Ana Paula Mendonça
Helena Souto
Kleber Neves
Luiza Erthal
-‐
Envelopados
-‐
7 genes -‐> 8 proteínas
no Ebola
-‐
RNA (-‐)
-‐
Nucleocapsídeo:
nucleoproteína (NP),
proteínas virais (VP35 e
VP30) e polimerase (L)
-‐
Matriz: VP40 e VP24
-‐
Envelope: proteína GP
Ito et al. 1999 Journal of Virology
Pep[deo de Fusão do Ebola
-‐ Induz fusão de membrana na presença de
fosfa\dilinositol na
membrana da célula e Ca++ durante processo.
Glicina-‐Alalina-‐Alanina-‐Isoleucina-‐Glicina-‐Leucina-‐Alanina-‐
Triptofano-‐Isoleucina-‐Prolina-‐Tirosina-‐Fenilalanina-‐Glicina-‐
Prolina-‐Alanina-‐Alanina
Pep[deo de fusão: W8A
triptofano
Estrutura
do pep[deo
de fusão do
Ebola em
micelas SDS
Freitas et al., 2007 The Journal of Biological Chemistry
Lipid Rads
Obje\vos
Estudar a importância das interações
aromá\cas-‐ aromá\cas na
estrutura do pep[deo
Estudar o papel do
colesterol durante a fusão de membranas
Interação do pep[deo de fusão WT e do mutante em células sem colesterol e rads isolados de
Modelo experimental
•
Vero
•
BHK-‐21
•
C636
Depleção de colesterol
Interação de pep[deo-‐ membrana
FT-‐IR
Microscopia de Força Atômica
Agregação de vesículas
Depleção de Colesterol X Viabilidade Celular
• Essencial para a replicação de filoviridae;
Depleção de Colesterol X Viabilidade Celular
Figura 1. Efeito do MβCD na viabilidade celular. (A) Depleção de colesterol.Células foram pre tratadas com MβCD por 30 min a 37°C, e a quan\dade de colesterol foi quan\fcada como descrito em materiais e métodos.(B) Viabilidade celular. Células foram incubadas com MβCD por 30 min a 37°C.
Interação de pep[deo-‐membrana
Interação de pep[deo-‐membrana
Figura 2. Interação Pep[deo-‐Membrana. (A) Células Vero foram incubadas com wtEBO16 a 25 (circulos) ou 37°C
(quadrados). A mistura de membrana diminuiu a razão excimero/monomero por 30 min. (B) Células viáveis na ausência (quadrado) ou na presença (círculos) de MβCD foram incubadas com wtEBO16 a 37°C. A mistura de membrana diminuiu a razão excimero/monomero por 30 min.
25°C 37°C
Presença de MβCD Ausência de MβCD
Estrutura secundária e membranas
Fourier Transform Infrared Spectroscopy
(A) 100% DMSO (B) 50% DMSO (C) PC (D) PC:PE:PI:Cho (E) PC:PE:SPM:Cho (F) DRM de Vero cells
Força da interação com a membrana
Atomic Force Microscopy (AFM)
Lyubchenko, 2011 - Micron
Agregação de vesículas induzida pelo
pep[deo de fusão do vírus Ebola
Lipossomas PC
wtEBO16 – agregação de lipossomas EBO16 W8A – não induziu agregação
Mutante + vesícula WT + vesícula
Lipossomas
PC:PE:PI:Cho
wtEBO16 e EBO16 W8A – não induziram agregação
Mutante + vesícula WT + vesícula
Lipossomas
PC:PE:SPM:Cho
wtEBO16 e EBO16 W8A – apenas uma pequena população > eficiência de ligação não suficiente para levar à agregação.
Mutante + vesícula WT + vesícula
Células BHK-‐21
lipid ra@s
Ambos induziram agregação.
EBO16 W8A – pequena população igual à original + diversos tamanhos de vesículas.
Mutante + vesícula WT + vesícula
Células Vero
lipid ra@s
wtEBO16 – grandes agregados (1690nm)
EBO16 W8A – duas populações de agregados (a menor ~597nm)
Mutante + vesícula WT + vesícula
Comportamento energé\co da
interação do pep[deo com a
membrana
• PC LUVs -‐ 100 mM de solução de wtEBO16 ou W8A
• Não houve saturação dos sí\os de ligação.
• Componente endotérmico: pode ser desestabilização da membrana e mudanças conformacionais.
