Avaliação da eficiência dos algoritmos de verossimilhança e de atribuições genéticas em estudos de genética de populações e filogeografia de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae)

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUACÃO EM GENÉTICA. CÉSAR RAIMUNDO LIMA COSTA JÚNIOR. AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS ALGORITMOS DE MÁXIMA VEROSSIMILHANÇA E DE ATRIBUIÇÕES GENÉTICAS EM ESTUDOS DE GENÉTICA DE POPULAÇÕES E FILOGEOGRAFIA DE Lutzomyia longipalpis (DIPTERA: PSYCHODIDAE). RECIFE - PE 2011.

(2) CÉSAR RAIMUNDO LIMA COSTA JÚNIOR. AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS ALGORITMOS DE MÁXIMA VEROSSIMILHANÇA E DE ATRIBUIÇÕES GENÉTICAS EM ESTUDOS DE GENÉTICA DE POPULAÇÕES E FILOGEOGRAFIA DE Lutzomyia longipalpis (DIPTERA: PSYCHODIDAE). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação stricto sensu em Genética do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestre Genética.. Orientador: Prof. Dr. Valdir de Queiroz Balbino. Recife, PE 2011.

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(4) Costa Júnior, César Raimundo Lima Avaliação da eficiência dos algoritmos de verossimilhança e de atribuições genéticas em estudos de genética de populações e filogeografia de Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidae)/ César Raimundo Lima Costa Júnior. – Recife: O Autor, 2011. 64 folhas : il., fig., tab. Orientadora: Valdir de Queiroz Balbino Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Genética, 2011.. Inclui bibliografia 1. Lutzomyia 2. Genética de populações 3. Leishmania I. Título.. 576.58. CDD (22.ed.). UFPE/CCB-2011-120.

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(6) Dedico este trabalho a minha família, a todos que torcem pelo meu sucesso e aos grandes mestres que encontrei pela minha caminhada..

(7) AGRADECIMENTOS. Agradeço aos meus pais que sempre me deram incentivo e confiança para os propósitos que traço para minha vida. A eles também agradeço, por serem os alicerces de minha vida e do meu caráter. Agradeço a minha irmã pela companhia e carinho. Agradeço também aos meus tios Armando, Sinalva, Malaquias, Cleonice e Vera Lúcia, que, depois de meus pais, são as minhas referências em minha família. Obrigado pelo amor e carinho. Agradeço também aos meus primos Armando Júnior, Mônica, Davi, e Amanda, por sempre me tratarem como irmão. Agradeço aos baianos que fazem parte de minha família; aos irmãos do peito: Frederico, Tiago, Rudson, Fabrício, Marjorie, Márcio, Carol, Lívia e Reynildo, obrigado por tornarem minha vida mais divertida e fraternal. Obrigado também a minha tia Eleny, que me adotou como filho mais velho e tem me ensinado sempre ver o lado bom das dificuldades. Agradeço a Pernambuco por me acolher, e por me dar a oportunidade de conhecer dois grandes mestres em minha vida até o momento: meu orientador Valdir Balbino, pelo exemplo de como exercer esta profissão sempre batalhando pelos seus alunos. Agradeço-o pela confiança, paciência, compreensão e principalmente amizade. E à Nara Freitas, grande exemplo de humanidade e companheirismo, agradeço pela acolhida maternal durante estes anos. Agradeço aos meus colegas Carlos e Marco pelo apoio na realização dos trabalhos. Agradeço-os também pelo companheirismo e amizade que, somados a todos integrantes de LABBE (Tiago, Marcus, Marcus Bahia, Grou, Narah, Lidiane, Nádia, Moisés, Fabão e Hercília), trouxeram-me companhia e divertimento. Agradeço aos meus amigos pernambucanos: Francisco, Viviane, Isabela, Raul, Magno, Wagner e Glória, que dividiram comigo estes anos com alegria e carinho. Agradeço em especial à Luciana Tosta pelo tempo em que dividimos o mesmo teto, agradeço o carinho e a amizade e agora a saudade. Agradeço aos membros do LGMH pelo apoio e amizade. Agradeço a FACEPE pela concessão de bolsa..

(8) "Afinal que é o homem dentro da natureza? Nada, em relação ao infinito; tudo, em relação ao nada; um ponto intermediário entre o tudo e o nada. Infinitamente incapaz de compreender os extremos, tanto o fim das coisas quanto o seu princípio permanecem ocultos num segredo impenetrável, e é-lhe igualmente impossível ver o nada de onde saiu e o infinito que o envolve. Que poderá fazer, portanto, senão perceber alguma aparência das coisas num eterno desespero e não poder conhecer nem seu princípio nem seu fim?" (Pascal)..

(9) RESUMO. Lutzomyia longipalpis, principal vetor da Leishmania infantum chagasi, apresenta um status taxonômico bastante controverso, sendo aventada a possibilidade que esta espécie represente, na verdade, um complexo de espécies crípticas. Diferenças genéticas entre as espécies irmãs podem implicar em diferenças nas suas respectivas capacidades vetoriais, a exemplo do que é observado no mosquito Anopheles gambie. Tornam-se então necessários, estudos que visem esclarecer o real status taxonômico desta espécie, aumentando o conhecimento acerca da capacidade vetorial deste organismo. Com a finalidade de refinar as inferências genéticas para as populações de Lutzomyia longipalpis baseados no fragmento de period, o presente estudo lançou mão de métodos probabilísticos e testes de atribuição foram utilizados (máxima verossimilhança e STRUCTURE) associados com as análises de variância molecular (AMOVA) e Fst. Este trabalho visou fornecer subsídios para ratificar a presença de espécies crípticas relacionadas às manchas dos tergitos abdominais dos machos de Lutzomyia longipalpis pertencentes à localidade de Sobral-CE, entretanto as demais populações de Lu. longipalpis não apresentou estruturação genética suficiente para que sejam atribuídas ao status de complexo de espécie.. Palavras-chave: Lutzomyia longipalpis; gene period; complexo de espécie críptica..

(10) ABSTRACT. Lutzomyia longipalpis, the main vector of Leishmania infantum chagasi, presents a taxonomic status rather controversial, and it‟s suggested the possibility that this species represents, in fact, a cryptic species complex. Genetic differences between species sisters may imply differences in their respective vectorial skills, the example of what is observed in the mosquito Anopheles Gambie. It‟s becomes necessary studies aimed clarifying the actual taxonomic status of this species, increasing knowledge about the vectorial capacity of this organism. In order to refine genetic inferences for Lutzomyia longipalpis populations based in period fragment, this study made use of probabilistic methods and assignment tests were used (maximum likelihood and STRUCTURE), associated with the analysis of molecular variance (AMOVA) and Fst. This work aimed to provide subsidies to ratify the presence of cryptic species related to abdominal tergites patches among males of Lutzomyia longipalpis belonged to Sobral-CE. However, the remaining populations of Lu. Longipalpis showed no genetic organization enough to be awarded the status of complex species. Key words: Lutzomyia longipalpis; period gene; cryptics species complex..

(11) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1. Fêmea de flebotomíneo.. 4. Figura 2. Ovos de flebotomíneos.. 5. Figura 3. Larvas de flebotomíneos (A), pupas de flebotomíneos (B).. 6. Figura 4. Forma Promastigota (A) e forma amastigota de Leishmania (B).. 7. Figura 5. Distribuição da leishmaniose visceral no Mundo.. 8. Figura 6. Cerâmicas. do. período. colonial. do. Peru. demonstrando. a. leishmaniose tegumentar.. 8. Figura 7. Distribuição da leishmaniose tegumentar no Mundo.. 9. Figura 8. Macho (A) e fêmea (B) de Lutzomyia longipalpis.. 10. Figura 9. Macho de Lutzomyia longipalpis. (A) macho com uma mancha; (B) macho com duas manchas abdominais.. Figura 10. 11. Resumo das informações disponíveis para os sons copulatórios e dos tipos de feromônio de 14 Lu. longipalpis em diferentes populações do Brasil.. 12. Figura 11. Regulação do gene period.. 15. Figura 12. Localidades e número de haplótipos que foram utilizados nas duas primeiras análises in silico de Lu. Longipalpis.. Figura 13. Logos de sequências de period indicando os sítios polimórficos de Lu. longipalpis nas populações de Sobral, Jaíba e Estrela de Alagoas.. Figura 14. Árvore de máxima verossimilhança observada para a população de Sobral-CE.. Figura 15. 25. Árvore de máxima verossimilhança observada para a população de Estrela-AL.. Figura 17. 23. Árvore de máxima verossimilhança observada para a população de Jaíba-MG.. Figura 16. 22. 26. Árvore de máxima verossimilhança para as populações de Lu. 28.

