PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE DIEGO SOARES LEOTE
EPIDEMIOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO SUL DO ESTADO DE SANTA CATARINA
Tubarão 2018
DIEGO SOARES LEOTE
EPIDEMIOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO SUL DO ESTADO DE SANTA CATARINA
Linha de Pesquisa: Investigação de agravos à saúde de origem infecciosa
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profa. Josiane Somariva Prophiro, Dra.
Tubarão 2018
DIEGO SOARES LEOTE
EPIDEMIOLOGIA DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA NO SUL DO ESTADO DE SANTA CATARINA
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Tubarão (SC), 14 de Dezembro de 2018.
___________________________________________________________________ Orientadora: Profa. Josiane Somaria Prophiro, Dra.
Universidade do Sul de Santa Catarina
__________________________________________________________________ Luiz Alberto Kanis, Dr.
Universidade do Sul de Santa Catarina
__________________________________________________________________ Ana Maria Antonello, Dra.
RESUMO
A leishmaniose visceral é uma doença parasitária transmitida por vetor, que figura entre as mais negligenciadas do mundo. A doença atinge preferencialmente crianças e pessoas imunodeprimidas, causando febre, emagrecimento e até a morte. O principal reservatório da doença é o cão doméstico e a monitorização da prevalência da doença nos cães pode prevenir o aumento dos casos em humanos. Este trabalho teve como objetivo definir a prevalência de Leishmaniose Visceral Canina em região não endêmica no sul do estado de Santa Catarina, bem como identificar fatores de risco para a infecção. Foi realizado um estudo transversal com cães provenientes de Centros de Controle de Zoonoses dos municípios de Tubarão e Criciúma. Coletaram-se amostras de sangue de 107 cães às quais foram analisadas pelo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real, além disso,foram observadas as características da população canina por meio de questionário e exame físico. Do total de cães coletados 20 animais foram positivos (19%) dos quais, 17 cães (85%) não apresentavam nenhum sinal clínico da doença. Determinou-se maior positividade nos animais acima de 7 anos (33,3%) e nos habitantes de zona urbana (23,3%). Não houve diferença entre machos e fêmeas positivos, bem como entre castrados e não castrados. Variáveis como gênero, idade, raça, pelagem ou castração, não apresentaram significância estatística quando aplicado o teste do qui-quadrado de Pearson. O principal sintoma identificado na observação foram as dermatopatias (84,2%). Conclui-se que a prevalência encontrada de cães positivos para Leishmaniose Visceral Canina no estudo é superior à prevalência comparando-se a outras regiões consideradas não endêmicas evidenciando que há a transmissão da doença na população estudada e que o alto índice de positivos assintomáticos pode contribuir para a não identificação dos casos.
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis is a vector-borne parasitic disease that is among the most neglected diseases in the world. The disease affects children and immunosuppressed people, causing fever, weight loss and even death. The main reservoir of the disease is the domestic dog and monitoring the prevalence of the disease in dogs can prevent the increase of cases in humans. This work aimed to define the prevalence of Visceral Canine Leishmaniasis in a non - endemic region in the southern state of Santa Catarina, as well as to identify risk factors for infection. A cross - sectional study was carried out with dogs from Centers for Zoonoses Control of the cities of Tubarão and Criciúma. Blood samples were collected from 107 dogs that were analyzed by the real-time polymerase chain reaction method, and the characteristics of the canine population were observed through a questionnaire and physical examination. Of the total number of dogs collected, 20 animals were positive (19%), of which 17 dogs (85%) had no clinical signs of the disease. A higher positivity was observed in animals older than 7 years (33.3%) and in urban dwellers (23.3%). There was no difference between positive males and females, as well as between castrated and non-castrated females. None of the variables presented statistical significance when applied to the Pearson chi-square test. The main symptom identified in the observation were dermatopathies (84.2%). It is concluded that the prevalence of dogs positive for Visceral Canine Leishmaniasis in the study is higher than the prevalence compared to other regions considered non-endemic, showing that there is transmission of the disease in the studied population and that the high index of asymptomatic positives may contribute to the non-identification of cases.
LISTAS
Lista de abreviaturas
CCZ: centro de controle de zoonoses
CEUA: comissão de ética para o uso de animais
CDCT: Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico DAT: directaglutinationtest (teste de aglutinação direta) DNA: deoxyribonucleicacid (ácido desoxirribonucleico)
EDTA: ethylenediaminetetraaceticacid (ácido etilenodiaminotetracético) ELISA: enzymelinkedimunossorbentassay (ensaio imunoenzimático) IC: intervalo de confiança
kDNA: kinetoplastdeoxyribonucleicacid (ácido desoxirribonucléico do kinetoplasto) LV: leishmaniose visceral
LVC: leishmaniose visceral canina OMS: Organização Mundial de Saúde
PCR: polimerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase) RIFI: reação de imunofluorescência indireta
S.R.D.: sem raça definida
SES/RS: Secretaria de Saúde do Estado do Rio Grande do Sul SINAN: sistema nacional de agravos de notificação
Lista de quadros
Quadro 1 – Lista de variáveis independentes ... 25
Lista de Tabelas
Tabela 1 – Características da população dos cães coletados nos municípios de Tubarão e Criciúma ... 28 Tabela 2 – Prevalência de Leishmania sp. em cães por PCR em tempo real, nos municípios de Tubarão e Criciúma. ... 28 Tabela 3 – Análise dos fatores de risco para infecção Leishmania sp. em cães nos municípios de Tubarão e Criciúma, onde (-) significa negativos (+) significa positivos e (I) indeterminados ... 29
Lista de Figuras
Figura 1 – Caracterização das forma promastigota (A) e amastigota (B) de
Leishmania sp. ... 7
Figura 2 – Representação ilustrativa da transmissão zoonótica de Leishmania sp .... 8 Figura 3 – Coleiras de identificação confeccionadas em PVC numeradas a caneta . 20 Figura 4 – Registro fotográfico do animal para identificação ... 21 Figura 5 – Médico veterinário preenchendo o questionário mediante observação.... 22 Figura 6 – Amostra coletada de cão por punção da veia jugular... 23 Figura 7 – Tubo Monovette 2,6ml contendo EDTA (tampa roxa) e tubo
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 5 1.1 REFERENCIAL TEÓRICO ... 6 1.1.1 Leishmanioses ... 6 1.1.2 Leishmaniose visceral ... 8 1.1.2.1 Etiologia ... 8 1.1.2.2 Epidemiologia ... 9 1.1.2.3 Vetor ... 10 1.1.2.4 Reservatório ... 11
1.1.2.5 Medidas de prevenção e controle ... 12
1.1.3 Leishmaniose visceral canina ... 12
1.1.3.1 Características clínicas ... 12 1.1.3.2 Etiologia e epidemiologia da LVC ... 13 1.1.3.3 Métodos diagnósticos ... 13 1.1.3.3.1 Diagnóstico clínico ... 14 1.1.3.3.2 Diagnóstico parasitológico ... 14 1.1.3.3.3 Diagnóstico sorológico ... 15 1.1.3.3.4 Diagnóstico molecular ... 16 1.1.3.3.5 LVC em Santa Catarina ... 17 2. OBJETIVOS ... 18 2.1 OBJETIVO GERAL ... 18 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 18 3. MÉTODOS ... 19 3.1 TIPO DE ESTUDO ... 19
3.2 POPULAÇÃO, LOCAL, TEMPO E AMOSTRA ... 19
3.2.1Critérios de inclusão ... 19
3.2.2 Critério de exclusão ... 20
3.3 COLETA DE DADOS ... 20
3.3.1 Coleta e armazenagem do material ... 22
3.3.2.1 Extração do DNA ... 24
3.3.2.2 Amplificação por PCR em tempo real... 24
3.4 VARIÁVEIS DE ESTUDO ... 25
3.5 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS ... 25
3.6 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 25
4. RESULTADOS ... 27 5. DISCUSSÃO ... 30 6. CONCLUSÃO ... 33 6.1 LIMITAÇÕES DO ESTUDO ... 33 6.2 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 34 REFERÊNCIAS ... 35 APÊNDICE ... 42 APÊNDICE A - Questionário ... 42
APÊNDICE B - Termo de Consentimentto Livre e esclarecido ... 43
APÊNDICE C - Artigo da dissertação ... 45
1. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são doenças parasitárias transmitidas por vetores que figuram entre as mais negligenciadas do mundo e são consideradas doenças das classes mais pobres, por apresentarem maior prevalência nos países menos desenvolvidos. Mais de 20 microrganismos diferentes foram identificados como causadores da doença e mais de 90 espécies de vetores participam da transmissão. A doença se manifesta em quatro apresentações clínicas distintas, denominadas: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucocutânea, leishmaniose dérmica pós calazar e leishmaniose visceral(LV)1.
