Aline Martins Cardozo
INOCULAÇÃO DE Azospirillum brasilense: EFEITO SOBRE CRESCIMENTO DE Zea mays EM SOLO NÃO ESTÉRIL E
QUANTIFICAÇÃO DE DNA BACTERIANO
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Ciências, área de concentração Recursos Genéticos Vegetais.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Carolina Maisonnave Arisi
Florianópolis 2017
AGRADECIMENTOS A Deus, por me manter sempre no caminho certo.
Aos meus pais Sérgio e Márcia e minha irmã Mayara, por me apoiarem em todas as decisões, pelo amor e pela motivação.
À minha orientadora, Ana Carolina Maisonnave Arisi, pela orientação, dedicação, por acreditar e confiar em mim.
À minha amiga, Kelly Justin da Silva, pela amizade, paciência em me ensinar e por ter contribuído grandemente para a realização deste trabalho.
Ao meu namorado Luís Felipe Rosman pelo apoio, carinho e paciência comigo.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular, em especial à Pamela Dall’Asta e Maryella Vargas, por também terem contribuído grandemente para a realização deste trabalho. A ajuda de vocês foi fundamental.
Ao professor Cláudio Roberto Fonseca Sousa Soares, que gentilmente cedeu seu laboratório para a realização de parte deste trabalho.
À CAPES e ao INCT/FBN por proporcionarem os recursos necessários para a execução deste trabalho.
À Universidade Federal de Santa Catarina, pela experiência de vida, crescimento profissional e pessoal.
A todos que de alguma forma participaram da minha formação como mestre.
CARDOZO, Aline Martins. Inoculação de Azospirillum brasilense: efeito sobre crescimento de Zea mays em solo não estéril e quantificação de DNA bacteriano. 2017. Dissertação (Mestrado em Recursos Genéticos Vegetais) – Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brasil.
RESUMO
A bactéria Azospirillum brasilense FP2 promove o crescimento de plantas através da fixação de nitrogênio, produção de fitormônios, melhoria geral do crescimento radicular e aumento da absorção de minerais e água, solubilização de fosfato, entre outros mecanismos propostos. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar o efeito da inoculação de A. brasilense FP2 sobre o crescimento de plântulas de Zea
mays cultivar Dekalb 390, através da avaliação de parâmetros de
crescimento das plantas, e também quantificar o DNA bacteriano nas raízes de milho por qPCR. Para quantificar A. brasilense em raízes de milho, os pares de iniciadores gênero específico AznifAF12/F19 e cepa específico AzoR2.1 foram testados. O experimento foi conduzido em vasos contendo solo não estéril, em casa de vegetação, em um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. As plântulas de milho foram coletadas aleatoriamente aos 7, 14 e 21 dias após a inoculação (DAI). Os resultados demonstraram que as plantas inoculadas com A. brasilense FP2 apresentaram um aumento da massa fresca total de raiz e parte área aos 7 e 14 DAI, na massa fresca das raízes frescas primárias e laterais aos 14 e 21 DAI, e maior comprimento da parte aérea aos 7 e 14 DAI, em relação às plântulas controle. Não houve amplificação de DNA de A. brasilense nas amostras das raízes inoculadas ou das plântulas controle, quando utilizado o primer AznifAF12/AznifAF19. Já usando o par de iniciadores AzoR2.1, a presença de A. brasilense foi detectada aos 7, 14 e 21 DAI em plântulas inoculadas. Um grande número de bactérias foi observado do sétimo dia (~108 UFC / g de raízes de milho) até ao vigésimo primeiro dia (~107 UFC / g de raízes de milho) após a inoculação. A presença de A.
brasilense não foi detectada nas raízes do tratamento controle. Em
conclusão, o crescimento do milho foi significativamente afetado quando inoculado com A. brasilense, demonstrando melhores taxas de crescimento. Para monitorar a inoculação das bactérias no solo não estéril, o par de iniciadores AznifAF12/F19 não foi eficaz. No entanto, o par de iniciadores AzoR2.1 foi eficiente e pode ser utilizado para
CARDOZO, Aline Martins. Inoculation of Azospirillum brasilense: effect on Zea mays growth in non-sterile soil and quantification of bacterial DNA. 2017. Dissertation (Masters in Plant Genetic Resources) – Postgraduate Program in Plant Genetic Resources, Federal University of Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil.
ABSTRACT
The rhizosphere bacterium Azospirillum brasilense FP2 promotes plant growth through nitrogen fixation, phytohormone production, improvement of root growth and enhanced uptake of minerals and water, phosphate solubilization and other proposed mechanisms. The objective of this work was to study the effect of inoculating A. brasilense FP2 on the growth of Zea mays seedlings cultivar Dekalb 390, by assessing certain growth parameters, and by quantifing bacterial DNA by qPCR. To quantify A. brasilense in inoculated maize roots, genus-specific primers AznifAF12/F19 and strain-specific primers AzoR2.1 were tested. The experiment was conducted in pots in a greenhouse. The experiment followed a randomized design with four replications and the seedlings were randomly collected at 7, 14 and 21 days after inoculation (DAI). Increases were observed in the total fresh weight of roots and shoots , fresh weight of primary and lateral roots at 14 and 21 DAI, and also in shoot length at 7 and 14 DAI for plants inoculated with A.
brasilense FP2 compared with the control seedlings. Regarding bacterial
DNA quantification, presence of A. brasilense was not detected in the control and in the inoculated root samples when using primer pair AznifAF12/AznifAF19. On the other hand, when using primer pair AzoR2.1, the presence of A. brasilense was detected at 7, 14 and 21 DAI in inoculated seedlings. A large number of bacteria were observed up to the 21th DAI (~107 CFU/g of maize roots). The presence of A. brasilense was not detected in all plants in the control. In conclusion, the response of maize was significantly affected when inoculated with A. brasilense, and to monitor inoculation of the bacteria in a non-sterile soil, the primer pair AznifAF12/F19 was not effective. However, the primer pair AzoR2.1 was efficient and can be used to monitor the population fluctuation of A. brasilense FP2 after the inoculation in maize.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO 2
Figure 2.1 Growth parameters of maize seedlings inoculated with A. brasilense FP2. Total root fresh weight (A), shoot length (B), shoot fresh weight (C), primary root length (D), primary and lateral root fresh weight (E) and seminal root fresh weight (F). * Statistically significant difference (P < 0.05) between inoculated and non-inoculated seedlings………...43 Figure 2.2 qPCR standard curves for A. brasilense quantification using A) Cq versus log DNA copy number. DNA extractions from A. brasilense strain FP2 pure culture as template DNA and AznifAF12/AznifAf19 primer pair. B) Cq versus log CFU. DNA extractions from mixtures of maize roots and A. brasilense culture as template DNA and
AznifAF12/AznifAf19 primer
pair.………...45 Figure 2.3 qPCR standard curves for A. brasilense quantification using A) Cq versus log DNA copy number. DNA extractions from A. brasilense strain FP2 pure culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair. B) Cq versus log CFU. DNA extractions from mixtures of maize roots and A. brasilense culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair.. ... 46 Figure 2.4 qPCR standard curves for A. brasilense quantification using A) Cq versus log DNA copy number. DNA extractions from A. brasilense strain FP2 pure culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair. B) Cq versus log CFU. DNA extractions from mixtures of maize roots and A. brasilense culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair.. ... 47 Figure 2.5 qPCR standard curve for total bacteria DNA quantification generated using DNA extractions from A. brasilense pure culture as template DNA and 16S rRNA primer pair. ... 48 Figure 2.6 Enumeration of log total bacterial DNA copy number by qPCR using 16S rRNA primer pair. Dekalb 390 cultivar seedlings were grown in non-sterile soil after inoculation with A. brasilense strain FP2. Samples were collected 7, 14 and 21 DAI. Data are presented as mean ± SD (n = 8)... 49