(12) whitmani e Lu. intermedia. Figura 18. Árvore de máxima verossimilhança para as populações de Lu. 29. longipalpis e Lu. cruzi. Figura 19. Elaboração da sequência consenso formado pelos primers forward e 30 reverso.. Figura 20. Imagem do programa MEGA 4.0. Mostrando símbolos da IUPAC 30. incorporados no alinhamento. Figura 21. Árvore de máxima verossimilhança observada para a população de 31. Sobral-CE aferida com o fragmento de 400 pares de bases. Figura 22. Estrutura. da. população. de. Lu.. Longipalpis,. pelo. método 32. STRUCTURE da cidade de Sobral-CE. Figura 23. Estrutura. da. população. de. Lu.. Longipalpis,. pelo. método 33. STRUCTURE da cidade de Jaíba-MG. Figura 24. Estrutura. da. população. de. Lu.. Longipalpis,. pelo. método 34. STRUCTURE da cidade de Estrela-AL. Figura 25. Estrutura da população pelo método STRUCTURE de Longipalpis. com. todas. populações. referidas. por. Araki. Lu. e. colaboradores (2009). Figura 26. Estrutura da população Lu. whitmani e Lu. intermedia, pelo método STRUCTURE.. Figura 27. 36. Árvore de UPGMA, baseada nos valores de Fst das populações de Lu. longipalpis, Lu. cruzi, Lu. whitmani e Lu. intermedia.. Figura 29. 35. Estrutura das populações de Lu. longipalpis e Lu. cruzi pelo método STRUCTURE .. Figura 28. 34. 39. Gel de agarose a 1%. Amplificação do marcador period com aproximadamente 540 pares de bases (ANEXO A).. 58.

(13) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Valores de Fst par-a-par para as populações de Lu. longipalpis, Lu. cruzi, Lu. whitmani e Lu. intermedia.. 38.

(14) LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS. Sigla 1S. Definição Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com uma mancha no tergito abdominal.. 2S. Fenótipo de Lutzomyia longipalpis com duas manchas no tergito abdominal.. AMOVA. Análise de variância molecular.. Fst. Índice de Fixação.. G. Distribuição Gama.. GTR. Modelo Evolutivo General Time Reversible.. HKY. Modelo Evolutivo Hasegawa-Kishino-Yano.. I. Proporção de sítios invariáveis.. K. Número de populações utilizado no STRUCTURE.. LV. Leishmaniose Visceral.. LVA. Leishmaniose Visceral Americana.. mm. Milímetros.. pb. Pares de base.. per. Gene period.. Thr-Gly. Região repetitiva dos aminoácidos treonina e glicina.. TIM. Proteína Timeless.. TrN. Modelo Evolutivo Tamura e Nei.. WHO/OMS. Organização Mundial de Saúde.. IUPAC. União Internacional de Química Pura e Aplicada..

(15) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO. 1. 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Flebotomíneos. 3. 2.2 Leishmanioses. 6. 2.3 Lutzomyia longipalpis. 9. 2.4 Complexo de espécies crípticas e implicações epidemiológicas. 13. 2.5 Gene Period. 14. 2.6 Métodos utilizados para inferência de complexo de espécies e. 17. estruturação genética de populações 3. OBJETIVOS. 18. 4. MATERIAL E MÉTODOS. 19. 5. RESULTADOS. 22. 6. DISCUSSÃO. 40. 7. CONCLUSÕES. 44. 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 45. 9. ANEXOS. 62. 10. MEMORIAL. 62.

(16) 1. INTRODUÇÃO Lutzomyia. longipalpis. (Lutz. &. Neiva,. 1912). (Diptera:. Psychodidae:. Phlebotominae) é o principal vetor da leishmaniose visceral americana, que possui como agente etiológico a Leishmania infantum chagasi. Este inseto possui distribuição descontínua no Novo Mundo, sendo encontrado desde o sul do México até o norte da Argentina, e habita principalmente áreas de semi-árido, floresta tropical seca, áreas de restinga, bem como regiões da bacia Amazônica em que os solos são bastante drenados e expostos a inundações sazonais. Em adição às barreiras geoclimáticas, capacidade de vôo reduzida proporciona o estabelecimento de diferenças eco-etológicas entre as populações de Lu. longipalpis que podem se refletir na transmissão da leishmaniose visceral. Observando as diferenças morfológicas dentro deste mesmo táxon, Mangabeira em 1969 sugeriu que Lu. longipalpis compreende um complexo de espécies irmãs, e após trinta e nove anos de trabalhos realizados com o táxon, ainda existem controvérsias quanto ao aspecto taxonômico do complexo longipalpis. Em 2001, Lutzomyia pseudolongipalpis foi descrita como uma espécie do complexo longipalpis e parece ser endêmica da Venezuela, sua descrição foi baseada em análises diversificadas envolvendo morfologia, etologia e biologia molecular. Para o Brasil evidências apontam para a existência de um complexo de espécie, considerando feromônios, sons copulatórios e marcadores genéticos de especiação como o gene period. O gene period é classificado como gene de especiação, pois a proteína que ele codifica exerce um controle importante no ritmo circadiano e já foi demonstrado que mutações em period estão relacionadas com eventos de especiação, principalmente entre os drosofilídeos. A utilização do gene period como marcador para inferências evolutivas tem sido amplo na literatura, pois, este gene está presente na maioria dos organismos pluricelulares, e sua utilização para elucidar os fenômenos evolutivos que cercam as populações brasileiras de Lutzomyia longipalpis estão disponíveis na literatura desde 2002. Entretanto, o fragmento de period disponível na literatura para Lutzomyia longipalpis possui apenas 266 pares de base e a partir deste fragmento associado principalmente a métodos de distância genética e índice de fixação (Fst) tem se inferido a 1.

(17) respeito da existência de espécies crípticas para as populações brasileiras deste vetor. Tais análises estão susceptíveis a um viés, haja vista, o tamanho e a variabilidade do fragmento analisado. Portanto, quando o fragmento de DNA possuir pouca informação filogenética, se faz necessário o uso de diferentes algoritmos para validarem hipóteses a cerca dos processos evolutivos que os táxons estão submetidos.. 2.

(18) 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 Flebotomíneos Os flebotomíneos são dípteros de pequeno porte pertencentes à subordem Nematocera, família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, que surgiram no Cretáceo Inferior. Esta subfamília é composta por seis gêneros, três dos quais são característicos do Velho Mundo [Phlebotomus, Sergentomyia e Chinius] e três são encontrados exclusivamente no Novo Mundo [Warileyia, Brumptomyia e Lutzomyia] (Young e Duncan, 1994). Uma vez que ainda não foram identificados vestígios fósseis demonstrando a ocorrência simultânea de algum destes gêneros no Velho e no Novo Mundo, acredita-se que a divergência entre eles tenha ocorrido a dezenas de milhões de anos (Lewis, 1982). A subfamília Phlebotominae engloba dípteros de importância no âmbito da saúde pública, pois é notória a presença de espécies vetoras de agentes etiológicos causadores de diversas patologias, tais como: arboviroses; bartoneloses e leishmanioses (Forattini 1973). Das cerca de 900 espécies descritas no mundo, estima-se que pelo menos 50 sejam possíveis vetores de patógenos relacionados à transmissão das leishmanioses (Rangel & Lainson, 2003, Kamhawi, 2006). O ciclo biológico dos flebotomíneos tem duração de 30 a 90 dias, de acordo com as condições ambientais observadas (Brazil et al., 2003). As suas formas adultas apresentam dimensões reduzidas (2 a 3 mm), exibem o corpo e as asas densamente cobertos por cerdas e possuem antenas compostas por 16 segmentos (Marzochi, 1992). Os flebotomíneos apresentam vôos curtos e baixos, conferindo-lhes um comportamento peculiarmente saltitante dentro de um raio de dispersão não superior a 200 metros (Alexander e Young, 1992),eles possuem hábitos crepusculares e noturnos, apesar de algumas espécies também se alimentarem durante o dia, conforme já foi observado em Lu. umbratillis na região amazônica (Lainson et al. 1994). Os flebotomíneos são encontrados em ecótopos naturais, tais como troncos de árvores, tocas de animais, folhas caídas no solo, frestas em rochas e em cavernas (Brazil et al., 2003, Azevedo et al., 1993). Algumas espécies são também encontradas em ambientes rurais e urbanos, que se caracterizam pela presença de abrigos de animais domésticos e habitações humanas, sugerindo que estes organismos se encontram em processo de adaptação às áreas antropicamente modificadas (Tolezano et al., 2001).. 3.

