Prevalência de anticorpos anti – Toxoplasma
gondii em avestruzes (Struthio camelus) de
criatórios comerciais no Estado de São Paulo
ANA PAULA ANGELUCCI CONTENTE
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária.
BOTUCATU – SP 2006
Prevalência de anticorpos anti – Toxoplasma
gondii em avestruzes (Struthio camelus) de
criatórios comerciais no Estado de São Paulo
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária.
Orientador: Prof. Ass. Dr. Paulo Francisco Domingues
BOTUCATU – SP 2006
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus
Contente, Ana Paula Angelucci.
Prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em avestruzes (Struthio camelus) de criatórios comerciais no Estado de São Paulo / Ana Paula Angelucci Contente. – 2006.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2006.
Orientador: Paulo Francisco Domingues Assunto CAPES: 50500007
1. Avestruz – Doenças 2. Toxoplasmose em animais 3. Toxoplasma Gondii
CDD 636.0896936
À minha mãe
Ana Maria,
por tudo o que é e representa...
A todos os meus irmãos,
pela confiança e amizade constantes.
Ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Paulo Francisco Domingues, que me aceitou como sua aluna e colega e me orientou durante este mestrado com bastante carinho e paciência, muito obrigada pelo companheirismo.
Ao Prof. Dr. Italmar Teodorico Navarro, professor da Universidade Estadual de Londrina, meu orientador durante a graduação, por todo o estímulo e apoio que me deu não apenas naquele período, mas também por ter me indicado um percurso tão bonito e desafiador que é a pós-graduação.
Ao Prof. Ass. Dr. Rafael Andreatti e seus residentes da Ornitopatologia, pela ajuda no envio das amostras.
Ao Prof. Dr. Helio Langoni, pelo apoio laboratorial para este estudo.
Aos residentes e colegas de trabalho, principalmente ao Rodrigo Costa da Silva, aos funcionários do Laboratório de Diagnóstico de Zoonoses, que colaboraram nesta pesquisa, às vezes indiretamente, obrigada pelo apoio e conhecimento dividido.
À Associação Brasileira dos Criadores de Avestruz (ACAB), por todo o apoio científico.
Aos meus amigos (seria impossível nomeá-los, correria um grande risco de esquecer alguém), que são tantos e tão importantes na minha vida, a todos agradeço pelas mãos e ombros oferecidos durante esta caminhada.
Ao meu namorado, Oliver K. Camargo, por fazer parte desta caminhada sempre ao meu lado, me ajudando a suportar todas as dificuldades e agora colhendo comigo todas as glórias.
A toda a minha família, por confiarem na minha capacidade, por me apoiarem nos dias difíceis e por me amarem.
“Foi o tempo que dedicaste a tua rosa que fez
a tua rosa tão importante”
Saint Exupéry
em O Pequeno Príncipe
“A vida é um processo de crescimento e
de superação, e o que hoje parece perfeito,
seja
uma idéia, uma atitude ou uma crença,
poderá ser inteiramente errado amanhã.”
Resumo
A toxoplasmose é uma zoonose cosmopolita causada pelo protozoário
Toxoplasma gondii, podendo acometer mamíferos e aves. O presente estudo teve
como objetivo estimar a prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii em avestruzes de criatórios comerciais do Estado de São Paulo, como forma de auxiliar no conhecimento do comportamento e importância do parasito nesta espécie animal. Foram colhidas 195 amostras de soro de avestruzes (Struthio
camelus), provenientes de Sorocaba, Campinas, São Carlos, Araçatuba, São
Paulo, Vale do Ribeira, Botucatu e São José do Rio Preto, estado de São Paulo. As amostras foram analisadas pela Técnica de Aglutinação Direta Modificada (MAT), para a pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma gondii. Os exames sorológicos revelaram 14,36% de animais sororreagentes ao T. gondii. A titulação mínima considerada foi a diluição maior ou igual a 1:16, e a maior diluição encontrada foi 1:16384. Não foi constatada diferença significativa entre os sexos. Apenas duas regiões (São Paulo e São José do Rio Preto) não apresentaram animais sororreagentes. Esses resultados salientam a importância de um estudo mais aprofundado sobre a infecção em avestruzes, e também sobre práticas de manejo que venham a minimizar os riscos de transmissão da toxoplasmose para essas aves e, por conseqüência, para o consumidor final.
