DETERMINAÇÃO DE ISOFLAVONAS NAS DIVERSAS ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO IOGURTE DE SOJA*

DETERMINAÇÃO DE ISOFLAVONAS NAS DIVERSAS

ETAPAS DO PROCESSAMENTO DO “IOGURTE” DE SOJA*

Elizeu A. ROSSI** Izabela ROSIER*** Ana R. DÂMASO**** Iracilda Z. CARLOS** Regina C. VENDRAMINI** Dulcineia S.P. ABDALLA*** Vânia H. TALARICO** Daniela F. MINTO**

*Trabalho executado com apoio financeiro da FAPESP (Proc. 99/12981-7).

**Depto. Alimentos e Nutrição - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/UNESP - 14801-902- Araraquara-SP- Brasil ***Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP - São Paulo - SP - Brasil

****Universidade Federal de São Carlos - 13565-905 - São Carlos - SP - Brasil

RESUMO: As isoflavonas presentes nos grãos de soja, substâncias capazes de exercer vários efeitos benéficos à saúde, entre eles o de reduzir os níveis de lípides séricos, podem ser sensivelmente afetadas pelas condições de processamento. Portanto, o objetivo do presente estudo foi quantificar as isoflavonas após as diversas etapas do processamento de um novo produto probiótico de soja fermentado com Enterococcus faecium e Lactobacillus jugurti, cuja ação hipocolesterolêmica já foi anteriormente demonstrada. As isoflavonas foram extraídas com mistura de metanol e ácido clorídrico (4:1) e quantificadas por cromatografia líquida de alta eficiência com coluna C18. As amostras foram coletadas em 10 etapas distintas do processo de obtenção do “iogurte” de soja. Os resultados mostraram que as isoflavonas glicosídicas apareceram em maior concentração em todas as amostras analisadas e que o processo de transformação da soja em “iogurte” ocasionou uma diminuição considerável de todas as formas de isoflavonas (glicosídicas e agliconas) fazendo com que o produto acabado apresentasse uma concentração cerca de 13 vezes menor que a verificada no grão “in natura”. O processo de fermentação não foi efetivo no sentido de promover a hidrólise das isoflavonas glicosídicas.

PALAVRAS-CHAVE: Soja; iogurte de soja; processa-mento; isoflavonas.

Introdução

Há algum tempo, a soja vem despertando grande interesse por parte dos pesquisadores em decorrência de uma correlação positiva entre o seu consumo e os diversos

efeitos benéficos à saúde. Nesse sentido, muitos estudos têm sido realizados demonstrando a ação preventiva e terapêutica d a s oj a em relação a vár ias do enças cr ôn ico -degenerativas, inclusive a hipercolesterolemia1, 13, 29_{. Tais}

p ro p riedad es s e d ev em a p r es ença de alg un s constituintes, entre eles as proteínas e, especialmente, as isoflavonas 4, 7, 30_.

Isoflavonas são fitoestrógenos ativos, capazes de exercer no organismo humano um fraco efeito hormonal e um potente efeito antioxidante que está associado, principalmente, a capacidade hipocolesterolêmica 23_.

A redução dos níveis séricos do colesterol total e de LDL com o consumo de produtos de soja tem sido evidenciada repetidamente em vários modelos animais e em humanos, onde a elevação do colesterol plasmático aparece como o principal fator de risco de doenças cardiovasculares 28_.

Entretanto, os processos tecnológicos empregados na obtenção de derivados de soja muitas vezes acabam por afetar as características do produto acabado, inclusive de alguns componentes que definem as suas propriedades profiláticas e terapêuticas, como é o caso das isoflavonas. Inúmeros trabalhos descritos na literatura científica têm demonstrado que a concentração e o perfil das isoflavonas também são alterados pelos diferentes tratamentos aplicados à soja na obtenção de diferentes produtos. Os tratamentos térmicos e os procedimentos aquosos são considerados como fatores significantes nesse aspecto 15, 16, 18 24, 26_.

Os resíduos resultantes dos processos de extração alcoólica, tais como os concentrados protéicos de soja, apresentam teores bastante baixos de isoflavonas 9_.

