Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos
LAURA CREDIDIO
Campinas UNICAMP
Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos
LAURA CREDIDIO
Campinas UNICAMP
2012
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP para obtenção do título de Mestre em Ciências, sob orientação do Prof. Dr. Claudio Saddy Rodrigues Coy e co-orientação Prof. Dra. Carmem Silvia Passos Lima.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA POR ROSANA EVANGELISTA PODEROSO ± CRB8/6652 BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
UNICAMP
Informações para Biblioteca Digital
Título em inglês: VEGF C936T polymorphism and risk of sporadic colorectal
cancer related to clinical and biological characteristics. Palavras-chave em inglês:
Polymorphism, genetic Colorectal neoplasms Gene frequency
Titulação: Mestre em Ciências Banca examinadora:
Claudio Saddy Rodrigues Coy [Orientador] José Alfredo Reis Neto
João José Fagundes
Data da defesa: 15-02-2012
Programa de Pós-Graduação: Ciências da Cirurgia
Credidio, Laura, 1976 -
C86p Polimorfismo C936T do gene VEGF no risco de adenocarcinoma colorretal esporádico e em seus aspectos clínicos e biológicos / Laura Credidio. -- Campinas, SP : [s.n.], 2012.
Orientador : Claudio Saddy Rodrigues Coy. . Coorientador : Carmem Silvia Passos Lima.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Polimorfismo genético. 2. Neoplasias colorretais. 3. Frequência do gene. I. Coy, Claudio Saddy
Rodrigues. II. Lima, Carmem Silvia Passos. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Dedicatória
__________________________________________________________________ Ao meu filho e meu marido, os Joaquim’s, que tiveram paciência e compreensão nas horas que mais precisei.
Aos meus pais que sempre me incentivaram a estudar.
A minha irmã querida, Ana Paula, sempre presente em minha vida.
Agradecimentos
__________________________________________________________________ Ao meu orientador Prof. Dr. Claudio Saddy Rodrigues Coy.
A Prof. Dra. Carmem Silvia Passos Lima.
As enfermeiras do gastrocentro, sob coordenação da enfermeira Lucia Helena.
As enfermeiras do HC do ambulatório de coloproctologia, especialmente a enfermeira Luciana que me acolheu com paciência, auxiliando nos procedimentos necessários.
Aos funcionários do gastrocentro, sempre solícitos quando necessário. A FAPESP por financiar este projeto.
Resumo
__________________________________________________________________ O papel da angiogênese para o desenvolvimento do câncer colorretal (CCR) ainda não é totalmente conhecido. Uma das principais glicoproteínas responsáveis pela angiogênese é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), acredita-se que o polimorfismo C936T, localizado no gene VEGF, esteja correlacionado com a suscetibilidade para o desenvolvimento do CCR.
Objetivos: Identificar as freqüências dos genótipos do polimorfismo C936T do gene VEGF em pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal esporádico (ACE) e controles e correlacionar a ocorrência do mesmo com as seguintes variáveis: sexo, idade, localização tumoral, acometimento de linfonodos (N) e infiltração tumoral (T) em pacientes.
Material e método: No período compreendido entre outubro de 2008 a dezembro de 2009 foram coletadas amostras de sangue periférico de pacientes com ACE, no ambulatório de Coloproctologia do HC UNICAMP (G1). O grupo controle (G2) foi constituído por doadores de sangue. Foram excluídos do estudo portadores de polipose familiar, síndrome de Lynch, doenças inflamatórias intestinais e com antecedente familiar de CCR. A extração do DNA genômico se deu por cloreto de lítio e por kit de extração de DNA. Os genótipos do polimorfismo C936T foi avaliado por meio da reação em cadeia da polimerase e digestão enzimática.
Resultados : O G1 constou de 261 pacientes, sendo 52,1% do sexo masculino com média de idade de 64,9 (32-97) anos. O G2 foi formado por 261 doadores de sangue, com idade media de 52,9 anos (25-62) sendo 52,1% do sexo masculino. A ocorrência do genótipo selvagem (CC) foi de 80,5%, do heterozigoto (CT) foi de 18,4% e do homozigoto (TT) de 1,1% em pacientes. No G2 a ocorrência dos genótipos foram 78,5% (CC), 20,7% (CT) e 0,8% (TT), indivíduos com genótipos distintos do gene estiveram sob riscos similares do ACE. Com relação á localização do tumor, 51,5% encontravam-se no reto, 16,4% cólon direito, 31,1% em cólon esquerdo. Em relação ao grau de invasão tumoral, 0,7%
como T4. Quanto ao acometimento de linfonodos, 53,9% foram classificados como N0, 33,6% como N1 e 12,5% como N2. Não se observou diferenças em relação ao grau de invasão tumoral, acometimento de linfonodos ou ocorrência de metástases (p = 0,2996) em relação à ocorrência do polimorfismo C936T.
Conclusão: O polimorfismo C936T do gene VEGF não correlaciona-se com o risco de ocorrência do tumor e com o sexo, idade, localização da lesão, acometimento de linfonodos e infiltração tumoral.
Abstract
__________________________________________________________________ Background: The role of angiogenesis for the development of Colorectal Cancer (CC) is not yet fully known. One of the major glycoprotein responsible for pro-angiogenesis is vascular endothelial growth factor (VEGF). It is believed that the C936T polymorphism located in the VEGF gene is correlated with less susceptibility to the development of CC.
Objectives: To identify the genotype frequencies of the C936T polymorphism of the VEGF gene in patients with sporadic colorectal adenocarcinoma (ACE) and controls and to correlate the occurrence of the same with following variables: gender, age, tumor location, lymph node (N) and tumor infiltration (T).
Methods: Between October 2008 and December 2009 samples were collected from peripheral blood of patients with colorectal cancer in the clinic of Coloproctology of HC UNICAMP (G1). The control group (G2) comprised blood donors. We excluded patients with familial polyposis, Lynch syndrome, inflammatory bowel diseases and family history of CC. The genomic DNA extraction was done by lithium chloride and by DNA extraction kit. The genotypes of the C936T polymorphism were assessed by polymerase chain reaction and enzymatic digestion.
Results: G1 consisted of 261 patients, 52.1% male with a mean age of 64.9 (32-97) years. The G2 is composed of 261 blood donors, with a mean age of 52.9 years (25-62) 52.1% male. The occurrence of wild genotype (CC) was 80.5%, the heterozygous (CT) was 18.4% and the homozygous (TT) of 1.1% in patients. In G2 the occurrence of genotypes were 78.5% (CC), 20.7% (CT) and 0.8% (TT); individuals with different genotypes of the gene were under similar risks of ACE. Regarding the location of the tumor, 51.5% were in the rectum, right colon 16.4%, 31.1% in the left colon. Regarding the degree of tumor invasion, 0.7% was classified as Tis, T0 1.5%, 8.1% T1, 19.3% T2, T3 65.2% and 7.4% as T4. As for the involvement of lymph nodes, 53.9% were classified as N0, 33.6% N1 and
lymph nodes or occurrence of metastases (p = 0.2996) in relation to the occurrence of the C936T polymorphism.
Conclusion: The C936T polymorphism of the VEGF gene did not correlate with the risk of tumor occurrence and sex, age, lesion location, lymph nodes and tumor infiltration.