Figure 2.8 Enumeration of log maize DNA copy number by qPCR using ZM1 primer pair. Dekalb 390 cultivar seedlings were grown in non-sterile soil after inoculation with A. brasilense strain FP2. Samples were collected 7, 14 and 21 DAI. Data are presented as mean ± SD (n = ).………....….50
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1.1 Espécies descritas do gênero Azospirillum...21
CAPÍTULO 2
Table 2.1 Primers used for Azospirillum, Azospirillum brasilense FP2 strain-specific, bacterial DNA (16S rRNA) and maize DNA (Zea mays) quantification by qPCR)...40
Sumário
INTRODUÇÃO ... 17
CAPÍTULO 1 ... 19
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 19
1.1.1 O USO DE FERTILIZANTES NA AGRICULTURA ... 19
1.1.2 BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO VEGETAL ... 20
1.1.2.1 Azospirillum spp. ... 20
1.1.3 MECANISMOS DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO PLANTA-MICRORGANISMOS ... 24
1.1.3.1 Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) ... 24
1.1.3.2 Fitormônios ... 26
1.1.3.3 Solubilização de fosfato... 28
1.1.3.4 Biocontrole ... 28
1.1.4 GRAMÍNEAS E SUA IMPORTÂNCIA ... 29
1.1.4.1 Zea mays ... 29 1.1.5 PCR quantitativa (qPCR) ... 31 1.2 OBJETIVOS ... 33 1.2.1 OBJETIVO GERAL ... 33 1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 33 CAPÍTULO 2 ... 35
2 Azospirillum brasilense FP2 QUANTIFICATION IN MAIZE ROOTS UNDER NONSTERILE GROWTH CONDITION BY STRAIN-SPECIFIC qPCR ASSAY ... 36
2.1 INTRODUCTION ... 37
CONDITIONS ... 39
2.2.3 DNA ISOLATION ... 39
2.2.4 A. brasilense, TOTAL BACTERIA AND MAIZE DNA QUANTIFICATION BY qPCR ... 39
2.2.5 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM A. brasilense CULTURE ... 41
2.2.6 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM MAIZE ROOTS .. 41
2.2.7 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM MIXTURES OF PLANT ROOTS AND A. brasilense CULTURE ... 42
2.2.8 DETERMINATION OF COLONY FORMING UNITS (CFU) BY PLATE COUNT ... 42
2.2.9 STATISTICAL ANALYSIS ... 42
2.3 RESULTS ... 43
2.3.1 EFFECT OF Azospirillum brasilense FP2 ON MAIZE GROWTH . 43 2.3.2 qPCR PARAMETERS FOR A. brasilense QUANTIFICATION ... 44
2.3.3 A. brasilense DNA QUANTIFICATION IN MAIZE ROOTS BY qPCR ... 47
2.3.4 TOTAL BACTERIAL DNA QUANTIFICATION IN MAIZE ROOTS BY qPCR ... 48
2.4 DISCUSSION ... 51
2.5 CONCLUSION ... 53
CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS ... 54
INTRODUÇÃO
A manutenção de uma alta produtividade agrícola, combinada com um aumento da demanda global por alimentos para uma população crescente e o esgotamento dos recursos naturais, tornou-se um grande desafio. Até agora, o manejo tradicional de nutrientes para preservar a alta produtividade das culturas foi baseado, principalmente, em insumos como fertilizantes químicos. No entanto, nas últimas décadas, o rendimento das culturas não aumentou proporcionalmente ao uso de fertilizantes, levando a uma baixa eficiência de utilização de nutrientes e a um aumento de custos e de riscos ambientais (TILMAN et al., 2011; TILMAN et al., 2002).
Uma estratégia para manter a produtividade e diminuir a utilização de insumos químicos é explorar o uso de microrganismos benéficos em sistemas agrícolas (ANDREWS; HODGE; RAVEN, 2010). A utilização de microrganismos benéficos para as plantas é mais conhecida em espécies da família Leguminosae, no modelo de simbiose que envolve bactérias nodulíferas genericamente conhecidas como rizóbios. Entretanto, um grande número de bactérias diazotróficas do gênero
Azospirillum, reconhecidas como bactérias promotoras do crescimento
vegetal (BPCV), tem sido identificado em associação com as raízes das plantas da família Poaceae, e estão associadas à promoção do crescimento da planta (BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004).
Várias contribuições foram relatadas por investigadores como resultado da interação de plantas com bactérias do gênero Azospirillum. Dentre as vantagens conferidas às plantas destacam-se o aumento nos níveis de clorofila, nitrogênio, prolina na parte aérea e nas raízes e da condutância estomática, além de maior altura de planta, produção de biomassa, produção de grãos, desenvolvimento das raízes, tolerância ao estresse hídrico, entre outras (HUNGRIA et al., 2010; LANA et al., 2012; PANKIEVICZ et al., 2015; SAWICKA; SWÊDRZYÑSKA, 1998). Além disso, as bactérias do gênero Azospirillum também atuam em processos como a solubilização de fosfatos, controle biológico de patógenos e na produção e secreção de hormônios, tais como auxinas, etileno, ácido abscísico, citocininas e giberelinas (COHEN; BOTTINI; PICCOLI, 2008; HUNGRIA et al., 2010; MEHNAZ, 2015; SANTI; BOGUSZ; FRANCHE, 2013). Dessa forma, esses microrganismos proporcionam incrementos no desenvolvimento e na produtividade das culturas (HUNGRIA et al., 2010). Entretanto, sugere-se que os resultados deste tipo de interação sejam fortemente afetados por fatores relacionados com o solo, fatores ambientais, genótipo de plantas e de bactérias
(COMPANT; CLÉMENT; SESSITSCH, 2010; FERREIRA et al., 2013; KRAFFCZYK; TROLLDENIER; BERINGER, 1984; MOUTIA et al., 2010; MUS et al., 2016). Assim, o desenvolvimento de novos estudos com diferentes tipos de solos, cultivares, e cepas bacterianas é importante.
Contudo, a sobrevivência de A. brasilense na rizosfera e a colonização efetiva na planta são fatores cruciais para se obter um aumento no rendimento da cultura, sendo necessário métodos eficazes para monitorar as cepas inoculadas no rizoplano, rizosfera e tecidos vegetais (STETS et al., 2015). Técnicas como PCR e qPCR já foram utilizados para identificar isolados (BAUDOIN, COUILLEROT et al., 2010, SHIME-HATTORI et al., 2011), assim como para quantificar inoculantes de Azospirillum (COUILLEROT, et al., 2010, FALEIRO, et al., 2013) a partir de rizosfera, solo e plantas. Em um estudo prévio foi desenvolvido um ensaio de qPCR visando o gene nifA para quantificar
A. brasilense (FALEIRO et al., 2013). Recentemente, foi desenvolvido
um ensaio qPCR de estirpe específico para quantificar a estirpe FP2 de
A. brasilense em trigo inoculado (STETS et al., 2015).
A estirpe A. brasilense FP2 tem sido amplamente estudada e sua interação com o trigo tem sido elucidada (CAMILIOS-NETO et al., 2014, STETS et al., 2015). Em estudos anteriores, investigou-se a associação da estirpe de A. brasilense FP2 com duas cultivares de milho, DKB240 e P30F53 (CANGAHUALA-INOCENTE et al., 2013, FALEIRO et al., 2015).
Contudo, este é o primeiro estudo que mostra a interação da estirpe de A. brasilense FP2 com a cultivar Dekalb 390, a qual possui alto potencial de produção e estabilidade, além de apresentar boa resposta à inoculação com A. brasilense (FERREIRA et al., 2013). Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os parâmetros de crescimento de plântulas de milho cultivar DKB390 inoculadas com A. brasilense FP2 e quantificar o DNA bacteriano associado à planta por qPCR.
CAPÍTULO 1 1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1 O USO DE FERTILIZANTES NA AGRICULTURA
O nitrogênio é um elemento essencial na constituição de aminoácidos e proteínas e, assim, primordial para os seres vivos. Nos sistemas agrícolas, o nitrogênio também é fundamental, sendo considerado um dos principais nutrientes que são aplicados no solo para suprir a demanda das plantas e assim melhorar o rendimento de grãos das culturas. Este nutriente é limitante para o rendimento final dos cultivos, principalmente de plantas não-leguminosas, onde são aplicadas altas quantidades. Desta forma, a adição de nitrogênio para sustentar e aumentar o rendimento das culturas, é uma prática universal e fundamental no manejo da agricultura moderna; sendo também, uma das principais razões que permitiu que a produção agrícola acompanhasse o ritmo de crescimento da população humana (GRANT et al., 2012; ROBERTSON; VITOUSEK, 2009).
Em escala global, mais de 193 milhões de toneladas de fertilizantes químicos foram aplicados aos solos para melhorar o rendimento das culturas em 2014, sendo que aproximadamente 108 milhões de toneladas foram de adubos nitrogenados. No Brasil, o consumo de fertilizantes químicos atingiu 14 milhões de toneladas em 2012, sendo cerca de 4 milhões de toneladas de adubos nitrogenados (FAOSTAT, 2014a).
