CARACTERIZAÇÃO DOS PRINCIPAIS GENÊROS
BACTERIANOS PRESENTES NO QUEIJO MINAS
ARTESANAL TIPO "CANASTRA"
S.N. Melo1, L.A. Cruvinel1,A.A. Pereira1,M.P. Ávila2, A.M.A. Nascimento2, G.A. Lacorte1
1- Laboratório de Biologia Molecular - Departamento de Ciências e Linguagens – Instituto Federal de Minas Gerais, Campus Bambuí – CEP: 38900-000 – Bambuí – MG – Brasil, Telefone: (37) 3431-4900 – e-mail: (saulomelobio@hotmail.com)
2- Laboratório de Genética de Microrganismos – Departamento de Biologia Geral – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas – CEP: 31270-901 – Belo Horizonte – MG – Brasil, Telefone: (31) 3409-2588
RESUMO – A produção de queijos artesanais é uma tradição no estado de Minas Gerais. A região da Serra da Canastra se destaca pela comercialização do “queijo da canastra” que é fabricado por produtores rurais com técnicas tradicionais. Neste trabalho foi realizado a análise metagenômica em todas as etapas de produção do queijo, desde a ordenha até o queijo maturado, onde foi possível perceber como funciona a dinâmica populacional dos microrganismos. A técnica de identificação de microrganismos por meio de crescimento em meio de cultura é a mais utilizada, porém essa técnica só detecta microrganismos cultiváveis. As análises mostraram que o “pingo” utilizado pelos produtores como fermento natural tem uma grande influência no produto final contribuindo principalmente com bactérias ácido-láticas. Foi possível notar que alguns gêneros de bactérias presentes em diferentes etapas do processo de produção diminuem sua abundância no queijo maturado, podendo indicar uma possível competição interespecífica por nutrientes.
ABSTRACT – Artisanal Cheese production is a traditional activity in Minas Gerais, particularly on Serra da Canastra region whose farmers produce the very recognized "Canastra Cheese" using traditional techniques. In this work, we performed a metagenomic analysis of each stage of the Canastra Cheese production, from raw milk to ripped cheese, in order to understand the dynamics of microbial communities. We observed that the residual whey, known as “pingo”, used by farmers has a remarkable contribution to the final product, predominantly represented by lactic acid bacteria groups. We also found that bacterial genera present in different stages of the production reduced their abundance in matured cheese, which may indicate a possible interspecific competition for nutrients.
PALAVRAS-CHAVE: metagenômica; leite; cru; pingo; artesanal.
KEYWORDS: metagenomics; milk; raw; whey; artisanal
1. INTRODUÇÃO
O Queijo Minas é provavelmente o queijo brasileiro mais antigo e original, com início de sua fabricação no período colonial, principalmente no Estado de Minas Gerais, como forma de aproveitamento do leite (OLIVEIRA, 1987). O Estado de Minas Gerais devido ao seu clima, solo, campos de pastagens e sais minerais atua diretamente na dieta do animal, o que influencia na qualidade do leite que consequentemente é usado na fabricação do queijo. Os queijos artesanais do estado de Minas gerais com maior credibilidade são produzidos nas microrregiões da Serra da Canastra, Serro, Araxá, Cerrado e Campos das Vertentes. De acordo com a portaria n°694, de 17 de novembro de 2004, fica identificada a microrregião da Canastra como produtora do Queijo Minas
Artesanal, composta pelos municípios de Bambuí, Delfinópolis, Medeiros, Piumhi, São Roque de Minas, Tapiraí e Vargem Bonita. A região da Canastra localiza-se no sudoeste do Estado de Minas Gerais, limitando-se ao norte com a região do Triângulo Mineiro ao sul com a região do Lago de Furnas e a oeste com a região centro-oeste de Minas.
O processo de produção do queijo canastra ainda se mantem resistente a toda tecnologia atual, os produtores optam por produzir o queijo em pequenas queijarias sendo os funcionários os próprios habitantes do núcleo familiar. A adequação dos parâmetros que estabeleçam padrões de qualidade e higiene no processamento do queijo minas artesanal torna possível a comercialização segura desse produto que foi tombado como o primeiro bem imaterial do Estado de Minas Gerais (aprovada pelo decreto 42.645 de 5 de junho de 2002). A peculiaridade do queijo se dá por esse tradicionalismo na produção, como forma de fermento láctico ainda se é adicionado o “pingo” ao leite cru. (EMATER-MG, 2004) O “pingo” é o soro que foi fermentado durante o processamento do queijo e escorre pela bancada onde os produtores o armazenam em garrafas plásticas para utilizar posteriormente como fermento natural.