Símbolos, Siglas e Abreviaturas
ACE Adenocarcinoma colorretal esporádico
APC Polipose adenomatose colônica, do inglês adenomatous polyposis coli CCR Câncer colorretal
DCC Deletado no câncer do colón, do inglês deleted in colon cancer DNA Ácido desoxirribonucléico
EGF Fator de crescimento epidérmico FCM Faculdade de Ciências Médicas FGF Fator de crescimento de fibroblastos G1 Grupo paciente
G2 Grupo controle HC Hospital das clínicas
HIF-α Fator induzido por hipóxia alfa
HNPCC Câncer colorretal hereditário não poliposo
K-ras Do inglês Kirsten retrovirus-associated DNA sequence KCL Cloreto de potássio
MgCl2 Cloreto de magnésio
mM Milimol
mRNA Ácido ribonucléico mensageiro
ng Nanograma
NlaIII Enzima de restrição endonuclease NRP-1 Neutrofilina 1
OR Risco relativo
pb Pares de base
PCR Reação em cadeia de polimerase
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas PIGF Fator de crescimento placentário
pmol Picomole
SMAD Proteínas relacionadas SMA e Mad
TGF-β Fator de crescimento de transformação beta TNM Classificação de tumores malignos
TRIS HCL Tampão de Acido clorídrico UNICAMP Universidade de Campinas
VEGF Fator de crescimento endotelial vascular
VEGFR Receptor de fator de crescimento endotelial vascular VPF Fator de permeabilidade vascular
Lista de quadros
Quadro 1. Isoformas do VEGF ... 22
Quadro 2. Classificação TNM ... 30
Quadro 3. Estágio tumoral ... 31
Quadro 4. Critérios de Amsterdam ... 32
Lista de tabelas
Tabela 1. Análise comparativa da idade média entre pacientes e controles ... 39 Tabela 2. Idades média e mediana e genótipos do polimorfismo C936T do
gene VEGF ... 40 Tabela 3. Idade média dos genótipos polimorfismo C936T do gene VEGF
em pacientes (G1) e controles (G2) ... 40 Tabela 4. Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo ... 41 Tabela 5. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T de
pacientes e controles por sexo ... 42 Tabela 6. Distribuição de pacientes e controles por classe ... 42 Tabela 7. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a localização tumoral ... 44 Tabela 8. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
os estágios da TNM ... 45 Tabela 9. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante ... 47 Tabela 10. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante ... 48 Tabela 11 Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
a infiltração tumoral ... 49 Tabela 12. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante ... 50 Tabela 13. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo
o acometimento de linfonodos ... 52 Tabela 14. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
Lista de Figuras
Figura 1. Clivagem do VEGF ... 24
Figura 2. Banda auto-radiografada com genótipos do polimorfismo C936T
do gene VEGF ... 53
Lista de Gráficos
Gráfico 1. Distribuição de pacientes e controles por sexo ... 41 Gráfico 2. Distribuição de pacientes e controles por classe ... 43 Gráfico 3. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a localização tumoral ... 44 Gráfico 4. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo os estágios da TNM ... 46 Gráfico 5. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a classificação TNM excluindo-se pacientes com
terapia neo-adjuvante ... 47 Gráfico 6. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se
pacientes com terapia neo-adjuvante ... 48 Gráfico 7. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo a infiltração tumoral ... 50 Gráfico 8. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4,
excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante ... 51 Gráfico 9. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T
segundo o acometimento de linfonodos ... 52 Gráfico 10. Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 18
1.1 Epidemiologia ... 19
1.2 Angiogênese e câncer ... 21
1.3 Fator de crescimento endotelial vascular ... 22
1.4 Polimorfismo C936T do gene VEGF ... 26
2 OBJETIVO ... 28
3 MATERIAL E MÉTODO ... 29
3.1 Avaliação clínica ... 29
3.2 Critério de exclusão ... 32
3.3 Grupo controle ... 33
3.4 Análise molecular do polimorfismo C936T do gene VEGF ... 33
3.5 Aspectos éticos ... 36 3.6 Análise estatística ... 38 4 RESULTADOS ... 39 4.1 Idade ... 39 4.2 Sexo ... 40 4.3 Classe ... 42 4.4 Localização tumoral ... 43 4.5 Classificação TNM ... 44
4.5.1 Infiltração tumoral e acometimento de linfonodos ... 49
5 DISCUSSÃO ... 56
6 CONCLUSÕES ... 60
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61
ANEXO 1: Termo de consentimento de pacientes ... 69
ANEXO 2: Termo de consentimento de controles ... 71
ANEXO 3: Tabela controles ... 73
ANEXO 4: Tabela pacientes ... 81
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia
Uma das neoplasias mais freqüentes e letais no Brasil e no mundo ocidental, quando diagnosticada tardiamente, é o adenocarcinoma colorretal esporádico (ACE). O tumor ocorre em indivíduos com 40 a 70 anos de idade. A sobrevida média mundial é estimada em 44%, mas se detectado precocemente a sobrevida pode ultrapassar 90% [1, 2].
O ACE é o terceiro tipo de câncer mais freqüente entre os homens e o segundo entre as mulheres nas regiões sul e sudeste do Brasil. Nos países desenvolvidos é o segundo tipo de câncer com maior incidência de óbito em ambos os sexos [3, 4]. Segundo a Secretaria da Saúde de Campinas é o segundo tipo de câncer causador de óbito entre as mulheres [5]. Seu desenvolvimento pode estar relacionado a aspectos hereditários, ou em sua maioria, a fatores ambientais relacionados à hábitos alimentares, tabagismo e sedentarismo.
Estima-se que em 95% dos casos, o ACE se desenvolve a partir de um adenoma [3, 6], sendo que em 60% dos casos ocorra a partir da mutação do gene supressor APC. O fenótipo metilador de ilhas CpG (CIMP) é responsável por 35% dos carcinomas colorretais, os outros 5% são provenientes da mutação em via de sinalização na Síndrome de Lynch [7, 8].
A transformação de uma célula normal em adenoma pode ocorrer entre 5 a 20 anos e de adenoma para o câncer entre 5 a 15 anos [9]. A evolução do adenoma para o carcinoma decorre de uma seqüência de mutações, e em 50 a 80% dos casos, a primeira mutação ocorre no gene APC. Sua inativação impede a diferenciação celular resultando na proliferação das criptas intestinais, a displasia [6, 10, 11]. A seguir ocorre a ativação do proto-oncogenese K-ras em oncogene; esta mutação está presente em 30 a 50 % dos casos de ACE. Posteriormente pode ocorrer a mutação do gene DCC, responsável por manter a adesão celular e
Estas proteínas liberam sinais inibidores de crescimento para o núcleo celular e sua mutação promove a proliferação celular. Por último a mutação ou perda do gene supressor de tumor P53, presente em quase todas as células do organismo e responsável pela regulação dos genes de reparo e apoptose celular. Esta mutação encontra-se presente em 75% dos carcinomas, promovendo assim o crescimento celular [12].
1.2 Angiogênese e câncer
O ACE, como citado previamente, decorre por meio de mutações sucessivas, interferindo no controle do crescimento, diferenciação, transcrição, metilação e apoptose celular, passando a se comportar de forma insólita [13-15]. Fearon & Volgestein [6] demonstraram que as mutações não ocorrem em uma única célula, mas nas descendentes das mesmas, acumulando-se progressivamente.
Acredita-se que a angiogênese seja essencial para o crescimento tumoral e disseminação metastática [13, 15-20]. As primeiras etapas do crescimento e progressão tumoral são limitadas, iniciando-se como uma massa avascular e quando o tumor cresce além de 2 a 3 milímetros, requer sua própria vascularização, induzindo a angiogênese [21].