Abstract
Toxoplasmosis is a widespread zoonosis caused by Toxoplasma gondii, a protozoan that may infect mammals and birds. The aim of the present study was to measure the prevalence of T. gondii in ostriches (Struthio camelus) from commercial farms of São Paulo State, as a way to help in the knowledge and importance of the parasite in this animal specie. 195 serum samples were collected from ostriches proceeding from Sorocaba, Campinas, São Carlos, Araçatuba, São Paulo, Vale do Ribeira, Botucatu e São José do Rio Preto, São Paulo State. These samples were tested using the Modified Agglutination Test (MAT) to the investigation of Toxoplasma gondii antibodies. This search detected 14,36% seropositive animals to Toxoplasma gondii. The minimum titration considered was the larger dilution or same to the 1:16, and the higher dilution was 1:16384. It was not found any significant statistical difference between males and females. In only two regions (São Paulo and São José do Rio Preto), there was no seropositive animals. Those results point out the importance of a study more deepened about this infection in ostriches, and about management practices that could minimize the toxoplasmosis transmission risks to these birds and, by consequence, to the final consumer.
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Tabela 01: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii
em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo, no ano de 2005, considerando título igual ou superior a 1:16 como reagente...29
Tabela 02: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii
em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo, no ano de 2005, conforme o título...30
Tabela 03: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii
em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo
no ano de 2005, conforme o sexo...30
Quadro 01: Número de amostras de soros de avestruz colhidas de cada
cidade/região criatória do estado de São Paulo, segundo seu
percentual de criadores, 2005...25
Quadro 02: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii
em soro de 195 avestruzes de propriedades do estado de São Paulo no ano de 2005, de acordo com a cidade ou região...31
SUMÁRIO
RESUMO...XII
ABSTRACT...IX
LISTA DE TABELAS E QUADROS...X
1. INTRODUÇÃO...12
2. REVISÃO DE LITERATURA...14
3. OBJETIVO...21
4. MATERIAL E MÉTODOS...23
4.1. Determinação do número de amostras...24
4.2. Obtenção das amostras de sangue...25
4.3. Obtenção do soro...26 4.4. Sorologia...26 4.5. Análise estatística...27 5. RESULTADOS...28 6. DISCUSSÃO...32 7. CONCLUSÃO...36 8. REFERÊNCIAS...38 9. ANEXOS...51
9.1. Anexo A - Produção de Antígeno...52
9.2. Anexo B - Preparação de antígeno fixado pela formalina (AF)... 53 9.3. Anexo C - Solução Tampão Borato 8,7...
Introdução
1. INTRODUÇÃOA toxoplasmose é uma zoonose parasitária de caráter cosmopolita, causada pelo Toxoplasma gondii, parasito intracelular obrigatório, podendo provocar graves sintomas clínicos em grande variedade de hospedeiros intermediários, inclusive o homem.
Dentre esses hospedeiros, os animais de produção são apontados como fonte de infecção para seres humanos e outros animais através do consumo de carne. Além de um problema médico veterinário devido às perdas econômicas que proporciona, a toxoplasmose também é um problema de saúde pública, tendo em vista o seu potencial zoonótico.
Ainda não se conhece a importância da espécie avestruz (Struthio camelus) na cadeia epidemiológica da doença, pois são escassos os estudos sobre toxoplasmose nesta espécie animal, tanto em animais de criações comerciais como para aqueles em estado selvagem.
Com o crescimento e desenvolvimento da estrutiocultura e regulamentação do abate desses animais, e sabendo-se que os cortes comerciais da carne de avestruz logo estarão disponíveis para o mercado consumidor, torna-se necessário o conhecimento de sua freqüência no ambiente e em animais destinados ao consumo humano para que possam ser estabelecidas medidas de controle da doença. Assim, destaca-se a importância de se conhecer a prevalência do Toxoplasma gondii nesta espécie animal, para se avaliar a necessidade ou não de preocupações tanto com o manejo destes animais quanto com a saúde pública.
Revisão de
Literatura
2. REVISÃO DE LITERATURAA toxoplasmose é uma enfermidade causada pelo Toxoplasma gondii (NICOLLE & MANCEAUX, 1909), parasito intracelular obrigatório (COOK et al. 2000). A toxoplasmose acomete o homem e todos os animais de sangue quente já postos à prova (FRENKEL, 1971).
A toxoplasmose é difundida em seres humanos e muitos outros animais homeotérmicos (DUBEY & BEATTIE, 1988), sendo considerado um dos parasitos mais freqüentes no ser humano (BROOKS, 1992). No ciclo de vida do parasito, os felinos domésticos e silvestres são os hospedeiros definitivos e o homem, outros mamíferos e aves participam como hospedeiros intermediários do agente (FRENKEL, 1971, 1973 e 1976).
Os gatos excretam oocistos de T. gondii em suas fezes, sendo os mesmos não esporulados e, portanto, não infectantes. Após a defecação, a esporulação leva de um a cinco dias e é dependente das condições ambientais. Os oocistos podem sobreviver por mais de 18 meses mesmo em condições desfavoráveis e são resistentes a muitos desinfetantes (DUBEY & BEATTIE, 1988).
Os hospedeiros intermediários adquirem a infecção principalmente por três vias: 1. Ingestão de oocistos presentes no solo, areia, e em qualquer local onde os gatos defequem, e que se disseminem através de hospedeiros-transportadores (FRENKEL, 1976) tais como moscas, baratas e minhocas (RUIZ & FRENKEL,
transplacentária (FRENKEL, 1976).