Entretanto, o nitrogênio mineral adicionado ao solo não é imediatamente absorvido pelas plantas, o que resulta em perdas de até 2/3 do fertilizante aplicado, gerando impactos negativos ao meio ambiente e aumentando o custo de produção (SYSWERDA et al., 2012). Isto inclui a lixiviação (contaminação de águas subterrâneas), o escoamento superficial (contaminação de águas superficiais), a eutrofização dos ecossistemas aquáticos, a volatilização da amônia e a emissão de N2, N2O e outros óxidos de nitrogênio, bem como efeitos sobre a diversidade microbiana (ADESEMOYE; KLOEPPER, 2009; BREDEMEIER; MUNDSTOCK, 2000). Além disso, há também a poluição gerada pela produção industrial desses fertilizantes, pois envolve o consumo de combustíveis e a emissão de gases poluentes para a atmosfera (WEBER; MIELNICZUK, 2009).
Diante desse cenário, a preocupação atual está em minimizar os efeitos negativos de fertilizantes químicos ao meio ambiente, e também
diminuir os custos de produção sem alterar a produtividade, para tanto, práticas sustentáveis devem ser adotadas. Uma alternativa é explorar o potencial de microrganismos benéficos, tais como os fixadores de nitrogênio que podem ser utilizados como inoculantes na agricultura (LUCY; REED; GLICK, 2004; LUGTENBERG; KAMILOVA, 2009; OKON; LABANDERA-GONZALEZ, 1994).
1.1.2 BACTÉRIAS PROMOTORAS DO CRESCIMENTO VEGETAL Bactérias promotoras do crescimento vegetal (BPCV) compreendem um grupo de microrganismos que são benéficos às plantas, visto a sua capacidade de colonizar as superfícies das raízes, rizosfera, assim como tecidos vegetais internos (DAVISON, 1988; KLOEPPER; LIFSHITZ; ZABLOTOWICZ, 1989).
As BPCV podem estimular o crescimento das plantas por meio de vários processos, incluindo a fixação biológica do nitrogênio (FBN); aumentando a atividade da nitrato redutase (HUERGO et al., 2008); por meio da síntese de hormônios e uma variedade de outras moléculas (MEHNAZ, 2015; PERRIG et al., 2007); por solubilização de fosfato (RODRIGUEZ et al., 2004) e exercendo o controle biológico de patógenos (CORREA et al., 2008). Em geral, acredita-se que a vantagem do crescimento das plantas através das BPCV se dá pelas diversas combinações destes mecanismos (BABALOLA, 2010; DOBBELAERE et al., 2001; HUNGRIA et al., 2010).
Uma vasta gama de gêneros de BPCV já foi descrita na literatura científica. São eles: Acetobacter, Acinetobacter, Alcaligenes,
Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus,
Beijerinckia, Burkholderia, Derxia, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Ochrobactrum, Pantoae, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas e Zoogloea (VERMA et al.,
2010). Com exceção das bactérias do gênero Rhizobium, as mais estudadas dentre as BPCV são as pertencentes ao gênero Azospirillum (BASHAN; DE-BASHAN, 2010).
1.1.2.1 Azospirillum spp.
Azospirillum é uma bactéria gram-negativa não-fermentativa,
pertencente à classe Alphaproteobacteria. Foi isolada pela primeira vez e nomeada em 1978 (TARRAND; KRIEG; DÖBEREINER, 1978). Atualmente é uma BPCV muito bem estudada em ensaios de laboratório
e a campo, sendo conhecida por sua capacidade de produção e excreção de fitormônios, solubilização de fosfato, produção de sideróforos e, principalmente, pela sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico (MEHNAZ, 2015). Além disso, também atua como agente de controle biológico contra fitopatógenos, devido à indução da expressão de genes envolvidos na defesa da planta, assim como induz o aumento da área foliar e altera características morfológicas na planta (CORREA et al., 2008).
O gênero Azospirillum abrange um grupo de BPCV de vida livre, ou seja, não forma nódulos e já foi encontrado em quase todos os lugares do planeta (HUNGRIA et al., 2010; MEHNAZ, 2015). Atualmente, pelo menos 20 espécies de Azospirillum já foram descritas (Tabela 1), mas em termos de fisiologia e genética os mais estudados são A. lipoferum e A.
brasilense.
Tabela 1.1 Espécies descritas do gênero Azospirillum spp.
Espécie Referência
A. lipoferum (TARRAND et al., 1978)
A. brasilense (TARRAND et al., 1978)
A. amazonense (MAGALHÃES et al., 1983)
A. halopraeferans (REINHOLD et al., 1987)
A. irakense (KHAMMAS et al., 1989)
A. largomobile (SLY; STACKEBRANDT, 1999)
A. doebereinerae (ECKERT et al., 2001)
A. oryzae (XIE; YOKOTA, 2005)
A. melinis (PENG et al., 2006)
A. canadense (MEHNAZ; WESELOWSKI; LAZAROVITS, 2007a)
A. zeae (MEHNAZ; WESELOWSKI; LAZAROVITS, 2007b)
A. rugosum (YOUNG et al., 2008)
A. palatum (ZHOU, Y. et al., 2009)
A. picis (LIN et al., 2009)
A. thiophilum (LAVRINENKO et al., 2010)
A. formosense (LIN et al., 2012)
A. humicireducens (ZHOU, S. et al., 2013)
A. fermentarium (LIN et al., 2013)
A. soli (LIN et al., 2015)
Essas espécies são abundantes principalmente em áreas tropicais e podem ser isolados a partir da rizosfera e de raízes de plantas da família Poaceae, principalmente de gramíneas forrageiras, milho, trigo, arroz, sorgo e cana-de-açúcar (HARTMANN, ANTON; BALDANI, 2006). Além destas, outras plantas como o café, frutas e orquídeas também foram relatadas como hospedeiros desta bactéria, mas com menos frequência em comparação às gramíneas. Há relatos também de que as bactérias desse gênero podem ser endofíticas facultativas, ou seja, podem permanecer no interior dos tecidos vegetais e possuem capacidade de sobreviver no solo (BALDANI et al., 1997; DOBEREINER; PEDROSA, 1987; HUERGO et al., 2008; PEDRAZA et al., 2007; ZAMBRANO; SALGADO; HERNÁNDEZ, 2007).
Apesar de, em geral, serem consideradas como bactérias da rizosfera, apresentam diferenças específicas entre espécies do gênero, ou até mesmo entre estirpes na forma como colonizam as raízes. Elas predominantemente colonizam a superfície da raiz, entretanto algumas espécies são capazes de infectar as plantas (DÖBEREINER; BALDANI; REIS, 1995; PATRIQUIN; DÖBEREINER, 1978). Desta forma, algumas espécies têm mecanismos específicos para interagir com as raízes e colonizar o interior das plantas, enquanto outras colonizam o interior das plantas através de feridas das células corticais. A. lipoferum ocorre, preferencialmente, no córtex de milho e A. brasilense em trigo, arroz e milho (BALDANI; BALDANI, 2005; ROESCH et al., 2007). Além disso, algumas linhagens de A. lipoferum e de A. brasilense são capazes de colonizar o interior das raízes de trigo, enquanto outras não apresentam essa capacidade, colonizando principalmente a zona de elongação e pelos radiculares (BALDANI et al., 1986; BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004; BODDEY; DOBEREINER, 1995; DÖBEREINER et al., 1995; PATRIQUIN; DÖBEREINER, 1978).
O acompanhamento do padrão de colonização de A. brasilense Sp245 em raízes de trigo demonstrou que os primeiros locais de colonização da raiz primária são os pontos de surgimento de raízes laterais e dos pelos radiculares (BROEK et al., 1993). Outro estudo detectou, por meio de anticorpos monoclonais específicos e técnicas imunológicas, a estirpe A. brasilense Sp245 no xilema da raiz de uma cultivar de trigo. Para A. brasilense sp7, foi observado que esta estirpe apenas coloniza a superfície radicular (SCHLOTER et al., 1994). Assmus et al. (1995) confirmaram, utilizando a mesma cultivar do trabalho anterior, que A. brasilense Sp245 entra no interior de células capilares da raiz, as quais tinham paredes aparentemente intactas, enquanto que a ocorrência da estirpe SP7 foi restrita a rizosfera. Em conclusão, o modo
de colonização das raízes das plantas por Azospirillum depende de cada espécie e estirpe.
