INSTITUTO DE QUÍMICA
FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN
ESTUDO DA RETENÇÃO DE VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS E HIDROSSOLÚVEIS EMPREGANDO CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO SUPERCRÍTICO DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE ACORDO COM OS
CONCEITOS DE ANALYTICAL QUALITY BY DESIGN
CAMPINAS 2018
ESTUDO DA RETENÇÃO DE VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS E HIDROSSOLÚVEIS EMPREGANDO CROMATOGRAFIA COM FLUÍDO SUPERCRÍTICO DE ULTRA ALTA EFICIÊNCIA E DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS DE ACORDO COM OS
CONCEITOS DE ANALYTICAL QUALITY BY DESIGN
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de
Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química, na área de Química Analítica
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Cristina Breitkreitz
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN, E ORIENTADO PELA PROFA. DRA. MÁRCIA CRISTINA BREITKREITZ.
CAMPINAS 2018
Profa. Dra. Márcia Cristina Breitkreitz (Orientadora)
Profa. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya (FCF-UNICAMP)
Profa. Dra. Alessandra Sussulini (IQ – UNICAMP)
A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Este exemplar corresponde à redação final da
Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno
FERNANDO HENRIQUE PASCOTI BRUHN, aprovado
mе dеυ força е coragem, mе apoiando nоs momentos dе maiores dificuldades. Obrigado pelo carinho, paciência е pоr sua capacidade dе me trazer pаz nа correria dе cada semestre. Também aos meus filhos, Gabriela e Thiago, quе embora nãо tivessem conhecimento disto, iluminaram dе maneira especial оs meus pensamentos mе levando а buscar mais conhecimentos. Agradeço também a meus queridos pais e irmão pelo incentivo е pelo apoio sempre constantes e, finalmente, a todos os professores que de alguma forma contribuíram com minha formação, em especial às professoras Márcia e Isabel, que me incentivaram desde o começo desta jornada, sempre mostrando que era possível a realização deste sonho, mesmo com todas os desafios e dificuldades encontradas pelo caminho.
“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”
Este trabalho teve por objetivo descrever a retenção e separação das principais vitaminas lipossolúveis e hidrossolúveis na técnica de Ultra High Performance
Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC) em função dos principais fatores
experimentais envolvidos e utilizar os conceitos de Analytical Quality by Design para o desenvolvimento de métodos analíticos. Inicialmente, por meio de um estudo de triagem, as fases estacionarias Acquity HSS C18 SB e AcquityTorus 2-PIC foram identificadas como sendo as mais promissoras, juntamente com o metanol como modificador orgânico da fase móvel, em conjunto com os aditivos formato de amônio (10 mmol L-1), água (5%) e hidróxido de amônio (10 mmol L-1), que se mostraram fundamentais para melhoria dos parâmetros cromatográficos para as vitaminas hidrossolúveis. Em seguida, um Planejamento do tipo Composto Central foi realizado para estudar as variáveis que influenciam a densidade do fluído: porcentagem de modificador orgânico ao final do gradiente, contra-pressão e temperatura. As respostas avaliadas foram: fator de retenção (k), número de pratos (N), assimetria (As), área dos picos e resolução (Rs). O estudo multivariado mostrou que os três fatores influenciaram de forma diferente cada resposta analítica e permitiu, por meio de funções de desejabilidade, a construção do Design Space, que é a região onde se garante robustez e adequabilidade dos parâmetros do método cromatográfico. Todas as vitaminas apresentaram respostas analíticas (áreas) diretamente proporcionais à concentração, com r > 0.99. Na análise de um produto farmacêutico em forma de cápsula gelatinosa mole não foram detectados interferentes da matriz e do diluente.
Palavras-chave: Vitaminas, Cromatografia com fluído supercrítico de ultra alta eficiência (UHPSFC), Analytical Quality by Design (A-QbD).
The objective of this work was to describe the retention and separation of the major fat soluble and water soluble vitamins in the Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography (UHPSFC) technique as a function of the main experimental factors involved and to use the concepts of Analytical Quality by Design for the development of analytical methods. Initially, through a screening study, the stationary phases Acquity HSS C18 SB and Acquity Torus 2-PIC were identified as the most promising along with methanol as the organic modifier of the mobile phase and ammonium formate (10 mmol L-1), water (5%) and ammonium hydroxide (10 mmol L -1
) as additives, which were mandatory for the improvement of chromatographic parameters for water soluble vitamins. Then, a Central Composite Design was performed to study the variables that influence the fluid density: percentage of organic modifier at the end of the gradient, counter-pressure and temperature. The evaluated responses were: retention factor (k), number of plates (N), asymmetry (As), area of the peaks and resolution (Rs). The multivariate study showed that the three factors influenced in a different way each analytical response and allowed, by means of desirability functions, the construction of the Design Space, which is the region where robustness and adequacy of the parameters of the chromatographic method are guaranteed. All vitamins presented analytical responses (areas) directly proportional to the concentration, with r > 0.99. In the analysis of a pharmaceutical soft capsule, no interferences of the matrix and the diluent were detected.
Palavras-chave: Vitamins, Ultra high performance supercritical fluid chromatography (UHPSFC), Analytical Quality by Design (A-QbD).
AA: Ácido Ascórbico.
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária. ATP: do inglês, Analytical Target Profile.
BPR: do inglês, Back Pressure Regulator. CO2: Dióxido de Carbono.
CPP: do inglês, Critical Process Parameters. CQA: do inglês, Critical Quality Attributes. CZE: do inglês, Capillary Zone Electrophoresis. DAD: do inglês, Diode Array Detector.
Dc: Densidade crítica.
DCG: do inglês, Dense Gas Chromatography. DoE: do inglês, Design of Experiments.
DS: do inglês, Design Space.
ELDS: do inglês, Evaporative Light Scattering Detector. ESI: do inglês, Electrospray Ionization.
FDA: do inglês, Food and Drug Administration. FE: Fase Estacionária.
FM: Fase Móvel.
FMEA: do inglês, Failure Mode Effect Analysis. GC: do inglês, Gas Chromatography.
HILIC: do inglês, Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography. HPLC: do inglês, High Performance Liquid Chromatography. HRGC: do inglês, High Resolution Gas Chromatography. ICH: do inglês, International Conference on Harmonization. KS: do inglês, Knowledge Space.
LQ: Limite de Quantificação.
LSER: do inglês, Linear Solvatation Energy Relationship. MODR: do inglês, Method Operable Design Region. MS: do inglês, Mass Spectrometry.
NFLC: do inglês, Normal Phase Liquid Chromatography. PAT: do inglês, Process Analytical Technology.
Pc: Pressão crítica.
PTFE: Politetrafluoretileno.
QbD: do inglês, Quality by Design. QbT: do ingles, Quality by Testing. RDC: Resolução da Diretoria Colegiada.
RPLC: do inglês, Reverse Phase Liquid Chromatography. RSM: do inglês, Response Surface Methodology.
SFC: do inglês, Supercritical Fluid Chromatography.
SFC-MS: do inglês, Supercritical Fluid Chromatography – Mass Spectrometry. Tc: Temperatura crítica.
UHPLC: do inglês, Ultra High Performance Liquid Chromatography.
UHPSFC: do inglês, Ultra High Performance Supercritical Fluid Chromatography. UPC2: do inglês, Ultra Performance Convergence Chromatography.
USP: do inglês, United States Pharmacopeia. UV: Ultravioleta.
UV-Vis: Ultravioleta-Visível. VHS: Vitaminas Hidrossolúveis. VLS: Vitaminas Lipossolúveis.
