UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE CEILÂNDIA – FCE/ UNB
CURSO DE FARMÁCIA
FÁBYA NEPOMUCENO DE LIMA
SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS DE BACTÉRIAS SALMONELLA ENTERICA ISOLADAS DE CARNES DE FRANGO COMERCIALIZADAS NO
DISTRITO FEDERAL
BRASÍLIA, DF 2018
2 FÁBYA NEPOMUCENO DE LIMA
SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS DE BACTÉRIAS SALMONELLA ENTERICA ISOLADAS DE CARNES DE FRANGO COMERCIALIZADAS NO
DISTRITO FEDERAL
Orientador: Profa. Dra. Daniela Castilho Orsi
Co-orientador: Profa. Dra. Izabel Cristina Rodrigues da Silva
BRASÍLIA, DF 2018
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado como requisito para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia, na Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia.
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4 FÁBYA NEPOMUCENO DE LIMA
SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS DE BACTÉRIAS SALMONELLA ENTERICA ISOLADAS DE CARNES DE FRANGO COMERCIALIZADAS NO
DISTRITO FEDERAL
BANCA EXAMINADORA
Orientadora: Profa. Dra. Daniela Castilho Orsi (FCE/ Universidade de Brasília)
___________________________________________________
Profa. Dra. Izabel Cristina Rodrigues da Silva (FCE/ Universidade de Brasília)
__________________________________________________
Prof. Msc. Daniel Oliveira Freire (Faculdade LS/ Brasília)
BRASÍLIA, DF 2018
5 AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, que foi minha maior força nos momentos de angústia e desespero. Sem ele, nada disso seria possível. A fé que tenho em ti alimentou meu foco, minha força e minha disciplina, abençoando o meu caminho durante minha graduação e elaboração deste trabalho.
Sou grata à minha família, avós, tios e primos, que sempre confiaram no meu potencial e nunca desistiram de mim. Em especial, agradeço à minha mãe, Flávia Ferreira Nepomuceno, por tranquilizar meu coração com gestos e palavras nos momentos de estresse; ao meu pai, Reginaldo Ferreira de Lima, por ser meu maior exemplo e fonte de inspiração, e ao meu irmão, Pedro Henrique Ferreira de Lima, que sempre esteve na minha torcida apesar de todas as circunstâncias. Vocês são meus maiores bens na Terra, foram minha base e alicerce durante essa importante fase da minha vida.
Às minhas orientadoras, Daniela Castilho Orsi e Izabel Cristina Rodrigues, pelas valiosas contribuições nesta pesquisa, me proporcionando a chance de expandir meus horizontes. Sou grata a elas pela total dedicação não só durante a construção deste trabalho, mas ao longo de toda a minha jornada acadêmica, me instruindo de maneira sábia e honrosa. Agradeço a disposição do Professor Daniel Oliveira Freire, em aceitar meu convite e participar da banca de avaliadores, vindo a acrescentar com seus imensuráveis conhecimentos.
Obrigada, aos verdadeiros amigos, que me deram apoio e incentivo, e que permaneceram fielmente ao meu lado, compreendendo e respeitando o meu necessário distanciamento e noites em claro atrás de livros e computadores.
6 RESUMO
No Brasil, apesar do programa de controle e monitoramento de Salmonella spp. na produção avícola, essa bactéria continua a ser um dos patógenos mais identificados em produtos avícolas expostos ao consumo. O objetivo deste trabalho foi determinar a presença de Salmonella spp. em carnes de frango comercializadas em supermercados do Distrito Federal e traçar seu perfil de susceptibilidade a antimicrobianos. Foram coletadas 18 amostras de carne de frango resfriadas de diferentes cortes (peito, coxa, sobrecoxa, coxinha da asa, asa, filé e miúdos). Foram realizados testes bioquímicos para triagem de Salmonella spp. e os isolados suspeitos foram identificados através da técnica de PCR. A susceptibilidade das cepas aos antimicrobianos foi avaliada pela técnica de disco-difusão (método de Kirby-Bauer). O presente estudo mostrou alta prevalência de Salmonella enterica nas carnes de frango (10 amostras positivas de 18 amostras analisadas, ou seja, 55,6% de positividade). Todos os isolados de Salmonella apresentaram o gene invA após análise molecular. Das 24 cepas testadas, os antibióticos aos quais as cepas apresentaram maior resistência foram: tetraciclina, amoxacilina com ácido clavulânico e sulfonamida. Nove cepas (37,5%) classificaram-se como multirresistentes, isto é, cepas resistentes ou com resistência intermediária a três antibióticos ou mais. A utilização de antibióticos na medicina veterinária de forma indiscriminada leva a indução de cepas resistentes/multirresistentes com a possibilidade de transmissão tanto para outras aves quanto para homens saudáveis, gerando prejuízos financeiros aos abatedouros e à saúde pública.
