143
Tabela 36: Média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima do Fluconazol sobre C. neoformans
*Condições do estudo: Pesquisa da Concentração inibitória mínima CIM em placas de microdiluição e leitura em 48 horas: resultado em µg/mL
** pacientes com sorologia positiva para o HIV ***pacientes com sorologia desconhecida para o HIV ****µ ± dp – Média e disvio padrão
*****Min. – Mínima e Max. Máxima
Tabela 37: Média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima do Fluconazol sobre C. neoformans
* Pesquisa da atividade fungicida em Ágar Sabouraud dextrose, leitura em 48 horas: ausência de crescimento: atividade fungicida (CFM) - resultado em µg/mL
** pacientes com sorologia positiva para o HIV *** pacientes com sorologia desconhecida para o HIV ****µ ± dp – Média e disvio padrão
*****Min. – Mínima Max. Máxima
VARIAVEL
Isolados HIV+ ISOLADOS NÃO HIV Isolados de origem humana
isolados de origem ambiental Fluconazol N=8** N=13*** N=21 N=29 µ ± dp**** 28,60 ± 33,98* 19,60 ± 52,98 23,03 ± 45,92 33,51 ± 51,67 Mediana 12,20 3,05 3,05 12,2 Min.–Max.***** 3,05 – 97,65 0 – 195,31 0 – 195,31 1,52 – 195,31 VARIAVEL
Isolados HIV+ ISOLADOS NÃO HIV Isolados de origem humana
isolados de origem ambiental Fluconazol N=8** N=13*** N=21 N=29 µ ± dp**** 31579,59 ± 70227,6* 2521,21 ± 6963,32 13591,07 ± 44320,99 3891,50 ± 10287,58 Mediana 585,93 195,31 195,31 195,31 Min.–Max.***** 97,65 – 200.000 0 – 25.000 0 - 200000 48,82 – 50.000
144
5.13 Valores CIM 50 e CIM 90 para óleos essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C. neoformans isolados de origem humana e ambiental
Na tabela 38 observa-se os valores de CIM 50 e CIM 90 para os óleos essenciais de Eucalyptus citriodora, Eucalyptus globulus, Eugenia
caryophyllus, Melaleuca alternifolia, Thymus vulgaris, Blend de óleos
essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C. neoformans isolados de origem humana e ambiental.
Tabela 38. Valores CIM 50 e CIM 90 para óleos essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C.
neoformans isolados de origem humana e ambiental
Condições do estudo: Pesquisa da Concentração inibitória mínima CIM em placas de microdiluição e leitura em 48 horas: resultado em % e µg/mL
CIM: concentração inibitória mínima
*CIM50 CIM de um antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos Isolados. **CIM90 CIM de um antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos Isolados v/v: volume por volume em porcentagem
ISOLADOS C. neoformans ISOLADOS BIOLÓGICOS DE ORIGEM HUMANA N- 21 C.neoformans ISOLADOS BIOLÓGICOS DE ORIGEM AMBIENTAL N-29 Óleos essenciais/ antifúngico CIM 50* µg/mL - % (v/v) CIM 90** µg/ml - % (v/v) CIM 50 µg/mL - % (v/v) CIM 90 µg/ml - % (v/v) E. citriodora 10,98 -0,012 1406,25 -1,56 0,34 – 0,00038 5,49 – 0,0061 E. globulus 0,68 – 0,00076 87,89 – 0,09 5,49 – 0,0061 43,9 – 0,04 E. caryophyllus 1,37 – 0,0015 43,9 – 0,04 1,37 – 0,0015 5,49 – 0,0061 M. alternifolia 703,12 – 0,78 2812,5 – 3,12 87,89 – 0,09 175,78 – 0,19 T. vulgaris 0,68 – 0,00076 2,74 – 0,003 0,68 – 0,00076 1,37 – 0,0015 “Blend” 1,37 – 0,0015 10,98 – 0,012 2,74 – 0,003 10,98 – 0,012 Fluconazol 30,5 – 48,82 – 6,10 - 12,20 –
145
5.14 Valores CFM 50 e CFM 90 para óleos essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C. neoformans isolados de origem humana e ambiental
Na tabela 39 observa-se os valores de CIM 50 e CIM 90 para os óleos essenciais de Eucalyptus citriodora, Eucalyptus globulus, Eugenia
caryophyllus, Melaleuca alternifolia, Thymus vulgaris, Blend de óleos
essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C. neoformans isolados de origem humana e ambiental.
Tabela 39. Valores CFM 50 e CFM 90 para óleos essencias e o antifúngico Fluconazol sobre C.
neoformans isolados de origem humana e ambiental
* Pesquisa da atividade fungicida em Ágar Sabouraud dextrose, leitura em 48 horas: ausência de crescimento: atividade fungicida (CFM) - resultado em µg/mL
CFM: concentração fungicida mínima
*CFM50 CFM de um antifúngico capaz de inibir o crescimento de 50% dos Isolados. **CFM90 CFM de um antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos Isolados v/v: volume por volume em porcentagem
ISOLADOS C. neoformans ISOLADOS BIOLÓGICOS DE ORIGEM HUMANA N= 21 C.neoformans ISOLADOS BIOLÓGICOS DE ORIGEM AMBIENTAL N=29 Óleos essenciais/ antifúngico CFM50* µg/mL - % (v/v) CFM90** µg/mL - % (v/v) CFM50 µg/mL - % (v/v) CFM90 µg/mL - % (v/v) E. citriodora 2812,5 – 3,12 90.000 – 100 21,97 – 0,024 351,56 – 0,39 E. globulus 703,12 – 0,78 2812,5 – 3,12 175,78 – 0,19 703,12 – 0,78 E. caryophyllus 87,89 – 0,09 703,12 – 0,78 175,78 – 0,19 703,12 - 0,78 M. alternifolia 45.000 – 50 45.000 – 50 11.250 – 12,5 45.000 – 50 T. vulgaris 175,78 – 0,19 703,12 – 0,78 21,97 – 0,024 351,56 – 0,39 “Blend” 175,78 – 0,19 1406,25 – 1,56 351,56 – 0,39 2812,5 – 3,12 Fluconazol 195,31 - 50.000 - 195,31 – 390,62 -
146
5.15 – Etest®
5.15.1 Isolados Biológicos de origem humana
Na fita Etest® os valores da concentração para a anfotericina B variaram de 0,002 a 32.0 μg/mL. O isolado número 5 de origem humana foi sensível no valor ≥ 0,002µg/mL. O isolado de número 10 obteve valor de CIM de 0,5µg/mL e 95% de inibição (apresentou zona interna da elipse com microcolônias). Isolados 11 e 12 mostraram resistência, CIM >32 µg/mL. A média e o desvio padrão da concentração de anfotericina B para CIM foi 3,18 ± 9,58µg/mL (Tabela 40 e 42) (Gráfico 33).
