TÍTULO: “EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DO EXTRATO DE PIMENTA “ DEDO DE MOÇA” DURANTE A PRENHEZ DE RATAS WISTAR FÊMEAS ADULTAS”
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE SÃO PAULO INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): MARIANA CRISTINA CESAR, ALANA RODRIGUES ALVES AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): MÉRCIA TANCREDO TOLEDO ORIENTADOR(ES):
RESUMO
A pimenta dedo de moça (Capsicum baccatum var pendulum) tem sua pungência determinada pela presença de capsaicinóides. O principal capsaicinóide é a capsaicina, um composto vaniloide responsável pela sensação de dor em queimação através da sensibilização de neurônios sensitivos por meio de receptores específicos. Estes receptores específicos liberam neuropeptídios com o CGRP (Calcitonin gene-related peptide) que interage com canais de K+ durante repolarização e afeta a contração uterina dada sua abundância nos nervos sensitivos do miométrio e endométrio das ratas. Assim, este trabalho tem por objetivo principal, analisar as possíveis alterações feto-placentárias induzidas pela administração do extrato de capsaicina durante o período de máxima atividade placentária em ratas Wistar prenhas sacrificadas ao 20º (a termo). Para a elaboração do extrato utilizado, foram utilizadas pimentas dedo de moça submetidas a secagem em estufa a 40º e trituradas para o preparo da extração alcoólica. Foram utilizadas 20 ratas Wistar prenhas, distribuídas em quatros grupos experimentais [CP = Controle Negativo, GCP = Grupo Controle Positivo, T1 = Tratamento 1 (0,25mL de extrato) e T2 =Tratamento 2 (0,5mL de extrato)]. O controle positivo recebeu soro fisiológico e o Negativo não foi gavado. As ratas foram pesadas três vezes por semana até a eutanásia (20º dia experimental) com halotano para a realização das cesárias, análise fetal, hepática e placentária. Foram encontradas alterações significativas no crescimento intrauterino dos fetos nos grupos tratamentos em relação aos grupos controles. Além disso, houve alterações placentárias das ratas do grupo tratamento 2, com deposição de material hialino atípico para a idade gestacional e alterações das estruturas vasculares. Não foram observadas alterações significativas quanto ao peso das ratas, à ingesta alimentar e hídrica, comportamento e pelagem das fêmeas adultas, peso placentário, número de fetos formados e número de corpos lúteos. Conclui-se, portanto, que o extrato da pimenta dedo-de-moça levou a uma restrição de crescimento dos fetos dos grupos tratados. São necessários mais estudos para análise dos demais padrões, visto que, possivelmente a pequena amostra tenha atrapalhado os resultados.
01. INTRODUÇÃO
A pimenta dedo de moça (Capsicum baccatum var. pendulum), pertencente à família Solanaceae, apresenta pungência devido a presença de capsaicinóides, principalmente da capsaicina (8-metil-N-vanilil-6-nonenamide).