A doença é causada por protozoários do gênero Leishmaniae transmitida pela picada da fêmea do flebotomínio que esteja infectada2. No Brasil,
Leishmania(Leishmania) chagasi foi isolado como o agente causador da LV, assim
como a transmissão foi atribuída aos insetos Lutzomia longipalpis e Lutzomia cruzi3. No período de 2000 a 2011, foram notificados mais de 40.000 novos casos de LV no país4, mais de 3.000 registros de morte mencionaram a LV como causa básica ou associada, gerando uma média de quase 300 mortes por ano. A região mais afetada é a região Nordeste do Brasil, em contrapartida, a região Sul registra o menor número de casos em todo o país5. Todavia, percebe-se um aumento no número dos casos em direção ao sul, incluindo a Argentina e os estados do Rio Grande do Sul e Paraná, deixando Santa Catarina isolado, sem aumento das notificações, entre essas localidades. No ano de 2013, enquanto os casos nacionais ultrapassavam os 3.400, o estado de Santa Catarina registrou somente 1 caso, nenhum desses na região sul do estado6.
O principal reservatório urbano da LV é o cão doméstico - Canis familiaris. Um estudo comparando a prevalência da LV e da leishmaniose visceral canina (LVC) demonstrou correlação na flutuação da ocorrência de casos em humanos e cães, sugerindo que os cães mantém o parasito em circulação no ambiente mesmo em períodos de baixa transmissão pelos vetores7.A enzootia canina tem precedido a ocorrência de casos humanos e a infecção em cães tem sido mais prevalente que no homem8.
Santa Catarina registra o menor número de casos em humanos em todo o país, porém nenhum deles aconteceu na região sul do estado. Porém, em 2016,
identificou-se a presença de espécies de flebotominios capazes de transmitir a doença na região sul9, o que justifica a importância de definirmos a prevalência e os fatores de risco para a infecção por LVC para essa região. A quantificação dos fatores associados à infecção em cães pode ser útil para o melhor direcionamento das atividades de controle e para o desenho e planejamento de estratégias que visem à prevenção de infecções nesta população. Além disso, estas são também fundamentais para o entendimento da expansão e da urbanização da LV9–11.
Analisar a prevalência de LVC em área não endêmica para LV fornece, aos sistemas de saúde, dados significativos na decisão de estratégias de prevenção da doença em humanos. O trabalho em questão visa determinar a prevalência de LVC nos municípios de Tubarão-SC e Criciúma-SC, bem como, a identificação dos principais fatores de risco para a infecção em cães.
1.1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1.1 Leishmanioses
As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por protozoários intracelulares obrigatórios do gênero Leishmania, pertencentes à ordem Kinetoplastida e à família Trypanossomatidae. A estrutura extra nuclear, denominada kinetoplasto, que possui seu próprio DNA (kDNA), confere a esses microrganismos mecanismos especiais de replicação. O gênero Leishmania é classificado em dois subgêneros, baseado nas diferenças anatômicas dos locais de desenvolvimento no interior do intestino do vetor, são eles: Leishmania, encontrado nas Américas e
Viannia, encontrado na Europa, Ásia e África1,12.
O parasito se apresenta em duas formas evolutivas distintas: amastigota e promastigota. A forma amastigota é intracelular, não flagelada e com aproximadamente 4µm, é encontrada no hospedeiro vertebrado, infectando tanto macrófagos, quanto outras células e órgãos linfóides. Já a forma promastigota tem de 15-20µm, possui flagelo e é encontrada no interior do hospedeiro invertebrado (Figura 1). A transformação da forma amastigota em promastigota é realizada no intestino do vetor, posterior à ingestão através da picada. Após a reprodução por fissão binária, o parasito migra para a probóscide do vetor, tornando-se infectante novamente(Figura 2)14.
Figura 1 – Caracterização das formas promastigota (A) e amastigota (B) de
Leishmania sp.
Fonte: adaptado de BESTEIRO et al, 200715.
A transmissão das Leishmanioses é dividida em dois tipos: antroponótica e zoonótica. A transmissão antroponótica ocorre dos humanos para o vetor e novamente para os humanos e só é identificada na África Ocidental, Índia e China. Já a transmissão zoonótica ocorre de um animal para o vetor e depois para um humano, sendo identificada em todas as regiões onde as leishmanioses ocorrem2. Dentre os hospedeiros intermediários da doença, o cão aparece como principal ator na manutenção das leishmanioses no ambiente4.Mundialmente, analisando-se mortalidade por doenças causadas por parasitos, as leishmanioses estão em segundo lugar, ficando atrás somente da malária, sendo também a terceira causa mais comum de morbidade em crianças com menos de 15 anos nessa classe de doenças14.
Figura 2 - Representação ilustrativa da transmissão zoonótica de Leishmania sp.
Fonte: BLANCO e NASCIMENTO, 201717.
As Leishmanioses podem se apresentar de quatro formas clínicas distintas: LV, leishmaniose cutânea ou leishmaniose tegumentar americana, leishmaniose mucocutânea e leishmaniose dérmica pós calazar2.A atuação do cão como reservatório das formas cutâneas não está bem elucidada, sendo muitas vezes considerado apenas hospedeiro acidental, na LV o cão tem papel importante na manutenção do parasita e, consequentemente, do ciclo da doença18, razão pela qual nos concentramos nessa forma no decorrer do trabalho.
1.1.2 Leishmaniose visceral
1.1.2.1 Etiologia
A LV é uma doença crônica, sistêmica, caracterizada por febre de longa duração, perda de peso, astenia, adinamia e anemia, dentre outras manifestações, podendo ser fatal sem o tratamento adequado8, é causada principalmente pelos parasitos Leishmania(Leishmania)donovani, predominante na África Ocidental, Índia
e China e Leishmania(Leishmania)infantum, encontrada nas Áfricas Ocidental e Central, Oriente Médio, China e nas Américas15. A origem do agente etiológico da LV nas Américas ainda é discutida, uma hipótese supõe que L. infantum e L. chagasi seriam espécies sinonímias e que a introdução ocorreu após a colonização do continente, através de cães vindos do Mediterrâneo, a outra hipótese considera a L.
chagasi uma espécie nativa16.
1.1.2.2 Epidemiologia
Segundo a OMS, até 2010, um total de 98 países relataram casos de LV, totalizando mais de 58.000 casos oficiais notificados por ano, porém, considerando-se os altos índices de não notificação, estima-considerando-se que o número de casos considerando-seja de 4 a 8 vezes maior. Mais de 90% dos casos mundiais de LV ocorrem em apenas seis países: Índia, Bangladesh, Sudão, Sudão do Sul, Etiópia e Brasil17.
O Brasil é o terceiro maior foco do planeta, compreendendo 90% dos casos das Américas. Em 19 anos de notificações (1984-2002), ocorreram 48.455 casos de LV, 66% desses casos foram registrados nos estados da Bahia, Ceará, Maranhão e Piauí. A média anual no país, entre 2009 e 2017, foi de 3.720 casos e a incidência foi de 2 casos/100.000 habitantes6.
Com relação à letalidade, entre os anos de 2000 a 2011, registraram-se no Brasil 3.322 casos de morte por LV, sendo 2.727 casos como causa básica e 595 como causas associadas. O número médio de mortes relacionadas com a LV foi de 277 por ano, com variação de 198 em 2001 para 350 em 2009. No mesmo período, 41.015 novos casos de LV foram notificados (taxa de incidência anual média de 1,84 casos / 100.000 habitantes). A mortalidade no período foi de 0,15 óbitos por 100 mil habitantes (95% IC: 0,13-0,16) e taxa de letalidade de 8,1% (IC 95%: 7,8-8,4)4.