Os valores de CIM 50 e CIM 90 para anfotericina B nos 21 isolados de origem humana foram 0,125 e 0,5µg/mL respectivamente (Tabela 43).
147
Tabela 40. Valores da CIM para Anfotericina B sobre C. neoformans isolados biológicos de origem humana.
Etest – CIM em µg/mL
Isolados CIM (µg/mL)* INIBIÇÃO (%)**
1 – ICB 78 0,125 100 2 – ICB 87 0,064 100 3 – ICB 89 0,5 100 4 – ICB 105 0,19 100 5 – ICB 107 0,002 100 - S 6 – ICB 108 0,125 100 7 – ICB 113 0,064 100 8 – ICB 127 0,25 100 9 – ICB 150 0,25 100 10 – ICB 154 0,5 95% 11 – ICB 155 32 R 12 – ICB 160 32 R 13 – ICB 164 0,125 100 14 – ICB 167 0,023 100 15 – ICB 168 0,125 100 16 – ICB 169 0,047 100 17 – ICB 170 0,047 100 18 – ICB 172 0,012 100 19 – ICB 183 0,125 100 20 – ICB 189 0,094 100 21 – ICB 283 0,125 100
Legenda: Em azul C.neoformans isolados de pacientes com sorologia desconhecida
para o HIV
Em rosa C.neoformans isolados de pacientes com sorologia positiva para o HIV
Condições do estudo: Pesquisa da Concentração inibitória mínima CIM Para Etest e leitura em 48 horas: resultado em % e µg/mL
*CIM: concentração inibitória mínima **Inibição de crescimento em porcentagem
S: Sensível – ausência de crescimento até 0,002µg/ mL R: Resistente – presença de crescimento a 32µg/mL
148
Gráfico 33. Concentrações inibitórias mínimas (CIM) da anfotericina B sobre C. neoformans isolados de origem humana
5.15.2 Isolados Biológicos de origem ambiental
Para os isolados biológicos de origem ambiental número 44 apresentou sensibilidade na concentração ≥ 0,002µg/mL. Os isolados 39 e 48 na concentração 0,5 e 0,125 µg/mL respectivamente e 95% de inibição (zona interna da elipse com microcolônias). O isolado 45 foi resistente CIM >32 µg/mL. A média e o desvio padrão da concentração de anfotericina B para CIM foi de 3,18 ± 9,58µg/mL (Tabela 41 e 42) (Gráfico 34).
Os valores de CIM 50 e CIM 90 para anfotericina B nos 29 isolados de origem ambiental foram de 0,25 e 0,38µg/mL respectivamente (Tabela 43).
0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 CIM e m µg /m L
C. neoformans: Isolados biológicos de origem humana de 01 a 21
149
Tabela 41. Valores da CIM para Anfotericina B sobre C. neoformans isolados biológicos de origem ambiental
Etest – CIM em µg/mL
Isolados CIM (µg/mL) INIBIÇÃO (%)
22 – B 07 0,125 100 23 – B 08 0,032 100 24 – B 20 0,25 100 25 – B 64 0,25 100 26 – ICB 114 0,125 100 27 – ICB 165 0,094 100 28 – ICB 166 0,25 100 29 – ICB 174 0,094 100 30 – ICB 175 0,125 100 31 – ICB 176 0,25 100 32 – ICB 178 0,5 100 33 – ICB 182 0,125 100 34 – P3 A20 0,002 100 35 – P9 A5 0,25 100 36 – P9 A7 0,032 100 37 – P9 A10 0,125 100 38 – P11 A8 0,38 100 39 – P17 A9 0,5 95 40 – P3 B5 0,25 100 41 – P6 B4 0,25 100 42 – P9 B11 0,19 100 43 – P10 B8 0,5 100 44 – P10 B20 0,002 100 45 – P17 B5 32 R 46 – P1 C6 0,25 100 47 – P3 C2 0,25 100 48 – P3 C11 0,125 95 49 – P9 C5 0,38 100 50 – P10 C5 0,25 100 Padrão C. neoformans ICB-163D 0,32 100
Condições do estudo: Pesquisa da Concentração inibitória mínima CIM Para Etest e leitura em 48 horas: resultado em % e µg/mL
*CIM: concentração inibitória mínima **Inibição de crescimento em porcentagem
S: Sensível – ausência de crescimento até 0,002µg/ mL R: Resistente – presença de crescimento a 32µg/mL
150
Gráfico 34. Concentrações inibitórias mínimas (CIM) da anfotericina B sobre C. neoformans isolados de origem ambiental.