Palavras-chave: Frango de Corte. Contaminação de Alimentos. Salmonella enterica. Antibiograma. Cepas Resistentes.
7 ABSTRACT
In Brazil, despite the control and monitoring program of Salmonella spp. in poultry production, this bacterium continues to be one of the most identified pathogens in poultry products exposed to consumption. The objective of this work was to determine the presence of Salmonella spp. in chicken meat commercialized in supermarkets in the Federal District and to trace their antimicrobial susceptibility profile. Eighteen samples of chilled chicken meat were collected from different cuts (breast, thigh, leg quarter, wing, fillet and hearts, livers and gizzards). Biochemical tests were performed to isolate Salmonella spp. and the suspected isolates were identified using the PCR technique. The susceptibility of the strains to the antimicrobials was evaluated by the disc-diffusion technique (Kirby-Bauer method).
The present study showed a high prevalence of Salmonella enterica in chicken meat (10 positive samples from 18 samples analyzed, ie 55.6% positive). All Salmonella isolates showed the invA gene after molecular analysis. Of the 24 strains tested, the antibiotics to which the strains showed the greatest resistance were: tetracycline, amoxicillin with clavulanic acid and sulfonamide. Nine strains (37.5%) were classified as multiresistant, ie strains resistant or with intermediate resistance to three or more antibiotics. The use of antibiotics in veterinary medicine indiscriminately leads to the induction of resistant / multiresistant strains with the possibility of transmission to other healthy birds and men, causing financial losses to slaughterhouses and public health. The use of antibiotics in veterinary medicine indiscriminately leads to the induction of resistant / multiresistant strains with the possibility of transmission to other healthy birds and men, causing financial losses to slaughterhouses and public health.
Keywords: Broiler Chicken. Food Contamination. Salmonella enterica. Antibiogram.
Resistant strains.
8 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 11
1.1 Produção e consumo de carne de frango no Brasil ... 11
1.2. Características do gênero Salmonella spp. ...13
1.3 Salmonella spp. na cadeia produtiva do frango de corte. ... 14
1.4 Legislação brasileira. ... 15
1.5 Uso da biologia molecular na identificação de Salmonella spp. ... 16
1.6 Salmonella spp. e resistência aos antimicrobianos. ... 17
2. OBJETIVOS ... 20
2.1 Objetivo geral ... 20
2.2 Objetivos específicos ... 20
3. JUSTIFICATIVA ... 21
4. ARTIGO ELABORADO CONFORME AS NORMAS DE SUBMISSÃO DA REVISTA HIGIENE ALIMENTAR ... ...22
5. MATERIAL E MÉTODOS ... 25
5.1 Coleta, preparo das amostras e análises microbiológicas ... 25
5.2 Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos das bactérias isoladas ... 26
5.3 Análises moleculares ... 27
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 28
7. CONCLUSÃO ... 33
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO ARTIGO ... 34
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA REVISÃO DE LITERATURA ... 37
10. ANEXOS ... 42
9 LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequência do primer e tamanho do produto amplificado na PCR para
identificação do gene invA... 26
Tabela 2. Prevalência de bactérias Salmonella enterica isoladas nas amostras de carne de frango... 27
Tabela 3. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das bactérias Salmonella enterica isoladas das amostras de carnes de frango... 29