Coward et al 10_{, analisando a quantidade das}

diferentes formas de isoflavonas em uma variedade de grãos e produtos de soja, demonstraram a existência de 12 tipos de isoflavonas: 3 agliconas (genisteína, daidzeína e

gliciteína) e 9 glicosídeos (genistina, daidzina, glicitina, acetildaidzina, acetilgenistina, acetilglicitina, malonilgenistina, malonildaidzina e malonilglicitina) em diferentes concentrações. De acordo com os autores, a concentração dessas formas representa, de certa maneira, a história do processamento desses produtos, uma vez que a conversão de uma forma em outra pode ser decorrente do tratamento recebido.

Os efeitos das variações da matéria-prima e do processamento também foram observados no trabalho de Nakamura et al 18_{, os quais determinaram as concentrações}

de isoflavonas em 11 tipos de soja procedentes de diferentes países e em 12 produtos à base de soja amplamente consumidos no Japão. A variação de concentração nas sojas de diferentes procedências foi bastante acentuada, assim como nos diversos produtos analisados, sendo a concentração maior verificada no “kinako” (soja torrada em pó) e a menor no “soy-sauce” (molho de soja).

Em processos onde a soja permanece de molho em água, em temperatura ambiente, por tempos prolongados, também foi observada a perda das isoflavonas em torno de 11% e quando submetida ao cozimento às perdas chegavam a 50% 25_{, demonstrando que a solubilidade das isoflavonas}

aumenta com a temperatura.

Também o processo fermentativo pode alterar os níveis e formas das isoflavonas nos produtos acabados, fazendo com que as agliconas (genisteína e daidzeína) se apresentem em níveis mais altos como conseqüência da ação hidrolítica da -glicosidase própria de determinadas bactérias láticas utilizadas no processo 13, 17, 27_.

As modificações químicas nas isoflavonas ocasionadas pelos diferentes processamentos podem alterar as suas respectivas taxas de absorção e metabolismo, além de provocar mudanças nas características sensoriais e nas propriedades funcionais dos produtos que as contêm 3, 6, 10_.

Frente ao exposto, o objetivo desse trabalho foi quantificar as isoflavonas após as diversas etapas do processamento de um novo produto probiótico de soja fermentado com Enterococcus faecium e Lactobacillus jugurti, visando conhecer quanto e como o processo envolvido na obtenção desse alimento pode afetar os fitoestrógenos presentes na soja. Por outro lado, a realização desse estudo poderá auxiliar no entendimento da ação hipocolesterolêmica desse produto, já demonstrada por Rossi et al 21_.

Material e métodos Material

Constituído por amostras retiradas de 10 diferentes pontos do processamento do “iogurte” de soja (Figura 1), a saber: grãos de soja com casca; grãos de soja sem casca; grãos cozidos; água de cozimento; resíduo (“okara”); “leite” não pasteurizado; “leite” pasteurizado; mistura básica antes

do tratamento térmico (1); mistura básica após o tratamento térmico (2); “iogurte” de soja.

O procedimento foi repetido três vezes e amostras obtidas foram analisadas em triplicata.

Obtenção do “iogurte”

Foi obtido a partir de “leite” de soja produzido na UNISOJA - Unidade de Produção e Desenvolvimento de Derivados de Soja da Faculdade de Ciências Farmacêuticas/ UNESP, de acordo com a metodologia descrita por Rossi et al 20_.

Métodos

Quantificação das isoflavonas -Preparo das amostras:

Os grãos de soja, com casca e sem casca, bem como os grãos cozidos foram moídos, e, juntamente com o resíduo, foram secos em estufa a vácuo em temperatura d e 600_{C, até a o b ten ção d e pes o con s tan te e}

desengordurados com hexano, durante 10 horas em extrator de soxhlet 2_.

As amostras de “leite”, misturas básicas 1 e 2 e “iogurte” foram congeladas, liofilizadas, pulverizadas e desengorduradas com hexano, durante 10 horas em extrator de soxhlet 2_.

-Extração:

As amostras foram submetidas a uma extração feita com mistura metanol/HCl conc. (4:1), a partir de 0,5 g de amostra seca e desengordurada, sob agitação por 2 horas, seguida de centrifugação a 9000 rpm por 10 min à 40_{C. O}

sobrenadante foi filtrado em membrana de celulose acetato (0,45 µm) e uma alíquota de 5 mL foi coletada e seca sob fluxo de N₂ 22

.