Tabela 42. Média, desvio padrão, mediana, máxima e mínima da sensibilidade de C. neoformans a anfotericina utilizando o método de Etest®
* pacientes com sorologia positiva para o HIV ** pacientes com sorologia desconhecida para o HIV ***µ ± dp – Média e disvio padrão
****Min. - Mínima Max. Máxima 0 5 10 15 20 25 30 35 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 CIM e m µ g/ m L
Isolados biológicas de origem ambiental de 22 a 50 e ICB 163 D
Etest® - CIM para Anfotericina B
VARIAVEL
Isolados HIV+ ISOLADOS NÃO HIV Isolados de origem humana
isolados de origem ambiental Anfotericina B N=8* N=13** N=21 N=29 µ ± dp*** 0,12 ± 0,15 5,06 ± 11,95 3,18 ± 9,58 1,30 ± 5,90 Mediana 0,07 0,125 0,125 0,25 Min.–Max.**** 0,0012 – 0,5 0,002– 32 0,002 - 32 0,002 - 32
151
5.16 CIM 50 e CIM 90 da Anfotericina B sobre isolados de C.
neoformans
Tabela 43: Valores de CIM50 e CIM90 da anfotericina B sobre isolados de C. neoformans de origem humana e ambiental utilizando-se o método Etest®
ANFOTERICINA B CIM50 µg/mL CIM90 µg/mL C. neoformans Isolados de origem humana 0,125 0,5 C.neoformans Isolados de origem ambiental 0,25 0,38
152
5.17 Composição química dos óleos essenciais com atividade antimicrobiana
Cada óleo possui substâncias com atividades antimicrobianas conhecidas como os terpenóides e fenóis. No quadro 1 estão relacionados os principais constituintes com atividade antimicrobiana de cada óleo essencial utilizado nesta pesquisa conforme informação da WNF.
Quadro 1. Composição química dos óleos essenciais de E. citriodora, E. globulus, E. caryophyllus, M. alternifolia e T. vulgaris com atividade antimicrobiana
Composição química dos óleos essenciais com atividade antimicrobiana
ÓLEOS ESSENCIAIS COMPOSTOS EM PORCENTAGEM (%) Monoterpenos Alcoóis monoterpênicos sesquitepenos Alcoóis sesquiter- penicos
Fenóis Óxidos Cetonas Ésteres Éteres aldeídos ácidos
E.citriodora < 03* 20 - 25 < 05 3 - < 01 - < 05 - 55-70 - E. globulus 15-20 03 01 01-03 - 60-75 < 01 03 - < 01 - E. caryophyllus - - 10 - 75 - 80 - - 08 01 - Tra- ços M. alternifolia 30 - 40 25 - 40 5-10 < 01 < 01 05 -15 - - - - - T. vulgaris 17 - 45 - < 02 07 40 - 55 02 < 01 - < 02 - -
*Concentração e Intervalo de concentração de substâncias com atividade antimicrobiana presentes nos óleos essências comercializados pela World’s Natural Fragrancies:
153
5.18 Concentração Fungicida Mínima de C.neoformans e principais compostos químicos dos óleos essenciais com atividade antifúngica
No quadro 2, observa-se os valores de CFM 90 dos óleos essências sobre os isolados de C. neoformans de origem humana e ambiental e pode-se relacionar e comparar qual óleo obteve melhores resultados sobre os isolados e quais compostos que realmente influenciam na atividade antifúngica de cada óleo.
Pode-se observar que os óleos que possuem melhores resultados em relação média e desvio padrão são classificados pela ordem de: 1º E.
caryophyllus; 2º T. vulgaris, 3º E. globulus, 4º E. citriodora e 5º M. alternifólia.
Quadro 2. CFM90 de C.neoformans e principais compostos químicos com atividade antifúngica dos óleos essenciais de E. citriodora, E. globulus, E. caryophyllus, M. alternifolia e T. vulgaris
Pesquisa da atividade fungicida em Ágar Sabouraud dextrose, leitura em 48 horas: ausência de crescimento: atividade fungicida (CFM) - resultado em µg/mL
CFM: concentração fungicida mínima
*CFM90 CFM de um antifúngico capaz de inibir o crescimento de 90% dos Isolados v/v: volume por volume em porcentagem
** Dados de Concentração e Intervalo de concentração de substâncias com atividade antimicrobiana presentes nos óleos essências comercializados pela World’s Natural Fragrancies:
CFM90 e Composição química dos óleos essenciais com atividade antifúngica
C. neoformans
ORIGEM HUMANA ORIGEM AMBIENTAL
Principais compostos com atividade antifúngica (%)** Óleos essencias CFM90* - humanos µg/mL CFM90 - humanos % (v/v) CFM90 - ambiental µg/mL - CFM90 - ambiental % (v/v) Monoterpenos Alcoóis Monoterpenos Fenóis E. citriodora 90.000 100 351,56 0,39 < 03 20 - 25 - E. globulus 2812,5 3,12 703,12 0,78 15-20 03 - E. caryophyllus 703,12 0,78 703,12 0,78 - - 75 - 80 M. alternifolia 45.000 50 45.000 50 30 - 40 25 - 40 - T. vulgaris 703,12 0,78 351,56 0,39 17 - 45 - 40 - 55
154
155 C. neoformans
C. neoformans é um dos agentes etiológicos da criptococose,
comumente encontrado no sistema nervoso central (SNC); Lindenberg et al., 2008; McCarthy et al., 2008; Thakur et al., 2008).
A criptococose é uma doença grave que pode ocorrer em indivíduos imunocompetentes, mas principalmente em pacientes imunocomprometidos, sobretudo os pacientes HIV positivos (McCarthy et al., 2008). É a segunda doença neurológica mais prevalente em pacientes brasileiros com AIDS (Vidotto et al., 2006; Martins et al., 2007; Pappalardo et al., 2007). O índice de mortalidade da criptococose no SNC é de 15 a 30%, mesmo com o tratamento (Charlier et al., 2008).
Atividade enzimática
A produção de exoenzimas reflete o grau de patogenicidade de um microrganismo. A exoenzima fosfolipase atua na hidrólise dos fosfolipídios dando origem a lisofosfolipídios que causam dano à célula epitelial levando a lise celular (Santangelo et al., 1999). Além disso, destrói substâncias surfactantes nos pulmões, facilitando a adesão da levedura (Vidotto et al., 1996; Karkowska-Kuleta et al., 2009).