Até o momento, nenhum representante de Azospirillum foi relatado como patógeno humano ou de plantas. Desta forma, estas bactérias são consideradas seguras, podendo ser utilizadas como biofertilizantes, a nível comercial para diversas culturas, especialmente cereais e gramíneas de importância econômica (MEHNAZ, 2015). Desta forma, estudos vêm sendo realizados com a inoculação de A. brasilense em diferentes espécies de cereais e demostram efeito positivo nos mais variados caracteres das plantas, como, por exemplo, o aumento do número de grãos, maior massa de matéria seca, maior área foliar, aumento do sistema radicular, aumento no número de espigas, maior porcentagem de germinação de sementes, bem como, incrementos na produtividade (ALBRECHT; BENNETT; QUESENBERRY, 1981; BALDANI; DÖBEREINER, 1980; DÍAZ-ZORITA; FERNANDEZ, 2008; DOBBELAERE et al., 2001; HUNGRIA, 2011; HUNGRIA et al., 2010; MEHNAZ et al., 2010).
Estudos realizados com várias espécies de plantas mostraram ser possível atingir um aumento de 5 a 30% no rendimento através da inoculação com Azospirillum, principalmente quando utilizada baixa quantidade de fertilizante químico nitrogenado (OKON; LABANDERA-GONZALEZ, 1994). Em casa de vegetação, esse aumento de rendimento pode ser ainda maior (HOLGUIN; PATTEN; GLICK, 1999). Outros trabalhos também mostraram que a utilização de linhagens de
Azospirillum spp promoveu aumento significativo na produção de grãos,
no conteúdo de nitrogênio, potássio e fósforo total das plantas (BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004), na matéria seca da parte aérea e no acúmulo de nitrogênio nas raízes (REIS et al., 2008). Os aumentos na produção e no crescimento a partir da inoculação com
Azospirillum spp. são atribuídos a um efeito geral no crescimento das
raízes, maior capacidade de assimilação de nutrientes e de resistência à seca (BASHAN; HOLGUIN, 1997). Perrig et al. (2007) realizaram experimentos com duas linhagens de A. brasilense, Cd e Az39, ambas usadas na formulação de inoculantes na Argentina. Os resultados obtidos mostraram que ambas as linhagens promoveram aumentos nos níveis de ácido indol-3-acético (AIA), ácido giberélico (GA3), ácido abscísico (ABA), zeatina e etileno indicando que A. brasilense é potencialmente capaz de promover diretamente o crescimento da planta e aumentar o rendimento agronômico.
Diante disso, algumas linhagens de BPCV já são utilizadas como produtos comerciais para a cultura do milho. Um exemplo é o
Azospirillum brasilense estirpes Abv5 e Abv6, as quais são derivadas da
estirpe FP2 (HUNGRIA et al., 2010), comercializadas no Brasil, estirpe Az39 na Argentina (OKON et al., 2015), e estirpe CRT1 comercializada na Europa (WALKER et al., 2012), entre outras.
Entre as diversas linhagens de Azospirillum brasilense empregadas como bioinoculantes, a linhagem FP2, uma mutante espontânea da linhagem Sp7, se destaca pelo fato de possuir genes de resistência aos antibióticos estreptomicina e ácido nalidíxico (PEDROSA; YATES, 1984). Esta característica permite o fácil isolamento dessas bactérias em meio de cultura, sendo amplamente utilizada em experimentos visando uma melhor compreensão da interação de Azospirillum spp. com as plantas, a fim de alcançar a eficiência no uso de bactérias diazotróficas, para aumentar a produtividade, reduzir custos de produção e utilizar práticas agrícolas mais sustentáveis (DALLA SANTA et al., 2004; LANA et al., 2012). 1.1.3 MECANISMOS DE PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO PLANTA-MICRORGANISMOS
Existem diversos mecanismos envolvidos na promoção de crescimento das plantas por meio da bactéria Azospirillum. Estes efeitos benéficos podem ser um efeito individual ou combinado de vários mecanismos que existem nesta bactéria. Entre esses mecanismos estão, principalmente, a fixação de nitrogênio, a produção de fitormônios, a solubilização de fosfatos e o biocontrole (MEHNAZ, 2015). Esses atributos para a promoção de crescimento das plantas por Azospirillum estão descritos detalhadamente abaixo.
1.1.3.1 Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN)
A FBN é o processo de conversão de nitrogênio gasoso (N2), um gás inerte presente em grande quantidade na atmosfera, em amônia (NH3), que é a forma de N assimilável pela maioria dos organismos vivos. É considerada um dos processos mais importantes para a manutenção da vida na terra. Apenas uma parcela relativamente pequena das espécies de organismos procariotos possui a enzima nitrogenase que é capaz de realizar essa conversão, os quais são chamados de fixadores de N2 ou diazotróficos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). A habilidade de fixar nitrogênio atmosférico em amônia permite aos diazotróficos não somente sobreviver, como também proliferar em condições de privação de
nitrogênio. Essa estratégia, no entanto, impõe uma despesa energética grande, uma vez que a nitrogenase consome 16 moles de ATP por mol de dinitrogênio fixado in vitro, sendo que esse custo energético sobe para até 40 moles de ATP in vivo (HILL, 1992).
Esse processo fornece compostos nitrogenados diretamente para as plantas por meio de associações, ou quando os organismos morrem e os liberam no ambiente, fornecendo o nitrogênio para o desenvolvimento vegetal (LINDERMANN; GLOVER, 2003).
A codificação das proteínas envolvidas na redução do N2 é realizada pelos genes nif (nitrogen fixation) (REES; HOWARD, 2000). Os genes nif são requeridos para a estrutura, biossíntese e regulação da nitrogenase e, portanto, encontrados em todos os diazotróficos (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). O complexo enzimático é formado por duas unidades básicas de proteínas distintas, sendo denominadas de acordo com a sua composição metálica. São elas: a dinitrogenase redutase (ferro-proteína que coleta a força redutora e energia) ou NifH; e a dinitrogenase (proteína ferro-molibdênio, que coleta e reduz o substrato) ou NifDK (HOWARD; REES, 1994; REES; HOWARD, 2000; STEENHOUDT; VANDERLEYDEN, 2000). Após a redução do N2ou da obtenção de amônia a partir do meio, o microrganismo assimila essa amônia por meio da produção de glutamina e glutamato, compostos que irão atuar como doadores de nitrogênio nas reações do metabolismo celular (ARCONDÉGUY; JACK; MERRICK, 2001).
Os avanços relacionados ao estudo da fixação biológica de nitrogênio, demostraram que o complexo enzimático da nitrogenase pode atuar com diferentes formações independentemente da presença do molibdênio (Mo). Nesse contexto, outros dois tipos de nitrogenase independentes de molibdênio são também conhecidos. Bishop; Jarlenski; Hetherington (1980) e Robson; Woodley; Jones (1986) verificaram estes dois sistemas diferenciados, onde em condições de ausência, o Mo pode ser substituído por vanádio (V), gerando um complexo enzimático contendo este elemento como cofator; e outro em condições de ausência do Mo e V, contendo apenas ferro. Esses tipos já foram encontrados em espécies dos gêneros: Clostridium, Rhodobacter, Anabaena, Rhodospirillum, Heliobacterium e Azospirillum. (DIXON; KAHN, 2004;
EADY, 1996; EINSLE et al., 2002; SEEFELDT; DANCE; DEAN, 2004).
Em A. brasilense a FBN é conhecida como a principal característica, onde diversos genes estão envolvidos na fixação, assimilação e regulação de nitrogênio (MEHNAZ, 2015). Desta forma, a regulamentação da fixação de nitrogênio é muito complexa, e responde
aos níveis de oxigênio e de nitrogênio fixado, os quais controlam a expressão dos genes nif, e assim regulam a atividade do complexo enzimático nitrogenase a nível de transcricional e pós-transcriocional (ZHANG et al., 1997).
Em geral, os microrganismos diazotróficos são de vida livre, ocorrendo em todos os tipos de solo, na rizosfera e em simbiose com espécies vegetais leguminosas e associados a gramíneas (e.g. A.
brasilense, A. lipoferum, A. amazonense), endofíticos obrigatórios (e.g. Acetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum spp.), em águas doces e
salgadas e no trato intestinal de certos animais, como os cupins (DIXON; KAHN, 2004). Entre os microrganismos simbiontes destacam-se as bactérias promotoras de crescimento vegetal (BPCV), as quais são capazes de fixar nitrogênio atmosférico através da fixação biológica de nitrogênio (FBN).