A LV foi, primariamente, caracterizada como doença de caráter eminentemente rural. Em 2009 notou-se uma expansão para áreas urbanas de médio e grande porte e se tornou crescente problema de saúde pública no país e em outras áreas do continente americano, sendo uma endemia em franca expansão geográfica8.
Todas as unidades federativas já apresentaram casos autóctones de LV. A maior incidência encontra-se no Nordeste com mais de 50% dos casos notificados, seguido pelas regiões Sudeste, Norte, Centro-Oeste e Sul respectivamente6.
Em consulta ao Sistema de Informação de Agravos de notificação (SINAN),encontrou-se em 2001, para as regiões, Sudeste, Centro-oeste e Sul um percentual de 9,4%, 4,6% e 0,1% dos casos notificados no país, quando que em 2017, esses valores passaram a 24,2%, 6,4% e 0,4%, sendo possível perceber um aumento no percentual de casos confirmados de LV nas regiões Sudeste, Centro-oeste e Sul. Esses dados apontam uma tendência de disseminação da doença em direção ao sul do país. O maior crescimento foi na região Sul que apontou incremento de quatro vezes mais casos quando comparados os períodos. Embora houvesse um crescimento considerável das notificações da região Sul, o estado de Santa Catarina apresenta o menor número de casos registrados na região, mesmo que, demograficamente, esteja localizado entre os dois outros estados, a ausência do principal vetor, embora tenham sido encontradas espécies com potencialidade de transmissão e a não inclusão da doença nas suspeitas diagnósticas são hipóteses para esse acontecimento6.
1.1.2.3 Vetor
Com relação a transmissão da LV, o invertebrado responsável é a fêmea do flebotomínio, popularmente conhecido por mosquito-palha. Estes insetos são pertencentes à ordem Diptera, família Psychodidae e subfamília Phlebotominae. Se caracterizam por serem insetos pequenos, medindo se 1 a 3mm de comprimento, terem o corpo revestido por pelos e coloração clara. Em relação ao comportamento, voam em pequenos saltos e pousam com as asas entreabertas. Na sua fase larvária se desenvolvem em locais úmidos e escuros, ricos em matéria orgânica. Na fase adulta a fêmea necessita alimentar-se de sangue para o desenvolvimento dos ovos, justificando sua importância na transmissão da LV4.
Apesar de, os flebotomínios se apresentarem como a mais importante forma de transmissão vetorial, sugere-se, em alguns estudos, a participação de carrapatos e pulgas na disseminação do parasito22,23. Transfusão sanguínea, transplante de órgãos e a via transplacentária também são formas de transmissão sem que haja a presença de um hospedeiro invertebrado24.
No Brasil, duas espécies de vetores estão associadas à transmissão da LV,
Lutzomia longipalpis e Lutzomia cruzi18. Apesar destes terem sua origem silvestre, habitantes de florestas primárias, estudos demonstram uma grande concentração dessas espécies em regiões periurbanas e urbanas20,26,27. A L. longipalpis se adapta facilmente ao peridomicílio e a variadas temperaturas, podendo ser encontrada no interior dos domicílios e em abrigos de animais domésticos, principalmente próxima a uma fonte de alimento4.
Embora L. longipalpis seja considerado o principal vetor para L. infantum no Brasil, alguns trabalhos se dedicam a identificar a participação de outras espécies de flebotomínios na transmissão da LV. Algumas espécies como: Migonemya migonei,
Lutzomyia migonei e Pintomyia fischeri foram identificadas como potenciais vetores
para L. infantum, principalmente em áreas endêmicas onde não foi encontrado L.
longipalpis26–30.
Quando da avaliação da presença do vetor no estado de Santa Catarina, um estudo de 2010, capturou 39 exemplares de P. fischeri no município de Florianópolis31,em 2016 foi avaliada a fauna de flebotomínios nos municípios de Criciúma, Tubarão e Imaruí, no sul de Santa Catarina, embora não tenha encontrado
L. longipalpis, foram identificados exemplares de P. fischeri, sugerindo que a região
tem potencial para a transmissão da LV9. Em Porto Alegre, região que já registrou casos humanos de LV, foram identificados Lu. neivae, P. fischeri, e Lu. migonei.
1.1.2.4 Reservatório
Ainda com relação a localização geográfica da LV, a presença de reservatórios vertebrados no ambiente tem significativa importância, no ambiente silvestre são considerados reservatórios primários, alguns canídeos silvestres e roedores, entre eles são mais frequentes as raposas Dusicyon vetulus e Cerdocyon
thous e os marsupiais Didelphis albiventris32,33. Na área urbana, o cão doméstico
Canis familiaris é considerado o principal reservatório. Embora outras espécies
tenham sido identificadas como reservatório, o cão adquiriu grande importância devido à estreita convivência com o homem, ao intenso parasitismo cutâneo e à grande quantidade de animais assintomáticos, o que dificulta a identificação dos animais transmissores4,32.Contudo, o ciclo parasitológico somente pode ser estabelecido quando o hospedeiro e o vetor vivem no mesmo ambiente ecológico4,34.
1.1.2.5 Medidas de controle e prevenção
O programa brasileiro de controle das leishmanioses adota três medidas principais: diagnóstico e tratamento imediato dos casos humanos, eliminação do vetor através do uso de inseticidas, identificação sorológica dos cães infectados e eliminação dos soropositivos8. A utilização de coleiras ou inseticidas com efeito repelente, a vacinação dos cães e a eutanásia de cães infectados são medidas de controle propostas pelo Ministério da Saúde, porém consideradas por muitos controversas e de pouca efetividade, uma vez que doenças transmitidas por vetores biológicos associados à reservatórios domésticos e a aspectos ambientais, tem difícil controle e incerteza no conhecimento epidemiológico devido à recente urbanização11,35.
1.1.3 Leishmaniose visceral canina
1.1.3.1 Características clínicas
Os cães infectados com Leishmania, podem desenvolver sinais clínicos muito semelhantes aos sintomas da doença nos humanos, incluindo lesões de pele tais como difusa, não-pruriginosa, alopecia generalizada ou localizada; seborreéiaseca disseminada ou localizada; hiperqueratose ou úlceras na mucosa e eczema no nariz ou ouvidos. Perda de peso e apetite, linfadenopatia localizada ou generalizada, lesões oculares, blefarite, ceratoconjuntivite bilateral, uveíte, glaucoma, epistaxe, anemia, insuficiência renal, diarreia crônica, onicogrifose, corrimento nasal e edema de pernas, também são sinais comumente encontrados em cães com LVC36.Também a exemplo da doença humana, uma grande parte dos cães soropositivos pode se apresentar assintomática, estudos demonstram que até 80% dos cães infectados, não apresentaram quaisquer sinais clínicos da doença37– 39
.
Essa distinção nas manifestações clínicas nos permite classificar os cães portadores em 3 classes: assintomáticos, quando não apresentam sinais clínicos
sugestivos de infecção; oligossintomáticos, quando apresentam alterações dermatológicas leves, linfadenopatia e perda de peso discretas; e sintomáticos, quando os sinais comuns da doença estão evidentes em quase sua totalidade, enfatizando perda de peso acentuada, ceratoconjuntivite, onicogrifose e alopecia40.
1.1.3.2 Etiologia e epidemiologia da LVC
Os principais agentes etiológicos da LVC identificados nas Américas são: L. (L.)chagasie L. (Viannia) brasiliensis, tendo como vetor o Lutzomiaspp.. Na Europa, o vetor de transmissão é o Phlebotomusspp., e o agente L. (L.) infantum41.
No Brasil, antes da década de 80, a LVC era considerada uma doença endêmica apenas nas áreas rurais, porém após esta data, percebeu-se uma disseminação gradual da doença para as áreas urbanas. A urbanização da LVC está associada ao desmatamento, à subsequente adaptação do vetor aos nichos urbanos e a intensa migração, que levou à incorporação de cães residentes em áreas rurais, local onde eram mais prevalentes, no ciclo de transmissão do ambiente urbano3. O transporte de cães entre áreas endêmicas e não endêmicas para LVC no Brasil, aliado às modificações ecológicas e distribuição das espécies de vetores, tem criado novos cenários epidemiológicos, indicando uma disseminação da doença para o sul do país42.