Tabela 4. Número de cepas de Salmonella enterica isoladas de carne de frango com resistência aos antimicrobianos testados... 30
Tabela 5. Perfis de resistência antimicrobiana das cepas de Salmonella enterica isoladas de carne de frango... 31
LISTA DE ANEXOS ANEXO 1. Triagem para Salmonella spp. com os meios SS e XLD... 41
ANEXO 2. Culturas puras, nos meios XLD e SS... 41
ANEXO 3. FA, Teste bioquímico para confirmação de Salmonella... 42
ANEXO 4. LIA, Teste bioquímico para confirmação de Salmonella... 42
ANEXO 5. Antibiograma, Técnica kirby-Bauer... 42
ANEXO 6. Eletroforese em gel de agarose dos produtos de PCR... 43
ANEXO 7. Genoma de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Java strain NCTC5706... 44 ANEXO 8. Sequência do primer para Salmonella enterica subsp. enterica... 45
ANEXO 9. Região genômica correspondente ao primer deste estudo mostrando Salmonella enterica subsp. enterica... 47 ANEXO 10. NORMAS DE SUBMISSÃO PARA A REVISTA HIGIENE ALIMENTAR... 54
10 LISTA DE ABREVIATURAS
APPCC (HACCP, em inglês) – Análises de Perigo e Pontos Críticos de Controle ABPA – Associação Brasileira de Proteína Animal
BHI – Brain Heart Infusion
DTA – Doenças Transmitidas por Alimentos
EFSA – Autoridade Europeia para a Segurança dos Alimentos FA – Fenilalanina
FAO – Food and Agriculture Organization of the United Nations g – gramas
ºC- grau Celsius
GTA – Guia de Trânsito Animal hs – horas
H2S – ácido sulfídrico
IPS-1(SPI-1, sigla em inglês) – Ilhas de patogenicidade em Salmonella spp.
LIA – Lisina Iron Agar
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento mL - mililitros
OMS – Organização Mundial de Saúde SCV – Vacúolo que contém Salmonella spp.
SIFs – Filamentos Induzidos por Salmonella spp.
Subsp. – Subespécie SS – Salmonella Shigella
SVE – Serviço Veterinário Estadual SVO – Serviço Veterinário Oficial SIF – Serviço de Inspeção Federal TSI – Três Açúcares e Ferro
UE – União Europeia
PCR – Reação em Cadeia de Polimerase XLD – ágar Xilose-Lisina-Desoxicolato
11 1. INTRODUÇÃO
1.1. Salmonella na cadeia produtiva do frango de corte
A disseminação do patógeno Salmonella spp. em ambiente avícola possui diversas fontes de transmissão dentro da cadeia de produção do frango de corte, sendo assim, de complexa epidemiologia, o que torna difícil a identificação dos fatores favorecedores da contaminação. A rastreabilidade do ponto inicial da contaminação envolve todo o processo de produção, desde o confinamento na granja, transporte das aves e o ambiente industrial de abate e processamento da carne de frango (BRASIL, 2012; MENDONÇA, 2016; TESSARI & CARDOSO, 2015).
A contaminação das aves por Salmonella spp. em uma granja pode ter várias possibilidades de origem, como exemplo se define o ciclo vertical, em que aves positivas transmitem o microrganismo à sua progênie, isto é, se estabelece pela contaminação inicial no momento da passagem do ovo pela cloaca contendo a presença do patógeno e se estende progressivamente ao longo de toda a cadeia produtiva até o produto final no frigorífico. Já o ciclo horizontal se estabelece nas empresas avícolas através do consumo de rações positivas pelas aves, sendo estas compostas de matéria-prima, geralmente de origem animal, contaminada por salmonela. Possíveis fontes de infecção também incluem fômites, equipamentos, roupas e indivíduos colaboradores, portando a bactéria Salmonella spp. (BACK, 2010; HERMANN, 2012; TESSARI & CARDOSO, 2015).