Entre as principais substâncias presentes na composição química da pimenta estão os carotenoides, importantes para o valor nutricional e coloração, e
capsaicinóides. Estes, são alcaloides que fornecem a pungência (1) e são derivados
de substâncias não voláteis e se concentram na placenta, tecido localizado na parte interna próxima as sementes, e são liberados quando há dano físico às células da
pimenta.(2,3) A presença de capsaicinóides nas pimentas faz a proteção da semente,
para a sua germinação, por atuarem como antibacterianos e antifúngicos, ou por
protegerem os frutos maduros contra predadores indesejáveis(2). A capsaicina,
principal capsaicinóides, é uma substância branca, cristalina, solúvel em lipídeos e
formada a partir do ácido homovanílico.(4)
Sabe-se que a exposição excessiva à capsaicina pode acarretar irritação na área de contato ou problemas respiratórios, bem como alguns tipos de câncer pela ingestão de altas quantidades. Entretanto, essa substância tem sido extensivamente
estudada devido a propriedades farmacológicas.(5) A capsaicina é conhecida por ter
efeito analgésico, anticâncer, anti-inflamatório, antiobesidade, antioxidante(6) e, além
disso, por reduzir os níveis de glicose pós-prandial e melhorar a resistência à insulina. Os efeitos sensitivos podem ser obtidos através da interação da capsaicina com o receptor TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1) e sua ativação em fibras nervosas sensoriais C e Aδ(7). Este mecanismo exato é pouco conhecido(8), mas facilita
a liberação de neuropeptídios, como a substância P e o CGRP.(9) Um mecanismo
alternativo proposto para a regulação do CGRP, em vasos deferentes de ratos, foi através da aplicação de um agonista de TRPV1 que mostrou a atenuação da resposta de contração induzida eletricamente. Este efeito foi atribuído a liberação de CGRP dos terminais dos nervos sensitivos. Entretanto, em uma segunda exposição, sua capacidade para neutralizar a contração muscular foi reduzida, sugerindo
esgotamento do CGRP após a primeira estimulação.(7)
Sabendo que CGRP é o neuropeptídeo mais abundante nos nervos sensitivos
experimental de Klukovits (2003) que a capsaicina influencia a contração uterina por alterar a concentração de diferentes neuropeptídios nas fibras nervosas sensoriais, o que fez com que houvesse mudanças nas amplitudes de contração com determinadas frequências de estímulo. Isto é comprovado também pelo fato de que após danos a nervos sensoriais, o que causa depleção de neuropeptídios, a amplitude das contrações não muda depois de administrada qualquer dose in vitro de capsaicina. Alguns tipos de fibras nervosas sensoriais no útero de ratas podem sofrer degeneração durante a gravidez. Isto é um fenômeno conhecido, porém não
completamente compreendido.(11)
Os eventos neuroendócrinos na placenta, no feto e na mãe são críticos para o início e a manutenção da gravidez, para o crescimento e desenvolvimento do feto bem
como para o parto.(13) Dentre as alterações que ocorrem durante a gestação está o
desenvolvimento da placenta que apresenta funções como excreção, trocas gasosas,
manutenção da homeostasia, secreção de hormônios e hematopoese.(13,14) Em
roedores, há um labirinto placentário, estrutura bem desenvolvida e responsável pelas
trocas entre o sangue materno e o sangue fetal.(14)
Sendo assim, devido a falta de estudos que apontem sobre os riscos da administração crônica de capsaicina, este trabalho teve como objetivo avaliar esses riscos, observando-se se há ação na alteração do período gestacional devido a interação com os receptores e neuropeptídeos bem como a viabilidade e vitalidade fetal.
02. OBJETIVOS Objetivos Gerais
O presente estudo teve como finalidade avaliar o efeito da administração crônica de extrato de capsaicina durante a prenhez de ratas Wistar fêmeas adultas.
Objetivos Específicos
Neste trabalho, foram avaliados a integridade feto-placentária, a vitalidade e viabilidade fetal na administração crônica de extrato de capsaicina durante a prenhez.
03. MATERIAIS E MÉTODOS A) Animais
Para a realização deste projeto foram selecionadas vinte ratas Wistar fêmeas adultas e dois ratos Wistar machos adultos provenientes do Biotério da FCMS/PUC-SP, campus Sorocaba.
Todos os experimentos foram realizados obedecendo às normas de experimentação animal determinada pelo COBEA após a aprovação do comitê de
ética de experimentação animal (CEUA/FCMS; protocolo no2016/57).
Os animais foram mantidos em câmara de experimentação climatizada, com controle da temperatura (22ºC± 2ºC) e ciclo claro/escuro de 12/12 horas. Os animais foram alimentados com dieta normoprotéica (17% proteína), comercial (NUVILAB) e tiveram livre acesso a água.