1. Introdução ... 13
1.1 Analytical Quality by Design ... 13
1.2 Cromatografia com Fluido Supercrítico ... 17
1.2.1 Histórico ... 17
1.2.2 A Condição Supercrítica ... 21
1.2.3 Composição de Fase Móvel ... 26
1.2.4 Fases Estacionárias... 31
1.2.5 Desempenho Cinético ... 35
1.2.6 Áreas de Aplicação da Técnica ... 40
1.3 Vitaminas ... 43
1.3.1 Palmitato de Retinol (Vitamina A) ... 46
1.3.2 Colecalciferol (Vitamina D)... 49
1.3.3 Acetato de -Tocoferol (Vitamina E) ... 51
1.3.4 Tiamina (Vitamina B1) ... 53
1.3.5 Riboflavina (Vitamina B2) ... 55
1.3.6 Nicotinamida (Vitamina B3) ... 56
1.3.7 Piridoxina (Vitamina B6) ... 58
1.3.8 Ácido Fólico (Vitamina B9) ... 59
1.3.9 Cianocobalamina (Vitamina B12) ... 61 1.3.10 Ácido Ascórbico ... 63 2. Objetivo ... 69 3. Experimental ... 69 3.1 Reagentes ... 69 3.2 Equipamentos ... 70 3.3 Colunas Cromatográficas ... 70 3.4 Amostras ... 71
3.5.2 Avaliação do Volume de Injeção ... 72
3.5.3 Seleção de Fase Móvel (Modificador Orgânico) e Seleção de Fase Estacionária ... 73
3.5.4 Seleção de Fase Móvel - Aditivos ... 75
3.5.5 Planejamento Experimental ... 76 3.5.6 Linearidade ... 77 3.5.7 Injeções da Amostra ... 78 4. Resultados e Discussão ... 80 4.1 Solubilidade ... 80 4.2 Volume de Injeção ... 87
4.3 Estudo de Seleção de Fase Estacionária e Fase Móvel ... 89
4.3.1 Estudo da Seleção de Fase Estacionária ... 90
4.3.2 Estudo da Seleção de Fase Móvel ... 97
4.4 Planejamento Experimental ... 113
4.4.1 Resultados Empregando a Coluna Acquity HSS C18 SB ... 114
4.4.2 Resultados Empregando a Coluna Acquity Torus 2-PIC ... 123
4.5 Linearidade, Limites de Detecção e Quantificação ... 133
4.6 Injeções da Amostra ... 135
5. Conclusão ... 138
6. Perspectivas Futuras...140
1. INTRODUÇÃO
1.1 Analytical Quality by Design
O desenvolvimento de ferramentas analíticas cada vez mais eficientes apresenta-se como um aspecto fundamental na indústria farmacêutica, pois a análise de fármacos em matérias-primas e produtos acabados é necessária em praticamente todo o processo de desenvolvimento e produção de medicamentos. Desta maneira, há uma constante busca por métodos analíticos mais rápidos, econômicos e ecologicamente sustentáveis em relação aos tradicionais para a prática de trabalho nas indústrias farmacêuticas de todo o mundo.
Por este motivo, há mais de uma década, a agência regulatória americana, a FDA (Food and Drug Administration) iniciou um trabalho de introdução de novas tecnologias e metodologias analíticas para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos, com o propósito de favorecer a construção de um ambiente científico e ao mesmo tempo flexível para a obtenção de produtos confiáveis, com alto nível de qualidade, sem a necessidade de vigilância regulatória extensiva. Sob esta perspectiva, esta agência lançou em 2004 o guia denominado Process Analytical
Technology (PAT), no intuito de encorajar as empresas farmacêuticas a melhoram o
entendimento a cerca de seus processos de fabricação, através do uso de ferramentas inovadoras de design, análise e controle de operações farmacêuticas [1]. Em continuidade à iniciativa de PAT, em 2005 o International Conference on
Harmonization (ICH), um grupo formado por autoridades de agências regulatórias
dos Estados Unidos, Europa e Japão, lançou a iniciativa de Quality by Design (QbD), a qual é definida como "uma abordagem sistemática para o desenvolvimento que começa com objetivos previamente definidos e enfatiza o entendimento e controle do produto do processo, com base na ciência e no gerenciamento de riscos” [2]. A estratégia de QbD tem por objetivo aumentar o conhecimento nos processos industriais por meio de uma abordagem racional e multivariada baseada em ferramentas científicas e de análise de risco para atingir a qualidade desejada e minimizar erros. Um aspecto central no conceito de QbD é que a qualidade do produto deve ser construída ao longo do seu desenvolvimento, em contraposição à
estratégia adotada anteriormente, denominado Quality by Testing (QbT), onde os fatores eram estudados por meio de testes univariados e a qualidade era simplesmente testada ao final do processo de fabricação [3].
A estratégia de QbD estabelece o estudo das variáveis experimentais de forma multivariada e, por este motivo, as ferramentas de Planejamento e Otimização Experimental (Design of Experiments - DoE) são fundamentais nesta estratégia. Este procedimento apresenta diversas vantagens em relação ao método univariado, dentre as quais pode-se citar a detecção de interações entre as variáveis em estudo, obtenção de uma superfície de resposta que descreve como as propriedades do sistema variam em função das variáveis experimentais e a otimização efetiva do sistema, considerando seus diferentes atributos de qualidade. Inicialmente a estratégia de QbD foi introduzida para o desenvolvimento de produtos e processos de fabricação na área farmacêutica, sendo aplicado principalmente em problemas da formulação [4,5], síntese de ingrediente ativo farmacêutico e biofármacos [6,7]. Mais recentemente, surgiu a vertente analítica do QbD, denominada Analytical Quality by
Design, na qual o enfoque é a aplicação de conceitos de QbD ao desenvolvimento
de métodos analíticos [3,8–10].
Para implementação dos princípios de QbD na área analítica, deve-se, primeiramente definir todos os requisitos que o método deve atender em termos de qualidade, ou seja, definir o Analytical Target Profile (ATP) [3]. Deve-se então selecionar quais atributos são críticos para o desempenho adequado do método (Critical Quality Attributes - CQA) tais como retenção adequada na coluna, resolução apropriada entre todos os picos no cromatograma, simetria adequada para integração, linearidade, precisão, exatidão, etc., e deve-se estabelecer um valor alvo ou um limite de aceitação para cada um deles. Em seguida, definem-se quais são as variáveis experimentais críticas que impactam estes atributos de qualidade, e que, portanto devem ser monitoradas e controladas para garantir a qualidade desejada, os quais são denominados Critical Process Parameters (CPP) [2]. Como o número de parâmetros experimentais que podem potencialmente afetar os CQA pode ser muito grande, esse número deve ser reduzido, através de uma análise de risco, priorizando os parâmetros mais críticos. Esta etapa pode ser realizada empregando algumas das ferramentas formais de análise de risco existentes, tais como o FMEA
(Failure Mode Effect Analysis) [11] e o Diagrama de Ishikawa [3] ou por meio de tabelas de análise de risco, nas quais são atribuídos os níveis de risco a cada CPP (baixo/médio/alto).
No método FMEA, as variáveis são classificadas de acordo com a probabilidade com que podem afetar os CQA, a severidade do efeito sobre os resultados analíticos e a dificuldade em sua detecção, resultando em um número para cada parâmetro. Aqueles que atingiram numeração acima de um valor de corte são considerados críticos, e devem ser escolhidos para a próxima etapa, e aqueles que resultaram em numeração abaixo da linha de corte podem ser seguramente eliminados dos estudos futuros [9]. Já a ferramenta de Diagrama de Ishikawa segrega os parâmetros em diferentes categorias, por exemplo aquelas associadas com instrumentação, materiais, métodos, medições, ambiente do laboratório e fatores humanos. Em seguida, são classificados entre os que devem ser controlados, os que representam apenas ruído e os que devem ser avaliados experimentalmente a fim de se obter critérios de aceitação. Dessa forma, apenas as condições críticas são conduzidas para futuros estudos, enquanto as demais são fixadas por experimentos preliminares ou por conhecimento prévio do analista [3].