(19) Modificações. abruptas. nos. ecossistemas. têm. modificado. características. ecológicas de várias espécies de flebotomíneos e de reservatórios, interferindo diretamente na dinâmica de transmissão das leishmanioses. Este novo cenário emerge dos desmatamentos, a partir dos quais alguns hospedeiros do parasita podem adentrar espaços habitados pelo homem, onde eventualmente são encontrados flebotomíneos adaptados ao ambiente domiciliar. De hábitos alimentares bastante diversificados, tornam-se aptos a transmitir o parasita entre humanos e mamíferos domésticos com relativa facilidade (Costa et al., 2007). Geralmente notívagos, somente as fêmeas dos flebotomíneos (Figura 1) são hematófagas. Algumas espécies apresentam uma notável especificidade alimentar, no que se refere à obtenção de fontes de repastos sanguíneos, enquanto que outras são extremamente promíscuas, alimentando-se numa gama considerável de espécies de vertebrados (Morrison et al., 1993).. Figura. 1:. Fêmea. adulta. de. flebotomíneo.. Fonte:. OMS. (http://apps.who.int/tdr/publications/tdr-image-library). Acesso em 21/01/2011.. A saliva constitui elemento crítico na hematofagia das fêmeas dos flebotomíneos, uma vez que afeta as respostas hemostáticas, inflamatórias e imunológicas dos hospedeiros. Em geral, sabe-se que a saliva dos insetos hematófagos apresenta, pelo menos, uma substância antiplaquetária, uma anticoagulante e uma substância vasodilatadora que, em conjunto, propiciam um ambiente favorável à obtenção de sangue e ao parasitismo (Andrade et al., 2005). O sangue exerce importantes funções na maturação dos ovos (Figura 2) em que estes se tornam viáveis e são ovopositados entre três a oito dias após o repasto (Marcondes, 2001). Entretanto, em estudo realizado com Ph. papatasi, Tesh e Guzman 4.

(20) (1996) demonstraram que mesmo sem repasto sanguíneo as fêmeas são capazes de ovopositar apenas com dieta alimentar baseadas em carboidratos. Existem ainda fatores intrínsecos à capacidade vetorial dos flebotomíneos, que se comportam como espécie-específicos e desta forma, observa-se que a maioria das espécies de flebotomíneos parece ser refratária ao desenvolvimento de Leishmania (Sacks e Kamhawi, 2001). Andrade e colaboradores (2002) realizaram um estudo para investigar a transmissão vertical de leishmaniose visceral canina através de fêmeas gestantes, onde não foi possível identificar a presença do parasito nos seus descendentes, tornando-se inconclusivo comprovar a possibilidade da transmissão vertical.. Figura. 2:. Ovos. de. flebotomíneo.. (Fonte. http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/flies/Lutzomyia_shannoni01.htm). Acesso em 21/01/2011.. A ovoposição dos flebotomíneos geralmente ocorre em locais úmidos e sombreados, onde é encontrada grande quantidade de. matéria orgânica em. decomposição (Forattini, 1973). A eclosão ocorre cerca de 10 dias após a sua deposição, sendo que ovos de uma mesma postura podem apresentar períodos de incubação consideravelmente mais longos. Existem evidências mostrando que os ovos de algumas espécies podem atravessar longos períodos de quiescência, fenômeno geralmente observado nos casos onde as condições ambientais não se mostram favoráveis à eclosão (Young & Duncan, 1994). As larvas (Figura 3A) são pequenas (< 1,2 mm) e vermiformes, caracterizando-se pela presença de uma cápsula cefálica esclerotizada e de pequenas cerdas ao longo de toda a sua extensão. As larvas de primeiro estágio exibem duas cerdas longas na parte 5.

(21) posterior do corpo, enquanto que nos demais estágios, o número observado de cerdas é quatro (Marcondes, 2001). O desenvolvimento larval ocorre em microhábitats terrestres, situados em fendas de rochas, base de troncos de árvores e tocas de animais, ambientes onde se alimentam avidamente da matéria orgânica em decomposição ali encontrada (Ferro et al., 1997). Antes de se transformarem em pupas, as larvas param de se alimentar e procuram abrigos menos úmidos, onde se prendem a um objeto. A fase de pupa (Figura 3B) dura de sete a 12 dias, havendo uma tendência para que a emergência dos machos ocorra mais precocemente (Young e Duncan, 1994).. Figura 3A: Larvas de flebotomíneos. Figura 3B: Pupas de flebotomíneos (Fonte: OMS http://apps.who.int/tdr/publications/tdr-image-library). Acesso em 21/01/2011.. 2.2 Leishmanioses Leishmanioses são zoonoses que resultam do parasitismo dos hospedeiros vertebrados por protozoários do gênero Leishmania (Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae), apresentando vasta distribuição geográfica nas regiões tropicais e subtropicais do globo terrestre (WHO, 2008). As leishmanias apresentam formas diversas durante o seu ciclo biológico envolvendo formas distintas de desenvolvimento (Figura 4). Estas formas representam uma adaptação às mudanças nas condições ambientais encontradas pelos parasitas nos hospedeiros vertebrados e dos insetos vetores (Besteiro et al., 2007). Nos flebotomíneos, as leishmanias são células flageladas móveis (promastigotas – 4A) que se replicam no meio extracelular e residem no trato alimentar do inseto. Nos hospedeiros vertebrados, por sua vez, as leishmanias assumem uma forma aflagelada e passam a ser denominadas de amastigotas (Figura 4B).. 6.

(22) (A). (B). Figura 4: Formas de Leishmania. (a) Forma promastigota (tubo digestivo e glândula salivar do vetor). (b) Forma amastigota (em macrófragos de fígado do hospedeiro) (Fonte: Vigar Zaman, 1979).. As leishmanioses são endêmicas em pelo menos 88 países, estando distribuídas em todos os continentes (exceto a Oceania e a Antártida), nos quais acometem cerca de 12 milhões de pessoas. Decorrentes das manifestações clínicas, as leishmanioses dividem-se em dois tipos principais: tegumentar e visceral. A multiplicidade das espécies de Leishmania, as particularidades das situações epidemiológicas dos hospedeiros reservatórios e de vetores envolvidos, bem como a pluralidade das formas clínicas, e sua ampla distribuição, permitem distinguir vários tipos nosogeográficos de leishmanioses. A leishmaniose visceral (LV) tem como principais agentes etiológicos a Le. infantum e Le. donovani no Velho Mundo e Le. infantum chagasi, no Novo Mundo (Lainson et al., 1987). A LV constitui um sério problema de saúde pública em decorrência de sua alta incidência e letalidade nas Américas, Europa, África e Ásia (Figura 5). Especificamente no continente americano, estende-se desde o México até a Argentina, sendo que cerca de 90% dos casos diagnosticados em humanos são provenientes do Brasil (Monteiro et.al., 2005). Já a leishmaniose tegumentar é considerada uma doença autóctone do continente Americano, uma vez que artífices pré-colombianos já reproduziam em peças de cerâmicas, figuras humanas com aspectos que remetem este estado patológico (Figuras 6A e 6B; León e León, 1976, Apud Fiocruz,1997).. 7.

(23) Figura 5: Distribuição da leishmaniose visceral no mundo. As regiões em vermelho indicam as áreas hiperendêmicas de leishmaniose visceral (Fonte: Organização Mundial de Saúde em http://www.who.ch/tdr). Acesso em 21/11/2011.. (A). (B). Figura 6: A e B: cerâmicas do período colonial do Peru que provavelmente retratam manifestações. da. leishmaniose. tegumentar.. http://www.dbbm.fiocruz.br/tropical/leishman/leishext/html/hist_rico.htm).. (Fonte: Acesso. em. 21/01/2011.. A leishmaniose tegumentar apresenta quatro variantes clinicamente distintas: leishmaniose cutânea, que apresenta 90% da sua representatividade em países como Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, República Árabe da Síria, Brasil e Peru (Figura 7, WHO, 2007); leishmaniose muco-cutânea; leishmaniose cutâneo-difusa; e leishmaniose dermal pós-calazar (Piscopo e Mallia, 2006). A leishmaniose tegumentar encontra-se no grupo das endemias de grande porte, com forte impacto na saúde pública do Brasil devido a sua extensa distribuição pelo território Nacional e a ocorrência de formas clínicas graves, associado à dificuldade no diagnóstico e tratamento (Monteiro et al., 2005).. 8.