B) Procedimento de Cruza
As vinte ratas selecionadas foram acasaladas com dois machos Wistar adultos (90 dias), colocadas três ratas para um macho em cada gaiola. E a detecção da prenhez foi realizada através de esfregaços vaginais obtidos das fêmeas pós-acasalamento, o que permitiu a avaliação da presença de espermatozoides no canal
vaginal das fêmeas, sendo esta determinante do início da prenhez como o dia zero.(15)
C) Elaboração do extrato
As pimentas tiveram os pedúnculos retirados, foram lavadas e em seguida, submetidas à secagem em estufa a 40ºC por 24 horas, com a finalidade de atingir teor de água adequado para o armazenamento. Posteriormente, as pimentas secas foram trituradas em liquidificador e, adicionaram álcool 70º INPM para atingir solução com concentração de 10% (10g/100mL). Assim, a solução permaneceu em repouso por sete dias coberta com filme de PVC para a extração. Na etapa seguinte, a solução foi submetida a filtração e evaporação. Então, o extrato foi diluído em soro fisiológico na
concentração 1:1 (v/v) para a gavagem.(16,17,18)
D) Administração do extrato
Os animais, após o acasalamento, foram distribuídos em 4 grupos experimentais à saber: grupo controle negativo GC (sem gavagem, n=5), grupo controle positivo GCP (gavagem de soro fisiológico, n =5), grupo tratamento com extrato de pimenta 1 (gavagem de 0.25 mL de extrato, n=5) e grupo tratamento com
extrato de pimenta 2 (gavagem de 0.5mL de extrato, n=5).(17)
Os animais tratados com extrato de capsaicina, receberam extrato após o período de implantação do embrião (3° dia de prenhez) até o período a termo (20º dia de prenhez), sendo realizada a gavagem três vezes por semana. Durante esse
período, as ratas foram analisadas quanto à ingesta alimentar e hídrica, alterações dos pelos e do comportamento.
E) Sacrifício e Coleta de Material
Os animais foram eutanasiados com Halotano, com sobredosagem em relação às doses consideradas anestésicas. O anestésico inalatório foi embebido em algodão
e colocado junto ao animal em ambiente fechado, como determina o CONCEA. (19)
Após a eutanásia, foram colhidos de cada animal, amostras de feto e tecido placentário. Todos os produtos de concepção foram pesados e avaliados quanto a integridade de sua estrutura. Os fetos tiveram seus comprimentos crânio caudal, face transversa, face longitudinal, diâmetro torácico e diâmetro abdominal mensurados com paquímetro para posterior análise. A placenta foi retirada e separada do embrião, ambos mantidos em fixador, formol 10%, para posterior inclusão das placentas em parafina. Os blocos obtidos originaram cortes histológicos de 5 micrômetros, que foram processados e corados por hematoxilina e eosina para posterior análise. Além disso, o fígado foi retirado, pesado e analisado quanto a alterações macroscópicas.
F) Análise morfológica das placentas
Foram escolhidas, ao acaso, duas placentas de cada corno uterino e, a análise morfológica da placenta foi realizada através da coleta de três imagens escolhidas aleatoriamente no aumento de 100x (objetiva 10) em campos ópticos, em microscopia de luz, através do uso de software de aquisição (IMAGE PRÓ-PLUS).
G) Número de fetos e sítios de reabsorção fetal
Foram expostos os cornos uterinos para a realização da contagem de fetos mortos, de reabsorção embrionária (aborto) e de fetos vivos.
Foram avaliadas a porcentagem de implantação uterina e a viabilidade fetal. Para a análise da porcentagem de implantação uterina faz-se o perfil da perda pré e pós-implantação da seguinte maneira: A taxa de perda pré-implantação foi calculada como: número de corpos lúteos - número de implantação x 100/ número de corpos lúteos. A taxa de perda pós-implantação foi calculada como: número de implantação
- número de fetos vivos x 100/ número de implantação. (20)
H) Análise Estatística
Os resultados das análises da espessura das camadas placentárias foram avaliados segundo Friedman test com nível de significância para 10% entre os grupos. Para a correlação do ganho de peso das ratas entre os diferentes grupos foi utilizado ANOVA. Os demais resultados foram analisados segundo método de análise de
variância não paramétrico aplicando-se o teste de Kruskall-Wallis, seguido de teste de Dunn’s de múltiplas comparações utilizando-se software PRISMA com nível de significância para 5%.