1.1.3.3 Métodos Diagnósticos
Existem vários métodos disponíveis para o diagnóstico da LVC e estes estão em constante avanço, porém a escolha de um método realmente eficaz passa pela avaliação de alguns critérios. Segundo Maia e Campino (2008) um teste diagnóstico eficaz deve ser capaz de confirmar a suspeita clínica em um único paciente e detectar a infecção em cães assintomáticos, ter alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade, ser simples, fácil de executar, não ser oneroso e estar disponível em laboratórios regionais ou adaptável às condições de campo43.
Entre as alternativas descritas na literatura, existem métodos clínicos, parasitológicos, sorológicos e moleculares. A principal recomendação do Ministério da Saúde é a utilização dos testes sorológicos de Ensaio imunoenzimático (ELISA)
e Imunofluorescência indireta (RIFI), como triagem e confirmatório, respectivamente4,8.
1.1.3.3.1 Diagnóstico clínico
O diagnóstico clínico é o mais simples e baseia-se na observação clínica do cão, considerando principalmente a presença de lesões cutâneas, onicogrifose, perda de peso, hepatomegalia e esplenomegalia, aliada à anamnese. A limitação deste método está na detecção de pacientes assintomáticos e na equivalência dos sintomas comparado a outras doenças. Sendo assim, não é possível a confirmação do diagnóstico através da simples exploração clínica, fazendo-se necessário o emprego de testes diagnósticos parasitológicos, sorológicos ou moleculares8.
1.1.3.3.2 Diagnóstico parasitológico
Os exames parasitológicos visam a observação das formas infectantes do agente em esfregaços de tecidos contaminados. Os exames histológicos ou de imunohistoquímica são os mais conhecidos e tem como limitação necessidade da presença do agente no tecido coletado. Métodos parasitológicos destacam-se pela especificidade, limitando a detecção de falsos positivos32.
Estes testes podem ser realizados a partir de amostras de medula óssea, linfonodos, baço, fígado, pele ou sangue periférico, porém a maioria das amostras é obtida através de procedimentos muito invasivos. Em animais assintomáticos, onde a carga parasitária não é elevada, a visualização do parasita torna-se mais rara44.
O exame parasitológico direto consiste na visualização das formas amastigotas livres ou infectandomonócitos, macrófagos e neutrófilos em esfregaços obtidos através de aspirados dos órgãos afetados, corados com Giemsa ou Corante de Leishman. Já na histopatologia, amostras obtidas através de biópsia dos órgãos infectados são coradas com hematoxilina-eosina para visualização do parasito nos tecidos45,46.
A imunohistoquímica pode ser usada quando a carga parasitária é baixa no tecido analisado, quando o parasito não é claramente visualizado no microscópio. As amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina são processadas utilizando o sistema estreptavidina-peroxidase / biotina com soro hiperimune canino como
anticorpo primário ou pelo uso de anticorpos policlonais ou monoclonais anti-Leishmania47. Estudos têm apontado maior sensibilidade na imunohistoquímica quando comparada ao método histopatológico. Cultura de tecidos in vitro, inoculação em animais de laboratório e xenodiagnóstico utilizando o vetor, também são descritos como alternativas de diagnóstico parasitológico, porém com muitas limitações de aplicação44,48.
1.1.3.3.3 Diagnóstico sorológico
Segundo Alvar et al. (2004), os testes sorológicos são amplamente utilizados já que a resposta humoral específica na LVC, em geral, é muito intensa, com altos níveis de imunoglobulinas específicas, no entanto, a sensibilidade ainda subestima a taxa de infecção em populações de cães de áreas endêmicas49. Taxas variáveis de anticorpos de acordo com o estágio de infecção ou a presença de sinais clínicos e a possibilidade de reação cruzada com outras espécies4, faz com que a presença de anticorpos anti-Leishmania somente, não seja sinal conclusivo de doença43.
Alves e Bevilacqua (2004) mencionam que os métodos diagnósticos utilizados em inquéritos epidemiológicos devem possuir alta sensibilidade eespecificidade, pois através da primeira obtém-se menor taxa de animais negativos evitando apermanência de animais positivos e pela segunda evita-se que cães não infectados sejamsacrificados50.Os testes sorológicos como o ELISA e a RIFI fazem parte da recomendação do Ministério da Saúde para inquéritos sorológicos na LVC, porém podem apresentar reação cruzada com Trypanossoma cruzi e L. brasiliensis4.
O teste ELISA baseia-se em reações antígeno-anticorpo aliada à utilização da enzima peroxidase e adaptado para utilização de vários antígenos, entre eles: antígenos citoplasmáticos purificados, peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes. O teste é útil tanto para uso laboratorial, quanto para aplicações em campo e sua facilidade possibilita a utilização para triagem de um grande número de amostras em curto espaço de tempo43.
RIFI é considerado o padrão ouro dos diagnósticos sorológicos, porém necessita de equipamento específico e técnicos habilitados, o que torna a sua realização onerosa. A necessidade de diluições seriadas de soro torna a sua realização trabalhosa e demorada. Este método utiliza parasita de corpo inteiro como antígeno, um anticorpo não fluorescente e um anticorpo fluorescente com
especificidade contra determinantes antigênicos do primeiro anticorpo. A visualização da fluorescência que determina a positividade43,49.
O teste de aglutinação direta (DAT), consiste na utilização de soro ou plasma da amostra em reação com formas promastigotas inteiras de Leishmania, coradas, em forma de suspensão ou liofilizadas, para visualização da aglutinação da amostra51.Dispensa equipamentos sofisticados, tem baixo custo e seus procedimentos são de simples execução, porém o longo período de incubação e a necessidade de diluições seriadas dificulta a utilização para triagem em grandes quantidades de amostra52.
Os kits de testes imunocromatográficos rápidos, tem sido cada vez mais utilizados para triagem no diagnóstico de LVC, sua facilidade de aplicação e rapidez no resultado facilitam a utilização em campo e agilizam a intervenção. Os testes utilizam tiras de papel de nitrocelulose impregnadas com o antígeno, onde o aparecimento de duas linhas (uma controle e uma teste) identificam um resultado positivo. Há uma tendência nas orientações do Ministério da Saúde para a utilização deste tipo de teste para triagem em inquéritos epidemiológicos para LVC43.
1.1.3.3.4 Diagnóstico molecular
A técnica molecular, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), consiste na detecção de DNA do agente e tem sido muito utilizada atualmente53. Um grande variedade de tecidos tem sido utilizada para a detecção de Leishmania por PCR. Medula óssea, linfonodo, pele, sangue total e swabs conjuntivais tem revelado a presença do parasito no diagnóstico molecular. A eficácia da técnica de PCR depende da qualidade dos primers, o número de cópias, o método de extração do DNA, o material biológico e a técnica PCR utilizada tem mostrado resultados diferentes quando comparadas54,55.
A utilização da PCR quantitativa, em tempo real, permite a monitorização da amplificação de DNA específico, assim, uma estimativa de carga parasitária pode ser obtida em diferentes amostras43.
Estudos comparando os métodos diagnósticos apontam para uma grande diferença na eficácia e na capacidade de detecção de portadores assintomáticos56– 59
15,9% de acordo com a soropositividade pelo teste de ELISA. Entretanto, a prevalência a partir do PCR foi de 24,7% de cães positivos para o DNA de
L.infantum. Os resultados demonstram uma prevalência maior pela técnica de PCR
que a detectada por sorologia12.
1.1.3.3.5 LVC em Santa Catarina
Maziero et al. (2014) investigaram a ocorrência de LVC na região oeste de Santa Catarina, na fronteira com a Argentina e com o Paraná. Foram incluídos 252 cães na pesquisa, utilizando como diagnóstico sinais clínicos, ELISA, IFAT e PCR, destes, 48 restaram positivos tanto nos métodos sorológicos como moleculares, 39,6% dos animais positivos apresentaram sintomas da doença. Ainda analisando os animais positivos, 72,9% eram provenientes de áreas rurais60.