(24) Figura 7: Distribuição das leishmanioses cutâneas no mundo. As regiões em vermelho indicam as áreas hiperendêmicas de leishmaniose cutânea (Fonte: Organização Mundial de Saúde em http://www.who.ch/tdr). Acesso em 21/01/2011.. 2.3 Lutzomyia longipalpis Lutzomyia longipalpis é considerado o mais importante vetor da Leishmaniose Visceral Americana (LVA) na América Latina. Embora estudos já sinalizassem uma estreita associação entre Lu. longipalpis com locais de ocorrência comum de LVA, o status de vetor comprovado desta endemia somente foi atribuído por Lainson e colaboradores em 1977. A espécie foi inicialmente descrita por Lutz & Neiva (1912) a partir da análise de insetos capturados nos estados de São Paulo e Minas Gerais. Segundo as descrições de Young e Duncan (1994), os machos de Lu. longipalpis apresentam como parâmetros descritivos cerdas dorsais curvas e tubérculos bem desenvolvidos. As fêmeas, por sua vez, apresentam espermatecas menores e comprimento cerca de quatro vezes maior do que sua largura (Figura 8). Sua ampla distribuição, associada ao considerável número de barreiras geográficas naturais entre suas subpopulações, podem determinar o surgimento de diferenças fenotípicas neste díptero (Soares e Turco, 2003).. 9.

(25) (A). (B). Figura 8: Dimorfismo sexual em Lutzomyia longipalpis: macho (A) e fêmea (B).(Fonte:http://www.fiocruz.br/ioc/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?infoid=433&sid=32 ). Acesso em 21/01/2011.. Dados mais recentes acerca da morfologia desta espécie têm sido relatados, tais como: espiráculos posteriores (Pessoa et al., 2000) e estruturas sensoriais externas (Pessoa et al., 2001), observadas inclusive em larvas de quarto estágio. Algumas outras estruturas anteriormente referidas por Fausto e colaboradores (1998) não evidenciaram variações intraespecíficas entre populações brasileiras de Lu. longipalpis, diferente do que foi descrito em populações da Venezuela (Pessoa et al., 2001). Machos de Lu. longipalpis (Figura 9) apresentam dois morfotipos atribuídos às manchas nos tergitos abdominais, denominado fenótipos de uma (1S) ou duas (2S) manchas tergitais. Exemplares coletados no município de Sobral, Ceará, com duas manchas abdominais no terceiro e quarto tergitos, e machos coletados no Pará, com uma mancha abdominal, foram as primeiras evidências que serviram para associar os padrões de manchas abdominais encontrados nos machos de Lu. longipalpis à possibilidade do mesmo pertencer a um complexo de espécies crípticas (Mangabeira, 1969). Desde então, vários estudos foram realizados com o objetivo de elucidar o real status taxonômico de Lu. longipalpis. Segundo Ward e colaboradores (1985), o fenótipo de Lu. longipalpis 1S é encontrado desde o México até o sul do Brasil. Já a variação fenotípica 2S está distribuída desde o Maranhão até Minas Gerais e também na região fronteiriça do Brasil com o Paraguai. A simpatria entre as duas formas ocorre, sobretudo, no leste do Brasil (eg. Sobral-CE), entretanto, a alopatria de ambos morfotipos é observada em algumas localidades brasileiras (eg. 1S em Itaeté-BA e 2S em São Luiz-MA).. 10.

(26) (a). (b). Figura 9: Macho de Lutzomyia longipalpis. (a) Macho com uma mancha; (b) Macho com duas manchas abdominais.. Estudos de microscopia eletrônica revelaram que as manchas observadas por Mangabeira (1969) eram compostas por glândulas secretoras de feromônios sexuais (Lane e Ward, 1984). Neste contexto, foram determinados os perfis de feromônios de cinco populações brasileiras, uma da Colômbia e uma da Venezuela. Com base nestes resultados, Hamilton e Ward (1991) propuseram a existência de, no mínimo, seis populações geográficas de Lu. longipalpis na Região Neotropical, que secretam pelo menos três grupos quimicamente distintos de feromônios. Entretanto, não se observou uma relação direta entre o número de manchas tergais e o tipo de feromônio produzido (Soares e Turco, 2003). A existência de um complexo Lu. longipalpis também foi sugerida ao se estudar amostras das Américas Central e do Sul, através de marcadores genéticos mitocondriais e nucleares, assim como pela análise de perfis de isoenzimas (Lanzaro et al., 1993; Warburg et al., 1994; Morrison et al., 1995; Dujardin et al., 1997; Lanzaro et al., 1999; 1999; Yin et al., 1999; 2000; Soto et al., 2001; Arrivillaga et al., 2002; 2003; Watts et al., 2005). Baseando-se em caracteres morfológicos, etológicos e genéticos em populações venezuelanas deste flebotomíneo, Arrivillaga e Feliciangeli (2001) reconheceram Lu. pseudolongipalpis como a primeira espécie críptica deste complexo. Outros autores também encontraram evidências de um complexo de espécies para as populações brasileiras de Lu. longipalpis associadas aos padrões de manchas abdominais, aos sons copulatórios, feromônios e marcadores genéticos nucleares relacionados a genes de comportamento (Ward et al., 1983; 1988; Yin et al., 1999; Souza et al., 2002; 2004;. 11.

(27) Bauzer et al., 2002a; b; Maingon et al., 2003; Bottecchia et al., 2004; Hamilton et al., 2004a; 2005b; Watts et al., 2005). Araki e colaboradores (2009) sugeriram através de análises concatenadas do gene period, de sons de cópula e de tipos de feromônios a existência no Brasil de dois grandes grupos de populações de Lu. longipalpis. Um deles representaria uma única espécie, na qual machos emitiriam sons copulatórios Burst do tipo-1 e feromônios do tipo cembreno, estando distribuído ao longo das regiões costeiras do Norte e Nordeste, chegando a atingir a região Sudeste. O segundo grupo de espécies incipientes, mais heterogêneo do que o anterior, produziriam diferentes padrões de sons pulsados e de feromônios, representando pelo menos cinco prováveis espécies com distintos níveis de divergência genética entre si, suscitando relevantes consequências no âmbito epidemiológico deste incipiente processo de especiação (Figura 10).. Figura 10. Resumo das informações disponíveis para os sons copulatórios e dos tipos de feromônio de 14 Lutzomyia longipalpis em diferentes populações do Brasil (Araki et al., 2009).. Em estudos mais recentes, foi sugerido que Lu. cruzi (Mangabeira, 1938) também deve ser reconhecida como uma das espécies crípticas do complexo longipalpis (Vigoder et al., 2010). Com a descrição das espécies pertencentes ao complexo, é possível inferir, até o momento, que os fenômenos de alopatria e simpatria podem ser observados somente entre as espécies Lu. pseudolongipalpis e Lu. longipalpis sensu latu. 12.