04. RESULTADOS
Durante a experimentação, todos os animais dos grupos controles positivos (GCP) e negativos (GC) e dos grupos tratamentos 1 e 2 foram pesados três vezes por semana durante a prenhez. A média de ganho de peso do GC foi 33,64 (± 18,28) g, do GCP foi de 81,18 (±16,06)g, do tratamento 1 foi de 28,45 (± 69,24 )g e do tratamento 2 foi 36,23 (±38,59). Entretanto não houve diferença significativa no ganho de peso das ratas (p>0,05).
Ao 21º dia de prenhez, os animais foram sacrificados e tiveram o fígado coletado, pesado e analisado macroscopicamente. Entretanto não foram observadas alterações macroscópicas e não houve alteração significativa do peso do fígado nos diferentes grupos (p>0,05).
Após a exposição dos cornos uterinos, foi avaliado o número de fetos vivos e mortos, bem como os sítios de reabsorção embrionária, através da quantificação de corpos lúteos no ovário direito e esquerdo, que indica o número de óvulos fecundados. E a quantidade de corpos lúteos no ovário e fetos no útero. A relação entre corpos lúteos e implantes permite calcular o índice de blastocistos implantados e os que não se implantaram correspondem, portanto, às perdas pré-implantação.
Pelos resultados apresentados, todos os animais, independente do tratamento, obtiveram alterações na implantação dos embriões. Verificou-se que nos animais do grupo controle negativo houve perda de implantação que variou de 0% a 18,18% dos fetos. Já no grupo controle positivo, e perda fetal foi significativa apenas na rata 1, com 12,5%. Nos animais do grupo tratado 0,25 mL de extrato a perda fetal variou de 0 a 100%. No grupo tratado com 0,5 mL de extrato, a perda de implantação variou de 0 a 100% de implantação, ocorrendo a perda foi de 100% em dois animais.
Não houve diferença significante no número de fetos e corpos lúteos dos diferentes grupos experimentais.
O peso fetal não apresentou diferença significativa entre as amostras: relação grupos controle x controle positivo (p<0,05); controle x tratamento com 0,5 mL (p<0,01); controle x tratamento com 0,25 mL (p<0,001); e entre os tratamentos 0,25 mL x ),5 mL (p< 0,001).
Após a retirada dos fetos, foram feitas medidas do comprimento craniocaudal, face longitudinal, face transversal, diâmetro torácico e diâmetro abdominal. Houve diferença entre as amostras dos grupos, em todas as medidas, com redução significativa dos comprimentos nos grupos tratamentos (p<0,01).
Na avaliação do peso placentário, houve diferença significativa entre os grupos controle negativo e tratamento com 0,25 mL (p<0.05), nos demais grupos não foram encontradas diferenças significativas (p>0.05).
A análise morfológica da placenta foi realizada através da coleta de imagens escolhidas aleatoriamente no aumento de 100x (objetiva 10) em campos ópticos em microscopia de luz, através do uso de software de aquisição, armazenamento de impressão das imagens microscópicas (IMAGE PRÓ-PLUS).
O material foi devidamente processado e incluído em parafina. Cortes histológicos de 5m foram corados em HE (Hematoxilina e Eosina). Foi tomado o cuidado de analisar as imagens sob o mesmo aumento microscópico, verificando-se a integridade dos tecidos placentários, decídua basalis, espongiotrofoblasto e labirintotrofoblasto.
Nas placentas das ratas do grupo controle negativo pudemos observar decídua basalis, espongiotrofoblasto e labirintotrofoblasto íntegros, com abundância de células, refletindo a integridade das camadas placentárias.