De julho de 2010 a outubro de 2011, um estudo examinou 2.124 cães residentes da Ilha de Santa Catarina, utilizando como triagem o teste de ELISA e confirmando por IFAT, com resultado de 29 animais soropositivos, correspondendo a 1,4%. Observou-se, durante a necropsia, que todos os cães apresentavam um ou mais sinais de LV, como hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatia e glomerulonefrites. Além destas alterações, três cães sintomáticos apresentaram dermatite ulcerativa61.
No município de Florianópolis, cinco animais foram examinados,em três desses casos houve o isolamento de formas promastigotas através de cultivo de pele íntegra e punção de linfonodo. Dentre os três animais, apenas um apresentava lesões compatíveis com LVC, como descamação furfurácea, lesões crostosas, rarefação pilosa e eritema62.
Visto isso, diante da ausência de casos de LVC no sul do estado de Santa Catarina, considerando-se a presença do vetor da doença na região e a gravidade de uma possível infecção em humanos, pretende-se avaliar a prevalência de LVC em cães de dois municípios da região sul, definindo, também, os fatores de risco para contaminação pela doença.
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o perfil epidemiológico da LVC no sul do estado de Santa Catarina.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a prevalência da leishmaniose visceral em cães nos municípios de Tubarão-SC eCriciúma-SC;
Identificar os fatores de risco que contribuem para a infecção por Leishmaniasp. em cães;
Determinar a relação assintomáticos x sintomáticos entre os animais soropositivos.
3. MÉTODOS
3.1 TIPO DE ESTUDO
Com o objetivo de definir prevalência da LVC na amostra, o delineamento que foi empregado é o modelo de estudo transversal.
3.2 POPULAÇÃO, LOCAL, TEMPO E AMOSTRA
Como delimitação geográfica foram escolhidos os municípios de Tubarão e Criciúmapor serem os maiores municípios da região sul do estado de Santa Catarina e serem os únicos com Centros de Controle de Zoonoses ativos. Ambos representam, aproximadamente 30% da população da região sul.
Os dois municípios abrangem 537.000Km² de área e quase 318.000 habitantes, a estimativa é de que hajam em torno de 80.000 cães na região. Quanto à urbanização, apresentam desde extensas áreas rurais até locais com alta densidade populacional urbana. O relevo da região também compreende áreas de litoral, bem como proximidade com a serra geral. A diversidade social, também é marcante na região, o que possibilita uma boa análise dos fatores de risco35.
A coleta de amostras foi realizada em locais com alta concentração de cães, os centros de controle de zoonoses (CCZ). A definição da amostra foi realizada por meio de censo, onde todos os animais habitantes do local foram incluídos.Um total de 107 amostras foram obtidas, sendo 77 cães de Tubarão (72%) e 30 de Criciúma (28%).
3.2.1 Critérios de inclusão
Foram incluídos na coleta, todos os animais residentes nos locais de maior concentração de cães de cada município, sejam eles sadios ou com sintomas de LVC, sob a responsabilidade dos CCZs.
3.2.2 Critério de exclusão
Foram excluídos do estudo os animais dos quais o volume de sangue coletado foi inferior ao necessário para análise.
3.3 COLETA DE DADOS
Os animais foram previamente identificados com coleiras de pvc marcadas à caneta, contendo um número de identificação ou pelo número de registro do órgão tutor (Figura 3), associado a registro fotográfico de cada animal (Figura 4).
Figura 3 - Coleiras de identificação confeccionadas em PVC numeradas à caneta. Fonte: Fotografia do autor
Figura 4 - Registro fotográfico do animal para identificação Fonte: Fotografia do autor
A coleta de dados como raça, pelagem, gênero, idade, castração e localização, bem como a determinação de sinais compatíveis com LVC, referentes aos animais que participaram do estudo, foi realizada a partir do preenchimento de um questionário (Apêndice 1). Este foi preenchido mediante a observação direta dos cães por um Médico Veterinário e através de entrevista com o responsável pelo animal (Figura 5). Para a participação do cão no projeto de pesquisa, foi necessário que o responsável estivesse de acordo com o estudo, com a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 2).
Figura 5 - Médico Veterinário preenchendo o questionário mediante observação Fonte: Fotografia do autor
3.3.1 Coleta e Armazenagem do Material
Foi realizada colheita de 5mL de sangue dos animais através de punção da veia jugular, utilizando seringa descartável de 5ml e agulha hipodérmica 25 x 0,7mm (Figura 6). Após a coleta o material foi dividido em 2 amostras de 2,5 ml, sendo uma delas armazenada em tubo S-Monovette de 2,6 ml contendo EDTA e outra em tubo S-Monovette de 2,6ml com ativador de coágulo (Figura 7) e armazenado em à temperatura de 2° a 8° por no máximo 24hrs. O conteúdo dos tubos foi centrifugado em centrifuga Fanem Excelsa Baby II a 3500 rpm por 10 minutos para obtenção do soro ou plasma conforme o material coletado, o resultante da centrifugação foi armazenado em tubos ependorff e acondicionados em congelador a -20º C.
Figura 6 - Amostra coletada de cão por punção da veia jugular Fonte: Fotografia do autor
Figura 7 - Tubo Monovette 2,6ml contendo EDTA (tampa roxa) e tubo S-Monovette 2,6ml com ativador de coagulo (tampa vermelha).
3.3.2 Diagnóstico molecular - PCR em tempo real
3.3.2.1 Extração da DNA
O isolamento de DNA foi realizado a partir de 200 µL de soro pelo kit comercial Nucleid Acid and Protein Purification (Macherey-Nagel, Alemanha), conforme recomendações do fabricante. O protocolo incluiu lise celular com proteinase K para liberação de DNA e resina de sílica para purificação deste. Os DNAs extraídos foram armazenados em freezer à– 20°C até o momento de sua utilização.
3.3.2.2 Amplificação por PCR em tempo real
Foram utilizados os primers 13A (5´-GTG GGG GAG GGG CGT TCT-3´) e 13B(5´-ATT TTA CAC CAA CCC CCA GTT-3´) conforme descrito por Rodgers, Popper e Wirth (1990)64. A amplificação teve como alvo uma região de 120 pares de bases dos minicírculos do gênero Leishmania. Essas sequências de DNA estão presentes em cópias múltiplas em uma região conservada dos minicírculos de DNA do cinetoplasto(kDNA).
A amplificação por PCR em tempo real foi realizada em um termociclador StepOne™ Real Time PCR Systems (AB AppliedBiosystems) e os produtos amplificados foram detectados por meio do fluoróforo SYBR® Green. A reação foi padronizada em um volume final de 20 µL, contendo 15 µL de Fast SYBR® Green mastermix (AB AppliedBiosystems), 10 pmol de cada primer e 5 µL de DNA extraído de soro canino. As condições da amplificação foram: ativação da enzima a 95°C por 20 segundos, desnaturação a 95°C por 1 segundo e, por fim, anelamento e extensão a 61°C por 20 segundos.
Para a padronização da reação de PCR foi feita uma curva de dissociação para a análise da concentração ideal de primers a serem adicionados à reação e a análise de uma curva padrão da diluição seriada de DNA de referência de
Leishmania. Para cada corrida de amplificação foi utilizado um controle negativo de
DNA purificado de Leishmania. Todas as amplificações foram realizadas em duplicatas.
A extração e amplificação foram realizadas no Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CDCT), Secretaria da Saúde do Estado do Rio Grande do Sul (SES/RS) em Porto Alegre.
3.4 VARIÁVEIS DE ESTUDO
No estudo, a variável dependente foi a prevalência de LVC. As variáveis independentes são referentes aos fatores de risco para a infecção e são relacionadas no quadro a seguir.
Quadro 1 – Esquematização das variáveis independentes.
Variável Natureza Classificação Operacionalização
Sexo Qualitativa Nominal dicotômica Macho/Fêmea
Idade Qualitativa Nominal politômica Filhote/Adulto/Idoso Raça Qualitativa Nominal dicotômica Puro/S.R.D.
Sintomatologia Qualitativa Nominal dicotômica Sadio/Suspeito Pelagem Qualitativa Nominal dicotômica Curta/Longa Ambiente Qualitativa Nominal dicotômica Urbano/Rural Fonte: Elaborado pelo autor
3.5 PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS DADOS
Para análise estatística foi usado o método do qui-quadrado de Pearson e teste exato de Fischer. Todas as análises foram realizadas empregando os softwares OpenEpi 3.01 e SPSS 21.0.