-Separação e quantificação:

Realizada em cromatógrafo líquido (Shimadzu -Class VP), equipado com detector por arranjo de diodo, de acordo com as seguintes condições cromatográficas: coluna Hypersil ODS (C18) ( 250 x 4,6mm), da Supelco®, usando como fase móvel o gradiente linear: A = ácido acético em água ( 10: 90 v/v); B = metanol-acetonitrila-diclorometano (10: 5: 1 v/v); B em A a 10% por 5 minutos, de 10% para 45% em 10 minutos, de 45% para 70% em 10 minutos, e de 70% a 10% em 3 minutos, permanecendo por 7 minutos. Tempo total de corrida: 35 minutos. A vazão foi de 0,8 mL/ minuto. As amostras foram injetadas em triplicata e as isoflavonas (daidzeína, daidzina, genesteína, genestina, gliciteína e glicitina) foram monitoradas em 262nm 12_{. A}

identificação foi feita a partir da comparação dos tempos de retenção e dos espectros entre as amostras e os padrões e

a quantificação, por padronização externa. Todos os padrões foram de procedência Indofine Chemical Company, Inc. e os reagentes e solventes empregados foram de grau analítico e grau cromatográfico. Os resultados foram expressos em mg de isoflavona/100g de amostra integral (b.u.).

Análise estatística dos dados

Os resultados foram submetidos à análise de variância e testes de médias de Tukey para p 0, 05, utilizando o programa estatístico SAS.

FIGURA 1 - Fluxograma de processamento do “iogurte” de soja, com indicação dos materiais que foram coletados durante

o processo, para quantificação das isoflavonas. Descascadeira Tanque de cozimento Unidade de Extração H2O Açúcar

RESÍDUO DE SOJA RESÍDUO DE SOJA “OKARA”

Resultados e discussão

Os resultados mostram que concentração total de isoflavonas no grão de soja foi de 66,60 mg/ 100 gramas de amostra integral (b.u.) (Tabela 1 e Figura 2), concentração esta concordante com as encontrados na literatura. Carrão-Panizzi et al 5 _{encontraram concentrações de isoflavonas}

totais em soja variando entre 82 a 120 mg/100g, devido às variações de solo e de temperatura do local de cultivo e, verificaram também, concentrações entre 54 e 147 mg/100g, decorrente das diferenças de variedades.

É sabido que tanto as concentrações quanto às formas de isoflavonas na soja, podem sofrer grandes variações decorrentes de uma série de fatores, tais como a variedade do grão, a região e época de cultivo, as condições climáticas e, inclusive, as condições de processamento, com ênfase nos tempos e temperaturas empregados nos tratamentos térmicos 11, 19_.

N a Tab ela 1 s ão tamb ém ap r es entadas as concentrações individuais das isoflavonas pesquisadas nas amostras integrais (b.u.), relativas às diferentes fases do processo de obtenção do “iogurte” de soja. Pode-se verificar que a genistina foi a isoflavona que apareceu em maior concentração nas amostras referentes a todas as fases do processamento, seguida da daidzina e glicitina, todas glicosídicas. Já as formas agliconas apareceram em concentrações bem menores. Tais observações são interessantes uma vez que as formas agliconas são as responsáveis pelo sabor amargo e adstringente normalmente verificados nos derivados de soja, condição que determina uma menor aceitação desses produtos 2, 3, 6_.

A casca, que representa uma fração muito pequena do grão, quando retirada (tratamento 2) não ocasionou uma diferença significativa no teor total de isoflavonas em relação ao grão com casca (tabela 1). Esse resultado era esperado, uma vez que as isoflavonas concentram-se principalmente no hipocótilo, seguido do cotilédone do grão e muito pouco na casca 11_.

Após a realização da etapa de cozimento, feita a 950_{C/7 minutos (tratamento 3), verifica-se que a}

concentração de isoflavonas se mostrou consideravelmente menor em relação ao grão cru, fato que pode ser explicado em parte pela hidratação do grão, diluindo a concentração original, e em parte pela migração dessas isoflavonas para a água de cozimento. Todas as isoflavonas foram detectadas na água de cozimento que apresentou uma concentração total de 7,77 mg de isoflavonas /100g de amostra (tratamento 4).