A exoenzima proteinase degrada tecidos do hospedeiro e destroem queratina, colágeno, albumina, fibronectina, hemoglobina e proteínas da matriz extracelular bem como proteínas importantes para o sistema imune, digerindo as imunoglobulinas e parte do sistema complemento no local da infecção (Casadevall & Perfect, 1998). Campos & Baroni (2010), relatam que quanto maior o potencial de virulência manifestado nos diferentes mecanismo dessa virulência utilizados pelo microrganismo, associado a quadros de imunodepressão do hospedeiro, aumenta a possibilidade de penetração da levedura e conseguente infecção dos diferentes tecidos do paciente.
156
A produção de proteinase e fosfolipase foi avaliada antes e após contato com os óleos essenciais segundo a técnica descrita por Ruchel et al (1982) e fosfolipase conforme descrita po Price et al (1982).
A atividade enzimática da proteinase foi observada pela formação de um halo ao redor da colônia (PZ), decorrente da degradação da albumina bovina fração V na presença de proteinase. PZ é igual á razão entre o diâmetro da colônia (dc) e o diâmetro da colônia (dc) + diâmetro de degradação (zd) PZ = dc/dc + zd.
A atividade enzimática da fosfolipase é observada pela formação de um halo de precipitação ao redor da colônia (PZ), decorrente da formação de compostos insolúveis entre o cálcio e fosfolipídios presentes na gema de ovo. PZ é igual à razão entre o diâmetro da colônia (dc) e o diâmetro da colônia (dc) + diâmetro de prcipitação (zp) PZ = dc/dc + zp.
Após contato com o óleo essencial a pesquisa de produção das exoenzimas foi realizada nas concentrações sub-inibitórias da cepa padrão de C. neoformans ICB 163 D e de cada isolado testado. Como controle de produção das exoenzimas, isolados sem o contato com o óleo essencial foram avaliados simultaneamente. Os isolados foram semeados em pontos equidistantes de cada placas de Petri contendo o meio específico. Todos os isolados foram incubadas em estufa a 32°C com leituras em dias alternados até 15 dias, conforme descrito por Campos & Baroni, (2010).
Neste estudo todos os tensoativos e óleos essencias com ou sem tensoativos inibiram a produção destas exoenzimas, na cepa padrão de C.
neoformans ICB 163 D e em todos os isolados.
Pesquisa de Cápsula
A pesquisa da cápsula foi realizada com tinta nanquim e observada ao Microscópio de luz. Esta é uma tecnica amplamente utilizado, rápida, de baixo custo e que não exige tecnologia avançada.(Severo et al., 2009).
157
Neste estudo todas as leveduras apresentaram cápsula, mas após contato com os tensoativos e solvente e óleos essencias com ou sem tensoativos, a cápsula foi reduzida ou inibida, na cepa padrão de C.
neoformans ICB 163 D e em todos os isolados.
Antifúngicos sintéticos
A eficácia da anfotericina B é incontestável como melhor tratamento para a criptococose, porém sua toxicidade ainda é o grande problema para o tratamento com este fármaco.
Neste trabalho a anfotericina B foi a substancia utilizada para avaliar o comportamento de sensibilidade e resistência dos isolados estudados. Para esta avaliação utilizou-se o kit comercial E-Test®.
Este teste foi desenvolvido em 1990 e permite a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) das substancias; porém por ter um alto custo ele é inviável para utilização em larga escala (Candido et al.,1999).
O E-Test® é uma fita com antimicrobianos, com gradiente de concentração para se determinar quantitativamente à sensibilidade ou resistência de qualquer microrganismo.
Apesar da facilidade de execução e da concordância de resultados, quando comparados ao método padrão da CLSI, dificuldades de leitura são relatadas quando é observado o desenvolvimento de microcolonias ao redor da zona de inibição das tiras do E-Test®. Estas microcolônias na leitura foram observadas por Colombo et al, (1995) em 10% de 20 amostras de C.
glabrata, 44% de 25 amostras de C. albicans e 60% de 15 amostras de C. tropicalis testadas por este método.
O E-Test® tem sido considerado um excelente método para teste de agentes antimicrobianos contra vários patógenos e a adaptação para testes
158
de sensibilidade a antifúngicos tem alcançado sucesso (Colombo et al., 1995; Chen et al., 1996; Tapia, 2003; Dias, 2006; Espinel-Ingroff ,2006; Meinerz et al., 2010).
Neste estudo a interpretação dos resultados não foi baseada nos valores de CIM preconizados pelo CLSI (documento M27-A2 e M27S2); porque não existem valores definidos para anfotericina B pelo CLSI que apenas sugere CIMs acima de 1µg/mL.
C. neoformans isolados de origem humana apresentaram valores de
CIM 90 para anfotericina B de 0,5 µg/mL e para os de origem ambiental 0,38 µg/mL (Tabela 43). Dias et al., em 2006 (b) encontrou para os mesmos isolados de origem humana, valores de CIM90 de 0,08 µg/mL.
Fluconazol é o antifungico de escolha para manutenção do tratamento de micoses em pacientes imunodeprimidos. E foi o outro antifúngico utilizado para avaliar o comportamento de sensibilidade e resistência dos isolados neste estudado. Para avaliar a atividade desse antifúngico utilizou-se a técnica de microdiluição em caldo.
Neste estudo a CIM dos isolados de C. neoformans ao fluconazol, ficou entre entre 5,6 X10-6 e 97,65 µg/mL. Apenas dois isolados foram mais sensíveis a este antifúngico (Tabela 34). Dias et al em, 2006 utilizando a técnica de EUCAST encontrou sensibilidade desses isolados de origem humana na faixa de 0,12 a 32 µg/mL.
Conforme relatado a anfotericina B ainda é a substância fungicida mais utilizada no tratamento dessa micose mesmo com a sua alta nefrotoxicidade (Filippin & Souza, 2006).