3.6 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
Por utilizar método de coleta de material pouco invasivo e classificado com Grau de Risco II, utilizando anestésico para coleta de material biológico, o projeto foi encaminhado à Comissão de Ética para o Uso de Animais – CEUA/UNISUL para
avaliação da conformidade com a Resolução Normativa n° 12, de 20 de setembro de 2013, o qual remeteu parecer favorável à realização do estudo sob o nº 16.050.2.13.IV (ANEXO 2).
4. RESULTADOS
Um total de 107 amostras foram analisadas. Foram 77 cães de Tubarão-SC (72%) e 30 de Criciúma (28%). Do total 105 animais foram classificados como sem raça definida (98,1%), 97 animais era de pelagem curta (90,7%), 61 cães machos (57%) e 46 fêmeas (43%). Considerando a idade, 34 animais foram classificados como filhotes (até 11 meses), 67 adultos (de 1 a 7 anos) e 6 idosos (mais de 7 anos), 67 animais eram castrados (62,6%) e 40 não castrados (37,4%), 30 animais estavam em zona urbana (28%) e 77 em zona rural (72%) (Tabela 1).
Com relação a avaliação clínica, 83 animais não apresentaram sintomas de LVC (77,6%) e 24 foram considerados suspeitos, sendo 19 cães apresentando somente dermatopatias (79,2%), 1 apresentando somente emagrecimento (4,2%) e 1 somente ceratoconjuntivite (4,2%), 3 cães apresentaram mais de um sinal associado, sendo 2 com dermatopatias e onicogrifose e 1 com dermatopatias e ceratoconjuntivite.
Tabela 1 - Características da população dos cães coletados nos municípios de Tubarão e Criciúma.
Tubarão Criciuma Total
n (%) n (%) n (%)
Raça
sem raça definida 76 (98,7) 29 (96,7) 105 (98,1)
Puro 1 (1,3) 1 (3,3) 2 (1,9) Pelagem Curta 69 (89,6) 28 (93,3) 97 (90,7) Longa 8 (10,4) 2 (6,7) 10 (9,3) Idade Filhote 16 (20,8) 18 (60,0) 34 (31,8) Adulto 58 (75,3) 9 (30,0) 67 (62,6) Idoso 3 (3,9) 3 (10,0) 6 (5,6) Gênero Macho 44 (57,1) 17 (56,7) 61 (57,0) Fêmea 33 (42,9) 13 (43,3) 46 (43,0) Castração Castrado 47 (61,0) 20 (66,7) 67 (62,6) nãocastrado 30 (39,0) 10 (33,3) 40 (37,4) Localização Urbana 0 (0,0) 30 (100) 30 (28,0) Rural 77 (100,0) 0 (0,0) 77 (72,0) Suspeita Sadio 66 (85,7) 17 (56,7) 83 (77,6) Suspeito 11 (14,3) 13 (43,3) 24 (22,4) Sinais dermatopatias 9 (11,7) 10 (33,3) 19 (17,8) ceratoconjuntivite 1 (1,3) 0 (0,0) 1 (0,9) onicogrifose 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) emagrecimento 0 (0,0) 1 (3,3) 1 (0,9) dermatopatias + ceratoconjuntivite 1 (1,3) 0 (0,0) 1 (0,9) dermatopatias + onicogrifose 0 (0,0) 2 (6,7) 2 (1,9)
Tabela 2 - Prevalência de Leishmania sp. em cães por PCR em tempo real, nos municípios de Tubarão e Criciúma.
Tubarão Criciuma Total
n (%) N (%) n (%)
PCR
negativos 62 (80,5) 23 (76,7) 85 (79)
Positivos 13 (16,9) 7 (23,3) 20 (19)
Das amostras analisadas, 20 animais restaram positivos para a detecção de
Leishmania sp. por PCR em tempo real, indicando uma prevalência de 19%. Apenas
2 apresentaram resultado indeterminado. Do total de cães positivos 13 eram de Tubarão (65%) e 7 de Criciúma (35%) (Tabela 2). Analisando-se os fatores de risco, nenhuma das variáveis estudadas apresentou significância estatística (Tabela 3).
Tabela 3 - Análise dos fatores de risco para infecção Leishmania sp. em cães nos municípios de Tubarão e Criciúma, onde (-) significa negativos (+) significa positivos e (I) indeterminados.
(-) (%) (+)(%) (I) (%) P*
Raça
Sem raça definida 83 (79) 20 (19) 2 (1,9) 0,491
Puro 2 (100) 0 (0) 0 (0) Pelagem Curta 79 (81,4) 16 (16,5) 2 (2,1) 0,208 Longa 6 (60) 4 (40) 0 (0) Idade Filhote 27 (79,4) 7 (20,6) 0 (0) 0,630 Adulto 54 (80,6) 11 (16,4) 2 (3) Idoso 4 (66,7) 2 (33,3) 0 (0) Gênero Macho 48 (78,7) 11 (18) 2 (3,3) 0,580 Fêmea 37 (80,4) 9 (19,6) 0 (0) Castração Castrado 52 (77,6) 13 (19,4) 2 (3) 0,396 nãocastrado 33 (82,5) 7 (17,5) 0 (0) Localização Urbana 23 (76,7) 7 (23,3) 0 (0) 0,900 Rural 62 (80,5) 13 (16,9) 2 (2,6) Suspeita Sadio 65 (78,3) 17 (20,5) 1 (1,2) 0,849 Suspeito 20 (83,3) 3 (12,5) 1 (4,2) Sinais dermatopatias 16 (84,2) 2 (10,5) 1 (5,3) ceratoconjuntivite 0 (0) 0 (0) 0 (0) onicogrifose 0 (0) 1 (100) 0 (0) emagrecimento 1 (100) 0 (0) 0 (0) dermatopatias + ceratoconjuntivite 2 (100) 0 (0) 0 (0) dermatopatias + onicogrifose 0 (0) 0 (0) 1 (100)
5. DISCUSSÃO
A prevalência de LVC encontrada no presente estudo foi de 19%, sendo 16,9% no município de Tubarão e 23,3% em Criciúma. No mesmo estado Maziero e colaboradores (2014)65 encontraram prevalência de 21,8% avaliando cães da região oeste de Santa Catarina pelo método de PCR.
Analisando estudos realizados no estado de SC, quando os casos de LVC ainda eram pouco relatados, vê-se que Caramez e colaboradores (2015) obtiveram prevalência de 1,80% analisando 6712 cães do município de Florianópolis entre os anos de 2010 e 2014, período em que surgiram os primeiros casos de LVC no município. Steindel e colaboradores (2013)61, mencionam 1,4% de prevalência utilizando PCR no município de Florianópolis, em estudo com 2124 cães entre os anos de 2010 e 2011.
De 405 cães avaliados em área não endêmica da região metropolitana de Porto Alegre no Rio Grande do Sul, somente 16 restaram positivos à avaliação por PCR (4%)66. Em outra circunstância foram identificados 12 animais positivos dentre 2091 avaliados em região não endêmica do estado de São Paulo no ano de 2003, nesse caso utilizando diagnóstico sorológico em cães errantes e domiciliados.
Percebe-se que tanto no estado de Santa Catarina quanto em outros estados do Brasil, quando avaliados cães de região não endêmica utilizando a técnica de PCR como método diagnóstico, situação semelhante à que ocorre em nosso estudo, os valores de prevalência encontrados foram bem abaixo dos resultados que obtivemos, com exceção do Estado do Rio de Janeiro, onde observou-se prevalência de 21,6% em área onde o surgimento da doença ainda era recente67. Tal informação sugere que a transmissão da LVC esteja ocorrendo entre os cães nos municípios do Sul de Santa Catarina, aumentando as chances da aparição de casos humanos, uma vez que, em regiões endêmicas, a doença é mais prevalente nos cães do que nos homens e o aparecimento dos casos caninos precede os casos em humanos8.
