TÍTULO: DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS CONTRA T. GONDII EM AMOSTRAS COM CONCENTRAÇÕES VARIADAS DE IGG POR ENSAIO DE CAPTURA DE IGG EM PROTEÍNA A E REAÇÃO COM ANTÍGENO DE ALTA SENSIBILIDADE.
TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: Biomedicina SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO(ÕES): CENTRO UNIVERSITÁRIO DAS FACULDADES METROPOLITANAS UNIDAS -FMU
INSTITUIÇÃO(ÕES):
AUTOR(ES): ALINE BASTOS DIAS DOS PASSOS AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): HEITOR FRANCO DE ANDRADE JUNIOR ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ANDREA DA COSTA COLABORADOR(ES):
1.RESUMO
Reações de detecção de anticorpos utilizando antígeno adsorvido em fase sólida dependem de diluição adequada da amostra biológica, como soros. Algumas amostragens não permitem esta diluição precisa, como coletas em papel filtro ou sobrenadantes de purificações celulares, resultando em menor sensibilidade e especificidade. Isto é um problema em modelos experimentais, onde o pequeno volume de sangue de animais experimentais obriga seu sacrifício e inviabiliza coletas múltiplas. A adsorção à fase sólida de quantidade fixa de ligante de anticorpos permitiria a uniformização da quantidade de IgG capturada, sem interferência da sua origem, desde que houvesse vasto excesso de anticorpos ou alta sensibilidade do ensaio. O uso de ligantes específicos de IgG usados para purificação por afinidade, como a proteína A de Staphylococcus aureus (SPa) ou proteína G de Streptococcus sp., podem ser uma ferramenta útil para um reconhecimento antigênico mais preciso em ensaios em fase sólida. A SPa se liga a duas moléculas de IgG pela sua porção Fc liberando quatro sítios Fab de reconhecimento antigênico, que poderiam reagir com antígenos marcados. Esta determinação permitiria comparar precisamente amostras pequenas de material de volume desconhecido, obtidos de modelos experimentais desta infecção ou de suas vacinas, sem envolver a necessária morte do animal experimental para coleta do soro e permitindo uma comparação adequada. Neste projeto pretendemos padronizar a detecção quantitativa de anticorpos específicos anti-T. gondii utilizando ensaios de captura de IgG em proteína A adsorvida na fase sólida, para fixar a massa de IgG total e quantificação relativa dos anticorpos específicos por reação com antígeno de T. gondii conjugados a marcadores de alta sensibilidade, como o sistema avidina-biotina, em modelos experimentais de vacinação para toxoplasmose.
Palavras chaves: ELISA, proteína A, IgG, determinação, modelos experimentais, toxoplasmose.
2. INTRODUÇÃO
Anticorpos, ou imunoglobulinas são glicoproteínas sintetizadas e excretadas por células plasmáticas derivadas dos linfócitos B, em resposta a moléculas estranhas. Estas moléculas são chamadas antígenos e o seu reconhecimento pelo sistema imune resulta na produção seletiva de anticorpos que são capazes de se ligar a antígenos específicos (Yewdell et al.,2005). Anticorpos específicos IgG são produzidos numa resposta posterior a uma infecção e pode ser retida no hospedeiro durante um longo período. A detecção de IgG pode indicar tanto uma infecção quanto a vacinação prévia contra um agente (Romero-Steiner et al., 2009). O ensaio imunoenzimático (ELISA) é a técnica de laboratório mais usada para mensurar a concentração de anticorpos ou antígenos em solução, trata-se de um método popular para a avaliação e diagnóstico de diversas infecções como na toxoplasmose (Rodrigues et al., 2015).