Pelo exposto é importante se pesquisar uma substancia eficaz, com menores efeitos colaterais, com baixa toxicidade e tolerância por via oral como terapia para essa doença. Pesquisas com extratos e óleos essenciais
159
de plantas, pode ser uma nova opção para o tratamento desta infecção (Dismukes, 1993; Araújo et al, 2004; Meneses et al., 2009).
Óleos essenciais
Estudos vêm apontando as valiosas propriedades terapêuticas de óleos essenciais de plantas sobre as leveduras patogênicas (Villon & Chaumont, 1994; Carmo et al., 1998; Alves et al., 2000; Araujo, 2004; Lemos et al., 2004; Lee et al., 2008; Araujo et al., 2009; Lee et al., 2009; Zuzarte et al., 2011).
Os óleos essenciais constituem os elementos voláteis contidos em diferentes órgãos da planta e estão relacionados com diversas funções necessárias a sua sobrevivência (Oliveira et al., 2006). Bhavanani & Ballow (1992), relataram que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas. Os óleos essenciais são originários do metabolismo secundário das plantas e possuem composição química complexa, destacando-se a presença de terpenos e fenilpropanóides (Gonçalves et al, 2003; Silva et al., 2003).
Os terpenos ou terpenóides representam a maior classe de constituintes ativos em plantas, tendo mais de 30.000 substâncias descritas (Raven, 2001; Verpooter & Maraschin; 2001). A classificação dos terpenos decorre do número de unidades isoprênicas que são formadas por átomos de carbono. Os monoterpenos contêm duas unidades isoprênicas (10 átomos de carbonos) são voláteis e encontrados frequentemente nos óleos essenciais (Simões & Spitzer, 1999; Larcher, 2000; Raven, 2001) assim como os sesquiterpenos que constituem uma classe de substâncias naturais com diversos núcleos estruturais (Brochini et al., 1999). Os fatores ambientais na variabilidade de monoterpenos são de grande importância pelo fato dessas substâncias terem significado biossistemático, ecológico e evolutivo no organismo vegetal (Lima et al., 2003).
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Os compostos fenólicos de plantas se enquadram em diversas categorias, como fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides, estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas (Souza et al., 2007).
Este estudo inicia-se com 5 óleos essenciais e um Blend (mistura de óleos essenciais). Ao final, são dois os óleos essenciais ( E. caryophyllus e
T. vulgaris) com promissora atividade anti- Cryptococcus, para os isolados
analisados.
Os óleos essenciais escolhidos já haviam sido referidos na literatura com atividade antifúngica, associada ao fato de terem sido extraídos de plantas naturais do país de origem e à disponibilidade dos mesmos na empresa na época do experimento.
Os isolados de C.neoformans de origem humana e ambiental utilizados neste estudo foram gentilmente cedidos pelo Laboratório de Leveduras Patogênicas ICB-USP que os mantém na micoteca e em concordância com o Comitê de Ética onde este estudo se desenvolveu.
Influência dos fatores abióticos na composição química dos óleos essenciais
Os óleos essenciais são constituídos por uma mistura complexa de diversas classes de substâncias pertencentes ao metabolismo secundários das plantas. O metabolismo secundário por sua vez pode ser influenciado, dentre outros, por fatores genéticos, climáticos (temperatura, intensidade de luz, efeito sazonal, etc.) e edáficos (Morais, 2009).
Óleos essenciais são freqüentemente extraídos das partes vegetais através de arraste à vapor d’ água, hidrodestilação ou expressão de pericarpo de frutos cítricos, porém há outros métodos de extração como a
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enfleurage ou enfloração, extração por CO2 supercrítico (muito utilizado na indústria) e por solventes orgânicos apolares (não apresentam valor comercial).
Como já relatado a composição química dos óleos essenciais é determinada por fatores genéticos, porém, outros fatores podem acarretar alterações significativas na produção dos metabólitos secundários. Os metabólitos secundários representam uma interface química entre as plantas e o ambiente. Os estímulos decorrentes do ambiente, no qual a planta se encontra, podem redirecionar a rota metabólica, ocasionando a biossíntese de diferentes compostos. Dentre estes fatores, ressalta-se as interações planta/microrganismos, planta/insetos e planta/planta; idade e estádio de desenvolvimento, fatores abióticos como luminosidade, temperatura, pluviosidade, nutrição, época e horário de coleta, bem como técnicas de colheita e pós – colheita. Estes fatores podem apresentar correlações entre si, não atuando isoladamente, podendo exercer influência conjunta no metabolismo secundário (Morais, 2009).
A temperatura e a luminosidade são relevantes na fotossíntese, pois a interação destes fatores garante um ambiente ideal para o processo fisiológico (Souza et al., 2008). As variações de temperatura são responsáveis pelas alterações na produção de metabólitos secundários. Os óleos essenciais, na maioria das vezes, apresentam um aumento em seu teor quando as plantas produtoras se encontram em ambientes com temperatura elevada, porém, em dias muito quentes, pode-se observar perda excessiva dos mesmos.
A intensidade luminosa influencia a concentração bem como a composição dos óleos essenciais. Como exemplo, o desenvolvimento dos tricomas glandulares (estruturas vegetais que biossintetisam e armazenam o óleo essencial) de T. vulgaris são processos dependentes de luz (Morais, 2009).
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A sazonalidade pode interferir na composição química e no teor de óleo essencial. Kapur et al. (1982) observaram que ao destilarem folhas de
E. citriodora Hk. durante um ano, a intervalos mensais, que a produção de
óleo essencial foi mínima durante os meses de inverno (junho e julho), mas que aumentou gradualmente e permaneceu assim até os meses de setembro, outubro e novembro e alcançou o máximo de produção durante os meses mais quentes (dezembro a fevereiro). Observaram que houve um pequeno declínio nos meses de março e abril.
A idade e o estágio de desenvolvimento da planta podem influenciar não apenas a quantidade total de metabólitos secundários produzidos, mas a proporção relativa destes compostos. Tecidos mais jovens geralmente apresentam grande atividade biossintética, aumentando a produção de vários compostos, dentre estes, os óleos essenciais (Morais, 2009).