Em 2010, Correa e colaboradores determinaram prevalência de 6,8% analisando 108 cães do município de Florianópolis, utilizando como diagnósticos métodos de ELISA e RIFI68. Pacheco e colaboradores (2013) obtiveram prevalência de 5,3% também utilizando métodos sorológicos69. Carlos e Carneiro (2015) analisaram soro de 150 cães do município de Joinville, próximo ao acontecimento de um caso alóctone e obtiveram 4% de prevalência70. Azevedo e colaboradores (2008) prevalência de 7,8% utilizando testes sorológicos71. Isso mostra que mesmo utilizando testes com menor especificidade, a prevalência de LVC em regiões não endêmicas foi inferior a 10%.
Entre os anos de 2007 e 2013, 45.112 cães foram acompanhados no estado do Alagoas, utilizando diagnóstico sorológico de ELISA e RIFI, apontando 9,9% de positividade. Mostrando que mesmo em regiões onde os casos de LVC tem ocorrido e a transmissão já é conhecida encontra-se dados de prevalência abaixo da que foi encontrada no nosso estudo72. Outros estudos em regiões endêmicas como Santarém-AM e Araçatuba-SP apresentaram valores de prevalência próximos do obtido no presente estudo, 23,3% e 29,6% respectivamente.
Em 2017, realizou-se um levantamento de fauna que identificou a presença do vetor da doença na mesma região do estudo em questão9. A associação entre a ocorrência do parasito e a presença do vetor no mesmo ambiente fornece condições para o estabelecimento do ciclo da doença. Sendo assim, a ocorrência de cães infectados em ambiente de habitado pelo vetor torna iminente o aparecimento dos casos em humanos caso não seja tomada nenhuma providencia seja pelo controle do vetor e/ou do reservatório.
Nenhum animal de raça pura restou positivo, isso pode ter ocorrido devido ao número reduzido de animais dessa classe, já que os locais de estudos são destinados à resgate de animais abandonados. Sendo assim todos os animais positivos não puderam ter sua raça definida, concordando com estudos anteriores que apontam maior positividade para animais sem raça definida73. Fernandes e colaboradores (2016) apresentaram positividade 2,5 vezes maior em animais sem raça definida em relação aos animais de raça pura. É sabido que a grande maioria de cães errantes não tem uma raça definida, ao passo que animais de raça pura encontram-se em grande parte domciliados e com tutores de considerável situação
financeira, causando uma discrepância nos cuidados de higiene e ambiente entre os extremos, diminuindo a exposição, de certa forma, nos animais de raça pura.
Animais classificados como de pelagem longa apresentaram maior positividade em relação aos animais de pelagem curta, sendo 40% e 16,5% respectivamente. Embora não haja significância no presente estudo, estimava-se que animais de pelagem curta tivessem maior prevalência pois Gomes e colaboradores (2107) sugerem maior suscetibilidade a picada do flebotominio74.
Com relação a idade, houve uma maior prevalência entre os animais com mais de 7 anos (33,3%), em segundo lugar estiveram os animais com até 11 meses (20,6%). Similar ao nosso resultado, França-Silva et al. (2003) determinaram maior positividade em cães acima de sete anos75, Já Moreira et al (2003) sugeriram que animais até um ano de idade representam maior risco para LVC12.
Machos e fêmeas tiveram a prevalência semelhante, concordando com outros estudos já publicados73,74, assim como o fato de serem ou não castrados não resultou em diferentes índices de prevalência. A ausência de associação significativa entre sexo e prevalência de LVC foi relatada por muitos autores75–77, com exceção de Dantas-Torres et al. (2006) que observaram maior prevalência em machos avaliando cães do município de Paulista-PE78.
Diferente do que relatam alguns autores79, neste estudo os animais que residiam em área urbana apresentaram maior índice de positividade do que os animais de ambiente rural. Tal alteração pode gerar um erro de interpretação, uma vez que os animais eram provenientes de somente dois ambientes, um localizado em zona urbana e outro em zona considerada rural, sendo assim, o centro que apresentasse maior positividade, elevaria também a positividade por localização.
Dos animais positivos, 85% eram assintomáticos, corroborando com outros estudos, indicando que o portador assintomático atua como reservatório e tem papel importante na manutenção e disseminação da doença37,38,80. Steindel e colaboradores (2013) apontaram alta carga parasitária na pele de animais positivos, mesmo assintomáticos, favorecendo a transmissão através do vetor61.
Para Azevedo e colaboradores (2008) 29,8% dos cães positivos apresentavam dermatopatias e 23% onicogrifose.Dos animais soropositivos e sintomáticos, lesões cutâneas foram os sinais clínicos mais freqüentemente observados, assim como relatado por Feitosa et al. (2000).
6. CONCLUSÃO
O presente estudo determinou 19% de cães positivos para LVC em uma região onde não se registrou, até o momento nenhum caso da doença tanto em cães quanto em humanos. Sendo assim, estima-se que haja subnotificação dos casos, seja por desconhecimento dos sinais clínicos, seja por insegurança no desfecho do diagnóstico, da parte dos Médicos Veterinários da região.
Não foi possível definir nenhuma significância entre as variáveis propostas como fatores de risco para a infecção por Leishmania sp.. Porém, foi possível determinar tendências de maior freqüência de positividade entre cães, acima de 7 anos e sem raça definida. Um alto índice de animais positivos assintomáticos sugerem a manutenção do parasito no ambiente.
Julga-se necessária a realização de mais estudos na população em questão, utilizando classes de animais domiciliados, colhendo informações socioculturais dos proprietários e utilizando outros métodos diagnósticos.
6.1 LIMITAÇÕES DO ESTUDO
O número de animais utilizados foi reduzido, o que pode ter dificultando análises estatísticas mais confiáveis. O fato de os animais se encontrarem em abrigos públicos tornou impossível a definição de características sócio demográficas na análise dos fatores de risco. A técnica utilizada para diagnóstico foi somente PCR em tempo real, embora tenha maior especificidade, testes sorológicos poderiam ser realizados a fim de comparação de eficácia.
6.2 PERSPECTIVAS FUTURAS
Utilizando os resultados do estudo pretendemos isolar o parasito em tecidos dos animais positivos, através da visualização direto do parasito em amostras de linfonodo e medula óssea e confirmar assim o primeiro caso autóctone da região. Estender a pesquisa para animais domiciliados e refinar a análise dos fatores de risco incluindo características sociais e de hábitos de higiene dos tutores, delimitando outros possíveis fatores de risco. Estimular ações de prevenção, como vacinação dos cães, uso de coleiras repelentes e inquérito sorológico para identificação e tratamento dos animais infectados afim de controlar a disseminação da doença e o aparecimento de casos em humanos.
REFERÊNCIAS
1. Pace D. Leishmaniasis. J Infect. 2014;69(S1):S10–8.
2. Chappuis F, Sundar S, Hailu A, Ghalib H, Rijal S, Peeling RW, et al. Visceral leishmaniasis: what are the needs for diagnosis, treatment and control? Nat Rev Microbiol [Internet]. 2007;5(11):873–82. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17938629
3. Harhay MO, Olliaro PL, Costa DL, Costa CHN. Urban parasitology: Visceral leishmaniasis in Brazil. Trends Parasitol [Internet]. 2011;27(9):403–9. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.pt.2011.04.001
4. Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral [Internet]. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. 2014. 120 p. Available from:
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_vigilancia_controle_leishm aniose_visceral_1edicao.pdf
5. Martins-Melo FR, Lima M da S, Ramos AN, Alencar CH, Heukelbach J. Mortality and case fatality due to visceral leishmaniasis in Brazil: a nationwide analysis of epidemiology, trends and spatial patterns. PLoS One [Internet]. 2014 Jan 3 [cited 2016 Jun 13];9(4):e93770. Available from:
http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0093770
6. Brasil. Ministério da Saúde. DATASUS [Internet]. Available from: http://tabnet.datasus.gov.br/cgi/tabcgi.exe?sinannet/ cnv/leishvsc.def
7. Fraga DBM, Solcà MS, Silva VMG, Borja LS, Nascimento EG, Oliveira GGS, et al. Temporal distribution of positive results of tests for detecting Leishmania infection in stray dogs of an endemic area of visceral leishmaniasis in the Brazilian tropics: A 13 years survey and association with human disease. Vet Parasitol [Internet]. 2012;190(3–4):591–4. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.vetpar.2012.06.025
8. Brasil. Ministério da Saúde. Guia de vigilância epidemiológica. Vol. 7 ed., Brasília. 2009. 816 p.
9. Variza PF. Caracterização da fauna de flebotomineos (Diptera: Psychodidade) no sul de Santa Catarina, Brasil. Universidade do Sul de Santa Catarina; 2016. 10. Desjeux P. Leishmaniasis: Current situation and new perspectives. Comp
Immunol Microbiol Infect Dis. 2004;27(5):305–18.