No grupo GCP foi possivel observar deposição de glicogênio placentário na região do espongiotrofoblasto, que garante a disponibilidade de glicose para o rápido crescimento fetal. Além disso, na região do espongiotrofoblasto pôde-se verificar a presença de células trofoblásticas em grande número indicando maturidade placentária.
Nas placentas do grupo tratamento 1 de extrato não foram observadas alterações, sendo que a decídua basalis, o espongiotrofloblasto e o labirintotrofoblasto encontravam-se preservados. Já no grupo tratamento 2 de extrato, verificamos a deposição de material hialino atípico para a idade gestacional, na região do espongiotrofloblasto, entre as células trofoblásticas. Além disso, observamos alterações na estrutura vascular pela precipitação de sangue materno entre os vilos maternos-fetais, na região labiríntica.
Os animais foram acompanhados quanto a alimentação e a hidratação, com pesagem da ração diária e ingestão de água durante o período do experimento e não
foram observadas alterações nesses consumos. Além disso, observou-se o comportamento e coloração dos pelos que também não se modificaram durante o tratamento.
05. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A capsaicina é conhecida por seus efeitos anti-neoplásicos, analgésicos, antioxidantes e antiobesidade, porém poucos estudos relatam os seus efeitos durante a gestação(6). Sendo assim, verificou-se que a principal alteração resultante da
administração do extrato da pimenta dedo-de-moça foi a diferença significativa entre as medidas do comprimento craniocaudal, face longitudinal, face transversal, diâmetro torácico e diâmetro abdominal dos fetos dos grupos de tratamento em relação aos grupos controles, indicando assim, um possível efeito da pimenta. Além disso, foram observadas alterações histológicas nas placentas das ratas do grupo tratamento com 0,5 mL de extrato, evidenciando que a substância interferiu na troca placentária, prejudicando o desenvolvimento fetal apenas no grupo que recebeu maior dosagem do tratamento. Não foram observadas alterações significativas entre o ganho de peso das ratas dos grupos controles e tratamentos (p>0,05). E situação similar foi percebida no peso placentário e do número de fetos e de corpos lúteos formados. Além disso, durante o experimento não foram observadas alterações na coloração e no comportamento dos animais, demonstrando a ausência de toxicidade das amostras de extrato administradas.(24)
Portanto, pode-se concluir que o extrato de pimenta dedo-de-moça interferiu na troca placentária, levando à uma restrição do crescimento intrauterino dos fetos. São necessários mais estudos para uma melhor avaliação dos demais parâmetros, como ganho de peso da rata e formação de fetos e corpos lúteos, possivelmente prejudicados pela pequena amostra.
06. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. SIMÕES, L.S. Extração e caracterização de oleorresina de Capsicum
obtida a partir de pimentas malagueta (Capsicum frutescens) e dedo-de-moça (Capsicum baccatum var.pendulum). 2014. 63f. Dissertação (Pós
graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa – MG.
2. SANTOS, V. S. F. Caracterização morfológica e determinação da
pungência em pimentas picantes. 2009. 114f. Dissertação (Mestrado em
Engenharia Agronómica - Produção Agrícola Tropical) - Universidade Técnica de Lisboa. Lisboa.
3. VALVERDE, R. M. V. Composição bromatológica da pimenta malagueta in
natura e processada em conserva. 2011. 54f. Dissertação (Mestrado em
Engenharia de Processo de Alimentos) -Universidade Estadual da Bahia. Itapetinga – BA.
4. BERKE, T. G.; SHIEH, S. C. Capsicum cultivars. Em: PETER, K. V. (Ed.). Handbook of herbs ans spices. Segunda Ed. ed. Woodhead Publishing Limited, 2012.
5. CHINN, M. S.; SHARMA-SHIVAPPA, R. R.; COTTER, J. L. Solvent extraction
and quantification of capsaicinoids from Capsicum chinense. Food and
Bioproducts Processing, v. 89, n. 4, p. 340–345, out. 2011.
6. ZHU, Zhiming et al. TRP channels and their implications in metabolic diseases. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology, v. 461, n. 2, p. 211-223, 2011.