Os ensaios imunoenzimático apresentam-se muito sensíveis e são a técnica preferencial para revelação de anticorpos, utilizando antígenos específicos adsorvidos na fase sólida, seguido de reação com diluições fixas do soro e diferentes sistemas de revelação do anticorpo ligado (Shah & Maghsoudlou, 2016). Em geral, estes ensaios apresentam uma boa discriminação qualitativa, embora apresentem alguns problemas relacionados à sensibilidade e especificidade, o que levou a criação de sistemas de análise como curvas ROC (Hajian-Tilaki, 2013) e índices de sensibilidade e especificidade (Florkowski, 2008). Os testes qualitativos são de difícil padronização pela quantidade variável de imunoglobulina no soro, quer seja IgG ou outras classes (Khamis et al., 2016). Além disso, o sistema de diluição padronizada implica em uma coleta de sangue e separação do soro após coagulação, o que não pode ser feito em volumes abaixo de 50 µL, o que implica em sacrifício de animais experimentais para uma única coleta de sangue, em especial camundongos, o que ocorre na maioria dos estudos. Outro problema está relacionado ao tipo da coleta ou a conservação de amostras em sistemas menos convencionais, como em sangue caudal de camundongos em papel filtro, com recuperação por eluição, seco, porém estas abordagens levam a um aumento no tempo de ensaio e correções adicionais com seus próprios erros intrínsecos, devendo ser usado apenas de forma qualitativa. A detecção do anticorpo ligado ao antígeno em ELISA é obtida pela atividade da enzima conjugada ao anticorpo secundário através da incubação junto a um substrato que produzirá um produto mensurável e com isso o elemento crucial para a detecção é a interação especifica de um anticorpo a um antígeno. A
especificidade de um anticorpo liga-se apenas ao epítopo do antígeno estudado pelas suas frações Fab (Schroeder et al., 2009). A intensidade de ligação de um anticorpo a um único epítopo, definida como afinidade, a rapidez desta ligação e o tempo de exposição para que ela ocorra são determinantes para imunoensaios (Forsström et al., 2015). Para imunodetecção é necessário expor o anticorpo ao epítopo com tempo suficiente para que a reação ideal ocorra e também e permita a remoção dos anticorpos livres por lavagem. Isto é obtido facilmente em fase sólida ou partículas revestidas de epítopo como nas reações de ELISA. Neste modelo podemos expor quantidades variáveis de imunoglobulina a uma quantidade fixa de ligantes. Isto leva a possibilidade de que ocorra uma oferta de ligantes menor que a oferta de anticorpos específicos, independente do sistema de detecção usado no ensaio. Como utilizamos sistemas de detecção enzimáticos com conjugados reveladores do anticorpo ligado ao antígeno, a sensibilidade e quantificação do processo pode ser prejudicado pela reação exponencial da enzima reveladora e pela utilização de absorbância, uma medida também exponencial, o que torna as reações sensíveis ao extremo, mas de baixa quantificação relativa entre amostras positivas.
Na avaliação de vacinas, onde a quantidade de imunoglobulinas produzidas é importante, os ELISA clássicos com quantidades vastas de antígeno no suporte sólido podem não oferecer diferenças entre as quantidades de imunoglobulinas especificas produzidas, em especial no caso de grande quantidade de anticorpos específicos, o que pode ser compensado com diluições menores de soro. Em maiores diluições do soro, seria possível medir com certeza uma quantidade de imunoglobulinas pelo excesso de antígeno disponível, mas estes ensaios tem dependência de conjugados de alta sensibilidade, reagentes com menores quantidades de anticorpos. Em vacinas, um dos critérios imunológicos para a sua eficiência é a produção de anticorpos específicos, mas frequentemente há necessidade de comparar diversas imunógenos, com variação de antígenos, adjuvantes ou vias de administração, todas com capacidade de induzir qualitativamente anticorpos específicos, mas com difícil comparação entre elas, seja pela variação entre animais ou de resposta imune, que deverão ser testados em estudos de proteção posteriormente e são preciosos. O uso de sacrifício do animal para coleta de sangue para determinação de anticorpos não permite o desafio do mesmo animal, a melhor ferramenta de detecção de eficiência vacinal.
Técnicas alternativas, como a coleta de sangue em papel, são de difícil quantificação, embora possa ser aprimorada pela quantificação de sangue total pela detecção de
hemoglobina contida no papel, técnica usada anteriormente por nosso grupo (Zorgi et al.,2011), mas a quantificação é trabalhosa e esbarra nos limites de excesso de anticorpo nas amostras com maior quantidade de sangue.
Assim, há necessidade de um desenho alternativo para detecção de anticorpos que permita uma quantificação relativa da proporção de anticorpos específicos, através da inversão do sistema de reação, passando o anticorpo total a ser fixo de maneira regular na fase sólida e revelação com algum tipo de conjugado ao antígeno. Este tipo de ensaio é frequente em casos de detecção de IgM, imunoglobulina pentamérica. A IgM tem dez sítios de ligação ao antígeno, o que gera uma amplificação da detecção por antígenos conjugados, como na toxoplasmose (Kaul et al., 2004). Para IgG, que é monomérica, o problema é mais complexo dada apenas a presença de dois sítios de ligação ao antígeno (Schroeder et al., 2009). Assim, usando a captura direta, ou seja, a sensibilização com anticorpo, a atividade do conjugado antigênico deveria ser extremamente alta para permitir a sua detecção. A adição de biotina ao antígeno seguida de revelação com avidina peroxidase, daria uma amplificação adicional ao sistema, pela ligação de várias biotinas ao extrato antigênico. Uma alternativa seria a captura por anticorpos anti-IgG, que selecionaria não só a classe de anticorpos, mas também poderia aumentar a sensibilidade pela ampliação dos sítios de ligação ao antígeno. Além disso, ligações do anticorpo contra outras partes da IgG poderia levar a redução da exposição dos sítios Fab de ligação ao antígeno.