A toxoplasmose congênita é a principal forma da doença e ocorre em mulheres não imunes que apresentam soroconversão durante a gestação. O parasito infecta a placenta e, posteriormente, o feto (FRENKEL, 1990). Destes casos, 90% são assintomáticos ou oligossintomáticos (WONG & REMINGTON, 1994). A incidência da toxoplasmose aguda na gravidez varia de 0,06 a 1,4% (REMINGTON, 1990; FIGUEIRÓ-FILHO et al., 2005), onde aproximadamente 15% das infecções fetais resultam em morte intra-uterina, e dos 85% que nascem, 80% desenvolvem lesões oculares ou desordens cerebrais tardias na vida (KOPPE et al., 1986). Tem sido estimado que mais de 9% de retardamento mental está associado à infecção toxoplásmica congênita (CAIAFFA et al., 1993).
Outras formas de infecção são possíveis, segundo resultados de estudos de Werk & Bommer (1978), os autores sugerem que as células da série branca do sangue são receptivas à infecção do T. gondii assim como os precursores das células da série vermelha, enquanto eritrócitos maturos não podem ser infectados, demonstrando que há possibilidade de transmissão de toxoplasmose através de transfusão sangüínea. Couto et al. (2001), demonstraram que na grande maioria dos casos em que ocorre a infecção causada pelo Toxoplasma gondii em transplantados cardíacos a transmissão é através do órgão doador com exacerbação causada pelo regime de drogas imunodepressoras. Apesar da possibilidade do T. gondii ser transmitido quando são transfundidos plaquetas e eritrócitos e em transplante de órgãos, estas formas de transmissão são menos comuns quando comparadas com a ingestão de tecidos contendo bradizoítos ou alimentos contaminados com oocistos (DUBEY, 1994).
Estudos sorológicos indicam que mais de 80% das infecções primárias por toxoplasmose em humanos são assintomáticas, em decorrência da efetividade do sistema imunológico (LUFT & REMINGTON, 1992), embora graus variáveis da doença possam ocorrer em pessoas imunodeprimidas. Em se tratando de pacientes portadores de Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS),
pode haver reativação da infecção, que se manifesta de forma fulminante (GOLDSMITH, 1998) e com freqüência letal.
A taxa de infecção numa população depende de vários fatores, tais como padrões culturais, contato com o solo, presença de gatos, clima, disponibilidade de hospedeiros e maneira como a carne da alimentação é preparada (FRENKEL, 1976). Aonde gatos são comuns e/ou aonde os hábitos alimentares da população incluem ingestão de carnes cruas ou mal cozidas, as infecções por T. gondii são bastante comuns (BEATTIE, 1982).
A toxoplasmose humana encontra-se amplamente distribuída no mundo (TENTER et al., 2000). Nos EUA e Reino Unido, é estimado que 16-40% da população está infectada, enquanto nas Américas Central e do Sul e Europa Continental, estima-se que a infecção é de 50 a 80% (DUBEY & BEATTIE, 1988).
No Brasil, T. gondii infecta cerca de 60% da população adulta humana (GUIMARÃES et al., 1993). Em algumas regiões, 40% a 70% dos adultos sadios apresentam-se positivos para toxoplasmose em testes sorológicos (KAWAZOE, 1995), e cerca de oito a cada 10.000 crianças têm toxoplasmose congênita (MOZZATO & SOILBELMANN PROCIANOY, 2003).
Apesar da alta prevalência do T. gondii em humanos em todo o mundo, surtos são relatados com certa freqüência, sempre envolvendo o consumo de carnes cruas ou mal cozidas (BONAMETTI et al., 1997), ou outros alimentos e água contaminados com oocistos (MOURA et al., 2006). De acordo com Cook et al. (2000) o principal fator de risco de infecção para mulheres grávidas é a ingestão de carne crua (30%) ou mal cozida (63%).
Mesmo sendo detectada a presença do parasito na maioria das amostras de carnes curadas e embutidos, normalmente não são encontrados parasitas viáveis em alimentos submetidos a processos como salga da carne, defumação, cura ou congelamento, mas por outro lado, a cocção em microondas não se mostrou efetiva para inviabilizar os cistos do T. gondii (LUNDÉN & UGGLA, 1992). Navarro, et al. (1992a), estudando a presença do parasito em lingüiças suína feitas com carne de suínos inoculados experimentalmente com T. gondii, concluíram que concentrações de 2% e 2,5% de sal inativa o parasito em 48 horas
diversos tipos de carnes curadas, encontraram apenas 1,5% das amostras positivas para T. gondii, utilizando a Reação da Polimerase em Cadeia (PCR). Em estudo semelhante, Aspinall et al. (2002) encontraram uma prevalência de 38% das amostras positivas, também utilizando a PCR como forma de detecção do parasito. Em um estudo realizado por Mendonça et al. (2004) não foram detectadas parasitas viáveis em amostras de lingüiças suínas, mas o parasita esteve presente em 47,14% das amostras testadas, sendo detectada a presença pela PCR.