Em um artigo de revisão sobre aplicações de ferramentas de Quality by
Design, Orlandini et al. [3] explicam que, após aplicação da ferramenta de análise de
risco, é interessante a realização de estudos de varredura para avaliar o efeito dos CPP de maior criticidade sobre os CQA, a fim de reduzir o número de CPP de fato avaliados com mais detalhe em um planejamento experimental. Assim, define-se o
Knowledge Space (KS), conhecido como a região experimental a ser investigada
mais detalhadamente pelo estudo de DoE, que deve ser cuidadosamente conhecida, a fim de minimizar os risco de não se obterem resultados interessantes no estudo de DoE, pelo simples fato de ter escolhido parâmetros e níveis inapropriados para o estudo [10]. Como exemplo, planejamento do tipo Plackett-Burman pode ser empregado para avaliar o efeito do pH da fase móvel, vazão, temperatura, volume de injeção, e concentração de solvente orgânico na fase móvel sobre resolução e fator de assimetria dos picos cromatográficos [12]. Estudos de varredura também são utilizados com frequência sobre variáveis discretas, como tipo de coluna cromatográfica, tipo de tampão da fase móvel e solvente orgânico (prótico/aprótico),
reservando o planejamento experimental para as variáveis contínuas, como temperatura e níveis de gradiente [12].
Finalmente, após realizada a análise de risco e os estudos de varredura para determinação do KS, apenas os CPP que apresentarem alto risco são estudados por meio de ferramentas de DoE para construir superfícies de resposta e identificar o Design Space (DS), que é a região multidimensional cuja combinação multivariada dos CPP estudados garante a qualidade desejada do método [9], sendo limitado por regiões nas quais a performance do método não é aceitável. Dessa forma, um método analítico não é mais validado em apenas uma condição fixa, mas sim apresentado dentro de faixas aceitáveis para cada parâmetro [13]. Como consequência, tem-se que variações no método dentro do DS podem não serem consideradas como alterações analíticas, e não precisariam de futura aprovação regulatória para serem implementadas [2,13]. Para aplicações envolvendo metodologia analítica, o Design Space também pode ser denominado Method
Operable Design Region (MODR) [14].
Conforme descrito anteriormente, uma grande vantagem do uso de ferramentas de DoE durante o desenvolvimento do método é a possibilidade da determinação dos níveis de robustez do método analítico através da incorporação deste parâmetro no momento da determinação do DS e das especificações de trabalho e não somente após o desenvolvimento do método, como é realizado tradicionalmente. O próprio DS pode ser entendido como uma região teórica de robustez analítica, pois alterações dentro desta região não devem afetar significantemente a qualidade da separação [10,15].
A otimização do método deve então ser realizada através de análise estatística multivariada, sendo a metodologia de superfície de resposta (Response
Surface Methodology - RSM) a mais empregada atualmente [16–18], e que consiste,
através da aplicação de diversas técnicas matemáticas e estatísticas baseadas no ajuste da equação polinomial dos dados experimentais obtidos, na previsão do efeito de cada variável sobre as respostas estudadas, a fim de se otimizar simultaneamente os níveis das variáveis de forma a obter a condição de máximo desempenho do método.
Dentre as ferramentas de RSM, as funções de Derringer e Suich, ou funções de desejabilidade, são aplicadas quando um grande número de respostas deve ser avaliado simultaneamente, sendo necessária a determinação de uma condição que represente o melhor compromisso possível para todas elas. Nesta metodologia, inicialmente determina-se uma função de desejabilidade para cada resposta individualmente, introduzindo as especificações que cada resposta deve alcançar. Em seguida, com todas as funções de desejabilidade individuais definidas, é traçada uma função de desejabilidade global, definida como uma média geométrica de cada função individual [16–18] reduzindo o problema à otimização de uma única resposta.
Outro fator determinante para adoção do DoE como ferramenta para o desenvolvimento de um método analítico é a questão da redução na quantidade de experimentos a serem realizados, gerando redução no tempo e custo do desenvolvimento. Técnicas analíticas mais complexas, com grande quantidade de parâmetros a serem ajustados, interdependentes entre si, tal como as técnicas cromatográficas em geral, e em especial a cromatografia com fluido supercrítico, são fortes candidatas para aplicação de conceitos de DoE e RSM, garantindo um processo de desenvolvimento de método mais eficiente e robusto.
1.2 Cromatografia com Fluido Supercrítico 1.2.1 Histórico
Em 1906, os primeiros artigos envolvendo a cromatografia como ciência foram publicados pelo botânico russo Michael Tswett, demonstrando a separação de compostos orgânicos oriundos de extratos de plantas [19]. Desde então, um forte desenvolvimento da técnica pôde ser observado, com o surgimento da cromatografia gasosa (Gas Chromatography - GC) e, posteriormente, da cromatografia líquida (Liquid Chromatography - LC).
Em 1962, Klesper et al. [20] apresentaram o primeiro trabalho utilizando fluido supercrítico como fase móvel, pouco antes do surgimento da cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography – HPLC),
marcando, dessa forma, o nascimento da cromatografia com fluido supercrítico (Supercritical Fluid Chromatography – SFC). Entretanto, o uso desta técnica não foi amplamente difundido, como ocorreu com a HPLC, sendo resgatada somente a partir da década de 1990 como uma ferramenta útil para aplicação em metodologias de separação de compostos orgânicos [21].
Dentre as razões para a baixa difusão da técnica até então está o rápido estabelecimento da cromatografia gasosa de alta resolução (High-Resolution Gas
Chromatography – HRGC) e da HPLC, na década de 80, que acabaram inibindo o
crescimento da SFC. Enquanto a cromatografia gasosa já se apresentava como uma técnica bem estabelecida, com muita instrumentação disponível no mercado, de diversos fornecedores, buscava-se o desenvolvimento de métodos analíticos capazes de analisar compostos instáveis termicamente, não voláteis e polares, em cujo campo a GC não conseguia atuar. A cromatografia líquida surgiu com alternativa à GC para estes tipos de compostos e, embora inicialmente não apresentasse eficiência satisfatória, fortes investimentos foram realizados no intuito de desenvolver a técnica, nascendo assim a HPLC, que ofuscou o desenvolvimento da SFC e sua aplicação como técnica analítica para a grande maioria de aplicações [21].
A elevada capacidade de solvatação dos fluidos supercríticos foi descoberta por Hannay e Hogarth, em 1879, a partir de um estudo sobre a solubilidade de cloretos metálicos em etanol no estado supercrítico [21]. Somente em 1962, Klesper et al. demonstraram o uso de fluido supercrítico como fase móvel (FM) para separar uma mistura de porfirinas [20]. Sie e Rijnders, em 1967 [22], realizaram o primeiro estudo publicado para se avaliar o efeito da pressão sobre o coeficiente de partição e a permeabilidade e eficiência de colunas em sistemas cromatográficos, usando fluido supercrítico como FM.
No final da década de 1960, alguns pesquisadores desenvolveram instrumentações mais sofisticadas em relação aos equipamentos usados nos anos anteriores. Em 1966, Karayannis et al. [23] reportaram o desenvolvimento de um sistema equipado com regulador de pressão mecânico, capaz de controlar a pressão independentemente da vazão da fase móvel. Em 1969, Gidding et al. [24]
descreveram a cromatografia gasosa densa (Dense Gas Chromatography – DGC), citando em seu artigo a famosa frase “um dos aspectos mais interessantes da cromatografia gasosa de alta pressão seria sua conversão com a cromatografia líquida clássica”. Os autores estudaram diversos gases, como He, N2, CO2 e NH3, e avaliaram a retenção de vários grupos de compostos orgânicos, como purinas, nucleosídeos e nucleotídeos, esteróides, açúcares, aminoácidos e proteínas, entre outros.