(28) Entretanto, Azevedo e colaboradores (2000), em um estudo envolvendo análise morfométrica e de locos isozímicos com populações brasileiras de Lu. longipalpis, sugeriram a existência de um elevado polimorfismo intra-populacional que não necessariamente justificaria a ocorrência de um complexo de espécies. Em concordância diversos autores consideram essas populações, distintamente separadas no Brasil, como espécie única (Mukhopadhyay et al., 1997; 1998a; b; Mutebi et al., 1999; Arrivillaga et al., 2003, Balbino et al., 2006).. 2.4 Complexo de espécies crípticas e implicações epidemiológicas Espécies crípticas são definidas como organismos que não são diferenciados através da taxonomia tradicional e podem ser dados por “iguais” até mesmo por taxonomistas especializados (Araki et al., 2009). O correto reconhecimento do status taxonômico das espécies que compõem um complexo tem implicações práticas para conservação e manejo na identificação de importantes espécies do ponto de vista econômico e medicinal (Bickford et al., 2007). Dados obtidos a partir do sequenciamento de DNA ganharam grande popularidade em estudos taxonômicos. Seus resultados são reconhecidos por fornecerem indícios importantes para a delimitação de espécies (Vogler & Monghan, 2007; Meier, 2008), uma vez que podem ser produzidos em um ritmo muito rápido e sem a necessidade de pesquisadores especializados em taxonomia (Lee, 2000; Scotland et al., 2003; Vogler & Monaghan, 2007). No entanto, a utilização generalizada de dados obtidos a partir deste método tem gerado um grande problema: o desenfreado número de proposições de novas espécies crípticas, mesmo a partir de dados ainda incipientes (Tan et al., 2009). Em entomologia, a maioria das espécies é reconhecida com base em suas características morfológicas. Entretanto, a utilização exclusiva destes aspectos para algumas espécies pode gerar conflitos devido à notável variabilidade fenotípica observada em algumas famílias. No caso específico da família Sepsidae (Diptera), por exemplo, onde a maior parte desta diversidade está relacionada a fatores ambientais (Meier, 1995), o uso de sequências de DNA se mostra particularmente útil no esclarecimento das fronteiras naturais entre as espécies (Tan et al., 2009). Em outros casos, a variabilidade intraespecífica de membros desta família é, pelo menos parcialmente, geneticamente determinada (Reusch e Blanckenhorn, 1998). Neste caso, sequências de DNA podem 13.

(29) ainda ser utilizadas como provas adicionais, mesmo que se leve em consideração que a variabilidade observada em sequências de populações alopátricas pode se tornar de difícil interpretação (Petersen et al., 2007; Ang et al., 2008). Espécies diferentes podem vir a compartilhar. uma. mesma. assinatura. genética. específica,. sendo. erroneamente. enquadradas como uma única espécie (Meier et al., 2006; 2008). Da mesma forma, populações alopátricas de espécies diferentes podem exibir padrões de sequências distintos e evidências de DNA podem, equivocadamente, sugerir que deveriam ser divididas em várias espécies. (Meier, 2008; Meier et.al., 2008). Tan e colaboradores (2009) sugerem que a avaliação de espécies crípticas seja realizada de maneira multidisciplinar, em que dados morfológicos, etológicos e genéticos possam ser concatenados para o entendimento do status taxonômico de complexo de espécies. Resolver os conflitos taxonômicos de espécies de insetos vetores é importante para a compreensão de seu papel na transmissão de doenças. Assim, a correta identificação destes insetos evita possíveis confusões no reconhecimento das espécies vetoras e não vetoras (Marcondes, 1998). Um exemplo clássico de complexo de espécies em insetos vetores é representado pelo complexo Anopheles gambiae, constituído por sete espécies crípticas. Das espécies que o compõem, apenas An. gambiae s.s. e An. arabiensis são consideradas importantes vetores de Plasmodium no continente africano (White, 1974). Este aspecto correlaciona-se a diferenças na determinação de preferências por hospedeiros específicos e de outras características biológicas que, em conjunto, implicam em diferentes capacidades vetoriais (Ayala et al., 2006).. 2.5 Gene period Segundo Hall (2003), o gene period (per) de Drosophila controla uma série de ritmos biológicos, sendo que o mais proeminente e mais bem estudado é o ciclo circadiano do comportamento que condiciona o organismo para as diferentes mudanças fisiológicas, mediante a modulação de reações enzimáticas especificas (Shirasu et al., 2003). Este gene, inicialmente descrito por Konopka & Benzer (1971), teve a sua expressão detectada na maioria dos tecidos e em todos os estágios do desenvolvimento em D. melanogaster (Liu et al., 1988). A proteína codificada pelo gene period é um autorregulador do seu próprio gene, além de regular o gene timeless (TIM), estando ambas associadas ao ciclo de feedback negativo (Figura 11), que é central para a determinação da ritmicidade circadiana (Hall, 14.

(30) 2003). O gene period codifica uma proteína de aproximadamente 1200 aminoácidos (Citri et al., 1987), apresentando duas regiões de grande importância: o domínio PAS, que corresponde ao domínio de dimerização localizado em uma região conservada (Hoffman et al., 1991 e Colot et al,. 1988); e uma região não conservada, que apresenta repetições dos aminoácidos treonina e glicina, conhecida como região Thr-Gly (Colot et al., 1988).. Figura 11. Regulação do gene period (Fonte: Rosato et al., 2006).. A repetição Thr-Gly forneceu um sistema modelo útil para estudar as propriedades de mutação do minissatélite subjacente a esta região e, como geralmente observado em regiões repetitivas, é altamente polimórfica, em termos tanto de variação nucleotídica quanto do tamanho da sequência (Costa et al.,1991). Acredita-se que esta repetição de aminoácidos esteja envolvida na termoestabilidade do fenótipo circadiano, uma vez que mutantes em que per foi retirado se tornaram arrítmicos e sensíveis à variação de temperatura (Peixoto et al., 1993). A taxa de mutação e comprimento da repetição para o gene period dentro de D. melanogaster foram estimadas experimentalmente e, como esperado, foram várias ordens de grandeza maior do que a taxa de substituição de nucleotídeos da maioria dos genes nucleares (Rosato et al., 1996; 1997). Não surpreendentemente, observa-se uma enorme variação interespecífica na extensão desta sequência entre diferentes espécies de dípteros. Nos drosofilídeos, por exemplo, existe uma dramática expansão que ocorreu 15.

(31) com D. pseudoobscura, que consiste de um repetitivo motivo modificado em pentapeptídeo que tem mais de 30 cópias em comparação a D. virilis (Peixoto et al., 1992, 1993; Nielsen et al., 1994). Em D. melanogaster, essas repetições possuem tamanho intermediário e codificam entre 14 e 24 pares de dipeptídeos Thr-Gly ininterruptos (Sawyer et al., 1997). Estudos funcionais da região Thr-Gly revelaram que a repetição e o seu entorno codificam padrões específicos do comportamento rítmico e em alguns elementos do padrão circadiano de atividade locomotora bem como no ciclo de música de corte do macho entre as espécies D. melanogaster e D. simulans (Wheeler et al., 1991; Rogers et al., 2004). Segundo Sawyer e colaboradores (1997), a compensação de temperatura relacionada ao ciclo circadiano, ou seja, a forma como o período de 24 horas é protegido contra mudanças de temperatura, é diferente entre as variantes Thr-Gly. Em 1997, Sun e colaboradores isolaram o gene rigui em roedores, que apresentou cerca de 40% de similaridade com o gene period de D. melanogaster, sendo este o primeiro registro deste homólogo em mamíferos. Estudos posteriores revelaram a existência de uma família de genes period em vertebrados, constituída por mais dois genes parálogos e um pseudogene (Albrecht et al., 1997; Shearman et al., 1997; Takumi et al., 1998a; Takumi et al., 1998b; Zylka et al., 1998; Clayton et al., 2001; Gotter & Reppert 2001). Desde a identificação da família de genes period em cordados, várias hipóteses foram deflagradas a respeito da filogenia deste gene nos vertebrados. A mais recente admite que a ocorrência de duas duplicações genômicas que dirigiram a emergência dos primeiros vertebrados dos agnatas (Schantz et al., 2005). Trabalhos de filogenia envolvendo o gene period em vários níveis taxonômicos (populações, espécies, gêneros, subgêneros e famílias) foram realizados e atestaram a sua eficiência como marcador para estudos evolutivos (Nielsen et al., 1994; Reigeir et al., 1998; Gotter et al., 1999; Barr et al., 2005). Entretanto, Zheng e colaboradores (1999) questionaram a utilidade deste marcador em D. nasuta utilizando algoritmos baseados em distância genética, sugerindo cautela na escolha dos algoritmos que serão empregados nos trabalhos com o gene per. Para o gênero Lutzomyia, este marcador tem sido amplamente utilizado desde o seu isolamento em 1992 por Peixoto e colaboradores. Porém, os trabalhos que fizeram inferências evolutivas baseados neste marcador utilizaram métodos de distância para construir árvores filogenéticas. Estes trabalhos abordaram temas evolutivos como introgressão gênica e especiação críptica (Mazzoni, et al., 2006; Bauzer et al., 2002a, 16.