Vidotto et al. (1986) realizaram um levantamento sorológico em suínos abatidos nos municípios da região de Londrina e apuraram uma taxa de 34,62% de soro-positivos para o Toxoplasma gondii e, em estudo posterior, Vidotto et al., (1990) encontraram 37,84% de suínos soro-positivos, demonstrando o alto grau de infecção do meio ambiente por oocisto do T. gondii. Navarro et al., (1992b) obtiveram um percentual de 20,26% das amostras de carne de suíno do Estado do Paraná positivas. Segundo Van Knapen et al. (1982), em se tratando de suínos, ovinos e aves, a diminuição no percentual de animais prevalentes quando comparados com estudos na mesma região, é devido a mudanças de manejo em direção à tecnificação.
No Brasil foram realizados estudos em vários Estados, como São Paulo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Bahia e Goiás encontrando-se de 9,0% a 60,0% de bovinos reagentes ao T. gondii (SILVA et al., 1985; MEIRELES et al., 2003) enquanto no Estado do Paraná, Marana et al. (1994) encontraram 32,34%, demonstrando que os oocistos presentes nas pastagens são a principal fonte de contaminação dos bovinos e de outras espécies de animais.
No Estado de São Paulo foram encontrados por Mainardi et al. (2003) um total de 14,5 % de caprinos com sorologia positiva para Toxoplasma gondii. Na região de Londrina, Paraná, Sella et al. (1994), obtiveram 30,7% de caprinos leiteiros reagentes ao T. gondii.
Outras espécies animais também têm sido estudadas, como por exemplo, os eqüinos cuja carne é destinada à exportação. No Paraná, Vidotto et al. (1997)
encontraram uma porcentagem de 31,55% de eqüinos soro-reagentes, indicando forte risco de infecção, uma vez que esses eqüinos são destinados ao consumo humano, sendo exportados principalmente para a Comunidade Européia.
Lindsay et al. (1991a), observaram uma taxa de 44% de veados da cauda branca sorologicamente positivos para T. gondii, no Estado do Alabama, EUA, salientando que estes animais são possíveis fontes de infecção para a população local, devido ao hábito da caça à esses animais e conseqüente consumo desta carne.
A prevalência do Toxoplasma gondii em galinhas de criações extensivas pode ser considerada um bom indicador da prevalência de oocistos de T. gondii no ambiente porque as galinhas se alimentam diretamente no solo (DA SILVA et al., 2003; DUBEY et al., 2003, 2004a, 2005). Meireles et al. (2003) não encontraram nenhuma galinha soropositiva entre as pesquisadas em criações intensivas do estado de São Paulo. Em contrapartida, a prevalência encontrada por Dubey et al. (2004b) foi de 46,88% das galinhas criadas de forma extensiva em Israel. No Egito, DEVAB; HASSANEIN (2005), encontraram uma prevalência de 30% das galinhas criadas de forma extensiva, e de 11,10% nas criadas de forma intensiva.
A sintomatologia da toxoplasmose em galinhas naturalmente infectadas varia de total abstenção de sinais clínicos a sintomas como: febre, espasmos, paralisia, cegueira e morte (ERICHSEN & HARBOE, 1953 apud KANETO et al., 1997). Em um estudo com galinhas poedeiras e pombas experimentalmente infectadas com o parasito, Biancifiori et al. (1986), observaram a suspensão temporária da postura e morte de embriões, especialmente durante as duas primeiras semanas pós-inoculação, e sinais clínicos como diarréia, incoordenação, espasmos, hepatomegalia, esplenomegalia e morte.
Em um estudo a respeito do Toxoplasma gondii em avestruzes de criatórios comerciais, Dubey et al. (2000) no Canadá, encontraram apenas 2,9% de animais soro-positivos, enquanto Hove & Mukaratirwa (2005), ao pesquisarem o T. gondii no soro de 50 avestruzes selvagens do Zimbabwe, encontraram 48% dos animais reagentes para o Toxoplasma gondii,
estrutiocultura é uma atividade que permite o desenvolvimento de vários mercados e tendo como matérias-primas principais a carne, o couro, as plumas e os ovos (FIGUEIREDO et al., 2004). A criação de avestruz (Struthio camelus) começou como atividade comercial para produção de penas no século 19, na África do Sul. Naquela época a indústria encontrava-se concentrada na implantação dos plantéis, com pouca produção de couro e carne (DRENOWATZ et al., 1995). A carne de avestruz era originalmente considerada um subproduto da indústria do couro. A estrutiocultura era principalmente baseada em experiência. Desde alguns anos está havendo uma alteração no foco do produto final, dando maior importância à produção de carne, entretanto, ainda hoje pouco é conhecido sobre essa produção (LAMBOOIJ & PIETERSE, 2000).