Algumas bactérias usam como evasão a produção de proteínas de superfície que são capazes de aderir a proteínas do soro e assim passarem a ser recobertas destes antígenos, escapando da resposta imune. Entre estas, a proteína A do S.aureus e a proteína G de Estreptococos apresentam uma característica especial de se ligarem a porção Fc da imunoglobulina expondo apenas o Fab para o meio e assim não sendo reconhecidas pelo sistema complemento (Aybay, 2003). Estudos para detecção de imuno-complexos circulantes ou para retirada de imunoglobulinas indesejadas do sistema foram desenvolvidos utilizando bactérias fixadas contendo proteína A (Braun et al., 1998), a partir destes achados estas proteínas ligadoras de IgG foram purificadas e esta particularidade tem sido muito utilizada para o reconhecimento de IgG usando proteínas puras conjugadas a marcadores como em ensaios de microscopia eletrônica usando proteína A ouro para identificar os anticorpos ligados (Juan—Franco et al., 2013). Como a proteína A se liga a duas moléculas de IgG pelo seu Fc, com consequente exposição de quatro sítios Fab por cada molécula, ela é um substrato melhor para ser adsorvido em fase sólida e
ligar a uma quantidade fixa de IgG por poço sem interferir na ligação do epítopo com a fração Fab (Schroeder et al., 2009). Para a revelação da especificidade dos anticorpos poderíamos utilizar antígenos específicos conjugados a reveladores de alta eficiência, como sistema de ampliação ou as soluções ultrassensíveis de TMB (Frey A et al.,2000) Uma vantagem adicional deste método seria a capacidade de usar o mesmo tipo de reagentes em sorologia de diversas espécies animais, pois a proteína A apresenta capacidade de ligação com IgG de diferentes espécies, como por exemplo camundongos, coelhos, humanos e outros animais (Richman et al., 1982, Abbey et al., 2003). Obviamente o número de marcadores ou enzimas ligadas diretamente ou indiretamente ao epítopo e, portanto, ao anticorpo especifico é o que irá nortear a sensibilidade do ensaio.
Assim, neste trabalho teremos como objetivo padronizar métodos de detecção quantitativa de IgG especifica contra T. gondii, utilizando a captura por proteína A de IgG, visando maior eficiência e sensibilidade na detecção quantitativa de IgG especifica, utilizando como soroteca, soros com sorologia previamente conhecida, para validação da técnica, com controle de IgG no estudo do desenvolvimento de vacinas na toxoplasmose experimental.
3. OBJETIVOS
Geral
Desenvolvimento e padronização de ensaios imunoenzimáticos para otimização da detecção de IgG especifica na toxoplasmose experimental.
Específicos
Produzir antígeno total de taquizoítos de T.gondii biotinilados; Dosagem de anticorpos IgG anti-T.gondii por ELISA;
Avaliar diferentes preparações de soro para ensaio no teste ELISA como: soro total e soro obtido a partir da eluição em papel filtro;
4. METODOLOGIA
Parasitas
Taquizoítos da cepa RH serão mantidos por passagens sucessivas em camundongos BALB/c. Os animais previamente infectados serão eutanasiados com dose letal de anestésico e o peritônio será lavado com solução tamponada com fosfato de sódio 0.01M pH7.2 (PBS), contendo penicilina cristalina 2500U/mL e estreptomicina 10mg/mL. Após a quantificação em câmara de Neubauer, os taquizoítos serão inoculados intraperitonealmente (i.p.) em novos animais.
Obtenção de antígeno salino de Toxoplasma gondii (Camargo et al., 1978)
Os parasitas obtidos do exsudato peritonial de animais previamente inoculados serão filtrados em filtro de policarbonato de 3-5 uM de diâmetro e recuperados por centrifugação. O pellet de taquizoitos livres de células do hospedeiro ou de cultivo de tecido, são suspensos em solução hipotônica(PBS 0.1X) e lisados por ciclos de congelamento e descongelamento e sonicação (Sonic Dismembrator, QuigleyRochester Inc., USA), a 40 ciclos por 5-10 períodos de 30 segundos, em banho de gelo, sendo os ciclos repetidos até a lise completa dos agentes à microscopia de contraste de fase . Em seguida, o lisado será submetido a centrifugação a 10000g por 30 minutos a 4º C, em centrífuga refrigerada Eppendorf 5403, sendo o sobrenadante utilizado como antígeno solúvel de T.gondii (STAG). A proteína total será determinada pelo método de Bradford, utilizando gama-globulina humana como padrão (Bradford, 1976). As alíquotas serão mantidas à
-80 °C até o momento do uso, nos ensaios de ELISA.