Choi & Sohn 8 _{encontraram níveis muito baixos de}

isoflavonas em “leite” de soja, em parte como conseqüência da migração desses compostos para a água durante a etapa de cozimento.

Wang et al 25_{, observaram que grãos de soja quando}

permanecem de molho na água em temperatura próxima de ebulição, por tempos prolongados, a perda de isoflavonas pode chegar a 50%, também devido a migração das mesmas para água de hidratação.

O resíduo da soja, também denominado de “okara”, (tratamento 5), apresenta uma considerável concentração de todas as isoflavonas pesquisadas, justificando, em parte, os teores mais baixos verificados tanto no “leite”, como no produto acabado (“iogurte”). Entretanto, a incorporação de água ao extrato hidrossolúvel da soja, na proporção de 1 : 6,

Tratam. daidzina glicitina genistina daidzeína gliciteína genisteína Total

1 12,44a 2,27 8,35a 0,31 43,38a 0,31 0,52a 0,03 1,17a 0,23 0,74a 0,20 66,60a 3,30 2 14,30a 0,47 7,71a 0,54 46,98a 1,72 0,62a 0,09 1,39a 0,29 0,82a 0,06 71,82a 3,60 3 8,54b 0,72 3,73b 0,13 30,11b 0,39 0,37b 0,02 0,39b 0,06 0,94a 0,14 44,08b 1,38 4 2,22c 0,04 0,98c 0,04 4,49d 0,08 0,03d 0,00 0,03c 0,00 0,02b 0,00 7,77d 0,10 5 3,53c 0,08 1,70c 0,03 8,44c 0,91 0,27bc 0,04 0,24b 0,03 0,09b 0,00 14,27c 1,11 6 1,47d 0,19 1,10c 0,08 4,41d 0,48 0,02d 0,00 0,34b 0,01 0,05b 0,01 7,05d 0,73 7 0,89e 0,02 1,31c 0,31 4,45d 0,46 0,02d 0,00 0,40b 0,04 0,07b 0,00 7,15d 0,70 8 1,07e 0,03 0,33d 0,01 3,56d 0,12 0,05d 0,00 0,02c 0,00 0,07b 0,00 5,10e 0,22 9 1,06e 0,04 0,33d 0,01 3,69d 0,12 0,04d 0,00 0,03c 0,00 0,07b 0,01 5,22e 0,21 10 0,98e 0,03 0,37d 0,03 3,72d 0,06 0,04d 0,00 0,04c 0,01 0,09b 0,04 5,24e 0,11

- Os valores apresentados referem-se às médias desvios-padrão de 9 determinações

- Médias com letras iguais numa mesma coluna não diferem significativamente entre si (p 0,05).

1 = soja com casca; 2 = soja sem casca; 3 = soja cozida; 4=água de cozimento 5 = resíduo; 6= “leite" não pasteurizado; 7= "leite" pasteurizado; 8 = mistura básica (1); 9 = mistura básica (2); 10 = produto acabado ("iogurte" de soja).

Tabela 1 - Concentração de isoflavonas (mg/100g de amostra integral) nas diversas etapas do processamento do “iogurte” de soja.

durante o processamento desses produtos certamente representa a principal causa das baixas concentrações observadas.

Para os “leites” não pasteurizado e pasteurizado, foram encontrados valores de 7,05 e 7,15 mg de isoflavonas totais/100g, respectivamente, evidenciando uma concentração bastante baixa em relação ao grão íntegro. Nota-se que o processo de pasteurização não provocou nenhuma alteração significativa no teor total de isoflavonas.

Outros autores também verificaram concentrações baixas de isoflavonas em “leite” de soja. Coward et al 10_,

por exemplo, encontraram um teor de 9,6 mg/100g para “leite” de soja integral de procedência comercial. Esse teor ligeiramente superior ao verificado em nosso estudo pode ser reflexo de vários fatores, tais como variedade da soja utilizada e mesmo do tipo de processo empregado, situações não descritas pelos autores.