Com relação ao horário de coleta, ao longo do dia, pode-se observar que o aroma característico de cada planta torna-se mais acentuado, sendo possível acreditar que a concentração de óleos essenciais seja maior naquele período, ou que esteja ocorrendo alteração na proporção relativa entre os componentes deste mesmo óleo essencial. Assim, o horário de coleta das plantas torna-se um aspecto relevante na produção de óleos essenciais. A colheita torna-se o ponto crítico, pois se faz necessário que se defina o momento ideal para a mesma. Todas as pesquisas na área de metabólitos secundários de plantas medicinais deveriam ter como o principal objetivo, coincidir o momento de maior expressão de princípio ativo, neste caso, dos óleos essenciais, com o momento de maior rendimento de fitomassa, obtendo-se assim, o tão esperado sucesso (Mattos, 1996).
Por ser a água essencial à vida e ao metabolismo das plantas, pressupõe-se que em ambientes mais úmidos a produção de metabólitos secundários seja maior, Porém, isto nem sempre ocorre. A deficiência hídrica, caracterizada por diferentes formas e intensidades, é a principal
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causa de perda de produtividade (Ortolani & Camargo, 1987), porém, apresenta correlação direta na concentração de metabólitos secundários, havendo relatos na literatura de que o estresse hídrico geralmente induz um aumento na produtividade de alguns terpenoides.
Estudos realizados com o objetivo de avaliar a influência do estresse hídrico sobre a composição do óleo essencial de Ocimum basilicum demonstraram que, sob condições de estresse, houve redução no rendimento de massa seca total, ocorrendo, porém, um rendimento de óleo essencial duas vezes maior. Os componentes do óleo essencial apresentaram alterações significativas, havendo redução no percentual de sesquiterpenos e aumento no percentual de linalol e metilchavicol (Simon et
al., 1992).
Martins et al. (1995), relata que a nutrição é um dos fatores que requerem maior atenção, pois o excesso ou a deficiência de nutrientes pode estar diretamente correlacionado à variação na produção de substâncias ativas. Como exemplo desta variação pode-se citar o fósforo que contribui para o aumento da concentração de óleos essenciais em coentro (Coriandrum sativum) e funcho (Foeniculum vulgare) Corrêa Jr. et al. (1994).
Morais, 2009 observa que a alteração dos compostos majoritários nos óleos essenciais, seja por fatores genéticos, técnicos bióticos ou abióticos, podem influenciar diretamente na qualidade e, consequentemente, nos resultados de tratamentos e de testes biológicos sobre patógenos humanos ou fitopatógenos, podendo levar entre, os autores, divergência entre resultados provenientes de ensaios realizados com as mesmas espécies vegetais e patógenos. Para minimizar estes equívocos nos resultados e evitar que dados não conclusivos sejam publicados, o ideal é que, juntamente com os ensaios para verificação da atividade biológica, seja realizada a análise química dos óleos essenciais avaliados, para que se possa obter a caracterização fitoquímica destes.
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Pelo exposto neste trabalho fez-se opção por adquir óleos essenciais comercializados por uma empresa que mostrou se preocupar com a obtenção de matérias-primas vegetais de qualidade, no pais de origem da planta, possibilitando com isso a obtenção de óleos essenciais com composição química mais constante, acarretando resultados de atividades biológicas mais confiáveis. A empresa encaminhou ainda um boletim técnico com a composição química e a frequência desses compostos nos óleos essências por ela comercializados e analisados neste estudo. Ressaltamos que em estudo piloto, esses óleos essenciais analisados frente a C.neoformas em diferentes momentos, apresentaram resultados concordantes (dados não apresentados nesta pesquisa).
Técnicas para os ensaios com óleos essenciais
São várias as metodologias empregadas para a pesquisa da CIM dos óleos essenciais frente as leveduras tais como: difusão em ágar, difusão em disco, macrodiluição e microdiluição em caldo) e as variações individuais como: tamanho do inoculo, temperatura, tempo de incubação e meio de cultura. Pelo exposto a comparação dos valores de CIM entre alguns estudos é dificultada.
A escolha do método de microdiluição em caldo para esta pesquisa deve-se ao fato deste método ser de baixo custo, sem necessidade de equipamentos complexos para leitura, ser mais sensível que outros métodos usados na literatura, requerem pequena quantidade de óleos essencias e ter boa reprodutibilidade (Ostrosky et al., 2008).
165 Tensoativos e solventes
Nascimento et al. em 2007 relata que para uma a boa qualidade das análises com óleos essenciais, tornou-se comum a utilização de, detergentes ou agentes tensoativos como o Tween 20, Tween 80, e os solventes DMSO e etanol, para dispersão dos óleos essenciais no meio de cultura. As propriedades destes agentes auxiliam na visualização dos resultados da atividade antimicrobiana dos óleos, entretanto podem conduzir a possíveis interações com a substância testada, bem como produzirem atividade antimicrobiana.
Neste trabalho foram testados os dois tensoativos polissorbatos (Tween 20, Tween 80) e um solvente dimetilsufóxido(DMSO).
Tween (20 e 80): conhecidos como polissorbatos, são tensosativos hidrofílicos solúveis em água e empregados para obter emulsões do tipo óleo e água, como dispersantes ou solubilizastes de óleos. São sufactantes não iônicos, pouco tóxico para as membranas biológicas, constituídos por ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol. Estimulam a secreção de proteínas em microrganismos, além de alterar a morfologia e as superfícies da parede celular tanto de bactérias como de fungos. A relação entre fluidez da membrana e o aumento da secreção de enzimas fúngicas, o Tween facilita a solubilização dessas substâncias em meios aquosos e em solventes orgânicos (Giese et al., 2004; Tan, 2007).