1.1.3.2 Fitormônios
Aproximadamente 80% das bactérias do solo têm a capacidade de produzir fitormônios, incluindo as pertencentes ao gênero Azospirillum. Esses compostos alteram o metabolismo e morfologia das plantas, levando a uma melhor absorção de minerais e água, tornando as plantas mais saudáveis e produtivas (DE-BASHAN; ANTOUN; BASHAN, 2008). Os efeitos hormonais são apresentados como a principal contribuição de Azospirillum para o crescimento das plantas (BASHAN; DE-BASHAN, 2010). Os fitormônios são divididos em cinco grupos principais: auxinas, giberelinas, citocininas, ácido abscísico e etileno (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2007).
As auxinas são responsáveis pela divisão, extensão e diferenciação de células e tecidos de plantas. Estes compostos aumentam a taxa de fluxo de água e sais minerais no xilema e a formação de raízes, controlam o crescimento vegetativo, afetam a fotossíntese, a formação de pigmentos, a biossíntese de vários metabólitos e a resistência a estresses bióticos (BASHAN; DE-BASHAN, 2010). A produção do ácido-indol-3-acético (AIA) por Azospirillum usando triptofano é bem conhecida (REYNDERS; VLASSAK, 1979), e depende da composição do meio de cultura, pH e disponibilidade do triptofano como precursor (MALHOTRA; SRIVASTAVA, 2006; 2008; ONA, 2003).
O AIA é produzido durante todos os estágios de crescimento do
Azospirillum, incluindo a fase estacionária (MALHOTRA;
SRIVASTAVA, 2009). Várias auxinas incluindo ácido indol-butírico, ácido láctico, acetamida, ácido acetaldeído,
indol-metanol e ácido acético já foram detectados em culturas de Azospirillum (COSTACURTA; KEIJERS; VANDERLEYDEN, 1994; CROZIER et al., 1988; FALLIK et al., 1989; HARTMANN; SINGH; KLINGMÜLLER, 1983; SOMERS et al., 2005). A quantidade de auxinas produzidas depende da estirpe, por exemplo, A. brasilense SP7 produz dez vezes mais AIA que A. irakense (ZIMMER; APARICIO; ELMERICH, 1991). Plantas inoculadas com estirpes de Azospirillum mostraram um aumento no número e comprimento de pelos nas raízes, número de raízes laterais, diâmetro e comprimento de raízes laterais e adventícias, e área de superfície de raiz devido a maior produção de AIA (BASHAN; HOLGUIN, 1997; BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004). A produção desse fitormônio é considerada como o principal mecanismo responsável para o aumento do sistema radicular (MEHNAZ, 2015).
As giberelinas (GAs) são responsáveis pela divisão e alongamento celular, produzem plantas com estaturas maiores, promovem a indução da germinação em sementes, entre outras funções (RAVEN et al., 2007).
A. brasilense é conhecido por promover a germinação de sementes de
soja e trigo (BACILIO; VAZQUEZ; BASHAN, 2003; CASSÁN et al., 2009). Isto é, a melhoria da germinação de sementes das culturas com a inoculação de A. brasilense coincide com a alta produção de giberelinas (CASSÁN et al., 2009). Azospirillum sintetiza e metaboliza GAs in vitro e na planta. A produção de diferentes compostos GAs é relatada para diferentes espécies de Azospirillum (REIS; TEIXEIRA; PEDRAZA, 2011).
As citocininas são derivadas da adenina. Nas plantas, são produzidas em pontas de raízes e sementes em fase de germinação. Estas são transportadas até a parte aérea para regular a divisão celular, disparar a morfogênese na raiz, atuar na maturação dos cloroplastos, alargamento celular, expansão foliar, auxiliar na brotação, e atrasar a senescência (SPAEPEN; VANDERLEYDEN; OKON, 2009). A produção de citocininas por Azospirillum em meio de cultura já foi relatada por vários pesquisadores (CACCIARI et al., 1989; HOREMANS, 1986; STRZELCZYK; KAMPERT; LI, 1994; TIEN; GASKINS; HUBBELL, 1979).
O ácido abscísico (ABA) é um fitormônio sintetizado em todas as partes da planta, produzido em resposta ao estresse ambiental como diminuição do potencial de água no solo, calor ou estresse salino (BASHAN; DE-BASHAN, 2010). O ABA é produzido nas raízes e translocado às folhas, alterando o potencial osmótico de células-guarda, levando ao fechamento dos estômatos, evitando a perda de água no
momento de baixa disponibilidade hídrica (BARTELS; SUNKAR, 2005). A produção de ABA por A. brasilense Sp245 foi relatado por COHEN et al. (2008).
O etileno (C2H4) é um fitormônio gasoso sintetizado em todas as partes da planta a partir do aminoácido metionina, o qual regula vários processos de desenvolvimento como a germinação, maturação do fruto, senescência e abscisão foliar, floração, murcha, entre outros (ABELES; MORGAN; SALTVEIT, 1992). A produção de etileno durante a maioria das fases de crescimento das plantas é muito baixa. Níveis elevados têm sido observados em resposta a estresses biológicos ou ambientais, resultando muitas vezes na repressão do crescimento radicular e alongamento do hipocótilo, desfolha, desenvolvimento anormal e retardo de crescimento (JACKSON, 1991; KIM et al., 2014). Apesar de ser pouco, o etileno possui envolvimento na promoção do crescimento das plantas (GLICK et al., 1999; HOLGUIN; GLICK, 2001; HOLGUIN; GLICK, 2003; RIBAUDO et al., 2006).
1.1.3.3 Solubilização de fosfato
Algumas cepas de A. brasilense e A. lipoferum são capazes de produzir ácido glucônico e podem solubilizar fosfato de rocha (PUENTE et al., 2004; RODRIGUEZ et al. 2004). Chang e Li (1998) isolaram cepas de Azospirillum que degradaram calcário, mármore e fosfato de cálcio in
vitro. Em plantas de ervilha inoculadas com Azospirillum foi observado
uma mudança nos açúcares, quando havia deficiência de fósforo, o que fez com que a capacidade de Azospirillum spp. em mobilizar fosfato aumentasse. Açúcares como glucose são parte de exsudatos das raízes de ervilha cultivadas em solos deficientes de fósforo, aumentando assim a capacidade de Azospirillum spp. a solubilizar Ca3(PO4)2 insolúvel. Observou-se ainda que, sob deficiência de fósforo, o teor de glicose diminuiu, enquanto galactose, ribose, xilose e frutose aumentaram nos exsudatos radiculares (DEUBEL et al., 2000).
1.1.3.4 Biocontrole
O papel de Azospirillum como agente de biocontrole sempre foi ignorado, embora relatos de sua atividade anti-patogênica estivessem disponíveis há muito tempo. Mecanismos como competição ambiental, diminuição de agentes patogênicos, inibição do crescimento de fungos através da produção de substâncias tóxicas e aumento do crescimento de plantas para resistir ao patógeno são sugeridos como papel do
Azospirillum no biocontrole (BASHAN; DE-BASHAN, 2002a; 2002b;
RUSSO et al., 2008; SOMERS et al., 2005; TORTORA; DÍAZ-RICCI; PEDRAZA, 2011; YASUDA et al., 2009). Também já foi observado a influência dessas bactérias na promoção de efeitos positivos sobre os mecanismos de defesa do vegetal, impedindo a ação de patógenos, tais como, Pratylenchus zeae, Heterodera avenae e Atherigona soccata (BABU; SANKARANARAYANAN; JOTHI, 1998; BANSAL et al., 1999; KISHORE, 1998). Assim, a FBN, a produção de fitormônios, a solubilização de fosfatos e os efeitos positivos sobre os mecanismos de defesa da planta estimulados pela bactéria seriam os principais fatores responsáveis pela promoção do crescimento vegetal (MEHNAZ, 2015; MOREIRA et al., 2010).
1.1.4 GRAMÍNEAS E SUA IMPORTÂNCIA
A família Poaceae é uma das mais importantes entre as angiospermas em termos de diversidade morfológica, ecologia e importância econômica (GRASS PHYLOGENY WORKING, 2001; 2012). Ela inclui cerca de 10.000 espécies e mais de 700 gêneros espalhados por todo o mundo (JACOBS; KINGSTON; JACOBS, 1999; TZVELEV, 1989; WATSON; DALLWITS, 1993). Apresenta cereais de grande importância cultivados em todo o mundo como o milho, sorgo, milheto, setaria, trigo, arroz, cana-de-açúcar e também cereais como Miscanthus e switchgrass (BYRT; GROF; FURBANK, 2011; GRASS PHYLOGENY WORKING, 2012).