Biotinilação de antígeno de extrato total de taquizoítos de Toxoplasma gondii para ensaio de captura de IgG por proteína A
A biotinilação do antígeno será realizada de acordo com as instruções do fabricante de biotina (Sigma). Alíquotas do antígeno de taquizoítos de T. gondii previamente preparados (item 2) e a quantidade de biotina (EZ-LinkSulfo NHS-Biotin, Sigma) necessária para
biotinilar o antígeno será calculada através da seguinte fórmula: ml proteína x (massa de proteína em mg/ ml proteína) x (mmol proteína/ massa de proteína em mg) x (EM mmol biotina/mmol proteína) = mmol biotina onde: EM = excesso molar desejado de biotina em relação à proteína. A ligação será obtida por incubação de 1h em temperatura ambiente e finalizada pela adição de glicina 0.1M pH8.0 para o bloqueio de biotina livre. O extrato antigênico biotinilado obtido será novamente aferido pelo método de Bradford e estocados até o momento do uso.
Obtenção de amostras de soro
As amostras de soro utilizadas serão obtidas do bio-repositório do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Serão utilizadas amostras obtidas de sangue caudal de camundongos e amostras de soro total humano.
ELISA de captura para detecção de anticorpos IgG
Placas de 96 poços de poliestireno serão sensibilizadas com 100µl (10µg/ml) de Proteína A suspensa em tampão carbonato de sódio 0,1M pH 9,5, por 20hs à 4º C em câmara úmida por aproximadamente 18 hs à 4 °C em câmara úmida. Após a sensibilização as placas serão lavadas em lavadora de placas TECAN com PBS contendo 0,02% de Tween 20 (PBST) e bloqueadas com solução protéica PBS + albumina bovina (BSA) 1% (Sigma®), durante 1 hora em estufa à 37 °C. Após o bloqueio, as amostras de soros (100µl/poço) diluídas em Tampão contendo HEPES 50mN e BSA 0.05% pH 7.5, serão depositadas nas placas e incubadas a 37º C por 1 hora. Após novas lavagens com PBST, foram aplicados 100µl por poço de diluições de antígeno total de taquizoítos de Toxoplasma gondii biotinilado a concentrações previamente padronizadas com incubação de 1 hora à 37º C. Após a incubação com antígeno biotinilado e novas lavagens serão adicionados 100µl por poço de diluições de conjugados Avidina peroxidase (Sigma®), com incubação por 1 hora à 37º C. Após lavagens, a revelação da reação será realizada pela adição de TMB ( Sure blue Microwell Peroxidase substrate KPL) com interrupção após 30 minutos pela adição deHCL 4 N. As leituras das densidades ópticas (D.O) serão realizadas em leitor de microplacas Multimode Microplate Reader FilterMax FS5 (Molecular Devices®, Sunnyvale, Califórnia) no filtro de absorbância de 450nm.
Após a determinação da quantidade da quantidade de Proteína A, soro e conjugado, os ensaios serão padronizados em placas de 384 poços para a otimização dos ensaios. Placas de 384 poços de poliestireno serão sensibilizadas com 20 µl (1µl/ml) de Proteína A suspensa em tampão carbonato de sódio 0,1M pH 9.5, por 20h a 4°C em câmara úmida por aproximadamente 18hrs á 4°C em câmara úmida. Após a sensibilização as placas serão lavadas em lavadora de placas TECAN com PBS contendo 0,02% de Tween 20 (PBST) e bloqueadas com solução proteica PBS + albumina bovina (BSA) 1% (Sigma®), durante 1 hora em estufa à 37 °C. Após o bloqueio, as amostras de soros (20µl/poço) diluídas em Tampão contendo HEPES 50mN e BSA 0.05% pH 7.5, serão depositadas nas placas e incubadas a 37º C por 1 hora. Após novas lavagens com PBST, foram aplicados 20µl por poço de diluições de antígeno total de taquizoítos de Toxoplasma gondii biotinilado a concentrações previamente padronizadas com incubação de 1 hora à 37º C. Após a incubação com antígeno biotinilado e novas lavagens serão adicionados 20µl por poço de diluições de conjugados Avidina peroxidase (Sigma®), com incubação por 1 hora à 37º C. Após lavagens, a revelação da reação será realizada pela adição de TMB ( Sure blue Microwell Peroxidase substrate KPL) com interrupção após 30 minutos pela adição de HCL 4 N. As leituras das densidades ópticas (D.O) serão realizadas em leitor de microplacas Multimode Microplate Reader FilterMax FS5 (Molecular Devices®, Sunnyvale, Califórnia) no filtro de absorbância de 450nm.
5. RESULTADOS PRELIMINARES
Até o dado momento, foram feitos experimentos com diluições em concentrações diferentes de antígenos biotinilados de T. gondii. As diluições testadas foram 1:200,1:400,1:800 e 1:1600. Dentre essas diluições podemos observar que a diluição de 1:800, é que tem se diferenciado melhor, dentre as demais.
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