Fato interessante foi o observado nas amostras referentes aos tratamentos 8, 9 e 10, que apresentaram as 3 formas glicosídicas e as 3 agliconas sem diferenças significativas. Isso indica que o processo fermentativo não foi capaz de promover a hidrólise das formas glicosídicas, aumentando as agliconas, ao contrário dos relatos de Fukutake et al 13_{, o que permite concluir que as cepas dos}

microrganismos utilizadas no processo fermentativo (E. faecium e L. jugurti) não são produtoras da enzima ß-glicosidase. Por outro lado, verificou-se uma diminuição na concentração total de isoflavonas no produto final (“iogurte”) em relação aos “leites” (cerca de 27%), provavelmente devido aos demais ingredientes adicionados à mistura básica, o que ocasionou, mais uma vez, uma diluição das concentrações dos componentes do “leite”, inclusive das isoflavonas.

Concentração total de Isoflavonas

0 25 50 75 100 Tratamentos C o n c e n tr a ç ã o (m g /1 0 0 g

) Soja com casca

Soja sem casca Soja cozida

"Leite" não pasteurizado "Leite" pasteurizado Mistura básica (1) Mistura básica (2) "Iogurte" de soja

De maneira geral, os resultados mostraram que o processo de transformação da soja em “leite” e deste em “iogurte, determina concentrações totais de isoflavonas, da ordem de 10 e 13 vezes mais baixas, respectivamente, em relação ao teor verificado no grão integral, conforme mostra a Figura 2. Essas diferenças, como já mencionado anteriormente, se devem a diversos fatores, dentre eles a diluição de constituintes provocada pela hidratação do grão, incorporação de água e adição de outros ingredientes isentos de isoflavonas, como também a perdas, propriamente ditas, desses fitoestrógenos que ocorreram em parte devido a migração para água de cozimento e, em parte, pela retenção no resíduo (“okara”).

Frente a esses resultados, pode-se afirmar que tanto o “leite” quanto o “iogurte” não se constituem numa fonte adequada de isoflavonas, uma vez que, para a obtenção dos efeitos benéficos à saúde, é recomendada uma ingestão mínima em torno de 50 mg/dia 14_.

Portanto, é possível supor que o efeito hipocolesterolêmico do ”iogurte“ de soja, já observado por Rossi et al 21_{, não é devido à presença das isoflavonas, mas}

provavelmente da ação específica dos microrganismos utilizados na fermentação do produto.

Conclusões

O processo de transformação da soja em “iogurte” ocasionou uma diminuição considerável de todas as formas de isoflavonas (glicosídicas e agliconas) fazendo com que o produto acabado apresentasse uma concentração cerca de 13 vezes menor que a verificada no grão “in natura”. O processo de fermentação não foi efetivo no sentido de promover a hidrólise das isoflavonas glicosídicas.

FIGURA 2 - Concentração total de isoflavonas (mg/100g) nas amostras integrais correspondentes as diferentes etapas do processamento do produto fermentado (“iogurte” de soja).

ROSSI, E.A.; ROSIER, I; DAMASO, A.R.; CARLOS, I.Z.; VENDRAMINI, R.C.; ABDALLA, D.S.P.; TALARICO, V.H.; MINTO, D.F. Quantification of isoflavones in differents phases of the soy yogurt processing. Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 2, p. 93-99, 2004.

ABSTRACT: The isoflavones present in soybean are able to exert several benefical health effects, such as to reduce the seric lipid levels, but they can be extensively affected by the processing conditions. Thus, the objective of this study was to determine the isoflavones content in different phases of the soy yogurt processing: a new functional food fermented with Enterococcus faecium and Lactobacillus jugurti, whose hypocholesterolaemic action had already been stablished. The isoflavones were extracted from 10 different phases of the soy yogurt processing by a mix methanol/HCl (4:1) and quantified by HPLC with a C18 column. The results showed that all the samples contained a bigger concentration of glycosides isoflavones and the process employed to obtain the soy yogurt determined a significant decrease of all isoflavones forms (13 times smaller than in raw soybean). The fermentation process was not effective in order to determine the hydrolysis of conjugate isoflavones.

KEYWORDS: Soy; soy-yogurt; processing conditions; isoflavones

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