O Brasil ainda está em fase de implantação de plantel, com uma população nacional de cerca de 335.000 avestruzes, com grande concentração na região Sudeste (40% das aves). O Estado de São Paulo concentra a maior parte dos animais desta região, cerca de 125.000 aves, o que corresponde a 89% do plantel regional e 37% do plantel nacional (ANUÁRIO DA ESTRUTIOCULTURA BRASILEIRA 2005/2006). O mercado brasileiro já é o maior consumidor mundial de plumas. A carne e o couro encontram condições favoráveis, de grande atratividade para a formação de um mercado interno e um grande potencial de atendimento à atual demanda mundial (CARRER, 2005).
O manejo racional desta ave se assemelha mais ao de bovinos e eqüinos do que ao costumeiramente utilizado para as aves, no tocante à infra-estrutura necessária e aspectos de alimentação. O sistema digestivo dos avestruzes difere consideravelmente dos animais ruminantes, não ruminantes ou aves, seu sistema digestivo monogástrico herbívoro, proporciona sua exploração econômica a partir do aproveitamento de alimentos fibrosos, viabilizado pelo suporte forrageiro já existente na atual pecuária brasileira (CARRER & KORNFELD, 1999). Uma das principais fontes de nutrientes para os avestruzes provém do consumo de alimentos volumosos, de maneira direta via pastejo ou pela administração através de comedouros de forragens picadas. É necessário o fornecimento de pedras para
auxiliar o processo de digestão mecânica da porção fibrosa dos alimentos (JEFFEREY, 1996; CARRER & KORNFELD, 1999; DAVIS, 2006).
Ainda há poucos parasitos conhecidos que possam ser transmitidos através da carne de avestruz para consumidores humanos (HUCHZERMEYER, 1997), portanto, a ênfase, como em outras criações intensivas, será preventiva ao invés de terapêutica, e envolverá a integração de nutrição, manejo, genética e controle de doenças (GILLESPIE & SCHUPP, 1998).
Objetivo
3. OBJETIVOEste estudo teve como objetivo estimar a prevalência de anticorpos
anti-Toxoplasma gondii em avestruzes de criatórios comerciais do Estado de São
Paulo, como forma de auxiliar no conhecimento do comportamento e importância do parasito nesta espécie animal.
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOSOs trabalhos experimentais foram conduzidos nos laboratórios do Núcleo de Pesquisas em Zoonoses, NUPEZO, do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, FMVZ, da UNESP, campus de Botucatu.
A produção e preparação do antígeno utilizado para a sorologia realizada encontra-se no anexo A.
4.1. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE AMOSTRAS
Foi utilizado o programa EPIINFO (CDC, 2002), para o cálculo do número de amostras (n). Utilizando como referência uma prevalência esperada de 8%, segundo Marobin et al. (2004), nível de significância α = 1%, nível de confiança de 99% e margem de erro de 5%, encontrou-se um n de 195 animais.
As amostras foram coletadas de oito regiões criatórias do estado de São Paulo (Sorocaba, Campinas, São Carlos, Araçatuba, São Paulo, Vale do Ribeira, São José do Rio Preto e Botucatu), sendo as cidades de Sorocaba, Campinas e São Carlos responsáveis por 62% dos criadores de avestruz do Estado de São Paulo, baseando-se nestes dados o número de amostras foi dividido de forma a alcançar as principais cidades/regiões criatórias, conforme o Quadro 01. Esta
divisão foi baseada apenas em número de criadores, pois não há conhecimento a respeito do número exato de animais de cada região.
Quadro 01: Número de amostras de soros de avestruz colhidas de cada
cidade/região criatória do estado de São Paulo, segundo seu percentual de criadores, 2005
Cidade/Região Número de amostras %
Sorocaba 20 10,26 Campinas 75 38,46 São Carlos 25 12,82 Araçatuba 20 10,26 São Paulo 10 5,12 Vale do Paraíba 10 5,12 Botucatu 15 7,7
São José do Rio Preto 20 10,26
TOTAL 195 100
4.2. OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE
Com o número de amostras a ser colhido de cada região estabelecido, os avestruzes utilizados na amostragem foram selecionados aleatoriamente dentro das propriedades, desde que fossem animais destinados ao abate. A idade das aves utilizadas neste experimento variou de 12 a 18 meses, que é a idade mínima
de animais machos e fêmeas de cada região.
Foram colhidas 102 amostras de sangue de avestruzes fêmeas e de 93 machos. A colheita se deu através de punção das veias jugular direita, braquial ou metatársica, com seringas de 10 mL e agulhas 40x12 e o volume obtido variou de cinco a 10 mL.