Visto a sua importância, muitos estudos têm sido realizados com representantes dessa família. Entretanto, a maioria desses trabalhos focam em duas subfamílias economicamente importantes: Ehrhartoideae (arroz) e Panicoideae (milho, sorgo, cana e milheto), sendo que o arroz, o sorgo e o milho possuem seu genoma sequenciado e disponível em bancos de dados (KELLOGG, 2000; KELLOGG, 2002). Arroz e milho são considerados organismos modelos de estudos para fisiologia e genética, embora não representem um sistema de planta modelo ideal, pois possuem ciclo de vida longo e considerável tamanho físico para ser mantidas em laboratório.
1.1.4.1 Zea mays
O milho (Zea mays L.) é o principal cereal cultivado em todo o mundo, devido ao seu potencial produtivo, composição química e elevado valor nutritivo. Além disso, é uma excelente fonte energética,
visto o seu alto teor de amido, lipídios, proteínas e vitaminas encontradas nos grãos (PATERNIANI, 1978). Tem grande importância econômica já que pode ser utilizado de diversas formas, que vai desde a alimentação animal até a indústria de alta tecnologia (MATTOSO et al., 2006). O uso do milho em grão como alimentação animal representa a maior parte do consumo desse cereal, seguido pelo consumo humano e produção de etanol (CONAB, 2015; RANUM; PEÑA-ROSAS; GARCIA-CASAL, 2014).
As formas de consumo do milho incluem in natura, seja como milho verde ou industrializado, na forma de amido, óleo, farinha, xarope, bebidas alcoólicas, ou então na composição de cereais matinais, pipoca, entre outros. Os animais também podem consumir o milho como grãos in
natura ou como produtos industrializados, assim como consumir a
própria planta, na forma de silagem (MATTOSO et al., 2006; RANUM; PEÑA-ROSAS; GARCIA-CASAL, 2014).
Atualmente este cereal apresenta uma produção mundial de aproximadamente 1 bilhão de toneladas, sendo que os Estados Unidos e a China são os maiores produtores mundiais com cerca de 361 milhões de toneladas e 216 milhões de toneladas em 2014, respectivamente. O Brasil também ocupa lugar de destaque no cenário mundial de produção desta cultura, sendo o terceiro maior produtor do mundo, com produção de aproximadamente 80 milhões de toneladas em 2014 (FAOSTAT, 2014b). Na safra 2014/2015 a Região Sul do país liderou a produção deste cereal com cerca de 14 milhões de toneladas, seguido da Região Sudeste com produção de aproximadamente 8 milhões de toneladas (CONAB, 2015).
Entretanto, com a crescente demanda deste cereal em todo o mundo, houve uma crescente utilização de fertilizantes químicos (principalmente nitrogênio, fósforo e potássio - NPK) em combinação com tecnologias avançadas para suplementar as lavouras comerciais (BHATTACHARJEE; SINGH; MUKHOPADHYAY, 2008). No entanto, o uso indiscriminado de fertilizantes químicos tem ocasionado sérios problemas para o meio ambiente, levando a degradação dos recursos naturais e afetando negativamente diversas funções ecológicas do solo, visto que contribui para a poluição do solo e das águas subterrâneas (SHAHZAD et al., 2013).
Diante disso, diversos estudos têm sido realizados para mostrar a eficiência da inoculação de Azospirillum no desenvolvimento e produção de milho, a fim de minimizar os efeitos dos fertilizantes químicos, e sem prejudicar a produção da cultura. Respostas positivas ao crescimento de plântulas de milho devido à inoculação foram observadas em estudos
conduzidos in vitro (CAMILIOS-NETO et al., 2014; FALEIRO et al., 2015; STETS et al., 2015). Alguns estudos também já mostraram a eficiência da inoculação de Azospirillum em relação à produtividade, onde o rendimento médio dos tratamentos inoculados foi 24% superior ao do tratamento controle (HUNGRIA et al., 2010).
1.1.5 PCR QUANTITATIVA (qPCR)
As bactérias podem ser quantificadas de diversas formas como contando-se microscopicamente o número de células presentes num determinado material ou superfície, efetuando-se análises da turbidez, através da concentração de substâncias químicas ou da contagem do número de microrganismos viáveis utilizando um meio de cultura apropriado, entre outras. Contudo, dentre as principais técnicas utilizadas para quantificar esses microrganismos destaca-se a qPCR.
A capacidade de quantificar ácidos nucleicos com precisão é fundamental para muitos campos da pesquisa básica, testes de diagnóstico molecular e processos comerciais. Recentemente, com o aumento da utilização de microrganismos promotores de vegetal, aumentou-se a necessidade de metodologias capazes de monitorar a presença destes no interior dos tecidos vegetais. Metodologias clássicas baseadas no plaqueamento de soluções diluídas ou através da contagem do número mais provável (NMP) de culturas inoculadas são técnicas que apresentam difícil reprodutibilidade, principalmente quando utilizadas ambientes naturais, além disso estes métodos não são aplicáveis para o rápido monitoramento de experimentos realizados em larga escala, visto que são muito trabalhosos e consomem muito tempo para se obter resultados (VON FELTEN; DÉFAGO; MAURHOFER, 2010). Para tanto, a qPCR é uma ferramenta rápida, eficiente e precisa para quantificar os genes alvo e, então, realizar um monitoramento rápido e confiável de microrganismos em ambientes naturais e in vitro, visto que este método apresenta alta especificidade, sensibilidade e velocidade para realizar a detecção de microrganismos associados às plantas (COUILLEROT, O. et al., 2010; SORENSEN et al., 2009; VON FELTEN; DÉFAGO; MAURHOFER, 2010).
No que diz respeito a quantificação de BPCV, diversos pesquisadores já utilizaram esta técnica. Um trabalho realizado recentemente desenvolveu iniciadores a nível de cepa específica para quantificar o DNA de Azospirillum brasilense FP2 inoculado em trigo em condições estéreis e não estéreis (STETS et al., 2015). Anteriormente, a nível de gênero, iniciadores foram desenvolvidos para quantificar o
DNA de Azospirillum inoculado no milho em condições estéreis (FALEIRO et al., 2013). Couillerot et al., (2010) desenvolveram iniciadores para quantificar DNA de Azospirillum lipoferum cepa CRT1 na rizosfera e em plântulas de milho. Pereira et al., (2014) desenvolveram iniciadores para quantificar DNA de Herbaspirillum seropedicae em milho. Timmusk et al., (2009) desenvolveram iniciadores para quantificar DNA de Paenibacillus polymyxa encontrado na rizosfera de plantas selvagens de cevada. Além disso, a qPCR é uma importante ferramenta para quantificação genes alvos em amostras que foram submetidas ao processo de congelamento. Nesse caso, análise utilizando o processo de contagem por plaqueamento é inviável, sendo a metodologia da PCR em tempo real a mais adequada. Desta forma, a qPCR se mostra como uma importante ferramenta para futuros estudos envolvendo a interação entre plantas e microrganismos.
1.2 OBJETIVOS
1.2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os parâmetros de crescimento de plântulas de milho cultivar DKB390 inoculadas com A. brasilense FP2 e quantificar o DNA bacteriano associado à planta por qPCR.