Em 1787, o médico britânico João Hunter utilizou o termo angiogênese pela primeira vez, mas somente por volta de 1860 a morfologia vascular do tumor foi estudada com detalhes. Nas décadas de 30 e 40, pesquisadores estudaram a formação de novos vasos sanguíneos em tumores a partir de estudos experimentais [22].
A formação de novos vasos se dá através da vasculogênese ou da angiogênese. Na primeira, a formação de novos vasos surge a partir de hemangioblastos, células percursoras das células endoteliais, a segunda decorre de vasos sanguíneos pré-existentes, ocorrendo por quatro mecanismos diferentes: brotação, intussuscepção (divisão de estrutura vascular pré existente),
elongação/ampliação e por incorporação das células precursoras das células endoteliais nas paredes dos vasos sanguíneos.
Sua regulação ocorre por meio de moléculas pró-angiogênicas e anti-angiogênicas [18, 23]. Como exemplo destas moléculas temos a angiopoetina (Angpt-1), através da interação com seu receptor (Tie-2), neutraliza a vaso dilatação enquanto a angiopoetina 2 (Angpt-2) desestabiliza a matriz extracelular através da degradação parcial, bem como a ativação proteolítica de fatores de crescimento. [24]
A indução da angiogênese se deve a fatores como hipóxia, ph ácido, estímulos hormonais, tamanho do tumor entre outros, resultando na síntese de fatores de crescimento e citocinas que são liberados na matriz extracelular migrando em direção às células endoteliais. Estas proteínas se ligam aos receptores localizados na membrana plasmáticas das células endoteliais, ativando fatores de crescimento responsáveis pela angiogênese como o fatores de crescimento de fibroblastos (FGF), epidérmicos (EGF), de crescimento endotelial derivados de plaquetas (PDGF) e de crescimento endotelial vascular (VEGF), entre outros. Estes fatores iniciam a formação de brotos que proliferam e migram em direção à célula emissora de sinais, transformando-se em capilares maduros [12, 25].
Há aproximadamente 30 fatores endógenos pró-angiogênicos, alguns são mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o Fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e Fator de crescimento de transformação beta (TGF-β) e 30 fatores endógenos anti-angiogênicos, sendo os mais estudados a angiostatina, endostatina e trombospondina [26, 27]. Quando a regulação desse equilíbrio é afetada, como ocorre durante o crescimento de um tumor, os vasos começam a formar-se em locais e momentos inadequados [28].
Uma das principais glicoproteínas responsáveis pela angiogênese, com importante ação na proliferação, sobrevivência e migração celular, além de mediar
a permeabilidade vascular é o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seus receptores [29-31].
1.3 Fator de crescimento endotelial vascular
O VEGF foi uma dos primeiros fatores angiogênicos a serem identificados e acredita-se ser o principal regulador da angiogênese, com ação especifica para células endoteliais.
Em 1983, Harold Dvorak e colaboradores foram os primeiros a identificar esta glicoproteína, por meio da purificação de células tumorais, ao perceberem que esta melhorava a permeabilidade celular, sendo chamada de fator de permeabilidade vascular (VPF). Posteriormente, em 1989, Ferrara e Henzel identificaram a mesma proteína, da qual Ferrara já tinha purificado e seqüenciado, em meio condicionado, em células pituitárias bovinas e verificaram que promovia a proliferação de células endoteliais vasculares.
Em 1990, ficou claro que as duas proteínas eram a mesma, passando a ser denominada fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) [22, 26, 32, 33] sendo um potente regulador positivo da angiogênese [25, 27, 32, 34].
A região codificadora do gene VEGF se encontra no braço curto do cromossomo 6 na região p 21.3. O gene contém 8 éxons separados por 7 íntrons [18, 29, 35-37]. A remoção dos íntrons do pré-RNA transcrito a partir de um único gene resultam em 5 diferentes isoformas: VEGF ou VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D e fator de crescimento placentário (PIGF) e 2 diferentes da família que não provêm de humanos o VEGF-E e VEGF-F, como podemos visualizar no quadro 1 [22, 26, 27, 33].
Quadro 1: Isoformas do VEGF
VEGF ISOFORMAS
VEGF-A VEGF-A121 VEGF-A145 VEGF-A165 VEGF-A183 VEGF-A189 VEGF-A206
VEGF-B VEGF-B167 VEGF-B186
VEGF-C VEGF-D VEGF-E VEGF-F
PIGF PIGF-131 PIGF-152 PIGF-203 PIGF-224
Quadro 1: Os números correspondem a quantidade de aminoácidos após a remoção dos íntrons.
São mediados por três receptores transmembrana tirosina quinase, conhecidos como VEGFR (receptor do fator de crescimento endotelial vascular) denominados: VEGFR-1 (fms-like tyrosine kinase 1 ou Flt1), VEGFR-2 (fetal liver kinase, Flk1 ou KDR), VEGFR-3 (fms-like tyrosine kinase 4 ou Flt4). Os dois primeiros são expressos predominantemente em células endoteliais vasculares e suas progenitoras e o VEGFR-3 é expresso principalmente em células endoteliais linfáticas. As neutrofilinas 1 e 2 (NRP- 1 e 2) também agem como receptores para alguns membros da família do VEGF [25, 32, 38].
O VEGFR-1 foi o primeiro receptor de tirosina quinase identificado como receptor do VEGF e é expresso por células endoteliais, monócitos, macrófagos, células dentríticas, osteoclastos, pericitos e trofoblastos na placenta [39, 40]. Considerado como um inibidor na embriogênese, mas um estimulador na fase adulta, está relacionado com a migração celular [41].
O VEGFR-1 liga-se com VEGF, VEGF-B e PIGF e relaciona-se à metástase pulmonar [42]. Fan et al. demonstrou que o VEGFR-1 está presente e
funcional em células do câncer colorretal, podendo ativar processos que levam a progressão tumoral e metástase [43].
O VEGFR-2 é altamente expresso em células precursoras das células endoteliais na embriogênese precoce [41]. É considerado o principal receptor do VEGF, estimulando a mitose de células endoteliais e a indução da permeabilidade vascular e proliferação da célula endotelial [23]. Sua expressão é encontrada também em células-tronco hematopoéticas, células neuronais, osteoblastos, células do ducto pancreático, células progenitora de retina e megacariócitos [41, 42].
O VEGFR-3 possui uma expressão mais limitada e está relacionado com a linfangiogênese sendo expresso em células endoteliais linfáticas, capilares fenestrados, veias de órgãos endócrinos, monócitos e macrófagos.[41]
O fator de crescimento mais estudado e também o mais conhecido é o VEGF-A ou somente VEGF e possui várias isoformas, dependendo da clivagem dos íntrons (figura 1) [38].
O VEGF ou VEGF-A é uma glicoproteína com ligação dimérica à cisteína, apresenta um peso molecular de 40kDa, sendo uma seqüência homologa ao fator de crescimento placentário, ao VEGF-B e VEGF-C. Alguns tecidos expressão fortemente esta proteína como tecidos do sistema reprodutor feminino, tecidos isquêmicos, tumores e linhagem de células transformadas [44, 45].
As 4 isoformas, polipeptídeos com diferentes quantidades de aminoácidos [46] , são apresentadas na figura 1, sendo que a isoforma VEGF165
pode ser clivada gerando mais duas isoformas: VEGF110 e VEGF113, dois
Figura 1: Clivagem do VEGF
O VEGF-B é expresso no coração e musculatura esquelética, acredita-se que acredita-seja importante no deacredita-senvolvimento cardíaco além de regular a biodisponibilidade do VEGF-A competindo pelo receptor VEGFR-1 e NRP-1, ao qual se liga [25, 26].