4.3. OBTENÇÃO DO SORO
Acondicionadas em tubos de ensaio estéreis, as amostras de soro foram obtidas pelo repouso das amostras de sangue, lacradas e identificadas e então transportadas para o Laboratório de Diagnóstico em Zoonoses (LDZ), em isopor com gelo e então neste foi realizada a centrifugação do soro para melhor separação. Após este processo, as amostras foram novamente acondicionadas em frascos estéreis, identificadas e mantidas sob congelamento até o momento da realização da prova sorológica.
4.4. SOROLOGIA
Utilizou-se a Técnica de Aglutinação Direta Modificada (MAT), realizado segundo o método proposto por Desmonts & Remington (1980). O MAT é indicado como o método mais conveniente na detecção de T. gondii em pesquisas epidemiológicas em aves (DEVADA & ANANDAN, 2000), segundo Marca et al. (1996) e Franco et al. (2003), o MAT tem alta sensibilidade e especificidade para a detecção de anticorpos anti-Toxoplasma gondii, tendo também a vantagem de não requerer conjugados espécie-específicos.
Inicialmente foi realizada uma triagem das amostras, onde foram utilizadas as diluições 1:16 e 1:64. As amostras de soro foram diluídas individualmente em
microplacas de fundo chato, da marca comercial “Corning”, onde foram adicionados 150µl de Solução Salina Tamponada (SST) 0,01M pH 7,2 (ANEXO B) em todas as cavidades a serem utilizadas. Na primeira cavidade, foram adicionados 10µl de soro (diluição 1:16) e, após homogeneização com micropipeta, foram transferidos 50µl para outra cavidade, equivalendo a diluição 1:64. A seguir, 25µl de cada diluição do soro foram transferidos para as respectivas cavidades de microplacas com fundo em “V”, e 25µl de 2-mercaptoetanol 0,2M, diluídos em SST 0,01M pH 7,2 e, 50 µl do antígeno, diluídos em solução tampão borato pH 8,7 (ANEXO C) foram adicionados às cavidades. As placas foram seladas com filme plástico, homogeneizadas por um minuto e incubadas a temperatura ambiente, por seis horas ou overnight, quando então se procedeu a leitura com interpretação dos resultados.
Como reações positivas consideraram-se aqueles soros em que houve aglutinação do antígeno, caracterizado pela formação de uma malha ou película, tomando pelo menos 50% da área da cavidade da microplaca. A formação de botão compacto ou ocupando menos de 50% da área da cavidade da microplaca foi considerada como reação negativa. Em todas as placas foram testados soros controle sabidamente positivo e negativo, os quais orientaram a interpretação de cada reação.
Após a realização da triagem, foi procedida a titulação completa das amostras de soro que foram reagentes para as diluições de 1:64. Novamente as amostras foram diluídas como o exposto acima, e as diluições prosseguiram até a diluição 1:16384.
4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados dos exames sorológicos, considerando-se as amostras como positivas ou negativas, foram expressas em valores absolutos de acordo com o teste de sorologia, utilizando-se estatística descritiva (VIEIRA, 1998).
Resultados
5. RESULTADOSDentre as 195 amostras de soros submetidos ao MAT, 28 amostras apresentaram título igual ou superior 1:16, num percentual de 14,36% (IC [95%] = 9,75-20,07) de sororeagentes ao Toxoplasma gondii, como pode ser observado na Tabela 01.
TABELA 01: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo, no
ano de 2005, considerando título igual ou superior a 1:16 como reagente
Total amostra Positivos Negativos
n % N %
195 28 14,36 167 85,64
A distribuição dos sororeagentes, segundo o título no MAT encontra-se representada na Tabela 02.
TABELA 02: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo, no
ano de 2005, conforme o título
Diluição n % Negativos 167 85,64 1:16 5 2,56 1:64 11 5,64 1:256 5 2,56 1:1024 2 1,03 1:4096 3 1,54 1:16384 2 1,03 Total 195 100
Encontrou-se uma positividade de 14,70% nas fêmeas e 13,98% nos machos (Tabela 03), não sendo a diferença considerada estatisticamente significativa (p=0,95).
TABELA 03: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii em soro de 195 avestruzes, de propriedades do estado de São Paulo no
Número de amostras Positivas % Negativas % Macho 93 13 13,98 80 86,02 Fêmea 102 15 14,70 87 85,29 Total 195 28 14,36 167 85,64
Apenas nas cidades/regiões de São Paulo e São José do Rio Preto não foram detectados animais reagentes ao MAT, o Quadro 02 demonstra este resultado.