1.2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o efeito da inoculação de A. brasilense FP2 no desenvolvimento e plântulas de Z. mays, através da medida do comprimento e peso de massa fresca das folhas e das raízes, e também da massa fresca da raiz principal, laterais e seminais;
Testar os ensaios qPCR gênero-específico AznifA e cepa-específico AzoR2.1 para quantificar o DNA de A. brasilense FP2 inoculado em plantas de milho cultivadas em solo não estéril;
CAPÍTULO 2
Azospirillum brasilense FP2 quantification in maize roots
under nonsterile growth condition by strain-specific qPCR
assay
Autores: Aline Martins Cardozo, Kelly Justin Silva, Pâmela Dall’Asta, Ana Carolina Maisonnave Arisi*
2 Azospirillum brasilense FP2 QUANTIFICATION IN MAIZE ROOTS UNDER NONSTERILE GROWTH CONDITION BY STRAIN-SPECIFIC qPCR ASSAY
Abstract
The rhizosphere bacterium Azospirillum brasilense strain FP2 can promote plant growth and increase productivity when associated with important crops as maize. The objective of this work was to evaluate A.
brasilense FP2 population in Zea mays seedlings Dekalb 390 cultivar by
qPCR A. brasilense DNA quantification. Two primer pairs, AznifAF12/F19 and AzoR2.1 were tested. Z. mays seedlings were grown in nonsterile soil and harvested at 7, 14 and 21 days after inoculation (DAI). Root and shoot fresh weight were higher in inoculated than in control plants at 7 and 14 DAI. Regarding bacterial DNA quantification, presence of A. brasilense was not detected in control and inoculated root samples when using primer pair AznifAF12/AznifAF19. The strain-specific qPCR assay using primer pair AzoR2.1 was successfully used to quantify A. brasilense FP2, reaching 108 CFU per gram of root at 7 DAI and 107 CFU per gram of root at 14 and 21 DAI in inoculated seedlings, meanwhile A. brasilense DNA was not detected in control seedlings.
Key-words: plant-bacteria interaction, Azospirillum, maize, qPCR, soil non-sterile
2.1 INTRODUCTION
A strategy to maintain crop productivity and reduce the use of chemical inputs is to explore the use of beneficial microorganisms in agricultural systems (ANDREWS; HODGE; RAVEN, 2010). A large number of diazotrophic bacteria, recognized as plant growth-promoting bacteria (PGPB), have been identified in association with plant roots in Poaceae family. The genus Azospirillum is one of the most important genera of PGPB found worldwide under a variety of environmental and soil conditions (BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004; HARTMANN; BASHAN, 2009). It comprises free-living bacteria, which can colonize the root surface or the intercellular spaces of the host plant roots. In association with economically important grasses, PGPB can promote plant growth and yield by several mechanisms as nitrogen fixation and phytohormone production (FIBACH-PALDI; BURDMAN; OKON, 2012; STEENHOUDT; VANDERLEYDEN, 2000).
Given the importance of the genus Azospirillum, some strains are already used as commercial inoculants for maize. Examples include A.
brasilense strains Abv5 and Abv6 (which are derived from A. brasilense
FP2) sold in Brazil, strain Az39, sold in Argentina, and strain CRT1 sold in Europe, among others (CASSAN et al., 2009; DE MORAIS et al., 2016; HUNGRIA et al., 2010; MULLER et al., 2016; OKON et al., 2015; WALKER et al., 2012).
Success of interaction depends on several factors as A. brasilense quantity on inoculated seeds, active motility, bacterial survival, adsorption to soil particles, as well as competition with others microorganisms in the rhizosphere (BASHAN; HOLGUIN; DE-BASHAN, 2004; COUILLEROT et al., 2010). In addition, other factors may also affect the colonization and survival of this bacterium, such as environmental factors, different types of soils, crops, cultivars and strains (COMPANT; CLEMENT; SESSITSCH, 2010; FERREIRA et al., 2013; MOUTIA et al., 2010).
The survival of A. brasilense inoculant in rhizosphere and the effective plant colonization are crucial factors to achieve an increase in crop yield (DE MORAIS et al., 2016), so effective methods are required to monitor inoculated strains in the rhizoplane, rhizosphere and plant tissues (STETS et al., 2015). PCR and qPCR have been used to identify
Azospirillum isolates (BAUDOIN et al., 2010; SHIME-HATTORI et al.,
2011) and to quantify Azospirillum inoculants (COUILLEROT, OLIVIER et al., 2010; COUILLEROT, O. et al., 2010; FALEIRO et al.,
2013) from rhizosphere, soil and plants. In a previous study we have developed a qPCR assay using AznifAF12/AznifAF19 primers targeting
nifA gene to quantify A. brasilense (FALEIRO et al., 2013). A
strain-specific qPCR assay using AzoR2.1 primers was recently developed to quantify A. brasilense strain FP2 in inoculated wheat (STETS et al., 2015).
A. brasilense strain FP2 have been extensively studied and its
interaction with wheat have been recently elucidated (CAMILIOS-NETO et al., 2014; STETS et al., 2015). In previous studies, we investigated the association of A. brasilense strain FP2 with two maize cultivars, DKB240 and P30F53 (CANGAHUALA-INOCENTE et al., 2013; FALEIRO et al., 2015). Another cultivar, DKB390, presented high yield potential and stability and a good response to inoculation with A.
brasilense (FERREIRA et al., 2013).
In this study, our objectives were to evaluate plant growth parameters of Zea mays DKB390 cultivar seedlings inoculated with A.
brasilense FP2 and to quantify A. brasilense in maize roots by qPCR.
2.2 MATERIAL AND METHODS
2.2.1 BACTERIAL GROWTH CONDITIONS
Azospirillum brasilense strain FP2 (strain Sp7 ATCC29145 NalR SmR) (PEDROSA; YATES, 1984) was grown in 30 mL NFbHPN medium (KLASSEN et al., 1997; MACHADO et al., 1991) supplemented with 5 mg/L sodium lactate at 30 °C under aeration with shaking at 120 rpm until OD600 0.8 (~108 cells/mL). Streptomycin and nalidixic acid at final concentrations of 80 µg/mLand 10 µg/mLwere added to the bacterial culture. The bacterial culture was centrifuged (12000 g) for 2 min to obtain cell pellets and supernatants. The cell pellets were resuspended in NFbHPN medium. A correlation was obtained between the optical density and the number of colonies by plating known serially diluted in saline (0.9% NaCl) cell cultures in NFbHPN agar plates. Colony counts was performed after dilutions were spread on the medium plates and incubated for 72 h at 30 °C.
2.2.2 SEEDLINGS GERMINATION, INOCULATION AND GROWTH CONDITIONS
Seeds of Zea mays (cultivar Dekalb 390) were surface sterilized with 70 % ethanol for 3 min, 2 % sodium hypochlorite and 2.5 % Tween 20 for 30 min. Seeds were then washed three times with autoclaved water, transferred to water-saturated paper and maintained for 3 days in a growth sterile chamber at 25 °C, in the dark for germination. Thereafter, thirty germinated seedlings were incubated in 30 mL of ~108 bacterial cells/mL of A. brasilense strain FP2 in an orbital shaker (80 rpm) for 30 min at 30 °C (RONCATO-MACCARI et al., 2003), and then transferred to 2.7 L pots containing non-sterile soil. We used soil dystrophic red-yellow argisol collected from layer 0 – 20 cm with the following chemical properties: clay 93 g/kg, silt 249 g/kg, sand 658 g/kg, organic matter 16.62 g/kg TFSA, pH 5.4. No fertilizers and pesticides were applied during the experiment. Non-inoculated seeds were mock-inoculated under the same conditions. The experiment followed a randomized design with four repetitions. The pots, containing 3 seedlings each, were transferred to a greenhouse and maintained under controlled conditions. Seedlings were collected 7, 14 and 21 days after inoculation (DAI). Root and shoot length were measured through the ImageJ software and fresh weight were measured with a precision balance. The material was immediately frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C for DNA extraction.
2.2.3 DNA ISOLATION
Genomic DNA was extracted from bacterial cultures using the Wizard® Genomic DNA (PromegaTM, Madison, WI, EUA) and maize roots using a DNeasy plant mini kit (Qiagen) as described previously (PEREIRA et al., 2014). DNA concentration and quality were estimated on a Thermo Scientific NanoDrop™ 2000 spectrophotometer (Wilmington, DE, USA) by O.D. measurements at 260 and 280 nm. 2.2.4 A. brasilense, TOTAL BACTERIA AND MAIZE DNA QUANTIFICATION BY qPCR
Two primer pairs AznifAF12/F19 and AzoR2.1 were tested to quantify A. brasilense in inoculated maize roots by qPCR. Primer pair AznifAF12/AznifAF19 was designed targeting the nifA sequence
(FALEIRO et al., 2013). Primer pair AzoR2.1 was designed for A.
brasilense FP2 strain-specific detection (STETS et al., 2015), amplicon
was predicted to be located in a noncoding region. Universal primer pair targeting 16S rRNA was used to estimate total number of bacterial DNA and primer pair ZM1 which target hmg gene was used to quantify maize DNA in plant samples (Table 2.1).