Na década de 70, verificou-se o desenvolvimento de instrumentos capazes de realizar um gradiente de pressão. Jentoft e Gouw [25] separaram hidrocarbonetos policíclicos aromáticos e estireno através de um sistema de gradiente de pressão. Os autores verificaram que, quanto maior a pressão, maior o poder de solvatação da fase móvel, possibilitando a separação adequada dos compostos em estudo. Em 1977, Klesper e Hartamn [26] desenvolveram um sistema de SFC preparativa, obtendo o fracionamento de oligômeros de estireno, sendo que em 1978, Randall e Wahrhafting [27] descreveram o primeiro acoplamento de DGC com a espectrometria de massas (Mass Spectrometry - MS).
Com a introdução de colunas capilares em 1981 por Novotny et al. [28], verificou-se um aumento na comercialização de equipamentos de SFC, que eram semelhantes aos cromatógrafos a gás (colunas capilares, fornos e detectores de ionização em chama). A principal vantagem do uso de colunas capilares era a possibilidade de se desenvolver um gradiente de pressão, porém nesse sistema não era possível variar a pressão sem modificar a vazão da fase móvel, o que poderia ocasionar instabilidades, baixa robustez e deformações nos picos cromatográficos. Como esses sistemas não eram muito robustos e se limitavam ao uso de CO2 puro como fase móvel, sua aplicação era limitada à análise de compostos lipofílicos, e, dessa forma, entre as décadas de 1980 e 1990 houve diminuição drástica no uso da técnica [29], que só sobreviveu a esse declínio devido ao seu bom desempenho na separação de enantiômeros, com alta resolução e rapidez, quando comparada à HPLC [30].
Entretanto, em 1982, Gere et al. [31], contribuíram imensamente para o ressurgimento da técnica de SFC, pois, ao modificarem um equipamento de HPLC
em laboratório, adicionando um regulador de contra-pressão e usando colunas recheadas, tornaram possível o controle individual de pressão e da vazão de fase móvel, de modo a obter um gradiente de pressão, sem alteração da vazão da fase móvel. Além disso, a introdução de um sistema binário permitiu o emprego de modificadores orgânicos e aditivos na fase móvel, proporcionando a análise de compostos com ampla faixa de polaridade. Trabalho como este e os de Cui e Olesik [32], que estudaram os efeitos da mistura de CO2, metanol e água como FM e de Lee e Olesik [33] que avaliaram, em 1995, o uso de n-hexano e CO2, auxiliaram a impulsionar a técnica e a proporcionar o desenvolvimento de novos equipamentos. Entretanto, a repetibilidade e robustez destes equipamentos ainda eram inferiores às obtidas em LC, o que, de forma geral, barrou a implementação destes equipamentos em laboratórios analíticos [29].
Entretanto, nos últimos anos, observou-se o ressurgimento da cromatografia com fluido supercrítico, através do lançamento no mercado de uma nova geração de instrumentos e insumos analíticos que sanaram diversas limitações da técnica, observadas em seu início [21]. Em 2012, um novo equipamento foi lançado pela empresa Waters Corporation, introduzindo no mercado várias fases estacionárias (FE) com partículas de tamanho sub-2 µm, e que associadas aos modificadores orgânicos e aditivos adicionados à FM permitem a separação de uma vasta gama de compostos, de forma rápida e eficiente, resultando em uma mudança drástica no cenário de possíveis aplicações da técnica. Além disso, este equipamento garante repetibilidade das análises por meio do resfriamento da cabeça das bombas de CO2, o que aumenta a eficácia de compressão da FM, removendo o calor produzido, e do controle efetivo da pressão de retorno do sistema, com um novo regulador de contra pressão (BPR) que mantém a pressão constante mesmo usando gradiente [29,34]. A problemática crise gerada pela escassez de acetonitrila no mercado, em 2008, também favoreceu o retorno da SFC como técnica cromatográfica viável, pois obrigou cientistas a buscarem alternativas à LC, encontrando na SFC uma ótima alternativa para uma série de aplicações até então conduzidas exclusivamente por LC [35].
Esta nova tecnologia associa o potencial das técnicas de SFC e UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography), dando origem à técnica
denominada de Cromatografia com Fluído Supercrítico de Ultra Alta Eficiência (Ultra
High Performance Supercritical Fluid Chromatography - UHPSFC), que representa o
estado da arte em termos de técnica de separação, abrindo uma nova dimensão de instrumentação analítica que emprega os conceitos do fluído supercrítico sob altas pressões [36].
Avanços relacionados ao sistema de detecção em SFC também contribuiram para impulsionar o ressurgimento da técnica. São empregados detectores semelhantes aos de GC e de LC, como por absorção no UV-Vis, por arranjo de diodos (DAD), por espalhamento de luz evaporativo (ELSD) e por espectrometria de massas, que possibilitam obtenção de mais informações sobre as amostras [37]. Técnicas de ionização de espectrometria de massas mais recentes, como de ionização química em pressão atmosférica (APCI) e ionização por eletrospray (ESI) apresentam-se como as mais populares em SFC-MS, permitindo a introdução direta da amostra no espectômetro de massas. Bernal et al. consideram não haver limitações no acoplamento de SFC aos espectrômetros de massas disponíveis no mercado [37], representando uma alternativa de seletividade e complementariedade em relação à LC-MS [38].
O crescimento da aplicação da técnica pode ser comprovado pelo crescente número de publicações a cada ano. Saito et al. [21] afirmaram em seu artigo que na década de 1960, o número de artigos científicos publicados envolvendo a técnica foi muito pequeno, aumentando na década de 1970, porém não ultrapassando a marca de 30 artigos. Entretanto, na década de 1980, este número aumentou exponencialmente, para cerca de 400 artigos, e nos anos de 1990, chegou a cerca de 600 artigos publicados. Na década de 2000, observou-se, novamente, um aumento expressivo nas publicações, ultrapassando a marca dos 800 artigos publicados empregando SFC como técnica de separação.
1.2.2 A Condição Supercrítica
A condição supercrítica de um fluido é alcançada com valores de temperatura e pressão acima dos valores críticos. Embora raro, esta condição existe na natureza, como na atmosfera do planeta Vênus, composta por 96,5 % de CO2, e
temperatura em torno de 462 °C e pressão de 1350 psi. A água, em oceanos profundos, próximos aos vulcões submarinos, também está em condição supercrítica [39].
Na condição supercrítica, a densidade do gás e do líquido tornam-se iguais, e a interface entre ambos desaparece, formando um único fluido, o fluido supercrítico. A Tabela 1 apresenta a temperatura crítica – Tc (°C), pressão crítica - Pc (psi) e a densidade crítica – Dc (g/mL) de diversos compostos orgânicos, vários deles já empregados como fase móvel de instrumentos analíticos para as técnicas de SFC e UHPSFC.
Tabela 1. Parâmetros físico-químicos de alguns compostos utilizados como fase móvel em
Cromatografia com Fluído Supercrítico [40].