DMSO: conhecido como dimetil sulfóxido, composto que age como receptor de prótons em ligações de hidrogênio, confere sua afinidade com a água. Por essa razão é considerado um solvente atrópico, um subproduto da madeira sendo comercializado como um solvente comercial desde 1953. Para substâncias como proteínas e esteróides, o DMSO atua consideravelmente melhor como solvente quando comparado com a água. Em concentrações a 20% ou menores, também pode ser utilizado como
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anticongelante, já que sua ligação com o hidrogênio tende a formar uma matriz cristalina. Quando combinados com agentes tóxicos, a toxicidade do DMSO (que é relativamente baixa) aumenta significantemente. Facilita a penetração de substâncias através das membranas biológicas. O DMSO é de fácil penetração na pele não causando danos irreversíveis na membrana, o que o faz ser diferente dos outros solventes penetrantes (Gaylord Chemical Company, LLC – Technical Bulletin reaction solvent Dimethyl sulfoxide - DMSO, 2006).
Neste trabalho, os tensoativos Tween 20, Tween 80 e o solvente DMSO possuem atividade fungistática frente ao C. neoformans, conforme relatado por Nascimento et al., 2007.
Embora se tenha observado diferenças em relação à CIM e CFM, dos tensoativos e solvente optou-se pelo tensoativo Tween 20 para todos os ensaios, pelo fato da concentração ser a menor entre os dois tensoativos (20% de polissorbato), pela facilidade de homogeneização no meio de cultura, por não apresentar atividade fungicida. Apesar do Tween 80 apresentar os mesmos resultados que o Tween 20, não foi escolhido por se mais concentrado e com isso ser de difícil homogeneização no meio de cultura. Por outro lado Nascimento et al em 2007 recomendou a utilização do Tween 20 a 0,02% como emulsificador para os testes com óleo essencial.
A pesquisa de cápsula foi realizada para os dois tensoativos e para o solvente. Onde observou-se de redução a inibição dessa estrutura na presença dessas substâncias.
A CIM e a CFM dos óleos essenciais sobre a cepa padrão C.
neoformans ICB 163 D foram menores no ensaio sem o tensoativo Tween
167 Ensaios com óleos essenciais
Foglio (2003), em um estudo com Artemisia annua L., encontrou uma CIM de 1000 µg/mL a 1100 µg/mL para C.albicans, nas a frações purificadas de deoxiartemisinina e dihidroepioxiartenuina.
Sautour (2004), considerou significativa a atividade antimicrobiana, quando os resultados atingem valores < 200 µg/mL para compostos químicos isolados.
Neste estudo os óleos essenciais com fenol na composição (E.
caryophyllus e T. vulgaris) apresentaram a maior atividade fungicida com a
menor concentração (703,12µg/mL) sobre isolados de C.neoformans de origem humana.
Lee et al., 2009 estudando óleos essenciais de coníferas japonesas –
Pinus densiflora, Cryptomeria japônica e Chamaecyparis obtusa – em
diferentes microrganismos utilizando a técnica de difusão em ágar, observou que todos os óleos essenciais apresentaram atividade sobre C. neoformans, com CIM de 0,545 mg/mL para P. densiflora e CIM de 2,18 mg/mL para C.
japonica e C. obtusa. C. neoformans foi mais sensível a P. densiflora. O
trabalho sugere que o monoterpeno α-pineno detectado em todos os óleos seja o composto com atividade antimicrobiana mais importante.
O óleo essencial de Distichoselinum tenuifolium (Família Umbelliferae) é composto de hidrocarbonetos monoterpenos, sendo o principal composto mirceno (47,7 - 84,6%). Este também apresentou atividade antifúngica contra cepas de C. neoformans (Tavares et al., 2010).
Neste estudo o óleo essencial de E. citriodora Hooker é composto por < 3% de monoterpenos e de 20 a 25% de alcoóis monoterpênicos e sobre isolados de C.neoformans a CFM variou de 2 x 10-6 a 22.500µg/mL. Os
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compostos químicos do óleo essencial de E. citriodora são: citronelal (93,99%), β-citronelol (2,29%) (Anexo 3). Ambos são compostos químicos do grupo dos monoterpenos com atividade fungicida.
Já E. globulus Labill, apresenta em sua composição monoterpenos (15 – 20%) e os alcoóis monoterpênicos (3%) e apresentou CFM sobre os isolados de C. neoformans entre 2 x 10-6 e 2812,5 µg/mL. Os compostos químicos do óleo essencial de E. globulus são: eucalipitol (80,50%), limoneno (14,03%) (Anexo 4). Ambos são compostos químicos do grupo dos monoterpenos com atividade fungicida.
Castro e Lima (2010) investigaram a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial de E. globulus frente a espécies de Candida e encontraram CIM de 312,5 μg.mL–1 para 76,2% das cepas de Candida e CFM de 625 μg.mL–1 para 81% dessas cepas.
Óleos essenciais de Eucalyptus oleosa apresentaram atividade antifúngica sobre C. albicans (CIM de 0,97%) e o autor considerou que esta atividade estaria relacionada aos monoterpenos oxigenados e especialmente da substância 1,8-cineol (Marzoug et al., 2011).
Nos ensaios com óleo essencial de E. caryophyllus Sprengel sobre os isolados de C. neoformans a CFM foi de 2 x 10-6 a 175,78µg/m. Fenóis são encontrados na composição na concentração de 75 – 85%. Conhecido como óleo de cravo, é rico em eugenol, um derivado do grupo dos fenóis. Os compostos químicos do óleo essencial de E. caryophyllus são: eugenol (84,10%), β-cariofileno (12,67%), α-cariofileno (1,51%) e acetato de isoeugenol (1,08%) (Anexo 5). O eugenol pertence ao grupo dos fenóis com atividade antimicrobiana e os compostos cariofilenos pertencem ao grupo dos sesquiterpenos com atividade antinflamatória.
