na Praia da Taíba. Nos extratos provenientes dessas bactérias foram isolados compostos bem descritos por suas atividades anticâncer, estaurosporinas e dictiopirolona, e antraciclinas, respectivamente (JIMENEZ et al, 2012; ABREU et al, 2013; SOUZA et al, 2012).
6 CONCLUSÃO
Os actinomicetos da costa do Ceará são uma profícua fonte de substâncias com potencial anticâncer. Dentre os extratos ativos, 40% se destacam pela alta potência que pode ser reconhecida pelas CI50 menores que 1,00µg/mL. Em 4 estirpes recuperadas, foram identificados compostos ativos com ação antitumoral. Estes resultados destacam o potencial farmacológico de microrganismos marinhos que o litoral do Ceará reserva e imenso potencial entre os microrganismos para a exploração sustentável de compostos naturais com relevância biomédica e biotecnológica.