A maturação é a fase final da produção do queijo, além disso, o processo de maturação dos queijos pode contribuir com a redução de microrganismos patogênicos presentes nesse produto (BRANT e FONSECA, 2007; SILVA, 2006). Os derivados de leite, particularmente os queijos, são alimentos susceptíveis à diversos tipos de contaminações. E por não existir muito controle de fabricação, os queijos artesanais podem veicular diversos microrganismos patogênicos, ocasionando em surtos de infecção ou intoxicação de origem alimentar. Esses problemas tendem a agravar quando os queijos são processados com leite cru ou sem emprego de tecnologia e higiene adequado (OLIVEIRA et al., 2010).
As bactérias do grupo coliforme são consideradas como principais agentes contaminantes associados à deterioração de queijos, causando fermentações anormais e o estufamento precoce dos produtos (ALMEIDA & FRANCO, 2003). Algumas espécies de bactérias possuem a capacidade de inibir a patogenicidade de outras. Bactérias ácido-lácticas (BAL) são microrganismos gram-positivos, não esporulados e possuem crescimento em condições microaerofilas ou estritamente anaeróbicas. Os gêneros de Bactérias ácido-láticas mais comumente encontradas em queijos são: Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc e Enterococcus (BERESFORD et al., 2001). Ao serem empregadas na fermentação de alimentos são capazes de inibir ou reduzir a contaminação por microrganismos deteriorantes e/ou patogênicos, por meio da produção de vários agentes antimicrobianos (MAGRO et al., 2000).
Metagenômica é a análise genética diretamente dos genomas contidos em amostras ambientais, que se inicia com a extração do DNA e em seguida o sequenciamento dos genes, fornecendo acesso aos genes de comunidades microbianas possibilitando uma descrição mais ampla no campo da filogenética que são muitas vezes baseadas na amplificação de um gene especifico, como o 16S rRNA (THOMAS et al, 2012). A principal razão para o uso do rRNA é o fato que eles podem ser sintetizados rapidamente e diretamente por meio da enzima transcriptase reversa (WOESE, 1987). A reação de cadeia da Polimerase (PCR) é um processo de identificação rápido e eficiente envolvendo etapas como a extração do DNA e amplificação de uma sequência específica dos genes de bactérias. Segundo Brown (1998), a reação em cadeia da polimerase promove o aumento do número de cópias de um fragmento de DNA. A região do DNA a ser amplificada é determinada pelo par de primers ou iniciadores que são pequenas sequências de DNA construídas artificialmente, complementares e específicas a duas regiões distintas no DNA microbiano de interesse.
O objetivo desse trabalho foi identificar a dinâmica das populações bacterianas caracterizadas a partir dos seus gêneros durante o processo de produção do queijo minas artesanal da região da Serra da Canastra na cidade de Medeiros – Minas Gerais, utilizando da Metagenômica como fonte de identificação molecular com intuito de identificar os gêneros de microrganismos presentes em cada
etapa do processo de produção, compreender suas dinâmicas no processo de formação do queijo e em qual etapa do processo cada um desses grupos de microrganismos expressa sua maior frequência.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Genética e Evolução da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) na cidade de Belo Horizonte e no Laboratório de Biologia Molecular do Instituto Federal de Minas Gerais na cidade de Bambuí, no total foram sequenciadas 72 amostras de 12 etapas do processamento do queijo.
2.1 Delineamento amostral
Os locais de amostragem foram definidos com o auxílio da Prefeitura Municipal de Medeiros e da Associação de Produtores de Queijo Canastra de Medeiros (APROCAME). Foram definidos dois tipos de locais de amostragem: (1) três fazendas produtoras de queijo classificados com o padrão de qualidade da APROCAME, produtos de alto valor agregado (Fazendas: 1,3,4); e (2) três fazendas produtoras de queijo com produtos fora do padrão de qualidade, produtos de baixo valor agregado (Fazendas: 2,5,6).