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O óleo essencial de Ocimum gratissimum, popularmente conhecida como alfavaca, e o eugenol, principal constituinte do óleo essencial desta planta, foram estudados para verificar a atividade antifúngica sobre C
neoformans, Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum,
utilizando a técnica de diluição em ágar. Como resultados foi observadao a atividade sobre C. neoformans e P. brasiliensis A análise química desse óleo é constituída por eugenol, timol e terpenóides entre outas substancias. A fração clorofórmica desta planta na concentração de 62,5μg/mL inibiu 92% dos isolados de C. neoformans e o óleo essencial mostrou inibição de 8% desses isoladosa uma concentração de 125μg/mL (Lemos, 2004).
Para o óleo essencial de M. alternifolia Cheel, sobre isolados de C.
neoformans a CFM foi de 1,37 a 90.000µg/mL, seis isolados apresentaram
resistencia e dois isolados foram sensíveis. A cepa padrão de C.
neoformans. ICB 163 D apresentou resistência ao óleo a 100%. Os
monoterpenos (30-40%), alcoóis monoterpênicos (25-40%), óxidos (5-15%), fenóis e alcoóis sesquiterpênicos (<1%). Foram os compostos encontrados no óleo essencial de M. alternifolia utilizado nesta pesquisa. Os compostos químicos do óleo essencial de M. alternifolia são: terpinoleno (3,38%), ɣ-terpineno (7,24%) e 4-terpineol (77,15%) (Anexo 6). São compostos químicos do grupo dos monoterpenos com atividade fungicida (Vila & Cañigueral, 2006).
A atividade antifúngica do óleo essencial de M. alternifolia foi avaliada sobre Candida spp isolados da cavidade bucal de gestantes HIV positivas, sendo sete C. albicans, um C. tropicalis, um C. glabrata e um C. krusei, utilizando a técnica de difusão em ágar nas quantidades de 20 e 50 μL, nas concentrações de 10 a 100%, variando de 10 em 10%. Todos os isolados foram suscetíveis ao óleo essencial de M.alternifolia nas concentrações de 70% e 50%, respectivamente, nos volumes de 20 μL e 50 μL (Costa et al., 2010).
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O óleo essencial de T. vulgaris Lin. apresentou atividade sobre os isolados de C. neoformans de 2 x 10-6 a 43,9µg/mL. Dos óleos essenciais analisados nesta pesquisa este foi o que apresentou atividade fungicida nas menores concentrações para todos os isolados, principalmente para os isolados de origem ambiental. A composição inclui fenóis (40 - 55%), alcoóis monoterpênicos e os monoterpenos (17 – 45%). Hudaib et al., 2002 relatam que entre estes compostos está o timol e carvacrol que é um dos principais monoterpenos existentes no óleo essencial de tomilho. Entre os compostos químicos do óleo essencial de T. vulgaris, os principais são: cimeno (14,43%), carvacrol (5,08%) e timol (62,13%) (Anexo 7). O cimeno é um composto químico do grupo dos monoterpenos e possui atividade antimicrobiana contra Salmonella Enteritidis (Silva et al., 2010). Segundo Burt (2004), o cimeno facilita o transporte do carvacrol através da membrana citoplasmática para o interior da célula bacteriana.
O carvacrol e timol são compostos fenólicos que também possuem atividade antimicrobiana.
O óleo essencial de T. vulgaris apresentou atividade fungicida sobre espécies de Aspergillus (Klaric et al., 2007).
O óleo essencial de partes aéreas de Baccharis grisebachii foi avaliado quimicamente e encontraram-se 43 constituintes representando 94,3% do óleo total. Timol, éter metil timol, acetato thymyl, alfa pineno, humuleno, alfa e globulol são os maiores componentes. O óleo apresentou atividade fungicida sobre C. neoformans (125 µg/mL), Aspergillus spp. (125 µg/mL), e Trichophyton mentagrophytes e T. rubrum (62,5 µg/ml) (Hadad et
al., 2007).
O Blend sobre isolados de C. neoformans apresentou CFM entre 2 x 10-6 a 175,78µg/mL. Farmacologicamente, os agentes antifúngicos existentes no Blend compõem os alcoóis monoterpênicos existentes no óleo
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de M. alternifolia e os fenóis que compõe os óleos essências de E.
caryophyllus e T. vulgaris. Entre os principais compostos químicos do óleo essencial de Blend, os principais são: eugenol (25%), timol (21,92%) carvacrol,4-terpineol (24,87%), cimeno (6,54%) e ɣ-terpineno (5,45%), entre outros (Anexo 8).
Os óleos essenciais de Eugenia caryophyllus e Thymus vulgaris que tem compostos fenólicos na sua composição química apresentaram atividade fungicida sobre C. neoformans, com as menores concentrações inibitórias em relação aos óleos essenciais de Eucalyptus citriodora,
Eucalyptus globulus e Melaleuca alternifólia, que não apresentam este
composto na composição química.
Espera-se com esta pesquisa ter contribuído com mais um produto natural com atividade antifúngica sobre C.neoformans.
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Os óleos essenciais de Eugenia caryophyllus e Thymus
vulgaris, apresentaram atividade fungicida sobre C. neoformans, com as
menores concentrações inibitórias em relação aos óleos essenciais
Eucalyptus citriodora, Eucalyptus globulus, Melaleuca alternifolia, e o Blend..
Os polissorbatos Tween 20, Tween 80 e o solvente dimetilsufóxido DMSO na concentração a 0,02% reduziram a produção da cápsula de C.neoformans. Tween 80 e DMSO alteram a morfologia das células. O polissorbatos Tween 20 a 0,02% foi o de escolha para o estudo.
As células de C.neoformans com cápsula reduzida ou ausente tenderam a se agrupar em número de 2, 4 ou mais células.
Com excessão do óleo essencial de M. alternifolia, os óleos essenciais que alteraram a produção da cápsula também alteraram a morfologia das células de C.neoformans
Todos os óleos essenciais inibiram a produção das exoenzimas proteinase e fosfolipase de C.neoformans
As concentrações fungicidas mínimas do fluconazol foram maiores que as CFM dos óleos essenciais de E. caryophyllus e Thymus
vulgaris.
As concentrações inibitórias mínimas da anfotericina B foram menores que as do fluconazol e dos óleos essenciais analisados.
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