O ceco é o principal local de colonização da Salmonella spp. em aves, havendo, portanto, uma infecção oro-fecal em função da presença da bactéria no meio ambiente avícola. O mecanismo de invasão no animal inclui a atração de leucócitos a partir da infestação de células epiteliais, iniciando deste modo a fase sistêmica da infecção, e a consequente distribuição bacteriana aos demais órgãos como baço e fígado, onde geralmente há o isolamento da bactéria (MUNIZ et al., 2012).
O processo de abate inclui a insensibilização das aves, escaldação, depenação, evisceração, lavagem interna e externa, para então, a submissão ao pré-resfriamento, processo que se baseia no rebaixamento da temperatura das
12 carcaças por meio de imersão em água gelada ou pela passagem em túnel de resfriamento (chiller). O “chiller” é caracterizado por resfriadores contínuos no qual as carcaças são imersas em água fria e este é o método mais usado no Brasil e garante que o objetivo de manter a temperatura igual ou inferior à 7ºC das carcaças seja alcançado com êxito. As etapas de resfriamento visam garantir uma redução na carga bacteriana, entretanto qualquer desvio na temperatura ou na cloração de água pode gerar um efeito oposto ao desejado, aumentando desta forma a contaminação de carcaças (NICOLAU, 2016).
Uma preocupação sanitária a respeito da Salmonella inclui a capacidade de formar biofilmes em frigoríficos, atribuição que se expande para diversos tipos de superfícies, sejam elas bióticas (células, plantas) ou abióticas (aço, plástico), isto é, cepas de Salmonella permanecem no ambiente a partir da promoção de biofilmes em superfícies inertes (STEENACKERS et al. 2012). A formação de biofilmes no ambiente de abate se faz um ponto alarmante na precaução da disseminação da Salmonella, sendo complicado remover as bactérias do ambiente quando se tem formação de biofilme (MENDONÇA, 2016).
Visto a tamanha complexidade para uma cadeia de produção avícola saudável, se faz necessário à adoção de medidas preventivas, incluindo cuidados minuciosos com as aves de abatedouro. Esses cuidados englobam práticas de controle microbiológico das rações oferecidas aos animais e adoção de medidas higiênico-sanitárias durante a criação, manuseio, abate, armazenamento, processamento e transporte da carne. Em conjunto, é de suma importância à implementação de programas de boas práticas de fabricação e biosseguridade para devida prevenção de contaminações cruzadas, havendo consequentemente a redução nos níveis de contaminação das carcaças com Salmonella spp.
(MENDONÇA, 2016; SANTOS et al., 2013).
13 1.2. Características do gênero Salmonella spp.
A taxonomia do gênero Salmonella spp. engloba a família Enterobacteriaceae e compreende bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos, não produtores de esporos. As bactérias Salmonella spp. de forma geral, são capazes de utilizar citrato como única fonte única de carbono, e com exceção da S. entérica typhimurium, produzem gás a partir da glicose (GUIBOURDENCHE et al., 2010; FILHO, 2013;
MARTINS, 2015).
Salmonella spp. é definida como termossensível, à medida que pode ser destruída na faixa de 60ºC no período de 15 a 20 minutos (RODRIGUES, 2016). Sua temperatura ideal para crescimento envolve a faixa de 35 a 43°C, apresentando maior desenvolvimento em 37°C e extremos variando de 5 a 46°C, desta forma é capaz de sobreviver por períodos extensos de refrigeração e, particularmente, pode sobreviver ao congelamento em alimentos de origem animal. Suas concentrações tendem a declinar durante o armazenamento por congelamento na temperatura dentro de -2 a -5°C (NICOLAU, 2016; REVOLLEDO, 2008).
Quanto ao pH ideal para crescimento de Salmonella, a faixa entre 6,6 e 8,2 é a de maior aceitação, sendo os valores superiores a 9,0 e abaixo de 4,0 considerados como bactericidas. Os valores da atividade de água favoráveis ao crescimento da bactéria podem possuir variações entre sorovares ou de acordo com a inter-relação entre diferentes fatores, mas, em sua maioria englobam a faixa entre 0,94 a 0,99 (BRASIL, 2012; NICOLAU, 2016).