(32) 2002b; Araki et al., 2009). Nos trabalhos envolvendo genética de populações e filogenia de Lu. longipalpis baseados em per, apenas uma região com 266 pares de bases deste marcador foi utilizada. Este fragmento, que inclui um íntron de 54 pares de bases, localiza-se entre o domínio PAS e a região Thr-Gly, englobando quase que completamente o domínio de localização citoplasmática (CLD) do gene period (Bauzer et al., 2002a).. 2.6 Métodos utilizados para inferência de complexo de espécies e estruturação genética de populações. O método da máxima verossimilhança (Maximum-likelihood – ML), elaborado por Felsenstein (1981), é baseado em modelos probabilísticos de evolução, podendo levar em consideração parâmetros obtidos através de um modelo evolutivo, tais como a taxa de mutação entre sequências de DNA e a sua frequência de pares de bases (Nei & Kumar, 2000). Esta metodologia já foi utilizada em estudos que visavam à determinação do status taxonômico. de. insetos. vetores,. como. no. caso. do. complexo. de. Anopheles. (Nyssorhynchus) albitarsis (Lehr, 2005). Outros estudos também se valeram das topologias de máxima verossimilhança na tentativa de elucidar o caráter ambíguo das espécies crípticas (Wilkerson et al., 2005; Passamonti et al., 2004). Entretanto, árvores baseadas em máxima verossimilhança ainda não foram utilizadas em análises de populações de Lu. longipalpis. Os algoritmos de agrupamento de dados genéticos tornaram-se uma ferramenta importante em campos da biologia, incluindo a conservação e genética populacional (Dawson e Belkhir, 2001; Corander e Marttinen, 2003; Purcell & Sham 2004; 2006; Francois et al., 2006; Patterson et al., 2006). Tais métodos são muitas vezes utilizados para compreender a estrutura das populações, bem como para identificar indivíduos migrantes ou híbridos, como também são usados para detectar a estrutura populacional críptica (Hubisz et al., 2009). O STRUCTURE é um algoritmo bayesiano baseado em um modelo que é amplamente utilizado para o agrupamento de dados genéticos (Pritchard et al., 2000.; Falush et al., 2003; Falush et al., 2007). Dado o número de clusters (K) e assumindo o equilíbrio de Hardy-Weinberg e a articulação do equilíbrio dentro de grupos, este algoritmo estima as frequências dos alelos em cada grupo e as associações das populações para cada indivíduo. Ele usa o método Monte Carlo via Cadeia de Markov 17.

(33) (MCMC) para integrar um conjunto de parâmetros e fazer atribuições de agrupamento. Embora o valor de K tenha que ser fornecido para o algoritmo, um método heurístico de seleção K é frequentemente utilizado, baseando-se na comparação de probabilidades (Hubisz et al., 2009). Apesar de ainda não ter sido empregado para o estudo de populações de Lu. longipalpis, o algoritmo STRUCTURE é largamente utilizado com o objetivo de esclarecer a problemática taxonômica em espécies crípticas. Boyd (2007) aplicou esta metodologia com o intuito de determinar a composição dos membros do complexo de Anopheles annulipes em populações de Townsville, Nordeste da Austrália, revelando a existência de quatro grupos populacionais vivendo em simpatria; outro exemplo consistiu no emprego do ∆k (ad hoc) na estruturação do complexo Culex pipiens, que apontou a existência de três grupos definidos (Fonseca et al., 2004). A Análise de Variância Molecular (AMOVA) é um método para estimar a diferenciação populacional a partir de dados moleculares e teste de hipóteses sobre a mesma diferenciação (Excoffier et al., 1992). Tradicionalmente, metodologias como AMOVA e índice de fixação (Fst) pareado têm se mostrado eficientes no estudo da diversidade entre populações a partir de dados moleculares (Holsinger e Weir, 2009). Através destes testes, Mazzoni e colaboradores (2006) levantaram a hipótese de uma possível introgressão entre Lu. intermedia e Lu. whitmani. Vigoder e colaboradores (2010), por sua vez, utilizaram as análises de Fst para promover a comparação entre Lu. cruzi e Lu. longipalpis com o intuito de observar o grau de diferenciação entre essas populações.. 18.

(34) 3. OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GERAL  Utilizar algoritmos baseados na máxima verossimilhança e na análise baysiana para avaliar se o fragmento do gene period (com 266pb) é um marcador eficiente para elucidar o complexo Lutzomyia longipalpis no Brasil.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS  Verificar se o marcador period possui um poder de resolução quanto à filogenia do gênero Lutzomyia.  Comparar as árvores de máxima verossimilhança obtidas através dos fragmentos de period com 266 e 400 pares de bases.. 19.

(35) 4. MATERIAL E MÉTODOS Inicialmente foram recuperadas no GenBank 138 sequências nucleotídicas contendo. 266. pares. de. bases. do. gene. period. em. Lu.. longipalpis. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), previamente descritas por Araki e colaboradores (2009). Estas sequências são representativas de espécimes descriminados quanto ao número de manchas abdominais (1S e 2S), oriundos de populações das seguintes localidades no mapa a seguir:. Figura 11. Localidades e número de haplótipos que foram utilizados nas duas primeiras análises in silico de Lu. Longipalpis... A primeira análise in silico foi realizada com sequências oriundas de populações que existe simpatia entre os dois morfotipos: Estrela de Alagoas-AL ,Jaíba-MG e SobralCE. Estas sequências foram alinhadas utilizando-se a versão 4.0 do programa MEGA 20.

(36) (Tamura et al., 2007). Com a finalidade de facilitar a visualização dos sítios variáveis, foram gerados Logos de sequência para as três populações através do programa Weblogo 3.0 (Crooks, 2004). Árvores de máxima verossimilhança foram geradas através do PAUP* v. 4.0b10 (Swofford, 2002) e, para avaliar a consistência dos ramos gerados, utilizou-se o teste de bootstrap (Felsenstein, 1985) com 1000 pseudo-replicações. As análises de genética de populações também foram realizadas apenas com as amostras das populações de Sobral, Jaíba e Estrela de Alagoas, levando-se em conta os fenótipos 1S e 2S correspondentes. A estruturação genética das populações de Lu. longipalpis foi verificada utilizando-se o software Structure 2.3 (Pritchard, 2000), que se baseia num algoritmo de agrupamento bayesiano para estimar a probabilidade de um indivíduo fazer parte de uma dada população. Foi utilizado um período de aquecimento de 20.000 interações seguido por 200.000 interações de Monte Carlo via Cadeia de Markov (MCMC), repetindo este procedimento para cada número “K” de populações (ajustado de 1 a 10). Para determinar o número de grupos “K”, foi utilizada a quantidade ad hoc ∆K segundo Evanno e colaboradores (2005). Para as análises do índice de fixação (Fst) pareado, as populações de Marajó, Mesquita e Barra de Guaratiba foram excluídas devido ao tamanho amostral reduzido. Estes estimadores foram obtidos através do software Arlequin v. 3.1 (Excoffier et al., 2005), utilizando-se 1.000 permutações aleatórias. A matriz de Fst gerada foi empregada na construção de um dendrograma baseado no método de distância UPGMA com o software MEGA v. 4.0 (Tamura et al., 2007). A estrutura populacional foi averiguada utilizando-se AMOVA (Excoffier et al., 1992), que se baseia na avaliação de diferentes grupos hierárquicos.. Para a segunda análise com sequências obtidas do NCBI, as amostras de Lu. Longipalpis as 11 populações foram divididas em dois grupos, também em referência aos fenótipos, sendo cada um desses grupos analisado quanto ao seu grau de estruturação genética, foram realizadas as mesmas metodologias da primeira análise exceto o web logo. As mesmas análises (máxima verossimilhança, STRUCTURE, Fst) foram realizadas entre as sequências de period de Lu. intermedia, Lu. whitmani (Mazzoni et al.,. 21.