2.2 Coleta amostral durante o processo de produção
Definido as queijarias que participariam deste trabalho foram escolhidos os locais e a quantidade de amostras que foram coletadas durante o processo de fabricação do queijo, sendo: Leite 200ml, massa do latão 50ml, massa do pano 50ml, queijo frescal 50ml, pingo 50ml, pano 3cm³ e o queijo maturado coletado como peça inteira. As amostras do latão onde o leite estava armazenado, da pá utilizada para quebra da massa, da mão do manipulador, da bancada de manipulação e da prateleira que são colocados os queijos para maturação foram coletadas com o uso de swabs esterilizados numa área pré-determinada de 20 cm² (moldes de 4x5 cm).
Após a ordenha o manipulador armazena o leite um latão, nesse instante foi coletado o leite e realizado o swab do latão. Em seguida o manipulador adiciona o coalho e o pingo ao leite que são misturados usando uma pá, momento em que foi coletado o pingo e realizado o swab na superfície da pá. Após cerca de 40 minutos ocorre à coagulação do leite onde foi realizado a amostragem da massa do latão ainda com soro. O leite coagulado é revolvido com ajuda da pá separando a massa e o soro. O soro é retirado do latão com o auxílio de um escorredor e uma vasilha e a massa é colocada nos panos que já estão distribuídos dentro das fôrmas que se encontram sob a bancada de manipulação, momento que foi realizado o swab da mão do manipulador, swab da bancada, amostragem da massa em contato com o pano e a amostragem do pano. O manipulador realiza pressões sobre o queijo com o intuito de remover o soro. Após moldado o pano é retirado deixando a massa em contato direto com a fôrma onde se adiciona o sal e o encerra o processo, neste momento foi retirado amostra do queijo frescal. Os queijos são mantidos na bancada por no máximo 24 horas, onde são transferidos para as tábuas de maturação que também foram amostradas através de Swab. Após a coleta, as amostras foram transportadas e mantidas sob refrigeração no Laboratório de Biologia Molecular (IFMG-Bambuí) até o seu processamento.
2.3 Preparação das amostras e processo de extração
Ao iniciar as extrações foi necessário pesar uma quantidade média das amostras, sendo: Queijo maturado 2,60g, Queijo frescal 1,71g, Massa latão 1,75g, massa pano 1,42g. Os swabs já foram padronizados em uma solução tampão de 1,5ml. No momento da extração foram transferidas as amostras dos swabs para um tubo eppendorf de 2ml onde foram centrifugados por 10 minutos a 13000rpm. O sobrenadante foi transferido de volta para o tubo original e armazenado para futuras necessidades. Após a pesagem foi necessário ralar e macerar as amostras.
Na preparação do leite para extração foram colocados 1ml de leite e 1ml de Etanol a 20% em tubos de 2ml, posteriormente as amostras foram centrifugadas a 3000g por 5min e o sobrenadante foi descartado. A extração do DNA de cada amostra foi realizada utilizando o kit comercial de extração de DNA ambiental E.Z.N.A.® Soil DNA Kit D5625-01 para 50 preparações, seguindo o protocolo disponibilizado pelo fabricante. A caracterização dos grupos bacterianos presentes foi realizada utilizando a amplificação e o sequenciamento da região V4 do gene de RNA ribossômico 16S utilizando o par de primers 515F – 806R. A análise bioinformática de avaliação das sequencias de DNA geradas foi realizada utilizando o software MOTHUR v.1.33.0 (SCHLOSS et al., 2009) e a detecção de quimeras com o software UCHIME (EDGAR et al., 2011). A classificação das sequências foi realizada utilizando o banco de dados SILVA v123 (QUAST et al. 2013) e as unidades taxonômicas operacionais (OTUs) foram geradas utilizando como critério 97% de similaridade entre as sequências e o método de agrupamento average neighbor.