O gênero Salmonella spp. envolve duas espécies, a Salmonella bongori, a qual usualmente é isolada de animais de sangue frio, e a Salmonella enterica, a qual é comumente isolada do homem e de animais de sangue quente (GUIBOURDENCHE et al., 2010; FILHO, 2013; MARTINS, 2015).
A Salmonella enterica é subdivida em seis subespécies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica, sendo que diversos sorovares são reconhecidos em cada subespécie de acordo com a caracterização de antígenos somáticos (O) e flagelares (H), contabilizando no total 2.610 sorovares distribuídos
14 na seguinte proporção: Salmonella enterica subsp. enterica (1.547 sorovares);
Salmonella enterica subsp salamae (513 sorovares); Salmonella enterica subsp arizonae (100 sorovares); Salmonella enterica subsp diarizonae (341 sorovares);
Salmonella enterica subsp houtenae (73 sorovares) e Salmonella enterica subsp.
indica (13 sorovares) (RODRIGUES, 2011; GUIBOURDENCHE et al., 2010).
Os sorotipos podem ser diferenciados a partir de seus antígenos somáticos (O), capsulares (Vi) e flagelares (H). A Salmonella pode causar nas aves as infecções agudas e crônicas, sendo clinicamente classificadas em três principais enfermidades: tifo aviário (causado por Salmonella Gallinarum), pulorose (causada por Salmonella Pullorum) e infecções paratíficas, causando prejuízos imensos à avicultura. Estas cepas de Salmonella são hospedeiro-específicas, se equiparando a outras que afetam distintas espécies como Salmonella Paratyphi e Salmonella Typhi em humanos, Salmonella Dublin em bovinos e Salmonella Cholerae-suis em suínos (REVOLLEDO, 2008; SANTOS, et. al., 2013).
1.3. Legislação brasileira
As toxinfecções alimentares são alarmantes no ramo da indústria alimentícia, estando a salmonelose entre as patologias mais frequentes. Portando, toda a cadeia alimentar desde a criação dos animais, produção, armazenamento e distribuição do alimento deve possuir um controle de qualidade efetivo estabelecido a partir de um programa de segurança alimentar, a fim de aumentar a qualidade e a segurança dos alimentos produzidos. O Codex Alimentarius é um programa conjunto entre a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e a Alimentação (FAO) e a Organização Mundial da Saúde (OMS), de caráter internacional, onde constam as normas, diretrizes, padrões e recomendações relacionados à qualidade e inocuidade dos alimentos (SANTOS, 2013; TESSARI & CARDOSO, 2015).
No âmbito nacional é estabelecida a utilização de programas, como o BPP (Boas Práticas de Produção) e APPCC (Análise dos Perigos e Pontos Críticos de Controle), ambos relatados pela portaria nº 1428/93 dos Ministérios da Saúde e da Agricultura, para inspeção de todo o processo de produção da indústria de alimentos (TESSARI & CARDOSO, 2015).
15 Visando reduzir a disseminação da salmonelose, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento decretou outras portarias baseadas no Codex Alimentarius em distintos segmentos veiculados à indústria de frangos (TESSARI &
CARDOSO, 2015). O guia de trânsito de animais (GTA) exerce a fiscalização e controle de aves no momento em que exige o registro, pelo Ministério da Agricultura, constando o local de saída e chegada dos animais (SANTOS, 2013).
O “Programa de redução de patógenos: Monitoramento microbiológico e controle de Salmonella spp. em carcaças de frangos e perus”, estabelecido através das Instruções Normativas nº. 70 e nº. 20 é embasado nos princípios de Boas Práticas de Fabricação (BPF), Procedimento Padrão de Higiene Operacional (PPHO) e a Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), a fim de conferir um controle minucioso sobre o processo de abate e atentar simultaneamente às exigências de segurança do alimento (BRASIL, 2016; BRASIL, 2013; SANTOS, 2013).