(37) 2006) e Lu. cruzi (Vigoder et al., 2010) para avaliar a eficiência deste marcador em estudos evolutivos com outras espécies de flebotomíneos. A coleta, realizada em setembro de 2008, teve duração de três dias consecutivos e os espécimes foram coletados através de armadilhas luminosas tipo CDC. Em seguida, os Lu. longipalpis foram identificados quanto ao sexo e número de manchas abdominais, posteriormente, todas as amostras foram acondicionadas individualmente em álcool 70% para a extração do DNA. A extração do DNA destes flebotomíneos foi realizada segundo um protocolo padronizado a base Chelex 5% este consiste nas seguintes etapas: macerar a amostra em tubo plástico tipo eppendorf (1,5 mL) contendo 100 µl de Chelex® (BIORAD); em seguida incubar as amostras à 55ºC por 1 hora, imediatamente após incubar à 94ºC por 30 minutos, centrifugar a 13.000 rpm por 6 minutos e estocar o sobrenadante a -4ºC. Depois de extraído, o DNA foi quantificado e submetido à amplificação do marcador period com primers forward: AGCATCCTTTTGTAGCAAAC; e o reverse: TCAGATGAACTCTTGCTGTC (ANEXO A) descritos por Mazzoni e colaboradores (2002) que amplificam uma região do gene period contendo cerca de 540 pares de bases. Este fragmento abrange os 266 pares que foram utilizados para as análises in silico. Em seguida, este fragmento foi sequenciado no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Foram encaminhadas 46 amostras de DNA amplificado para o marcador period (26 1S e 20 2S), e alíquotas dos mesmos primers diluídos a 3,2 ρmol/µl. As sequências consenso foram geradas com base nos valores de Phred 20, através do programa Staden 1.6. As sequências foram alinhadas no programa MEGA e em seguida foi aferida a árvore de máxima verossimilhança no programa PAUP.. 22.

(38) 5. RESULTADOS Os conjuntos de dados referentes às populações de Sobral e Jaíba apresentaram apenas substituições sinônimas, enquanto que a população de Estrela de Alagoas além de substituições sinônimas apresentou também substituições não sinônimas e eventos de indels. O estudo detalhado dos sítios polimórficos dos conjuntos de dados confirmou a presença de padrões de substituição significativamente equivalente aos padrões de polimorfismos de base única (SNP) para os sítios 65, 112 e 197, em que mais de 90% das variantes fenotípicas possuíam um nucleotídeo específico (Figura 12).. (a). (a). (a). (c). (b). (b). (b). (c). (c). Figura 12: Logos de sequências de period indicando os sítios polimórficos de Lutzomyia longipalpis nas populações de Sobral, Jaíba e Estrela de Alagoas, respectivamente. (a) Sítio 65, (b) sítio 112, (c) sítio 197.. No sítio 65, mais de 90% das sequências de 1S possuiu uma citosina (C) e mais de 90% das sequências de 2S possuiu uma timina (T). Para o sítio 112, localizado no íntron, 100% das sequências de 1S apresentaram C e mais de 90% das sequências de 2S apresentaram T. No sítio 197, no segundo éxon, mais de 80% das sequências de 1S apresentaram C e mais de 90% das sequências de 2S apresentaram T (Figura 12). Na árvore de máxima verossimilhança gerada para a população de Sobral com o modelo evolutivo GTR+I+G, as formas 1S e 2S foram claramente separadas com valor de bootstrap significativo 53% (Figura 13). Também foi possível destacar a posição 23.

(39) monofilética do táxon Lu. longipalpis inferido através de 86% de confiabilidade do grupo externo, entretanto, neste clado Drosophila melanogaster e as demais espécies do gênero Lutzomyia não obtiveram sustentação do ramo.. 2S S. Figura 13: Árvore de máxima verossimilhança observada para a população de Sobral-CE, baseada no modelo evolutivo GTR+I+G. Nota-se que esta topologia conseguiu separar de forma consistente as duas variantes morfológicas com 53% de bootstrap. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 24.

(40) O modelo evolutivo sugerido mais apropriado para representar o conjunto de dados da população de Jaíba foi TrN+I+G. A topologia encontrada separou em clados distintos as formas fenotípicas 1S e 2S. Entretanto, o valor de bootstrap não foi significativo para esta separação (Figura 14), do mesmo modo que o marcador não separou o táxon Lu. longipalpis do grupo externo, evidenciando o fraco poder de resolução do marcador para este conjunto de dados. Para a população de Estrela de Alagoas, o melhor modelo evolutivo observado foi HKY+I e a topologia encontrada não apresentou sustentação nos ramos, inviabilizando a separação entre as duas variantes fenotípicas (Figura 15). No que tange à posição filogenética dos flebotomíneos, a topologia evidenciou o grupo Lu. longipalpis com 70% de bootstrap, ao mesmo tempo em que exibiu uma estruturação filogenética no grupo externo na qual D. melanogaster apresentou uma posição basal na topologia seguida de Ph. duboscqi, entretanto, tal estruturação não possui valores de bootstrap significativos.. 25.

(41) Figura 14: Árvore de máxima verossimilhança para a população de Jaíba-MG baseada no modelo evolutivo TrN+I+G. As duas variantes morfológicas foram separadas sem apresentar nenhuma inconsistência, entretanto esta topologia não pode ser considerada consistente devido ao baixo valor de bootstrap. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 26.

(42) Figura 15: Árvore de máxima verossimilhança para a população de Estrela-AL, baseada no modelo evolutivo HKY+I. A topologia observada não sustentou um monofiletismo entre os diferentes fenótipos. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 27.

(43) A fim de avaliar a capacidade de resolução do marcador period, também foram geradas árvores de máxima verossimilhança para as populações de Lutzomyia intermedia, Lu. whitmani e Lu. cruzi em que se constatou estruturação entre estas espécies. O conjunto de dados representado pelas sequências de Lu. intermedia e Lu. whitmani teve como melhor modelo evolutivo o GTR+I e a árvore aferida para as populações destas espécies apresentou diversos ramos sem valores significativos de bootstrap, não evidenciando o monofiletismo entre estas espécies (Figura 16). Em relação a filogenia do gênero Lutzomyia, os membros do subgênero Nyssomyia (Lu. intermedia, Lu. whitmani e Lu. umbratilis) comportaram-se como pertencentes a único táxon, sustentado por um bootstrap 99%; as demais espécies apresentaram valores significativos de bootstrap (superior a 50%). Do mesmo modo, a árvore aferida para Lu. longipalpis e Lu. cruzi (Figura 17) baseada no modelo evolutivo TrN+I também não sustentou a estruturação filogenética do grupo externo e juntou os grupos 1S e 2S de Lu. longipalpis e Lu. cruzi (bootstrap de 97%). As análises preliminares do sequenciamento das amostras coletadas em 2008 para a localidade de Sobral resultou em sequências de aproximadamente 400 pb de boa qualidade. O tamanho do fragmento final foi diferente (Figura 18) das amostras da primeira amplificação (ANEXO A) devido à remoção dos nucleotídeos que exibiram valores de Phred inferior a 20. A última árvore de máxima verossimilhança (Figura 20) foi aferida a partir de 400 pb do marcador period de Lutzomyia longipalpis e os nucleotídeos duvidosos foram nomeados segundo as regras da IUPAC, exemplo: Y quando o nucleotídeo duvidoso for T/C (Figura 19). Deste modo, o melhor modelo evolutivo observado para este conjunto de dados GTR+I+G, nesta árvore o clado que separa os morfotipos 1S e 2S está separado com 68% de valor de bootstrap, e o táxon Lu. longipalpis ficou evidenciado com 54% de valor de bootstrap, porém não houve estruturação filogenética para o grupo externo.. 28.

(44) InIAF02 InIAF06 InIAF15 InICP15 59. InIAF13 InIPO01 InIAF14 83. InIAF21 InICP19. 96. InIAF16 InIPO19 InIAF19 WhWPO13 InICP22 InIJC16. 56. InIAF01 InIAF12. 52. InIAF20 InIPO17 InIJC01 InIAC10 InIJC15 95. InICP11 InIJC26 InIAF04. 83. WhWPO08 WhWAC12. 66. WhWPO14 InICP13. 84. InIAF10 InICP20 WhWAC10 WhWPO03 WhWIL06 WhWAF16 WhWPO18 WhWIL04 50. WhWIL22 WhWIL08 WhWAC06 WhWAF03 WhWAF20 InICP16 WhWCP01a. 63. WhWAF11 WhWAF01. 65. WhWIL21 WhWAF14 85. WhWAF21 WhWPO11 InIJC22 WhWAF04. 99. WhWAF17. 95. WhWPO19. 69. InIPO13 WhWAF23 WhWAF12 50. WhWAF22 WhWAF06. 50. WhWAF18 L.umbratilis WhWAF05. 96. WhWAF15 WhWAF10 P.duboscqi. 70 61. 99. L.migonei L.evadroi L.renei. 74. L.dispar. Figura 16: Árvore de máxima verossimilhança para as populações de Lutzomyia whitmani (sequências com as iniciais Whi) e Lu. intermedia (sequências com as iniciais In), baseada no modelo evolutivo TrN+I. A topologia observada não sustentou um monofiletismo entre as espécies. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 29.