QUADRO 02: Resultados do Método de Aglutinação Direta para Toxoplasma gondii em soro de 195 avestruzes de propriedades do estado de São Paulo, no
ano de 2005, de acordo com a cidade ou região
Positivos Negativos Total
Cidade/Região n % n % N % Sorocaba 03 15 17 85 20 10,26 Campinas 16 21,33 59 78,66 75 38,46 São Carlos 03 12 22 88 25 12,82 Araçatuba 03 15 17 85 20 10,26 São Paulo 00 00 10 100 10 5,12 Vale do Paraíba 01 10 09 90 10 5,12 Botucatu 02 13,33 13 86,66 15 7,7 São J. R. Preto 00 00 20 100 20 10,26 TOTAL 28 14,36 167 85,64 195 100
Discussão
6. DISCUSSÃO
Verificou-se a prevalência de anticorpos contra T. gondii em 14,36% dos avestruzes criados em criatórios com fins comerciais do Estado de São Paulo. No Brasil, não foram encontrados mais estudos a respeito na espécie em questão, mas no Rio Grande do Sul foi realizado um estudo semelhante com emas de criatórios comerciais, de manejo igual ou semelhante ao utilizado para os avestruzes, e os autores encontraram uma prevalência de anticorpos de 8,10% (MAROBIN et al., 2004), sendo a técnica sorológica utilizada a hemaglutinação passiva. Dubey et al. (2000) encontraram em um estudo realizado no Canadá com 973 avestruzes, 28 animais positivos, ou seja, apenas 2,9% dos animais estudados apresentaram sorologia positiva. Como já citado anteriormente, em avestruzes selvagens no Zimbabwe a prevalência encontrada foi de 48% (HOVE & MUKARATIRWA, 2005). Assim como na presente pesquisa, nestes dois estudos a técnica utilizada também foi o MAT.
Pouco se sabe a respeito da toxoplasmose em aves. Em relatos de casos, a sintomatologia normalmente é bastante severa, com lesões oculares e cerebrais, acometendo desde canários (WILLIAMS et al., 2001; LINDSAY et al., 1995) e perus (QUIST et al., 1995), a pingüins (MASON et al., 1991). Em pesquisas com aves, ainda pouco se relata a respeito da sintomatologia. Diversos
como perus (DUBEY et al., 1993a), faisões (DUBEY et al., 1994), perdizes (MARTINES-CARRASCO et al., 2005) e galinhas (DUBEY et al., 1993b), em aves selvagens como os falcões (LINDSAY et al., 1991b). Porém neste tipo de pesquisa normalmente é apenas relatada a resposta imunológica dos animais ao T. gondii, pois os animais são sacrificados logo que obtida a resposta imune, deixando muito ainda a ser pesquisado.
Os oocistos esporulados de T. gondii são muito resistentes às condições ambientais, eles permanecem infectantes em solos úmidos e areia por mais de 18 meses, mas sobrevivem curtos períodos ao frio e à desidratação, (FRENKEL, 2000). Subentende-se que os oocistos deste parasito têm condições mais propícias à sua manutenção nas pastagens do nosso país quando comparadas às canadenses, o que reforçaria a hipótese de que a diferença encontrada entre este trabalho e o realizado por Dubey et al. (2000), é devido ao clima e às contaminações de pastagens e manejo sanitário e nutricional do avestruz.
Em pesquisa realizada com galinhas, bovinos, ovinos e caprinos, a qual levava em consideração os modos de criação extensivo, semi-intensivo e intensivo de cada uma das espécies (MEIRELES et al., 2003), encontraram taxas de infecção menores em criações intensivas, relacionadas ao tipo de manejo da criação, o que pode reduzir a taxa de infecção por este parasito no rebanho. Van Knapen et al. (1982) sugeriram que apenas as criações extensivas de aves mostram percentual de animais positivos acima de 30% dos testados, o que denota que a tecnificação das granjas e a retirada da ave do contato com o solo diminui o número de animais contaminados. Avestruzes não dependem apenas de grãos em sua alimentação, mas também de outras fontes de fibra (AL-NASSER et al., 2003), a dieta das aves como o avestruz consiste principalmente em insetos, outros pequenos invertebrados e plantas forrageiras e grande parte da água necessária para sua manutenção provém da vegetação (CHOLEWIAK, 2003).
Pouco ou quase nada se sabe a respeito da sintomatologia clínica da toxoplasmose em ratitas de forma geral e, especificamente em avestruzes, quais suas implicações na produção destes animais, fazendo-se necessários estudos
mais aprofundados sobre a infecção nesta espécie animal e de sua capacidade de resposta imune aos diferentes estímulos antigênicos desta parasitose.
Segundo Figueiredo et al. (2004), o Brasil vem sendo apontado como possuidor de um dos melhores ambientes para a criação da espécie, em função das nossas condições climáticas e territoriais, vocação agropecuária, baixos custos de produção e também em função da tecnologia e conhecimentos na área da avicultura. Reduzir a transmissão do T. gondii em propriedades rurais é um problema difícil devido às múltiplas fontes de infecção deste parasito. Para desenvolver estratégias de controle será necessário determinar essas fontes de infecção e os fatores de risco associados à aquisição da infecção por T. gondii em animais de produção criados sob várias práticas de manejo (DUBEY, 1996). O primeiro e necessário passo antes de implantar medidas de controle é conhecer quais parasitos podem ser encontrados em avestruzes. Em geral, pouco é conhecido sobre parasitos nestas aves, não apenas em suas áreas de distribuição original, mas também nos países importadores (PONCE GORDO et al., 2002).