Table 2.1 Primers used for Azospirillum, Azospirillum brasilense FP2 strain-specific, bacterial DNA (16S rRNA) and maize DNA (Zea mays) quantification by qPCR. Primer pair Orientation a Sequence Amplicon size Reference Azospirilum AznifAF12 F CGCAGCAACTGA TATGCAAAA 96 (FALEIRO et al., 2013) AznifAF19 R GCGTGCTTCCGT GACAAGT Azospirilum brasilense FP2 AzoR2.1 F CGCCACCATGCG ATCAA 90 (STETS, et al. 2015) AzoR2.1 R GCATGCCCAGTA CTGCAAGTC Zea mays ZM1 F TTGGACTAGAAA TCTCGTGCTGA 79 (DINON et al., 2011) ZM1 R GCTACATAGGGA GCCTTGTCCT 16S rRNA gene 16S F TCGCTAGTAATC GCGGATCA 70 (STETS et al., 2015) 16S R TGTGACGGGCGG TGTGTA
The amplification reactions were carried out in a final volume of 25 μL containing 12.5 μL of 2x Power SYBR GREEN PCR master mix, 600, 500, 100 or 200 nmol/L primer pair AznifAF12/AznifAF19, AzoR2.1, ZM1 and 16S, respectively, and water. The DNA template quantity used was 50 ng/µL for qPCR using AznifAF12/AznifAF19 and 15 ng/µL for qPCR using AzoR2.1R/F, ZM1 or 16S.
All reactions were carried out in duplicate on an ABI PRISM 7500 detection system (Applied Biosystems) under the following cycling conditions: 2 min at 50 °C, 10 min at 95 °C, and 40 cycles of 15 s at 94 °C and 1 min at 60 °C.
2.2.5 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM A. brasilense CULTURE
Standard curves were obtained by ten-fold serial dilutions of DNA isolated from pure A. brasilense culture in water resulting in DNA solutions ranging from 61.6 ng/µL to 61.6 fg/µL, corresponding to estimated DNA copy number from 106 to 100, based on the sequence length of A. brasilense FP2 (6.9 Mbp) under accession number APHV00000000 (STETS et al., 2015). Sterile water and genomic DNA from Herbaspirillum seropedicae were used as non-template control and negative control, respectively.
The reaction parameters (efficiency, slope, and correlation coefficient) were calculated by plotting the Cq values against the log10 DNA copy number. Amplification efficiency values were calculated from the equation E =[ (10−1/s) − 1] × 100, where E is the efficiency (percent) and s is the slope obtained from the standard curve.
2.2.6 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM MAIZE ROOTS
Maize root DNA was ten-fold diluted in water from 24.68 ng/µL to 24.68 pg/ µL, corresponding to 104 - 101 genome copy number, based on the maize genome length 2.2 Gbp (Zea mays B73 RefGen_v3). DNA isolated from non-inoculated maize roots samples were used for the construction of the standard curve. Sterile water and genomic DNA from soybean were used as non-template control and negative control, respectively.
2.2.7 GENERATION OF STANDARD CURVES FROM MIXTURES OF PLANT ROOTS AND A. brasilense CULTURE
Standard curves were also constructed using DNA extracted from a mixture of maize roots and serial dilutions of A. brasilense culture, as previously described (STETS et al., 2015). For this, maize seeds were surface sterilized and seedlings were grown under axenic condition as previously described (CANGAHUALA-INOCENTE et al., 2013). After 11 days, roots were collected and crushed in liquid nitrogen using a mortar and pestle. In 7 microtubes, 100 µL of an A.
brasilense FP2 culture diluted in water to reach 102, 103, 104, 105, 106, 107 or 108 CFU per tube were added to 100 mg of crushed roots. The mixture was then mixed and incubated for 1 h at room temperature. DNA was isolated from these mixtures using DNeasy plant mini kit (Qiagen). No bacteria were added to the negative control. The reaction parameters (efficiency, slope, and correlation coefficient) were calculated by plotting the Cq values against the log10 CFU/g of root. 2.2.8 DETERMINATION OF COLONY FORMING UNITS (CFU) BY PLATE COUNT
To determine the number of A. brasilense FP2 CFU, the inoculated and non-inoculated maize roots were crushed using a mortar, serially diluted (10−1 to 10−6) in saline (0.9% NaCl), and plated on NFbHPN medium and incubated for 72 h at 30 °C. Colonies were then counted.
2.2.9 STATISTICAL ANALYSIS
Colony counts were expressed as the number of CFU per gram (fresh weight) of root, and qPCR quantification data were converted to the equivalent number of CFU per gram (fresh weight) of root. The data were subjected to the Student’s t test, using the ASSISTAT software (version 7.7; Statistical Assistance, Universidade Federal de Campina Grande, Paraíba, Brazil).
2.3 RESULTS
2.3.1 EFFECT OF Azospirillum brasilense FP2 ON MAIZE GROWTH
Azospirillum brasilense FP2 was grown until OD600 0.8, and the mean plate counting was 2.2×108 CFU/mL. Maize seedlings (cultivar Dekalb 390) were inoculated with A. brasilense FP2, plants were grown in pots and harvested at 7, 14 and 21 DAI.
Figure 2.1 Growth parameters of maize seedlings inoculated with A.
brasilense FP2. Total root fresh weight (A), shoot length (B), shoot
fresh weight (C), primary root length (D), primary and lateral root fresh weight (E) and seminal root fresh weight (F). * Statistically significant difference (P < 0.05) between inoculated and non-inoculated seedlings.
Statistically significant differences between non-inoculated and inoculated plants were observed at 7 and 14 DAI for total root fresh weight, shoot fresh weight and shoot length. The mean of total root fresh weight were 0.30 and 0.86 g for inoculated seedlings, and 0.25 and 0.71 g for non-inoculated seedlings at 7 and 14 DAI, respectively (Figure 2.1A). The mean of the length of shoot for inoculated seedlings were 5.7 and 17.4 cm, and 4.4 and 14.7 cm for non-inoculated seedlings at 7 and 14 DAI, respectively (Figure 2.1B). The mean of fresh weight of shoot for inoculated seedlings were 0.2 and 0.6 g, and 0.1 and 0.5 g for non-inoculated seedlings at 7 and 14 DAI, respectively (Figure 2.1C). At 14 and 21 DAI, differences were observed for fresh weight of primary and lateral roots, the mean for inoculated seedlings were 0.38 and 0.70 g, and 0.32 and 0.58 g for non-inoculated seedlings at 14 and 21 DAI, respectively (Fig. 2.1E).
2.3.2 qPCR PARAMETERS FOR A. brasilense QUANTIFICATION Standard curves were performed from serial dilution of DNA isolated from A. brasilense pure culture and the limit of detection (LOD) for the qPCR assays for the quantification of Azospirillum using the AznifAF12/AznifAF19 primers and for A. brasilense FP2 using the AzoR2.1 strain-specific primers were 101 and 102 copies of bacteria genomic DNA, respectively. The efficiency values were 99% and 102%, respectively (Figures 2.2A and 2.3A). Standard curves were also performed using DNA extractions from a mixture of maize roots and serial dilutions of A. brasilense culture. In this situation, the LOD for the quantification of A. brasilense FP2 using AzoR2.1 and AznifAF12/AznifAF19 were 104 and 103 CFU/g of root and the efficiency values were 119% and 111%, respectively (Figures 2.2B and 2.3B).
Figure 2.2 qPCR standard curves for A. brasilense quantification using A) Cq versus log DNA copy number. DNA extractions from A. brasilense strain FP2 pure culture as template DNA and AznifAF12/AznifAf19 primer pair. B) Cq versus log CFU. DNA extractions from mixtures of maize roots and A. brasilense culture as template DNA and AznifAF12/AznifAf19 primer pair.
y = -3.3419x + 38.209 R² = 0.999 E= 99% 0 10 20 30 40 0 2 4 6 8 Cq
Log DNA copy number
y = -2.9294x + 44.078 R² = 0.9917 E= 119% 0 10 20 30 40 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cq
Figure 2.3 qPCR standard curves for A. brasilense quantification using A) Cq versus log DNA copy number. DNA extractions from A. brasilense strain FP2 pure culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair. B) Cq versus log CFU. DNA extractions from mixtures of maize roots and A.
brasilense culture as template DNA and AzoR2.1 primer pair.
y = -3.2691x + 34.034 R² = 0.9995 E = 102% 0 10 20 30 0 2 4 6 8 Cq
log DNA copy number
y = -3.0721x + 39.133 R² = 0.9979 E= 111% 0 10 20 30 40 0 2 4 6 8 10 Cq