O VEGF-C se liga com o VEGFR-3 e com o VEGFR-2, promovendo também a angiogênese em alguns tipos de tumores [25, 26, 32, 33].
O VEGF-D também se liga ao receptor linfático VEGFR-3, induzindo a linfangiogênese. Além disto, promove a disseminação de células tumorais para os linfonodos [48]. Sua expressão esta correlacionada a ocorrência de metástase linfonodal em diversos tipos de tumores, incluindo o câncer colorretal [26].
O VEGF-E foi codificada pelo parapoxvirus Orf, portanto não é um fator humano, conecta-se com o VEGFR-2, in vitro estimulando a quimiotaxia e mitose celular, in vivo induz a angiogênese e aumenta a permeabilidade vascular [25, 26].
O fator de crescimento mais recentemente descoberto é o VEGF-F, proveniente do veneno de cobra, este fator se liga somente com o VEGFR-2 e aumenta em até cinco vezes a permeabilidade vascular [49].
A maior fonte do PIGF na gravidez é na placenta e é essencial na angiogênese e vasculogênese durante a embriogênese.
Em células normais a tradução do VEGF, por meio do RNA mensageiro, é controlada pelos estímulos da angiogênese [15, 16, 29]. Nas células tumorais existe um descontrole na síntese do VEGF, causada pelo aumento da expressão do mRNA, podendo ser detectado no plasma em tumores avançados [50-52].
O VEGF, como citado previamente, poder ser induzido por vários fatores, sendo a concentração celular de oxigênio um dos principais. Na vigência de hipóxia, ocorre o aumento da quantidade de VEGF, promovendo assim a angiogênese, aumentando assim o numero de glóbulos vermelhos e fornecimento de oxigênio [26].
A hipóxia induz a síntese de VEGF através do fator de indutor de hipóxia (HIF). HIFs são fatores de transcrição heterodimérico composto por duas subunidade, α e β. A subunidade HIF-1α é regulada pelos níveis teciduais de oxigênio, sendo mantido em baixa quantidade em condições normais [23].
A baixa concentração de oxigênio, resulta na falta da hidroxilação da prolina hidrolise 4 e consequentemente há uma diminuição da ligação do HIF-1α com o gene supressor de tumor Hippel Lindau, inativando-o. Assim, ocorreria um acúmulo do HIF-1α, aumentando a expressão do VEGF e de outros fatores angiogênicos. A formação de vasos normais requer uma ativação coordenada de vários mediadores, no entanto a hiper expressão do VEGF-A resulta em vasos
anormais, tortuosos, frágeis, sem pericitos com propensão a sangramento, exsudação e aumento da permeabilidade vascular [28, 34].
O aumento da expressão do VEGF tem sido associada a pior prognóstico no câncer colorretal [26, 33, 38].
1.4 Polimorfismo C936T do gene VEGF
O DNA pode sofrer alterações em sua seqüência, de um único ou de vários nucleotídeos como: substituição, inserção a deleção das bases; mudança do número de repetições das bases e grandes alterações na estrutura do cromossomo. Se a freqüência destas alterações ocorre entre 1 a 99% da população é classificado como gene polimórfico, se for menor que 1% é classificado com gene idiomorfo e acima de 99%, classificado como gene monomorfo [53].
O polimorfismo deste estudo esta localizado no gene VEGF-A na região 936, onde ocorre a substituição de um único nucleotídeo (SNP) no éxon 8 na região 3’ não-traduzida (3’UTR) [35], ocorrendo a substituição da base citosina (C) pela timina (T) [54-57], resultando na perda da região que transcreve o fator AP-4 (activated protein 4). Analises do produto do DNA complementar (cDNA) sugere que o AP-4 codifica a proteína HLH, esta proteína reconhece sítios específicos da seqüência de DNA CAG2TG [58].
O AP-4 é um fator de transcrição hélice-alça-hélice que aumenta a expressão de vários genes virais e celulares pela ligação a sítios potenciador específicos, a perda do potencial de ligação deste sítio pode ser responsável pela diminuição da expressão do VEGF em portadores do alelo T comparado aos portadores do alelo C [37, 44, 59].
Na presença do genótipo selvagem, o nível da glicoproteína no plasma aumenta, estimulando a formação de novos vasos [18, 51, 60-62]. Acredita-se que o polimorfismo 936C→T do gene VEGF esteja correlacionado com suscetibilidade
RENNER et al [44], os portadores do genótipo variante CT e TT possuem baixos níveis séricos de VEGF, diminuindo a angiogênese e o risco de adquirir câncer. Esta hipótese é corroborada por outros autores onde o alelo T teria efeito protetor quanto ao risco de desenvolver neoplasia maligna [18, 56, 57, 63].
Contudo, Hofmann et al. [64] e Dassaoulas et al. [65] não identificaram associação do ACE e do polimorfismo C936T do gene VEGF.
A metanálise realizada por Xu et al. [37] contendo 13.293 casos de câncer e 12.308 controles, não evidenciou associação do ACE e polimorfismo C936T do gene VEGF.
Entretanto, outros autores evidenciaram que o alelo T associou-se ao maior risco de ACE e outras neoplasias malignas [61], de adenoma colorretal [66], câncer gástrico [62] e câncer bucal [67] . Esses autores acreditam que o genótipo variante heterozigoto C/T seja responsável pelo aumento da ocorrência de neoplasias, mas citam também que os resultados possam variar entre grupos étnicos diversos, com diferentes expressões em populações distintas.
Alguns autores compararam características histopatológicas do ACE com o polimorfismo citado, porém os resultados foram controversos. Tanto Hofman quanto Dassoulas não verificaram associação do polimorfismo VEGF C936T em relação ao tamanho, diferenciação tumoral, estágio tumoral, presença de metástase linfonodal e faixa etária. Chae et al. [68] obtiveram resultados semelhantes, porém Lurje [21] demonstrou que o genótipo selvagem CC esteve relacionado a recidiva no estágio III do ACE.
A adequada compreensão da biologia molecular e dos mecanismos genéticos do ACE pode proporcionar novas perspectivas para a prevenção, prognóstico e tratamento dos pacientes portadores desta enfermidade.
2 OBJETIVO
Verificar se o polimorfismo VEGF C936T influencia o risco de ACE Verificar se o polimorfismo VEGF C936T altera o sexo e a idade de ocorrência de tumor e a localização, invasão tumoral e acometimento linfonodal pelo tumor.
3 MATERIAL E MÉTODO
Avaliação de pacientes portadores de ACE atendidos, por ocasião do diagnóstico ou durante o seguimento clínico, no ambulatório de Coloproctologia do HC da UNICAMP, entre 2008 a 2010.
3.1 Avaliação clínica
As características analisadas foram: idade, sexo, raça, localização do tumor e estágio do tumor. Os dados referentes a idade, sexo, raça assim como a autorização para participação no estudo, foram obtidos pela pesquisadora responsável. Com relação a raça, os participantes foram classificados em caucasóides e não caucasóides.
O diagnóstico histológico foi realizado em cortes de fragmentos de tumor incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina por patologistas do Laboratório de Anatomia Patológica do Gastrocentro-UNICAMP. A classificação da diferenciação tumoral foi realizada de acordo com os critérios propostos por Broders [69]. O estágio do tumor foi obtido por meio de exame anatomopatológico do espécime cirúrgico e classificado pelos critérios TNM (quadro 2) [70].