FLUÍDO FORMULA MOLECULAR TEMPERATURA CRÍTICA -Tc (°C) PRESSÃO CRÍTICA - Pc (psi) DENSIDADE CRÍTICA Dc (g/mL) Dióxido de Carbono CO2 31,3 1071,3 0,47 Óxido Nitroso N2O 36,5 1053,7 0,45 n-Pentano C5H12 196,6 489,4 0,23 Hexafluoreto de Enxofre SF6 45,5 545,2 0,74 Xenônio Xe 16,6 858,2 1,10 Metanol CH3OH 240,5 1159,5 0,27 2-Propanol C3H7OH 235,3 690,7 0,27
Assim como a região de fluído supercrítico é aquela na qual a pressão e temperatura excedem os pontos críticos de pressão e temperatura, existe a região subcrítica, na qual a temperatura e pressão encontram-se abaixo dos pontos críticos de pressão e temperatura, respectivamente. Quando são empregados modificadores orgânicos e aditivos na fase móvel, os pontos críticos de temperatura e pressão se elevam drasticamente, chegando à cerca de 135 °C e 2436 psi para a mistura CO2/Metanol 70:30 (v/v) como fase móvel. Uma consequência prática deste fato é que a maioria das publicações em SFC e UHPSFC não apresenta, na verdade, a fase móvel em condição supercrítica, mas sim em condições subcríticas. Quando se trabalha com temperatura entre 40 a 60° C, qualquer que seja o gradiente
empregado, mesmo que inicialmente se esteja em condição supercrítica, um fluído subcrítico será obtido rapidamente, assim que a proporção de modificador orgânico aumentar ao longo do gradiente de fase móvel [30]. Na Figura 1 é ilustrado um diagrama de pressão/temperatura do CO2 puro, indicando a região onde o fluido supercrítico é obtido. Logo fora dessa região, obtém-se o fluído subcrítico.
Figura 1. Diagrama pressão/temperatura e os equilíbrios entre os estados sólido, líquido e gasoso.
Definição de região supercrítica para o CO2. Tc: temperatura crítica; Pc: pressão crítica. Adaptado da referência [40].
Teoricamente, o grande problema em se operar abaixo da condição supercrítica seria a separação de fases, sendo que neste caso a fase móvel passaria a ser constituída de uma fase gasosa, contendo CO2 e outra líquida, contendo principalmente o modificador orgânico utilizado [41]. Tal fenômeno ocasionaria sérios problemas cromatográficos, como alteração da solubilidade dos analitos, intensas alterações de retenção e formato de picos, além de elevação de ruído na linha de base devido à passagem da mistura gás-líquido no detector [41]. Entretanto, Lesellier e West descreveram, em seu artigo de revisão [30], que esta separação de fases nunca foi observada na região subcrítica, em temperatura inferior à temperatura crítica, mas com a pressão mantida acima daquela considera crítica, conforme confirmado em diversas publicações [42–45]. Se a temperatura tivesse que estar acima do ponto crítico, o emprego de modificadores orgânicos seria inviável, pois seria incompatível com o uso da maioria das colunas recheadas
disponíveis, e representaria uma dificuldade na análise de compostos termolábeis. Assim, a transição entre os estados supercrítico e subcrítico ocorre sem ocasionar grande impacto no desempenho do sistema [46].
Compostos como hidrocarbonetos leves, amônia, óxido nítrico e clorofluorcarbonos foram utilizados como fase móvel em condição supercrítica em alguns trabalhos [29], porém tiveram seu uso praticamente extinto devido aos sérios problemas de segurança resultantes de sua aplicação, aos danos aos equipamentos, à instabilidade quando utilizados para análise de compostos termolábeis e ao elevado dano ambiental [47]. O dióxido de carbono apresenta condições brandas para atingir a condição supercrítica (pressão de 1071,3 psi e temperatura 31,3 ºC), conforme mostrado na Tabela 1, além de não ser tóxico (exceto em altas concentrações) e inflamável e ser de fácil descarte [19], já sendo inclusive relatado o desenvolvimento de sistemas capazes de reciclar o CO2 do processo, tornando a técnica ainda mais amigável ecologicamente [36,48–50]. Além disso, por ser normalmente utilizado em temperaturas pouco acima da temperatura ambiente e não ser reativo, evita-se a degradação térmica e química dos analitos e a formação de compostos de degradação. Dessa forma, este composto consagrou-se como o mais empregado como fase móvel em SFC [29,30,39].
As propriedades físico-químicas de um fluido supercrítico, sob o ponto de vista cromatográfico, se assemelham às características dos gases, como baixa viscosidade e alta difusibilidade, resultando em uma elevada velocidade da fase móvel e pressão reduzida, garantindo uma separação eficiente [51]. Além disso, apresenta densidade e elevado poder de solvatação, semelhante a um líquido, proporcionando adequada solubilidade e rápido transporte dos analitos. Consequentemente, as análises empregando a técnica de SFC são mais rápidas, devido à baixa viscosidade do fluido supercrítico, o que possibilita o uso de vazões mais altas em relação à HPLC e a eficiência é comparável à GC, devido à alta difusibilidade dos analitos no fluido supercrítico [19]. Desta maneira, por unificar a Cromatografia Líquida com a Gasosa, a empresa Waters patenteou o seu equipamento como “Cromatografia de Convergência de Ultra Performance” (Ultra
Performance Convergence Chromatography - UPC2), confirmando a previsão de Gidding, em 1969.
Muitos trabalhos foram descritos na literatura buscando esclarecer o comportamento de retenção dos compostos em SFC, através da correlação do fator de retenção com as condições de pressão e temperatura, ou com as propriedades específicas da fase móvel, como densidade, fugacidade e solubilidade no soluto. Entretanto, fatores como viscosidade, difusibilidade e solubilidade da fase móvel estão diretamente ligados à densidade do fluído, que é um fator determinante sobre a força da fase móvel, e, consequentemente, sobre a retenção e seletividade. De forma geral, quanto maior a densidade da fase móvel, maior a solubilidade dos analitos nesta fase e menor é a sua retenção [39]. Basicamente, a densidade do fluído depende de três parâmetros ajustáveis do método analítico em SFC: composição da fase móvel, contra-pressão do sistema e temperatura da coluna [52,53].
O efeito da contra-pressão do sistema sobre a retenção é direto. Quando a pressão é aumentada, mantendo-se fixa a temperatura, a densidade e o poder de solvatação do fluido é aumentado, reduzindo a retenção dos analitos [54]. A amplitude desta alteração varia de acordo com a composição da fase móvel, sendo muito mais significativa quando somente CO2 puro é utilizado na fase móvel, se comparado à uma fase móvel composta de CO2 contendo um modificador orgânico. Isso porque a compressibilidade do fluido quando somente CO2 está presente é maior que quando um modificador orgânico é adicionado à fase móvel, reduzindo dessa forma o efeito de variações na contra-pressão sobre a retenção dos analitos [55].
Em relação ao efeito da temperatura sobre a retenção, verifica-se que o aumento na temperatura, sob pressão constante, leva ao aumento na pressão de vapor do soluto e redução na densidade do fluído supercrítico, além de alterar a afinidade do analito com a fase estacionária [54]. Trata-se, portanto de uma complexa mistura de mecanismos, que resulta em uma redução na retenção dos analitos. Esse efeito sobre a retenção é ampliado quando se trabalha com temperatura próxima à temperatura crítica, porém é minimizado quando a temperatura de trabalho encontra-se acima da temperatura crítica, podendo ser registrado inclusive aumento na retenção nestes casos, devido ao aumento na pressão de vapor [56].
Entretanto, quando se trabalha na condição subcrítica, o que é bastante comum em SFC e UHPSFC, seja por se utilizar uma temperatura branda, menor que a supercrítica, ou por se adicionar grande quantidade de modificador orgânico à fase móvel, verifica-se forte redução do efeito de compressibilidade da fase móvel, mantendo a densidade do fluído mais elevada. Dessa forma, o efeito de alterações na temperatura e na contra-pressão do sistema sobre a retenção é minimizado, quando se trabalha na condição subcrítica, proporcionando um método mais robusto quando se trabalha nesta região [30,46], o que justifica o emprego quase que unânime desta condição nas publicações recentes.
Em resumo, conforme descrito por Asberg et al. [57], os parâmetros: composição da fase móvel (presença de modificador orgânico), contra-pressão do sistema e temperatura da coluna afetam a retenção dos analitos e a seletividade, sendo que o primeiro parâmetro atua de forma mais significativa que os demais. Dessa forma, levando em consideração também a influência primordial da fase estacionária na retenção e seletividade, fica claro que os primeiros parâmetros a serem estudados em um desenvolvimento de método em SFC e UHPSFC são a escolha da fase móvel e da fase estacionária, seguidos dos parâmetros pressão e temperatura, como um ajuste fino da metodologia em desenvolvimento [39,58].