11. Coura-Vital W, Marques MJ, Veloso VM, Roatt BM, de Oliveira Aguiar-Soares RD, Reis LES, et al. Prevalence and factors associated with Leishmania infantum infection of dogs from an urban area of Brazil as identified by molecular methods. PLoS Negl Trop Dis. 2011;5(8).
12. Moreira ED, de Souza VMM, Sreenivasan M, Lopes NL, Barreto RB, de Carvalho LP. Peridomestic risk factors for canine leishmaniasis in urban
dwellings: new findings from a prospective study in Brazil. Am J Trop Med Hyg [Internet]. 2003;69(4):393–7. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14640499
13. L. R. Parasitologia. 4 ed. Koogan G, editor. Rio de Janeiro; 2008. 14. Taylor, MA; Coop, RL; Wall R. Taxonomia e morfologia parasitárias. In:
Koogan G, editor. Parasitologia Veterinária. 3 ed. Rio de Janeiro; 2010. p. 1– 43.
differentiation in Leishmania. Int J Parasitol [Internet]. 2007 Aug [cited 2018 Dec 5];37(10):1063–75. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17493624
16. Who. Leishmaniasis : worldwide epidemiological and drug access update. 2012;(Vl):24.
17. Blanco VR;, Nascimento-Júnior NM. Leishmaniose: Aspectos Gerais Relacionados com a Doença, o Ciclo do Parasita, Fármacos Disponíveis, Novos Protótipos e Vacinas. [cited 2018 Dec 5];2017(3):861–76. Available from: http://rvq.sbq.org.br
18. Basano S de A, Camargo LMA. Leishmaniose tegumentar americana: histórico, epidemiologia e perspectivas de controle. Rev Bras Epidemiol [Internet]. 2004 Sep [cited 2018 Dec 4];7(3):328–37. Available from:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1415-790X2004000300010&lng=pt&tlng=pt
19. Giunchetti RC, Mayrink W, Genaro O, Carneiro CM, Corr??a-Oliveira R, Martins-Filho OA, et al. Relationship between Canine Visceral Leishmaniosis and the Leishmania (Leishmania) chagasi Burden in Dermal Inflammatory Foci. J Comp Pathol. 2006;135(2–3):100–7.
20. Lainson R, Rangel BF. Lutzomyia longipalpis and the eco-epidemiology of American visceral leishmaniasis, with particular reference to Brazil - A review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005;100(8):811–27.
21. World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. 2010;(949):22–6.
22. Coutinho MTZ, Linardi PM. Can fleas from dogs infected with canine visceral leishmaniasis transfer the infection to other mammals? Vet Parasitol.
2007;147(3–4):320–5.
23. Coutinho MTZ, Bueno LL, Sterzik A, Fujiwara RT, Botelho JR, De Maria M, et al. Participation of Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) in the
epidemiology of canine visceral leishmaniasis. Vet Parasitol [Internet]. 2005 Mar [cited 2017 Feb 28];128(1–2):149–55. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304401704005461
24. Shaw J. The leishmaniases - survival and expansion in a changing world: a mini-review. Mem Inst Oswaldo Cruz [Internet]. 2007 Aug [cited 2017 Feb 28];102(5):541–7. Available from:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0074-02762007000500001&lng=en&nrm=iso&tlng=en
25. Lainson R. The Neotropical Leishmania species: a brief historical review of their discovery, ecology and taxonomy. Rev Pan-Amazônica Saúde.
2010;1(2):13–32.
26. Rodrigues ACM, Silva RA, Melo LM, Luciano MCS, Bevilaqua CML. Epidemiological survey of Lutzomyia longipalpis infected by Leishmania
infantum in an endemic area of Brazil. Rev Bras Parasitol veterinária [Internet]. 2014;23:55–62. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24728361 27. Spada JCP, Silva DT da, Martins KRR, Rodas LAC, Alves ML, Faria GA, et al.
Occurrence of Lutzomyia longipalpis ( Phlebotominae ) and canine visceral leishmaniasis in a rural area of. Rev Bras Parasitol Veterinária.
2014;2961(4):456–62.
28. Galvis-Ovallos F, da Silva MD, Bispo GB da S, de Oliveira AG, Neto JRG, Malafronte R dos S, et al. Canine visceral leishmaniasis in the metropolitan area of São Paulo: Pintomyia fischeri as potential vector of Leishmania
infantum. Parasite [Internet]. 2017;24:2. Available from:
http://www.parasite-journal.org/10.1051/parasite/2017002
29. de Carvalho MR, Valença HF, da Silva FJ, de Pita-Pereira D, de Araújo Pereira T, Britto C, et al. Natural Leishmania infantum infection in Migonemyia migonei (França, 1920) (Diptera:Psychodidae:Phlebotominae) the putative vector of visceral leishmaniasis in Pernambuco State, Brazil. Acta Trop [Internet]. 2010 Oct [cited 2017 Feb 28];116(1):108–10. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20457120
30. Guimarães VCFV, Pruzinova K, Sadlova J, Volfova V, Myskova J, Filho SPB, et al. Lutzomyia migonei is a permissive vector competent for Leishmania infantum. Parasit Vectors [Internet]. 2016 Dec 17 [cited 2017 Feb 28];9(1):159. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26988559
31. Dias ES. Detecção de infecção por Leishmania spp. em flebotomíneos coletados na cidade de Florianópolis (SC). Relatório Técnico-Científico (Parcial) [Internet]. 2010 [cited 2017 Mar 13]; Available from:
http://www.pmf.sc.gov.br/arquivos/arquivos/pdf/29_12_2010_11.23.25.da4311 76e5d86a0650f1cc57ffbf749b.pdf
32. Dantas-Torres F. The role of dogs as reservoirs of Leishmania parasites, with emphasis on Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viannia) braziliensis. Vet Parasitol [Internet]. 2007 Nov 10 [cited 2017 Feb 28];149(3– 4):139–46. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17703890 33. Sobrino R, Ferroglio E, Oleaga A, Romano A, Millan J, Revilla M, et al.
Characterization of widespread canine leishmaniasis among wild carnivores from Spain. Vet Parasitol [Internet]. 2008 Aug [cited 2017 Mar 1];155(3– 4):198–203. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0304401708002422
34. Romero GAS, Boelaert M. Control of visceral leishmaniasis in latin America - A systematic review. PLoS Negl Trop Dis. 2010;4(1).
35. Gontijo CMF, Melo MN. Leishmaniose visceral no Brasil: quadro atual, desafios e perspectivas. Rev Bras Epidemiol [Internet]. 2004 Sep [cited 2017 Mar
1];7(3):338–49. Available from:
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1415-790X2004000300011&lng=pt&nrm=iso&tlng=en
36. Cavalcanti, A; Lobo R; Cupollilo, E; Bustamante FPR. Canine cutaneous leishmaniasis caused by neotropical Leishmania infantum despite of systemic disease: A case report. Parasitol Int. 2012;61:738–40.
37. Otranto D, Dantas-Torres F. The prevention of canine leishmaniasis and its impact on public health. Trends Parasitol [Internet]. 2013;29(7):339–45. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.pt.2013.05.003
38. Penaforte KM, Belo VS, Teixeira-Neto RG, Ribeiro RAN, Oliveira RB De, Schettini DA, et al. Leishmania infection in a population of dogs: an
epidemiological investigation relating to visceral leishmaniasis control. Rev Bras Parasitol Vet [Internet]. 2013;22(December 2015):592–6. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24473887
39. Brito VN De, Oliveira CM, Lazari P, Sousa VRF. Epidemiological aspects of visceral leishmaniasis in Jaciara, Mato Grosso, Brazil, 2003 to 2012. Rev Bras Parasitol Vet. 2014;23(1):63–8.
40. Geraldo W, Suzan M, Michalick M, Norma M, Melo D, Luiz W, et al. Canine visceral leishmaniasis : a histopathological study of lymph nodes. 2004;92:43– 53.