Quadro 2:Classificação TNM
Categorias Descrição
Categoria T Tumor
Tx Tumor primário não pode ser avaliado T0 Não há evidencia de tumor primário
Tis Carcinoma in situ: intra-epitelial ou invasão da lâmina própria T1 Tumor invade a submucosa
T2 Tumor invade a muscular própria
T3 Tumor ultrapassa a muscular própria até a subserosa ou tecidos pericólicos não peritoniais ou perirretais
T4a Tumor penetra a superfície de peritônio visceral
T4b Tumor se estende diretamente ou está aderido em outros órgãos ou estruturas
Categoria N Linfonodos regionais
Nx Linfonodos regionais não podem ser avaliados N0 Sem metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em 1 a 3 linfonodos regionais N1a Metástase em um linfonodo regional N1b Metástase em 2 a 3 linfonodo regional N1c
Tumor se encontra na subserosa, mesentério ou tecidos noa perotonizados pericólicos ou perirretais, sem metástase em linfonodo regional
N2 Metástase em 4 ou mais linfonodos regionais N2a Metástase em 4 a 6 linfonodos regionais N2b Metástase em 7 ou mais linfonodos regionais
Categoria M Metástase à distância M0 Nenhuma metástase a distância foi identificada M1 Metástase a distância presente
M1a Metástase confinado a um órgão ou local (por exemplo, fígado, pulmão, ovário, sem nódulo regional)
M1b Metástases em mais de um órgão / local ou no peritônio
Quadro 3: Estágio tumoral
Estágio Classificação TNM 0 Tis N0 M0 T1 N0 M0 I T2 N0 M0 IIA T3 N0 M0 IIB T4a N0 M0 IIC T4b N0 M0 T1-T2 N1/N1c M0 IIIA T1 N2a M0 T3-T4a N1/N1c M0 T2-T5 N2a M0 IIIB T1-T2 N2b M0 T4a N2a M0 T3-T4a N2b Mo IIIC T4b N2b Mo
A constatação com relação a presença de metástases foi realizada pelo achado durante o ato operatório ou exames de imagem (radiograma de tórax, ultrassom abdominal, tomografia de abdômen e de tórax).
Com relação a localização tumoral, considerou-se o achado do espécime cirúrgico. Denominou-se cólon direito as lesões presentes no ceco, cólon ascendente e transverso; cólon esquerdo as lesões do cólon descendente e sigmóide; reto as lesões localizadas até 18 cm da margem anal.
3.2 Critérios de exclusão
Considerou-se como critérios de exclusão, polipose adenomatosa familiar, síndrome de Lynch (critérios de Amsterdam, quadro 4) [71, 72] doenças inflamatórias intestinais, antecedente familiar de ACE e aqueles que não aceitaram participar do estudo proposto.
Quadro 4: Critérios de Amsterdam
Amsterdam I
Ao menos três familiares portadores de câncer colorretal verificado histologicamente;
Um deve ser parente em primeiro grau dos outros dois; Ao menos duas gerações sucessivas devem ser afetadas;
Ao menos um dos casos de câncer colorretal deve ter sido diagnosticado antes dos 50 anos;
Polipose adenomatosa familiar deve ser excluída.
Amsterdam II
Ao menos três familiares devem ter um câncer associado com câncer colorretal hereditário não poliposo (HNPCC) (colorretal, endométrio, urotélio ou intestino delgado);
Ao menos duas gerações sucessivas devem ser afetadas;
Ao menos um dos casos de câncer associado ao HNPCC deve ter sido diagnosticado antes dos 50 anos;
Polipose adenomatosa familiar deve ser excluída.
3.3 Grupo controle
O grupo controle foi constituído por doadores de sangue oriundos do Hemocentro da UNICAMP.
Os critérios de inclusão para doadores de sangue foram: idade entre 50 e 60 anos, que não referiram perda de peso, sintomas gastrointestinais ou antecedente familiar de câncer colorretal, e que não apresentassem doenças consideradas pré-neoplásicas, adenomas colorretais, polipose adenomatosa familiar, síndrome de Lynch e doenças inflamatórias intestinais (critérios estabelecidos pelo Hemocentro da UNICAMP).
Os pacientes portadores de ACE incluídos no estudo fazem parte do Grupo denominado G1 e o Grupo controle foi denominado G2.
3.4 Análise molecular do polimorfismo C936T do gene VEGF
As análises das amostras foram processadas no Laboratório de Genética do Câncer da FCM da UNICAMP, coordenado pela Profa. Dra. Carmen Silvia Passos Lima.
Para a extração do DNA genômico é necessário a coleta de 4 ml de sangue periférico, tanto dos pacientes como grupo controle. A coleta é efetuada por meio de tubo esterilizado, com capacidade de armazenamento de 4 ml, contendo EDTA (anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético). A amostra é centrifugada a 1300 rpm por 10 minutos. O plasma é removido e descartado e os eritrócitos armazenados para posterior extração do DNA genômico.
O DNA genômico foi obtido por meio da extração por cloreto de lítio (WOODHEAD, 1986) e por kit de extração de DNA (Bionner), após o procedimento descrito acima. O método utilizado por extração de cloreto de lítio, após descarte do plasma sanguíneo, encontra-se descrito abaixo:
✓ “lavar” o sangue com tampão de lise e repetir o processo até a remoção completa das hemácias;
✓ Colocar 400µl tampão de digestão e 20µl de proteinase K; ✓ Levar a amostra a 55° por 2 horas;
✓ Adicionar 200µl de cloreto de lítio;
✓ Levar ao freezer por 15 minutos, centrifugar;
✓ Retirar o sobrenadante e colocar em um novo tubo;
✓ Adicionar etanol absoluto e inverter aproximadamente 50 vezes até que o DNA se precipite;
✓ Centrifugar, desprezar;
✓ Adicionar etanol 70%, agitar, centrifugar e desprezar o álcool; ✓ Secar o DNA, adicionar água e incubar a 55° por 10 minutos; ✓ Armazenar em freezer.
A extração por kit de DNA é reportada abaixo:
✓ Adicionar 20 ul de proteinase K em tubo limpo de 1,5 ml; ✓ Aplicar 200µl de sangue total no tubo contendo proteinase K;
35
✓ Adicionar 200µl de tampão de ligação (G2) e misture imediatamente por vorticidade. Ressuspender a amostra para atingir lise com máxima eficiência.
✓ Incubar a 60o por 10 min.
✓ Adicionar 100µl de isopropanol e homogeneizar com pipeta. ✓ Centrifugação rápida para as gotas da tampa caírem.
✓ Transferir cuidadosamente o conteúdo para o reservatório superior do tubo com coluna de vinculação;
✓ Fechar o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Transfira o tubo da coluna de vinculação a um novo tubo de 2 ml de filtração;
✓ Adicionar 500µl de tampão de lavagem 1 (W1), sem molhar a borda, fechar o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Abra o tubo e despeje a solução do tubo 2 ml em um frasco de eliminação;
✓ Juntar cuidadosamente 500µl de tampão de lavagem 2 (W2), fechar o tubo e centrifugar a 8.000 rpm por 1 min;
✓ Centrifugar mais uma vez para a 12.000 rpm por 1 min para remover completamente o etanol;
✓ Transferir o tubo da coluna de vinculação a um novo tubo de 1,5 ml para eluição, adicionar 100µl de tampão de eluição (EL, ou água livre de nuclease) para ligação de tubos de coluna, e esperar por um minuto à temperatura ambiente (15 o ~ 25o) até ser absorvido pela fibra de vidro do tubo de ligação da coluna.