1.2.3 Composição da Fase Móvel
O CO2, por apresentar momento dipolar zero, apresenta força cromatográfica semelhante ao hexano, ou seja, apresenta propriedades altamente lipofílicas, o que dificulta a eluição de compostos de alta massa molar e mais polares, capazes de realizar ligações de hidrogênio ou outras interações com a fase estacionária polar [39]. Para contornar este problema e melhorar a seletividade da fase móvel, foi desenvolvido um sistema de bomba binária que permitiu a adição de solventes polares na fase móvel, chamados de modificadores orgânicos, os quais são adicionados em pequenas quantidades (tipicamente de 1 a 30 %) com o intuito de aumentar o poder de solvatação da fase móvel e alterar sua seletividade, garantindo a solubilidade dos analitos e evitando sua precipitação quando a amostra é introduzida na coluna. Os modificadores orgânicos podem apresentar uma grande
faixa de polaridade, desde os apolares, utilizados em Cromatografia Líquida de Fase Normal (Normal Phase Liquid Chromatography - NPLC), até aqueles com caráter mais polar, utilizados em Cromatografia Líquida de Fase Reversa (Reverse Phase
Liquid Chromatography - RPLC). Desta maneira, é possível varrer toda a série
eluotrópica pela variação de polaridade da fase móvel e conduzir separações de analitos que seriam realizadas por Cromatografia Líquida, tanto no modo de Fase Normal quanto de Fase Reversa. Além disso, os modificadores orgânicos proporcionam a ativação de sítios ativos na superfície da fase estacionária e alteram a densidade da fase móvel, o que pode favorecer a análise cromatográfica [30].
Os diferentes tipos de interações entre os analitos e a fase estacionária, como ligações de hidrogênio, e dipolo-dipolo, favorecem o aumento de seletividade. Dependendo do tipo de modificador orgânico empregado, diversas características, como constante dielétrica, capacidade de formação de ligações de hidrogênio, capacidade de transferência de massas e viscosidade do solvente podem ser alteradas. O uso de álcoois como modificadores orgânicos, por exemplo, por possuírem a característica de formadores de ligação de hidrogênio, atuam minimizando o efeito prejudicial de distorção dos picos cromatográficos gerados pelos grupamentos silanóis livres da fase estacionária, pois estes se apresentam como receptores de ligação de hidrogênio, que deixam de interagir com os analitos, e passam a interagir com o modificador orgânico [29].
O metanol constitui um modificador orgânico de elevada força cromatográfica, devido à sua alta polaridade, e é considerado o solvente mais utilizado em eluição de compostos polares em SFC e UHPSFC. Ele é completamente miscível em CO2, em uma ampla faixa de temperatura e pressão. Um gradiente típico, com início de 2 a 5% de metanol, até 30 a 40%, constitui uma boa opção para a realização de um screening inicial, seguindo Naváková et al. [29]. Outros álcoois, como etanol e 2-propanol, também podem ser empregados, porém são observados picos cromatográficos mais largos e maiores tempos de corrida que quando comparados com metanol [55]. Além disso, o metanol é menos viscoso e mais polar, favorecendo a solubilização de compostos mais polares na fase móvel, e mais compatível com espectrometria de massas [55]. O emprego de acetonitrila também foi relatado por Brunelli et al. [55], proporcionando diferenças na ordem de
eluição e formato dos picos. No caso deste solvente, nota-se um aumento na retenção dos compostos e baixa simetria dos picos, o que pode ser explicado pela falta de grupamentos doadores para ligações de hidrogênio na molécula e assim apresentar uma baixa cobertura dos grupamentos silanóis livres. Por esta razão, a acetonitrila é dificilmente utilizada de forma pura, mas sim em conjunto com outros modificadores orgânicos tais como os álcoois metanol, etanol, 2-propanol, solventes próticos capazes de interagir via realização de ligações de hidrogênio, como doadores e receptores de elétrons. [45,55].
Quando a adição de um modificador orgânico à fase móvel de dióxido de carbono não for suficiente para garantir a eluição dos analitos com formato de pico adequado, introduz-se um terceiro componente à fase, usualmente chamado de “aditivo”, porém em menores concentrações que a do modificador orgânico, normalmente entre 0,05 a 1 % (v/v), com intuito de contornar problemas relacionados à seletividade, eluição e formato dos picos [30]. Tais compostos, geralmente bastante polares, podem até ser imiscíveis em CO2, mas devem ser solubilizados no modificador orgânico e miscíveis na mistura formada por CO2, modificador orgânico e aditivo [39]. Os aditivos podem afetar a retenção, separação e formato de picos através de diversos mecanismos, sendo estes muitas vezes não totalmente elucidados [30]. Geralmente, os aditivos atuam sobre os sítios ativos da fase estacionária alterando sua polaridade, sobre a polaridade da fase móvel, aumentando seu poder de solvatação, e podem alterar o nível de ionização dos analitos, levando à formação de pares iônicos entre ambos [30,39].
Os aditivos mais comuns incluem ácidos e bases, a fim de melhorar o formato dos picos e a seletividade de compostos ácidos ou básicos, respectivamente. Assim, a eluição de ácidos orgânicos pode ser melhorada com adição de ácidos fortes, como trifluoracético [59], ou de ácidos fracos, tais como ácido fórmico ou acético, que são compatíveis com a espectrometria de massas [60], ou ainda ácido cítrico e etanossulfônico [42,61], enquanto que a eluição de compostos básicos pode ser aperfeiçoada com a adição de aminas alifáticas, como isopropilamina, dietilamina, etildimetilamina ou trietilamina [42,62]. Até mesmo o uso de hidróxido de amônio já foi relatado, fornecendo formato de picos simétricos para diversos compostos básicos e racematos, sendo considerado um bom aditivo, por
ser volátil, compatível com espectrometria de massas, facilmente removível da coluna, quando comparado às aminas alifáticas e não degradar a sílica [29,44,63]. Perrenoud et al. [63] esclareceram em seu estudo que a maior parte das publicações em SFC e UHPSFC refere-se à análise de compostos neutros, ácidos ou levemente básico, embora compostos básicos sejam bastante comuns na área farmacêutica, englobando moléculas de valores de pKa entre 7 a 10. Eles afirmaram que compostos básicos apresentam restrições para serem plenamente analisados por estas técnicas, nas quais possuem desempenho cromatográfico pobre, com picos bastante distorcidos, incluindo caudas frontais e distais, picos divididos e com ‘ombros’, sendo sugerido fortemente o emprego de aditivos básicos para contornar tais inconvenientes.
Em alguns casos, aditivos ácidos e básicos são adicionados em conjunto na fase móvel, a fim de obter os benefícios acima descritos [63]. Podem ser usados sais, tais como acetato de lítio, acetato de tetrametilamônio ou cloreto de amônio. Tampões voláteis, como formato, acetato e carbonato de amônio, são utilizados com sucesso como aditivos em análise de compostos básicos [63,64] e ácidos, pois apresentam capacidade de aprimorarem o formato dos picos dos dois tipos de compostos simultaneamente [55], sendo empregados, geralmente, na concentração entre 1 a 20 mmol/L, junto ao modificador orgânico [65,66] com a vantagem de serem compatíveis com a técnica de espectrometria de massas e, normalmente, são utilizados em screening inicial, como aditivos da fase móvel, quando há compostos ionizáveis na amostra [30].