A prevenção da toxoplasmose animal requer conhecimento preciso da cadeia epidemiológica da doença, para se estabelecer com exatidão a possível fonte de infecção, que pode estar representada por alimentos contaminados ou felídeos (VIDOTTO, 1992). As estratégias para reduzir a disseminação da toxoplasmose incluem corretas práticas de manejo e educação sanitária, entre outras. Várias pesquisas têm sido realizadas para se obter uma vacina eficaz e segura, que visem reduzir os danos fetais, o número de cistos teciduais nos animais e prevenir a formação de oocistos em gatos, (DUBEY, 1994), diminuindo assim contaminação ambiental e ajudando a prevenir a exposição dos animais e do homem aos cistos e oocistos do parasito (DUBEY et al. 1997).
A carne de avestruzes está sendo promovida comercialmente como uma carne vermelha de baixo colesterol, devido a sua coloração e textura semelhantes às carnes de bovinos e ao seu baixo nível de gordura (JEFFEREY, 1996). Sabendo-se que o cisto do T. gondii apresenta-se não viável quando temperaturas internas da carne alcançam 67 oC ou – 12 oC, que o congelamento da carne por 1 dia em freezer doméstico apresentam cistos não viáveis (DUBEY,
desigual (LUNDÉN & UGGLA, 1992), temos base para indicar que o consumo da carne de avestruzes deve ser realizado após cocção completa da mesma. Quando se trata de produtos alimentícios, a contaminação exógena, causada por incorretos procedimentos de higiene, é de maior importância que a contaminação endógena (HIRAMOTO et al., 2001), sendo assim, é de grande valor também a higiene em todo o processamento da carne de avestruz, desde o abate até a manipulação para o consumo.
Conclusão
7. CONCLUSÃO
A prevalência de anticorpos para Toxoplasma gondii nos soros de avestruzes criados em criatórios comerciais do Estado de São Paulo, pelo Método de Aglutinação Direta Modificada, que fizeram parte deste estudo foi de 14,36%. Machos e fêmeas apresentaram prevalências bastante semelhantes, não sendo encontrada diferença significativa entre os sexos.
É importante conhecer e aprimorar o manejo sanitário dessas aves, para evitar a contaminação ambiental, da água e alimentos fornecidos à essas aves, com o intuito de controlar e diminuir a prevalência de animais contaminados com o parasito, diminuindo assim o risco de infecção para o ser humano.
A carne de avestruz pode ser consumida com segurança, desde que bem cozida, como é a indicação própria para qualquer tipo de carne, mas estudos mais específicos a respeito do tema devem ser realizados.
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Anexos
ANEXO A - Produção de Antígeno
Inocular 05 camundongos, via intraperitoneal, com 1 ml das suspensões da cepa RH, previamente selecionada.
Realizar lavado peritoneal, 3 dias após, com 10 ml de solução fisiológica 0,9% estéril, por animal.
Observar ao microscópio se os parasitos estão livres de contaminação bacteriana, hemácias e leucócitos. Homogeneizar, volume a volume, com líquido ascítico tumoral (células de sarcoma murino TG180), previamente diluído a 1:8 em solução fisiológica 0,9% estéril, para obter um volume final de 60 ml de suspensão.
Com esta suspensão de taquizoítos e células tumorais, inocular 60 camundongos Swiss, com 40 dias de idade (2 ml para cada). Dois dias após a inoculação, colher o exsudato, com 10 ml de solução fisiológica 0,9% estéril (DESMONTS & REMINGTON, 1980).
ANEXO B - Preparação de antígeno fixado pela formalina (AF)
Adicionar volume a volume solução de formalina-12% (formaldeído-6%), diluída em solução fisiológica 0,9%, à suspensão com parasitas, mantendo-se overnight a 4ºC.
No dia seguinte, centrifugar a 600g por 10 minutos e ressuspender o sedimento em 50ml solução fisiológica 0,9%.
Repetir essa operação mais três vezes, para remover o formaldeído, e finalmente ressuspender em solução tampão borato pH 8,7.
A suspensão final, contendo 2 x 107 parasitas por mL, deverá ser conservada a 4ºC (DESMONTS & REMINGTON, 1980).
ANEXO C - Solução Tampão Borato 8,7 REAGENTES 200ml 500ml 1000ml Cloreto de Sódio 1,4g 3,51g 7,02g Ácido Bórico 0,62g 1,55g 3,09g Hidróxido de Sódio 1 N * 4,8ml 12ml 24ml Albumina Bovina 0,8g 2g 4g
Água Deionizada estéril ou ultra-pura 195,2ml 488ml 976ml
*Hidróxido de Sódio 1 N