1.4. Biologia molecular na identificação de Salmonella spp.
Na microbiologia convencional, através do isolamento da bactéria é possível a sua identificação. As colônias suspeitas de serem Salmonella spp. devem ser submetidas a testes bioquímicos capazes de indicar qual o gênero pertencente. As amostras identificadas bioquimicamente como Salmonella spp. são submetidas a testes sorológicos com antisoros polivalentes (anti “O” e “H”) para determinação do sorotipo (TESSARI & CARDOSO, 2015).
Na biologia molecular, as ferramentas de diagnóstico são baseadas na análise de DNA e possuem relevância no estudo epidemiológico de Salmonella spp.
Os métodos de tipagem molecular têm sido muito utilizados na caracterização bacteriana. A partir dessas técnicas é possível analisar diferenças e similaridades entre cepas bacterianas, além de verificar a origem e disseminação das cepas. Os dados resultantes destas análises levam ao rastreamento de determinado microrganismo em investigações epidemiológicas, fornecendo informações importantes sobre a característica do patógeno (MENDONÇA, 2016).
16 A ribotipagem é um exemplo que tem sido adotada pelos laboratórios de referência mundial, como um método molecular para investigação epidemiológica e detecção da fonte de infecção. Possui propriedade para identificar cepas envolvidas na infecção humana, monitorar a disseminação de Salmonella dentro da cadeia produtiva de alimentos e dar informações epidemiológicas sobre as relações genéticas entre sorotipos. Tem como princípio avaliar o polimorfismo do DNA bacteriano na região onde se localiza o operon rrn, composto pelos genes 16S e 23S, codificadores do RNAr bacteriano. Estes genes aparecem em inúmeras cópias e sítios diversos no genoma, com diferentes regiões de flanqueamento, resultando em elevada variabilidade das regiões entre os genes 16S e 23S. A ribotipagem permite avaliar e comparar os perfis de bandas resultantes para, desta forma, determinar sua relação filogenética e evolucionária (MARTINEZ & TADDEI, 2008;
MENDONÇA, 2016).
1.5. Fatores de virulência de Salmonella spp.
As bactérias patogênicas são diferenciadas através da expressão de genes que codificam os fatores de virulência, estes possibilitam que o patógeno invada e desabilite a imunidade e infecte o hospedeiro (MENDONÇA, 2016). As fases de adesão, invasão e lesão nas células intestinais invadidas do hospedeiro, são fundamentais nesse processo patológico e devem ocorrer a partir do momento em que as bactérias traspõem as barreiras imunológicas do indivíduo em questão (MENDONÇA, 2016; BERCHIER JÚNIOR).
Nas chamadas Ilhas de patogenicidade em Salmonella spp. (IPS) estão localizados os genes de virulência, sendo cromossômicos ou plasmidiais e estas regiões são definidas como IPS-1, IPS-2, IPS-3, IPS-4, IPS-5 e IPS-6, sendo de maior prevalência os genes cromossômicos na região IPS-1 (MENDONÇA, 2016;
FERREIRA e CAMPOS, 2008).
Sobre as funções das IPS pode-se afirmar que o IPS-1 atua na invasão de células hospedeiras e indução de apoptose de macrófagos; o IPS-2 está envolvido na infecção sistêmica e replicação em macrófagos; o IPS-3 se relaciona em nível de resistência de patógenos e capacidade de multiplicação de Salmonella spp. em
17 ambientes pobres em magnésio; o IPS-4 é importante para a vida intramacrófica, além de abrigar genes para secreção de toxina e apoptose; o IPS-5 é encarregado no agrupamento de genes codificadores de múltiplas proteínas efetoras de T3SS e o IPS-6 está associado no transporte de proteínas ou células hospedeiras provindas de estímulos de respostas externas (FOLEY et al., 2013).
O gene invA está entre os genes necessários para invasão, característica importante para virulência de Salmonella, sendo estes genes responsáveis pela síntese de proteínas que compõem a estrutura deste sistema de secreção. Este sistema possibilita a translocação de proteínas efetoras para o interior do citoplasma da célula hospedeira (SCHMIDT & HENSEL, 2004, OCHOA & RODRIGUEZ, 2005).