Apesar das vantagens descritas, deve-se avaliar criteriosamente o emprego de aditivos à fase móvel. Alguns aditivos apresentam absorbância no UV, resultando em aumento no ruído da linha de base durante o desenvolvimento da programação de gradiente. Além disso, podem interagir fortemente com a fase estacionária, aumentando o tempo necessário para atingir o equilíbrio e, portanto, para a estabilização do sistema, além de sua remoção da coluna ser difícil, exigindo procedimentos de lavagem e regeneração mais complexos e demorados. Poe et al. [67] relataram em sua publicação que, com adição de aditivo à fase móvel, fenômenos mais complexos, como alterações na temperatura, na densidade da fase e na pressão do sistema podem ocorrer, sugerindo então a escolha criteriosa das
condições experimentais, de forma a minimizar a perda de eficiência que pode ocorrer devido à estas alterações nas condições do sistema.
A água também pode ser utilizada como aditivo, porém poucos estudos foram publicados empregando este solvente na fase móvel. Ela deve ser sempre utilizada em conjunto com algum solvente orgânico, que a torna então miscível em CO2. Ela é mais polar que o metanol e possui dois grupamentos que realizam ligações de hidrogênio, o que aumenta o poder de solvatação da fase móvel, sendo compatível com a técnica de espectrometria de massas. A quantidade utilizada varia entre 0,1 a 5% (v/v) [68]. Recentemente, Taylor et al. [65] relataram o uso de água como aditivo melhorando a capacidade de eluição e formato de pico de compostos polares. Além disso, a água demonstrou apresentar pequeno efeito sobre a seletividade da fase móvel, o que certamente representa uma vantagem em separações de misturas complexas de compostos [69].
Vale ressaltar que, em SFC e UHPSFC, é difícil avaliar exatamente qual a força de um ácido ou base empregado como aditivo na fase móvel, visto que as constantes de dissociação são diferentes daquelas conhecidas em meio aquoso. Além disso, está premissa é válida também para os analitos, ácidos e básicos, que devem apresentar constantes de dissociação diferentes em fluído supercrítico daquelas observadas em meio aquoso. Dessa forma, ao se utilizar um aditivo supostamente mais forte que o analito, pode-se apenas esperar que a escala de dissociação, determinada em fase aquosa, também se reproduza em fluído supercrítico [30].
Na cromatografia com fluído supercrítico, o pH da fase móvel não pode ser determinado, não sendo, portanto, um parâmetro estudado, tal qual ocorre em LC, durante o desenvolvimento de método por esta técnica. Entretanto, conforme descrito anteriormente, compostos são adicionados à fase móvel contendo CO2, de forma a alterar a polaridade da fase móvel, buscando aprimoramento de parâmetros como seletividade, retenção e desempenho cromatográfico. Tal fato demonstra a importância do entendimento das alterações na polaridade da fase móvel após adição de compostos ao CO2, a fim de prever, com maior exatidão, o comportamento de cada tipo de analito em estudo [70].
Um estudo recente de West et al. [70] avaliou o efeito das principais modificações da fase móvel realizadas em SFC sobre o pH da fase, através da leitura do pH com sondas solvatocrômicas. Os autores verificaram que os álcoois, bastante utilizados como modificadores orgânicos, reagem com o CO2 formando ácido alquilcarbônico, o que confere um caráter ácido à fase móvel, de pH de cerca de 5,0, indo de acordo com os estudos de Zheng et al., que concluíram que a fase móvel utilizando metanol como modificador aparentava um pH de cerca de 5,5 [71] . Além disso, o aumento da quantidade de metanol na fase móvel, como ocorre em um sistema de eluição por gradiente, resulta em maior formação de ácido, e, portanto, o pH da fase tende a reduzir ainda mais. A adição de aditivos como sais e bases, quando utilizados nas concentrações padrão (até 20 mmol/L), não resultam em aumento no pH, provavelmente devido às pequenas concentrações empregadas, mas parecem estabilizar o pH durante as corridas em eluição por gradiente. Os autores também verificam que o emprego de aditivos ácidos e água resultou em uma redução drástica do pH aparente da fase móvel, para abaixo de 1,7 [70].
1.2.4 Fases Estacionárias
A vasta faixa de polaridade dos solventes que podem ser adicionados ao CO2 permite uma alteração significativa da polaridade da fase móvel, a qual, por sua vez, possibilita a utilização de diferentes fases estacionárias, desde aquelas muito polares, baseadas em sílica e utilizadas em NPLC, até aquelas com grupos mais apolares, tais como o grupo octadecil ligado a sílica, muito utilizada em RPLC. Além disto, é possível utilizar fases com grupos químicos diferenciados ligados à sílica, tais como fenil, amina, diol, entre muitas outras. Desta maneira, é possível variar a seletividade da fase estacionária de forma muito abrangente, tornando as possibilidades de desenvolvimento analítico quase ilimitadas quanto a este quesito. Atualmente, existem colunas cromatográficas recheadas com fases estacionárias de ampla seletividade, com partículas de tamanho inferior a 2 µm, o que diminui o alargamento dos picos cromatográficos e permite análises mais rápidas. Outra característica importante da técnica de SFC está relacionada às baixas temperaturas
utilizadas no sistema, que impedem a degradação dos compostos termicamente instáveis [30].
Em seus artigos de revisão, West et al. [30] e Lesellier [72] afirmaram que, dentre as diversas estratégias de desenvolvimento de método em SFC e em UHPSFC, a principal é a escolha da fase estacionária para garantir uma boa separação, em contraste com o observado em LC, na qual a composição da fase móvel representa a primeira grande etapa de otimização a ser realizada. Os autores explicam que é bastante recomendável que se disponha de alguns tipos de fase estacionária com diferentes seletividades, de forma a garantir a maior ortogonalidade possível, sendo então realizado um screening inicial com todas elas, de forma a selecionar aquelas mais promissoras. Somente em seguida, com as fases estacionárias previamente escolhidas, se prossegue com as demais etapas do desenvolvimento analítico.
Para auxiliar neste importante processo de seleção de fases estacionárias, existe um sistema de classificação baseado no uso da relação da energia linear de solvatação – Linear Solvatation Energy Relationship (LSER), desenvolvido por West e Lesellier [73] e detalhado em diversos trabalhos subsequentes dos autores na área [74–77]. Os autores estudaram uma centena de compostos e 28 diferentes fases estacionárias, e relacionaram a capacidade de realização de cinco tipos de interações de cada fase com o analito, calculadas em termos de coeficientes, sendo eles: e - transferência de carga, s - dipolo-dipolo, a - doação de ligações de hidrogênio, b - receptor de ligações de hidrogênio e v - dispersão. O objetivo do trabalho foi entender a influência da fase estacionária quando a fase móvel é extremamente diferente de uma fase aquosa, visto que a retenção em SFC e UHPSFC é mais fortemente influenciada pelas interações entre os solutos e a fase estacionária que o observado em HPLC, onde a influência da água é dominante.
Em seus trabalhos, West e Lesellier dividiram as fases estacionárias em três grandes grupos: não polares, polares e aromáticas [74–76]. Esta classificação auxilia na escolha da fase estacionária mais adequada para realização da separação de novos produtos, sendo que após extenso estudo, os autores demostraram que,
para compostos farmacêuticos, os quais frequentemente apresentam grupamentos polares, as colunas classificadas como polares devem ser preferencialmente escolhidas, a fim de se obter suficiente retenção dos analitos. A Figura 2 ilustra uma representação da classificação proposta, por Nováková et al. [29] em seu artigo de revisão sobre o assunto, onde cada tipo de coluna cromatográfica está alocado conforme sua capacidade de realizar algum dos tipos de interações descritas anteriormente.
Figura 2. Classificação das Fases Estacionárias de acordo com Nováková et al. [29].