(45) P.dubosqi 2S271031 2S261033 2S221012 69. 2S071021 2S231025 2S12866. 51. 2S13916 2S031019 2S251014 2S17919 2S081023 2S19926. 91. 2S061038 2S151008 2S101040 2S161009 Cru1S04A Cru1S16B Cru1S20A Cru1S07B Cru1S11 Cru1S08A 2S241027 1S14953 Cru1S08B. 88. Cru1S09A Cru1S09B. 66. Cru1S21 1S17850 1S26857 1S18852 1S07997 1S12761 1S13762 1S23890 Cru1S07A Cru1S01A Cru1S14 Cru1S17 Cru1S15 Cru1S16A Cru1A20B Cru1S18 74. Cru1S01B Cru1S05B Cru1S02 1S291002 1S25784 1S191000. 97. 1S11781 1S08998 77. 1S28860 65. 1S06996 1S24979 1S30862 1S04977 1S03976 L.renei L.dispar L.evadroi L.migonei L.umbratilis. Figura 17: Árvore de máxima verossimilhança para as populações de Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi, baseada no modelo evolutivo GTR+I. A topologia observada não sustentou um monofiletismo entre as diferentes espécies. As sequências com as iniciais 1S e 2S pertencem ao táxon Lu. longipalpis e as sequencias com iniciais Cru são de Lu. cruzi. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 30.

(46) Figura 18: Imagem do Staden 1.6. Elaboração da sequência consenso formado pelos primers forward e reverso. As setas indicam a presença de nucleotídeos duvidosos quer por erro de sequenciamento ou heterozigozidade.. Figura 19: Imagem do MEGA 4.0 mostrando a inserção de símbolos da IUPAC, neste caso o Y marcado em azul ciano representa uma timina ou citosina.. 31.

(47) P.duboscqi L.evandroi L.dispar 1S21 1S28 1S25 1S12 1S29 2S24 2S18 76. 2S21 2S10 2S22 2S15. 51. 2S03 2S08 2S04 2S17 2S16. 2S S. 2S06 2S01 2S02 2S12 2S11. 68 67. 2S23 2S14. 91. 2S05 2S07 83. 1S22 1S06 1S16 1S13 1S01 1S27 1S10 1S19 1S18 1S26 1S07. 99. 68. 1S11 1S05 99. 1S02 1S17 1S23 1S09. 99. 1S24 1S03. 54. 1S04 L.intermedia 51. 100. L.umbratilis L.renei L.migonei. Figura 20: Árvore de máxima verossimilhança para as populações de Lutzomyia longipalpis, grupos 1S e 2S separados por 68%, baseada no modelo evolutivo GTR+I+G. Os nós em que não aparece nenhum valor de sustentação possuem valores de bootstrap inferior a 50%.. 32.

(48) As análises de estruturação genética foram realizadas com as mesmas populações acima descritas. Os resultados obtidos para a população de Sobral não diferiram dos resultados observados nas análises anteriores, tendo sido identificados dois grupos genéticos associados aos fenótipos 1S e 2S, com exceção de apenas um indivíduo de fenótipo 2S (Figura 20). A população de Jaíba não apresentou qualquer inconsistência, sendo possível associar perfeitamente os grupos genéticos com os grupos fenotípicos (Figura 21).. Figura 21: Gráficos mostrando a estrutura da população de Lu. longipalpis da cidade de Sobral-CE. Distribuição de Q de cada indivíduo para cada grupo. Cada indivíduo é representado por uma única linha vertical dividida em K cores, o tamanho do segmento colorido indica o grau de parentesco de cada indivíduo àquele grupo. O número 1 embaixo das barras indica que os indivíduos são 1S e o número 2 indica 2S.. A população de Estrela apresentou o maior número de inconsistências na associação entre os grupos genéticos e fenotípicos, com indivíduos de fenótipo 1S sendo atribuídos ao grupo genético 2S e vice-versa (Figura 22).. 33.

(49) Figura 22: Gráficos mostrando a estrutura da população de Lu. longipalpis da cidade de Jaíba-MG. Distribuição de Q de cada indivíduo para cada grupo. O número 1 embaixo das barras indica que os indivíduos são Jaíba 1S e o número 2 indica Jaíba 2S.. Nas análises de estruturação genética realizadas com 14 populações (as 11 populações geográficas, sendo Sobral, Jaíba e Estrela divididas em duas populações cada), os resultados obtidos foram de duas populações genéticas que estruturam as 11 localidades, cada cor indica uma população genética cada uma (Figura 23). Os resultados nos permitiram verificar que as populações de Sobral e Jaíba foram quase que perfeitamente separadas quanto ao fenótipo e estes, por sua vez, foram identificados como pertencentes a populações genéticas distintas. Apesar de algumas amostras não possuírem relação entre o fenótipo e o grupo genético, no contexto geral, houve relação entre o grupo fenotípico e o grupo genotípico. Entretanto, as populações de Natal, Marajó e Pancas, apesar de serem exclusivamente formadas por espécimes classificados morfologicamente como 1S, algumas amostras foram atribuídas geneticamente ao grupo formado pelo fenótipo 2S.. 34.

(50) Figura 23: Gráficos mostrando a estrutura da população de Lu. longipalpis da cidade de Estrela-AL. Distribuição de Q de cada indivíduo para cada grupo. O número 1 embaixo das barras de Q sinaliza os indivíduos de Estrela de Alagoas que são 1S e o número 2 indica os indivíduos Estrela de Alagoas 2S.. A fim de analisar a acurácia do método de estruturação genética utilizando o marcador period, foram utilizadas populações de Lu. whitmani e Lu. intermedia (Figura 24). Ambas as espécies tiveram indivíduos atribuídos aos dois grupos, não separando os grupos em espécies distintas.. Figura 24: Gráficos mostrando a estrutura da população de Lutzomyia longipalpis. Distribuição de Q de cada indivíduo para cada grupo. Os números embaixo das barras de Q sinalizam: 1 (Sobral 1S), 2 (Sobral 2S), 3 (Jaíba 2S), 4 (Jaíba 1S), 5 (Estrela de Alagoas 1S), 6 (Estrela de Alagoas 2S), 7 (Natal), 8 (Marajó), 9 (Barra de Guaratiba), 10 (Lapinha), 11 (Jacobina), 12 (Mesquita), 13 (Teresina) e 14 (Pancas).. 35.

(51) As análises realizadas posteriormente levaram em consideração as espécies: Lu. longipalpis e Lu. cruzi, os resultados observados não diferiram das análises anteriores e o guia ad hoc sustentou a existência de apenas dois grupos genéticos distintos, um formado por. indivíduos. 1S. e. a. maioria. dos. espécimes. de. Lu.. cruzi. (Figura. 25).. Concomitantemente, o grupo 2S foi formado por quase todos os indivíduos do grupo 2S. Algumas inconsistências foram observadas neste resultado, com a maioria ocorrendo na localidade de Estrela, tanto 1S como 2S.. Figura 25: Gráfico mostrando a estrutura genética das populações de Lutzomyia intermedia e Lu. whitmani. As cores das barras indicam o coeficiente de sociedade Q (probabilidade de uma amostra pertencer àquele grupo). Os números embaixo das barras de Q sinalizam a localidade de origem daquele grupo de amostras.. Os números de um a cinco são. populações de Lu. intermedia, e os números de seis a 10 são populações de Lu. whitmani. O gráfico mostra a presença de apenas dois grupos genéticos, um em verde e o outro em vermelho, porém não há um padrão de estruturação genética nem separação entre as duas espécies distintas.. Apesar da. população. de. Jacobina só. possuir espécimes identificados. morfologicamente como 1S, a estruturação genética desta população demonstrou que existem pelo menos dois grupos ocorrendo naquela localidade, o que poderia ser visto como uma inconsistência entre os dados genéticos e morfológicos. A população de Lu. cruzi, assim como na análise anterior, não foi separada da espécie Lu. longipalpis, onde a maioria dos exemplares de Lu. cruzi foram agrupados geneticamente ao morfotipo 1S de Lu. longipalpis (Figura 26).. 36.