✓ Armazenar a 20o negativos.
O polimorfismo C936T foi avaliado de acordo com os métodos descritos por Renner et al (2000) onde parte do éxon 8 foi amplificada, por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando uma solução contendo de 20mM Tris HCl (pH 8,4), 50nM de KCl, 4,5mM de MG2l2, 0,2mM de cada nucleotídeo
trifosfato, 20pmol de cada iniciador, 1U Taq DNA polimerase e 500ng de DNA. A reação iniciou-se pela desnaturação a 94ºC (5 minutos) seguida por 35 ciclos de incubação a 94°C (40 segundos), a 64°C (1 minuto), a 72°C (40 segundos) e 72ºC (5 minutos) para a extensão final. Após a reação, um fragmento de 208pb, do gene VEGF, foi obtido com a utilização dos iniciadores 5’- AAG GAA GAG ACT CTG CG2 AGA G2-3’ e posteriormente do iniciador reverso 5’ – TAA ATG TAT GTA TGT GGG TGG GTG TGT CTA CAG G - 3’.
Os produtos da amplificação dos grupos foram digeridos com 1U da enzima de restrição endonuclease NlaIII a 37° por 2 horas em banho-maria e posteriormente analisados por eletroforese em gel de agarose a 3,0% contendo brometo etílico. Os produtos da amplificação dos pacientes foram digeridos com a enzima de restrição endonuclease FastDigest®NlaIII (Hin1II) (Fermentas life sciences) por 5 minutos a 37° em banho seco e posteriormente analisados por eletroforese em gel de agarose a 2,0% contendo brometo etílico.
Um único fragmento de 208 pares de base (pb) correspondeu ao genótipo homozigoto selvagem CC. Fragmentos de 208, 122 e 86pb corresponderam ao genótipo heterozigoto CT e fragmentos de 122 e 86pb corresponderam ao genótipo homozigoto variante TT. Controles positivo e negativo para o polimorfismo foram avaliados em cada reação enzimática dos produtos da PCR em questão.
3.5 Aspectos éticos
37
necessários ao diagnóstico ou acompanhamento clínico dos pacientes e de uma única punção venosa em controles.
O diagnóstico e o estadiamento foram realizados no ambulatório de Coloproctologia HC da UNICAMP, podendo haver necessidade de exames laboratoriais, radiografia de tórax, ultra-sonografia e a tomografia computadorizada do abdome e pelve. Nenhum material adicional foi coletado dos pacientes ou controles.
Todas as informações obtidas dos pacientes e controles foram sigilosas, somente tendo acesso os profissionais envolvidos no estudo. Os dados foram armazenados em arquivo eletrônico, cuja responsabilidade cabe ao pesquisador responsável. O material biológico foi armazenado no Laboratório de Genética do Câncer (FCM-UNICAMP), sob a responsabilidade da Profa. Dra Carmen Silvia Passos Lima.
Os participantes foram informados e puderam optar por meio do "Termo de Consentimento Livre e Esclarecido" em:
✓ Permitir ou não o armazenamento do material coletado para pesquisas futuras nesta área;
✓ Receber ou não os resultados da pesquisa por correio ou telefone. Os procedimentos realizados só foram efetuados após a obtenção dos “Termos de Consentimento Livre e Esclarecido” de pacientes e controles (Anexos 1 e 2). O estudo foi aprovado no Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP (Parecer n° 759/2007, anexo 5).
O armazenamento do material biológico foi realizado para possibilitar a disponibilização a outras investigações do grupo de trabalho, e que para a utilização do mesmo, as pesquisas futuras deverão ser aprovadas pelo Comitê de Ética da instituição, mesmo com a autorização previa do individuo.
3.6 Análise estatística
O tamanho amostral do estudo teve como base as freqüências dos polimorfismos gênicos obtidas em indivíduos normais de outras populações e, foi calculado de acordo com as normas definidas por BEIGUELMAN [73] , sendo estabelecido o total de 250 pacientes.
O teste de verificação do Equilíbrio de Hardy-Weinberg foi realizado com o intuito de verificar se ocorre distribuição preferencial de algum dos genótipos avaliados no grupo de pacientes e controles utilizados no estudo (BEIGUELMAN, 1995).
O significado estatístico das diferenças entre grupos foi calculado por meio dos testes exato de Fisher, qui-quadrado, Kruskal-Wallis e Wilcoxon. O teste de regressão logística foi realizado para corrigir discrepâncias de idades em comparação entre pacientes e controles.
39
4 RESULTADOS
Fazem parte do estudo 261 controles (G2) e 261 pacientes com ACE (G1) atendidos, por ocasião do diagnóstico ou durante o seguimento clínico, no ambulatório de Coloproctologia do Hospital das Clínicas da UNICAMP.
O cálculo do tamanho amostral de acordo com as freqüências dos polimorfismos foi de 237,72.
O teste de Hardy-Weinberg foi aplicado a controles e pacientes. Ambos estão em equilíbrio (X2=0,019, p=0,89 e X2=0,587, p=0,4436 respectivamente),
para o lócus do polimorfismo VEGF C936T. 4.1 Idade
A idade média dos pacientes foi de 65,2 (32-97) anos, sendo que a comparação entre os grupos evidenciou faixa etária maior no Grupo G1 (tabela1). Tabela 1: Análise comparativa da idade média entre pacientes e controles
IDADE
Grupo média desvio-padrão mediana
G1 65,2 12,3 66
G2 52,9 3,7 53
teste Wilcoxon pareado p < 0.0001
Com relação à faixa etária não foram identificadas diferenças nas freqüências dos genótipos do polimorfismo (tabela 2), assim como na comparação das mesmas entre os grupos (tabela 3).
Tabela 2: Idades média e mediana e genótipos do polimorfismo C936T do gene VEGF
IDADE
Variante n Idade média desvio-padrão mediana
CC 415 59 11,1 56,0
CT 102 59 10,6 56,0
TT 5 58,4 11,8 53,0
teste de Kruskal-Wallis p = 0.9283
Tabela 3: Idade média das variantes do polimorfismo C936T por grupos IDADE
G1 G2
Variante n Idade média n Idade média
CC 210 64,9 205 52,9
CT 48 65,8 54 52,8
TT 3 62,6 2 52
4.2 Sexo
Com relação ao sexo de pacientes e controles, observou-se discreto predomínio do sexo masculino (52,1%) sendo que não foram observadas diferenças estatísticas em relação aos grupos (tabela 4).
41
Tabela 4: Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo SEXO G1 G2 n % n % Sexo F 125 47,9 125 47,9 M 136 52,1 136 52,1 Test qui-uadrado p=1,00
Gráfico 1: Distribuição de pacientes (G1) e controles (G2) por sexo
45,0% 46,0% 47,0% 48,0% 49,0% 50,0% 51,0% 52,0% 53,0% Masculino Feminino Sexo G1 G2
Tabela 5: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T de pacientes e controles por sexo
SEXO G1 G2 CC CT+TT CC CT+TT n n Feminino* 105 19 95 30 Masculino** 101 36 110 26
*Teste exato de Fisher p= 0,1105 **Teste exato de Fisher p= 0,1936
4.3 Classe
Observou-se também um predomínio da classe caucasóide, tanto no G1 (88,9%) como no G2 (87,4%), porém sem diferença estatística na comparação entre os grupos (p>0,05).
Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles por classe CLASSE
G1 G2
n % n %
Caucasóide 219 83,9 232 88,9
Não-caucasóide 42 16,1 29 11,1
43
Gráfico 2: Distribuição de pacientes e controles por classe
4.4 Localização do tumor
A localização tumoral prevalente foi no reto com 119 pacientes, seguido pelo cólon descendente (n=98), cólon ascendente (n=27) e com a menor ocorrência o cólon transverso (n=10). Em quatro portadores de neoplasia de cólon não foi possível a identificação do segmento acometido e em 19 não constava no prontuário se o tumor primário era do reto ou cólon (tabela 6 e gráfico 3) (p=0,1202). 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% Caucasóide Não caucasóide Raça G1 G2
Tabela 7: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a localização tumoral
LOCALIZAÇÃO TUMORAL
Cólon Direito Cólon esquerdo Reto
n % n % n %
CC 34 87,2% 55 74,3% 99 79,2%
CT 5 12,8% 19 25,7% 24 19,2%
TT 2 1,6%
Test qui-qadrado p= 0,2575
Gráfico 3: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a localização tumoral
4.5 Classificação TNM
A análise da freqüência das variantes do polimorfismo foram estudados em relação ao sistema TNM, não evidenciou diferença da freqüência da variante CC nos diversos estágios, enquanto que a variante CT foi mais freqüente no estágio I (p=0,0091). No estágio IV, a variante selvagem (CC) foi a única
0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% CC CT TT Localização Tumoral Cólon direito Cólon esquerdo Reto
45
VEGF C936T segundo a classificação TNM incluindo os pacientes com neoplasia de reto com tratamento neo-adjuvante. Foram excluídos 49 pacientes por falta de dados para a obtenção do estágio.
Tabela 8: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo os estágios da TNM ESTÁGIO TUMORAL I II III IV n % n % n % n % CC 32 67,4% 64 89,7% 63 76,3% 11 100% CT 15 30,4% 7 10,3% 19 23,8% TT 1 2,2%
Gráfico 4: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo os estágios da TNM
A análise com a exclusão de 83 pacientes portadores de neoplasia de reto com tratamento neo-adjuvante, também não evidenciou diferença significante em relação aos estágios do tumor pela classificação TNM (tabela 8). Quando agrupados os estágios I e II e comparamos com os estágios III e IV obtivemos p = 0,2947 (OR 1,325, 95% IC, 0,8109 a 2,166) como podemos visualizar na tabela 9. 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0% CC CT TT Estágio I II III IV
47
Tabela 9: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
ESTÁGIO I II III IV n % n % n % n % CC 17 81% 46 86,8% 49 74,2% 9 100% CT 4 19% 7 13,2% 17 25,8% Teste t-student p = 0,1526
Gráfico 5: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a classificação TNM excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
I II III I V 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% 100,0% CC CT Estágio I II III I V
Tabela 10: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
ESTÁGIO
I + II III + IV
n % n %
CC 63 85,1% 58 77,3%
CT 11 14,9% 17 22,7%
Teste exato de Fisher p = 0,2947
Gráfico 6: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando o estágio I e II versus III e IV, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante
I + II III + IV 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% CC CT I + II III + IV
49
4.5.1 Infiltração tumoral e acometimento de linfonodos
Para a análise da infiltração tumoral e de acometimento de linfonodos foram excluídos 83 portadores de neoplasia de reto com tratamento neo-adjuvante e 40 pacientes por falta de dados. Dois pacientes portadores de pólipos com transformação carcinomatosa e removidos no pré-operatório por colonoscopia foram classificados como T0. Não se observou diferença nas freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em relação à invasão tumoral (tabela 10). Não foi identificada nesta população a variante TT.
Tabela 11: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a infiltração tumoral INVASÃO TUMORAL Tis T0 T1 T2 T3 T4 N % N % N % N % N % N % CC 1 100% 1 50% 8 72,7% 23 88,5% 77 87,5% 7 70% CT 1 50% 3 27,3% 3 11,5% 11 12,5% 3 30% Qui-quadrado p = 0,6061
Gráfico 7: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo a infiltração tumoral
A análise da infiltração tumoral quando agrupamos as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 3 T4 também não obtivemos resultados estatísticos significantes (p=0,2288), o mesmo ocorreu com o risco relativo (OR 0,4487, 95% IC, 0,1550 a 1,2999) como demonstrado na tabela 11.
Tis T0 T1 T2 T3 T4 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% CC CT Tis T0 T1 T2 T3 T4
51
Tabela 12: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante Infiltração tumoral Tis + T0 + T1 T2 + T3 + T4 n % n % CC 10 71,4% 107 86,3% CT 4 28,6% 17 13,7%
Teste exato de Fisher p = 0,2288
Gráfico 8: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T agrupando as categorias Tis, T0 e T1 versus T2, T3 e T4, excluindo-se pacientes com terapia neo-adjuvante Tis+T0+T1 T2+T3+T4 0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0% CC CT Tis+T0+T1 T2+T3+T4
Com relação ao acometimento de linfonodos, também não foram identificadas diferenças significantes em relação as variantes estudadas (tabela 10) (p=0,7637).
Tabela 13: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo o acometimento de linfonodos LINFONODO N0 N1 N2 N % N % N % CC 58 (84,1%) 35 (81,4%) 15 (93,8%) CT 11 (15,9%) 08 (18,6%) 1 (6,3%)
teste exato de Fisher p = 0,4641
Gráfico 9: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T segundo o acometimento de linfonodos 0,0% 50,0% 100,0% CC CT Linfonodo N0 N1 N2
53
4.6 Análise do genótipo em pacientes e controles
Após a amplificação e digestão do DNA, os resultados foram analisados conforme a figura 2. Quando a imagem mostra somente fragmentos de 208pb significa que o paciente é portador do genótipo selvagem CC, quando a imagem mostra fragmentos de 208, 122 e 86pb, o paciente é portador do genótipo variante heterozigoto CT e quando na imagem aparecem os fragmentos de 122 e 86pb significa que o paciente é portador do genótipo variante homozigoto TT.
Figura 2: Banda auto-radiografada com genótipos do polimorfismo C936T do gene VEGF
Marcador CT CC TT
208 pares de base 122 pares de base 86 pares de base
Enzima de restrição NlaIII. M: marcador de DNA com tamanho de 100pb; CC= genótipo selvagem; CT= genótipo variante heterozigoto do C936T.
A análise dos genótipos do polimorfismo C936T não demonstrou diferença estatística entre os grupos (Tabela 13, gráfico 10)
Tabela 14: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em pacientes e controles VEGF 936 G1 G2 n % n % CC 210 80,5 205 78,5 CT 48 18,4 54 20,7 TT 3 1,1 2 0,8
teste exato de Fisher p= 0,737
Gráfico 10: Freqüências dos genótipos do polimorfismo VEGF C936T em pacientes e controles
A análise da chance de risco (OR) da variante CC em relação a CT foi de 1,47 com intervalo de confiança 95% (0,80 a 2,70), e da variante TT em
0,0% 20,0% 40,0% 60,0% 80,0% 100,0% CC CT TT VEGF G1 G2
55
relação CT foi de 0,34 com intervalo de confiança de 95% (0,03 a 3,63), com p=0,737 (regressão logística com fator de ajuste para a idade).