Pode-se verificar neste diagrama que colunas polares, como por exemplo aquelas baseadas em sílica (BEH) e sílica modificada (BEH 2-EP), e colunas apolares, que não apresentam nenhum grupamento polar (por exemplo, HSS C18) são alocadas em regiões opostas, com as fases apolares na esquerda e as polares à direita. Entre elas, fases com comportamento híbrido podem ser encontradas, como por exemplo, as fases aromáticas fluorfenil no topo. Segundo Galea et al. [78], colunas localizadas em regiões próximas no diagrama apresentam seletividade similares, embora alguma variação neste parâmetro ainda possa ser observada. Entretanto, quando dois componentes não são devidamente separados em uma dada coluna, deve-se buscar uma coluna localizada em outra parte do diagrama,
indicando que ela apresenta diferente capacidade de separação, e, portanto, poderá proporcionar a adequada separação dos analitos.
Um estudo recente realizado por Khater e West [79] monstrou que cinco fases estacionárias com partículas menores que 2 µm (HSS C18 SB, XSelect CSH Fluorofenil, BEH, BEH 2-EP e BEH RP18 Shield) podem ser utilizadas para a realização de uma triagem inicial durante o desenvolvimento de métodos por UHPSFC, pois estão alocadas em posições diferentes do diagrama ilustrado na Figura 2. Da mesma maneira, West e Lesellier [80] também descreveram como escolher os tipos de fase estacionárias para realização de um estudo ortogonal, empregando diferentes tipos de colunas cromatográficas. Segundo os autores, quando uma fase estacionária apolar é utilizada, como C18 (capeada), compostos aromáticos e hidrofóbicos são mais retidos, enquanto compostos polares são menos retidos, comportamento este similar ao observado em RPLC, sendo que a adição de modificador orgânico polar na fase móvel (por exemplo, metanol, etanol, acetonitrila) reduz a retenção da maioria dos compostos [72]. Para fases estacionárias polares, como cianopropil ou aminopropil, analitos mais polares são mais retidos, enquanto espécies hidrofóbicas e de alta massa molar eluem primeiro, tal como observado em NPLC, sendo que diferentes tipos de colunas polares resultam em diferente seletividades [72]. Entretanto, quando se utilizam fases estacionárias com diferentes características de polaridade, tais como C18 junto a outro grupamento polar, ou ligantes aromáticos (fenilpropil, pentafluorofenilpropil), a retenção não se caracteriza mais como similar à fase reversa ou fase normal, mas a um tipo de retenção única para SFC e UHPSFC. Dessa forma, uma coluna C18 capeada pode apresentar resultados de retenção bastante diferentes de uma coluna C18 não capeada, devido à presença dos grupamentos silanóis livres em sua estrutura, sendo possível que esta diferença de seletividade observada possa ser útil, dependendo das características dos analitos em estudo [80,81].
Muitas colunas utilizadas nesta classificação realizada por West e Lesellier são de HPLC, pois ainda existem relativamente poucos tipos de fase estacionárias produzidas especificamente para SFC e UHSFC [30]. Entretanto, muitos grupos de pesquisadores vem desenvolvendo tipos de fases estacionárias específicas para estas técnicas [82,83], com particular interesse nas fases
estacionárias baseadas em ligantes de líquidos iônicos, que podem ser úteis para separação de misturas de compostos ácidos e básicos, característica muito frequente em produtos de interesse farmacêutico [84]. Além disso, as fases estacionárias mais modernas de boa qualidade são altamente reprodutíveis lote a lote, garantindo o desenvolvimento de métodos robustos, além de sofrerem degradação da fase muito lentamente, sob as condições padrão de análise [85].
1.2.5 Desempenho Cinético
A dimensão da coluna cromatográfica também constitui um importante parâmetro a ser avaliado no desenvolvimento do método analítico. Desfontaine et al. [51] descreveram que a dimensão da coluna cromatográfica deve ser determinada de acordo com o volume morto do sistema, sendo bem estabelecido que o volume morto do sistema deve representar no máximo 10% da variação total (soma da variação relativa ao sistema e à coluna analítica), a fim de garantir que a maior porção da eficiência gerada pela coluna seja aproveitável. Para os sistemas de SFC mais modernos (UHPSFC), a variância é de 85 μL2, muito maior que a observada
em sistemas de UHPLC, com cerca de 10 μL2
de variação. Dessa forma, as colunas com tamanho de partículas reduzidas, menores que 2 µm, largamente utilizadas em UHPLC, não seriam compatíveis com sistemas de UHPSFC, mesmo os mais modernos. Isso porque a variação deste tipo de coluna é de cerca de 100 μL2
para coluna 50 mm x 2,1 mm x 1,7 µm, representando 45 % da variação total sistema/coluna, muito maior que o valor aceitável. Colunas com diâmetro de 4,6 mm seriam as mais adequadas, porém, a vazão necessária para estas colunas seria maior que o suportado pelos equipamentos, além do consumo de solvente ser extremamente elevado. Os autores concluiram que a melhor relação entre eficiência e consumo de solvente seria obtida com colunas com de 100 mm x 3,0 mm, sendo nestas condições a técnica de UHPSFC bastante competitiva com o UPHLC, do ponto de vista cinético.
Originalmente, partículas menores que 2 μm foram desenvolvidas para LC, a fim de atender a demanda industrial que visava aumento da eficiência na separação e redução de tempo de análise [86]. A introdução de colunas com
partículas menores que 2 μm é relativamente recente [87], sendo realizada antes mesmo do surgimento da nova geração de cromatógrafos de fluido supercrítico no mercado, o que limitou o ganho de eficiência observada com estas colunas, devido ao alto volume do sistema, associado à limitada capacidade de pressão das bombas dos equipamentos da época.
Entretanto, com o desenvolvimento da nova geração de cromatógrafos, a vantagem cinética da utilização de partículas pequenas, menores que 2 μm, pôde ser claramente observada. Uma forma de avaliar a eficiência do sistema cromatográfico, e em particular, da coluna cromatográfica, é através de uma curva que relaciona a altura equivalente a um prato (H) e a velocidade linear da fase móvel (μ) que é a curva de van Deemter (Equação 1).
(Equação 1)
A Equação 1 mostra os três diferentes fatores que afetam o valor de H, e, portanto, a eficiência da separação. O termo A está relacionado às diferentes trajetórias (caminhos múltiplos) do analito no leito cromatográfico e também à difusão de Eddy, quando as moléculas do analito se prendem em poros presentes na fase estacionária, de onde só saem por meio de difusão, sendo que tal termo não possui qualquer relação com a velocidade linear da fase móvel empregada. Uma vez na coluna em contato com a fase móvel, o analito tende a difundir em todas as direções, incluindo o sentido longitudinal. Esta difusão está descrita pelo termo B da equação e é responsável por um alargamento da banda. A importância deste termo está relacionada ao tempo de permanência do analito na coluna e à velocidade linear da fase móvel, sendo que quanto maior a velocidade, menor a difusão observada, aumentado da eficiência. O coeficiente C representa a cinética de transferência de massa do analito entre as fases móvel e estacionária, que deve ocorrer a fim de garantir a separação dos diferentes compostos da amostra, sendo diretamente proporcional à velocidade linear da fase móvel [88]. A Figura 3A mostra graficamente o comportamento de cada um destes coeficientes descritos acima
sobre o valor de H em função de μ, além de mostrar uma curva combinada com os efeitos de todos os fatores simultaneamente. A Figura 3B apresenta as curvas de van Deemter obtidas com colunas de tamanho de partícula de 3,5 μm (em SFC e HPLC) e de 1,7 μm (em UHPSFC e UHPLC), utilizando amostra de butilparabeno, com fase móvel de H2O:ACN e MeOH:CO2, respectivamente, a fim de comparar o efeito da redução do tamanho da partículas e das propriedades de cada sistema sobre a eficiência na separação [89].
Figura 3. Curva de van Deemter: (A) Relação de cada termo em função de µ (adaptado da referência [90]); (B): Curvas de van Deemter para as técnicas de HPLC, UHPLC, SFC e UHPSFC (adaptado da referência [89]).