As amostras extraídas foram quantificadas utilizando o Qubit 2.0, que é capaz de quantificar DNA, RNA e Proteínas usando alta sensibilidade à fluorescência. Para preparar a mistura utilizada na quantificação foram utilizados 199 µL de tampão e 0,01 µL de reagente, ambos acompanham o Kit do Quibt 2.0. Após o preparo da mistura, foi utilizado para quantificação 1µL de DNA e 199µL da mistura de leitura. A leitura é revelada em ng/µL. A PCR ocorreu conforme os protocolos do kit KAPA Library Quantification for Illumina e a eletroforese ocorreu usando o gel de agarose.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A análise metagenômica das amostras de cada etapa do processo de produção do Queijo Minas Artesanal tipo Canastra gerou cerca de um milhão de sequências de DNA adequada para análise. As dinâmicas de populações durante o processo de produção do queijo se mostram flutuantes em todas as fazendas, onde gêneros bacterianos como Pseudoxanthomonas, Aeromonas, Sphingomonas, Brevundimonas, Chryseobacterium e Actinomyces apresentaram frequência relativa alta em alguma etapa do processo de produção e baixa frequência relativa no queijo maturado.
A frequência relativa das 50 Unidades Taxonômicas Operacionais (OTUs) pode ser observada na Figura 1, que possibilita analisar os gêneros mais abundantes e onde eles são encontrados em cada etapa de produção.
No queijo fresco os grupos bacterianos se mostram mais abundantes quando se comparado com o queijo maturado, essa redução de gêneros mostra uma possível competição interespecífica por nutrientes. As bactérias ácido-lácticas foram encontradas em grande frequência nos queijos maturados, sendo o gênero Lactococcus o mais relativo em todas as fazendas. É possível perceber uma grande quantidade dessas bactérias presentes no “Pingo” utilizado pelos produtores, isso indica que esse fermento natural pode exercer uma forte influência na maturação do queijo.
Gêneros que podem conter bactérias patogênicas também foram encontrados em diferentes etapas do processo de produção como, Escherichia-Shingella, Klebsiella e Sthapylococcus. Alguns gêneros são encontrados diretamente nas instalações de produção como, Acinetobacter, Moraxella, Pseudoxanthomonas, Sthapylococcus e Sphingomonas. Durante o processo de maturação a prateleira pode contribuir com gêneros de microrganismos, somente a fazenda 4 utilizava de prateleira do tipo inox.
Nas fazendas de alto valor agregado (1,3,4) o número de Lactoccocus diminui consideravelmente durante o processo de maturação do queijo, ao contrário das fazendas de baixo valor agregado (2,5,6) onde o número de Lactoccocus aumenta no queijo maturado. O gênero Staphylococcus durante o processo de maturação apresenta perda de frequência relativa nos queijos maturados das fazendas de alto valor agregado, já nas fazendas de baixo valor agregado o número de frequência relativa encontradas no queijo maturado aumenta drasticamente o que exige um alerta visto que bactérias desse gênero, como Staphylococcus aureus, pode levar a intoxicação alimentar. O gênero Staphylococcus foi encontrado em todas as etapas do processo de produção.
Tabela 1- Unidades Taxonomicas Operacionais com frequência relativa em cada etapa do processo de produção do queijo, onde cada fazenda é representada por números de 1 a 6.
4. CONCLUSÃO
O tradicionalismo é o ingrediente principal na garantia de peculiaridade do queijo canastra. Com esse trabalho foi possível observar a riqueza de gêneros de microrganismos e como funciona a dinâmica dessas populações durante o processo de produção do queijo, analisando cada etapa do processo foi possível identificar onde cada gênero bacteriano atua. A competição interespecífica por nutrientes pode favorecer as bactérias ácido-láticas que são encontradas em sua maior abundância no “pingo”. O queijo maturado, que é o produto final, apresenta gêneros bacterianos em comum com os gêneros encontrados no “pingo”, essa relação mostra a proximidade do produto final com esse fermento natural. A análise comparativa mostrou diferenças na frequência relativa durante a maturação, o gênero Lactococcus em fazendas de alto valor agregado apresentou uma diminuição da frequência relativa quando se comparado com o queijo fresco onde a frequência de bactérias desse gênero aumentou. O gênero Staphylococcus obteve um aumento significativo na frequência relativa durante o processo de maturação nas fazendas de baixo valor agregado, o que pode ser preocupante uma vez que existem bactérias patogênicas nesse gênero. O “pingo” merece uma atenção especial principalmente pelos produtores visto que esse pode ser o componente que traz a peculiaridade ao queijo canastra.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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