7. RUSSELL, F. A. et al. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological reviews, v. 94, n. 4, p. 1099-1142, 2014. 8. LUO, Xiu-Ju; PENG, Jun; LI, Yuan-Jian. Recent advances in the study on
capsaicinoids and capsinoids. European journal of pharmacology, v. 650, n. 1, p. 1-7, 2011.
9. HOOVER, Donald B. Effects of capsaicin on release of substance P-like immunoreactivity and physiological parameters in isolated perfused guinea-pig heart. European journal of pharmacology, v. 141, n. 3, p. 489-492, 1987. 10. HERWEIJER, Geraldine et al. Characterization of primary afferent spinal
innervation of mouse uterus. Frontiers in neuroscience, v. 8, 2014.
11. KLUKOVITS, Anna et al. Role of capsaicin-sensitive nerve fibers in uterine contractility in the rat. Biology of reproduction, v. 70, n. 1, p. 184-190, 2004 12. FELDT–RASMUSSEN, Ulla; MATHIESEN, Elisabeth R. Endocrine disorders in
pregnancy: physiological and hormonal aspects of pregnancy. Best Practice
& Research Clinical Endocrinology & Metabolism, v. 25, n. 6, p. 875-884,
13. YEN,S.S.,The placenta as the third brain. San Diego,Department of Reproductive Medicine, University of California, 1994.
14. TOLEDO,M.T.,GOMES-MARCONDES,M.C., VENTRUCCI,G., Estudo das
camadas teciduais placentárias de ratas Wistar jovens adultas portadoras do carcinossarcoma de Walker 256. Campinas, UNICAMP,
Departamento de Fisiologia e Biofísica, 2005.
15. DAMASCENO, DEBORA CRISTINA et al. Anomalias congênitas: estudos experimentais. Belo Horizonte: Coopmed, 2008.
16. JUSTINO, Elaine Vaz; NASCIMENTO, Warley Marcos; BOITEUX, Leonardo Silva. Determinação da maturidade fisiológica de sementes de pimenta dedo-de-moça. Horticultura Brasileira, v. 33, n. 3, 2015.
17. BERNARD, Bruce K. et al. Studies of the toxicological potential of capsinoids: IV. Teratology studies of CH-19 Sweet extract in rats and rabbits. International
journal of toxicology, v. 27, n. 3 suppl, p. 41-57, 2008.
18. MADHUMATHY, A.P; AIVAZI, A-A.; VIJAYAN, V.A. Larvicidal efficacy of Capsicum annum against Anopheles stephensi and Culex quinquefasciatus.
Journal of Vector Borne Diseases, v.44, n.9, p.223-226, 2007.
19. CONSELHO NACIONAL DE CONTROLE DE EXPERIMENTAÇÃO
ANIMAL. MCTI: NORMATIVAS DO CONCEA. 2 ed. Brasília: Concea, 2015. 329 p. Disponível em: <http://www.mct.gov.br/upd_blob/0238/238343.pdf>. Acesso em: 07 dez. 2015.
20. LEMONICA, I. P.; DAMASCENO, D. C.; DI-STASI, L. C. Study of the embryotoxic effects of an extract of rosemary (Rosmarinus officinalis L.).Brazilian journal of medical and biological research= Revista brasileira
de pesquisas medicas e biológicas/Sociedade Brasileira de Biofisica...[et al.], v. 29, n. 2, p. 223-227
21. MELLO, J. R. B.; LANGELOH, A.; HABERMEHL, G.; KREBS, H. C.; BATATINHA, M.J.M.; ALMEIDA, C. R. C.; BASTOS, F. C.; BASSANI, M. L.; BARUFALDI, C. M.; ALVARES, F. T.; FRANCISCO, D. Avaliação do extrato aquoso de Crotalaria retusa Leguminosae sobre a fertilidade de ratas. Faculdade Veterinária UFRGS. Porto Alegre: Faculdade de Veterinária da UFRGS, v. 25, n.2, p.34-42, 2001.