5 DISCUSSÃO
A angiogênese desempenha um papel essencial no crescimento tumoral, invasão e metástase das células tumorais e pode ser estimulada pela produção de fatores produzidos pela células neoplásicas [74, 75]. Entre os fatores que regulam a angiogênese, o VEGF é o mais conhecido e considerando sua capacidade de estimular a proliferação vascular, a sua expressão teria a capacidade de modificar o comportamento biológico de tumores sólidos, incluindo o ACE. O gene VEGF humano entretanto, é altamente polimórfico propiciando uma ampla variação de sua expressão entre os indivíduos.
Acredita-se que o polimorfismo VEGF C936T interfira na produção da proteína [44, 76], sendo o genótipo homozigoto variante TT associado aos menores níveis plasmáticos da proteína VEGF [21]. Assim, o genótipo TT diminuiria a angiogênese e, em tese, proporcionaria menor desenvolvimento tumoral. Sabe-se que níveis séricos mais elevados de VEGF no período pré-operatório em portadores de ACE associou-se a menor sobrevida [77].
Entretanto, estudos desse polimorfismo em diversos tumores sólidos apresenta resultados distintos em relação ao risco de câncer ou fatores prognósticos [35, 57, 78]. Oliveira et al. [79] demonstraram que o genótipo selvagem CC é determinante para a maior agressividade do tumor esporádico de mama.
No câncer gástrico, Tzanakis et al [62] encontraram uma forte associação entre o gene C936T, o genótipo TT esta relacionado a um tamanho maior do tumor. No entanto, os resultados do presente estudo, bem como os resultados de Hofmann e Dassoulas não apóiam uma associação com o tamanho do tumor, graduação histológica, estágio do tumor, metástases linfonodais e idade ao diagnóstico em casos ACE, contudo Chae [68] mostrou que o alelo T esta relacionado com o estagio avançado (metástase) do ACE.
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características do tumor pode estar intimamente relacionada com o tipo de órgão que carrega a malignidade.
O presente estudo sugere que os genótipos estudados não aumentam o risco de ACE (CT x CC = OR 1,47 95% IC 0,80 a 2,70 e TT x CT = OR 0,34 95% IC 0,03 a 3,63). Estes achados foram corroborados por Hofmann [64], Dassaoulas [65], Xu [37] e colaboradores obtendo os mesmos resultados em relação ao polimorfismo C936T. Achados diversos foram obtidos por Eroglu e Wu [61, 80] em estudo que evidenciou que este polimorfismo aumenta a predisposição do paciente a desenvolver um tumor maligno, apesar da freqüência das variantes deste estudo ser semelhante a de outros estudos [56, 81].
Estes dados podem ser explicados pela ação de diversos fatores como a variação no lócus, ação de vários outros genes, aspectos ambientais e etnia, o que justificaria seu estudo em populações distintas. Hefler et al [82] reportaram que a presença de três genótipo homozigotos (2578/CC; 1154/GG; 634/CC) presentes simultaneamente aumentaram os níveis séricos de VEGF e relacionaram-se com menor sobrevida em 563 pacientes com carcinoma de ovário. Assim, além da variação seqüencial do gene VEGF que alteraria sua produção ou atividade, outros fatores angiogênicos presentes na circulação, interagindo com VEGF, poderiam influenciar seu papel na patogênese de cânceres.
O estudo da freqüência do polimorfismo torna-se importante pois pode correlacionar-se com informações genéticas populacionais e assim determinar sua influência no desenvolvimento tumoral. Nesta casuística, o estudo da distribuição genotípica pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg demonstrou que as variantes estudadas encontram-se dentro da proporcionalidade genética esperada.
A análise do polimorfismo com relação à idade, sexo e localização tumoral não evidenciou alterações significativas, achado distinto de BAE et al. [83], que constataram que a ocorrência do alelo T aumentaria o risco em indivíduos
com idade inferior a 55 anos, mulheres, e estaria associado a maior ocorrência de adenocarcinoma em cólon direito. Estes resultados podem ser explicados devido a diferença étnica.
O estudo de aspectos relacionados ao comportamento biológico do ACE também não evidenciou correlação quanto à presença do polimorfismo com aspectos relacionados à invasão tumoral, acometimento de linfonodos ou ocorrência de metástases, apesar de Vidaurreta et al. [76] reportar que o alelo T se mostrou em menor freqüência no estágio de Dukes D (presença de metástase a distância) e estágios inicias do CCR. Porém outros estudos mostram que o aumento da expressão do VEGF está associado a ocorrência de metástase [59, 68, 84] e estágios mais avançados da doença [68], mas poucos estudos relata o envolvimento do VEGF no estágio e localização tumoral [65]. Kim et al. [59] em estudo com três polimorfismos do gene VEGF em 445 portadores de CCR observaram que o genótipo 936TT associou-se a menor sobrevida.
No presente estudo o polimorfismo C936T não altera o risco de desenvolvimento ACE. Nossos resultados estão de acordo com Hofmann et al. [64], Dassoulas [65] e Wu [81] que sugeriram que os polimorfismos C2578A, G634C e C936T não são fatores de risco geral para a ACE. A análise do polimorfismo C936T do gene VEGF do presente estudo também foi realizada em câncer de mama, pulmão, estômago, melanoma [35, 62, 85] e não influenciou a suscetibilidade ao câncer de mama de forma significativa no estudo de Jin et al. [85]. Por outro lado, os portadores do alelo T no VEGF 936 apresentam diminuição do risco de câncer de mama e de pulmão de acordo com outros pesquisadores [56, 86]. Esses resultados não são inesperados, pois o VEGF funciona como um mediador fundamental da angiogênese, influenciando aspectos biológicos e fenotípicos (tamanho do tumor, grau histológico, estágio da doença, e potencial metastático) do que definir a susceptibilidade ao desenvolvimento de câncer.
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relação ao papel do polimorfismo C936T para o desenvolvimento e evolução de alguns tipos de tumores malignos, justifica-se a realização de outros estudos, incluindo a analise sérica da proteína do VEGF no sangue periférico dos pacientes e controles, além de correlacionar este polimorfismo com outros envolvidos na síntese do VEGF e angiogênese.
A princípio o VEGF C936T não pode ser considerado um marcador tumoral no câncer colorretal em nossa população, apesar da angiogênese ser um alvo terapêutico promissor, visando a inibição da formação de novos vasos e possibilitando assim a regressão tumoral. Estudos com casuísticas maiores e com indivíduos das diversas regiões do pais são necessários para definir o papel do polimorfismo no risco de ACE em nossa população. Descobertas sobre polimorfismos gênicos têm influenciando estas terapias utilizando o VEGF como alvo, possibilitando a adequação de tratamentos individuais e melhorar a resposta terapêutica no pós-operatório e tratamentos como quimioterapia [89, 90].
Algumas limitações devem ser consideradas neste estudo: os indivíduos do grupo controle podem desenvolver ACE nos anos subseqüentes e não foi considerado fatores ambientais como tabagismo e etilismo.
A contínua investigação para o melhor conhecimento sobre a funcionalidade dos diversos polimorfismos do gene VEGF e sua relação com o desenvolvimento tumoral deve ser incentivada, pois levará a uma melhor compreensão da biologia tumoral e comportamento, podendo influenciar aspectos terapêuticos assim como esclarecer a inconsistência de dados encontrados em estudos recentes.
6 CONCLUSÕES
✓ O polimorfismo C936T do gene VEGF não altera o sexo e a idade de ocorrência do tumor, bem como a localização, o acometimento de linfonodo e o grau de invasão tumoral.
✓ O polimorfismo C936T do gene VEGF não influencia o risco de ocorrência de ACE em indivíduos de nossa população.