Esse é um mecanismo de virulência comum a muitas bactérias Gram negativas, que consiste em uma estrutura molecular semelhante a uma agulha que atravessa a membrana da célula hospedeira, permitindo que proteínas efetoras sejam deslocadas do citoplasma bacteriano para o interior da célula eucariótica (TEME et al., 2008).
Uma vez no interior da célula, as proteínas efetoras interagem com domínios de proteínas e por meio da fosforilação ou transferência de resíduos promovem uma série de reações, levando a modificações no citoesqueleto de actina da célula hospedeira, possibilitando sua entrada, escape de sistema de defesa no interior de fagossomos, morte e outras alterações celulares permitindo a proliferação intracelular de Salmonella spp. (VIEIRA, 2009).
Os sorovares de Salmonella mais frequentemente isolados pelo envolvimento em casos de doenças alimentares no homem são S. Enteritidis e S. Typhimurium.
No que diz respeito aos fatores de virulência bacteriana, estes se associam fortemente a genes associados à virulência, resistência a antimicrobianos e adaptação ao meio em que vivem, sendo fatores determinantes para o status das bactérias em geral, enquanto que a idade e genética influenciam diretamente na susceptibilidade do hospedeiro. Deste modo, em Salmonella spp., se destacam fatores como a presença de fímbrias, flagelos, mobilidade, habilidade de penetrar e replicar nas células epiteliais, resistência ou multirresistência a antimicrobianos, entre outros (CDC, 2014; EFSA, 2015; VIEIRA, 2009; MENDONÇA, 2016).
18 1.6 Salmonella spp. e resistência aos antimicrobianos
A implantação de métodos minimizadores da incidência de patologias no plantel avícola se faz imprescindível devido a crescente demanda de produção.
Acerca disto, notou-se que o uso veterinário frequente e irracional dos antibióticos propicia o aparecimento de populações bacterianas resistentes, provenientes do compartilhamento e transferência de genes de resistência entre microrganismos da microbiota normal, incluindo a transmissão para diferentes patógenos, inclusive os de natureza zoonótica (BRASIL, 2012).
Como agravante, vários antibióticos foram introduzidos nas rações animais em doses sub-terapêuticas e vêm sendo utilizados continuamente na alimentação animal, como promotores de crescimento (BRASIL, 2012). A constante aplicação de antibióticos na manutenção de animais favorece a sobrevivência de cepas resistentes da espécie de Salmonella, podendo atingir os seres humanos através do consumo de alimentos infectados (MENDONÇA, 2016).
A resistência bacteriana em plantéis avícolas vem se disseminando a partir do processo de criação intensiva e do uso indiscriminado de antibióticos e em especial destaca-se a classe das quinolonas, que vem promovendo constante manutenção de lotes positivos para S. Enteretidis (FERREIRA, 2013; TESSARI & CARDOSO, 2015). A resistência bacteriana as cefalosporinas de terceira geração e as fluoroquinolonas vem emergindo em surtos e endemias de infecções por Salmonela spp. causando alarde quanto as perspectivas no tratamento de tais patologias pelo fato destes antibióticos já serem opções substitutas no combate a surtos de salmonelose, aos antimicrobianos cloranfenicol, sulfametoxazol, trimetoprim, ampicilina e amoxicilina (FERREIRA, 2008; BRASIL, 2012).
A seleção de cepas resistentes se tornou uma preocupação mundial de saúde e organizações científicas como FAO/WHO vem discutindo o uso de antibióticos na saúde humana e animal. Desta forma, o Brasil vem tentando seguir recomendações de segurança na restrição de certas drogas como aditivos, liberando-as apenas na aplicação terapêutica, incluindo doses maiores por menor período almejando minimizar o desenvolvimento de resistência bacteriana. Em 1998 foi proibido o uso das tetraciclinas e penicilinas como promotores de crescimento. A lista de proibição
19 brasileira seguiu com cloranfenicol e nitrofuranos (2003), olaquindox (2004) e carbadox (2005). E a partir de 2016 não se pode mais usar colistina como promotor de crescimento no Brasil (BRASIL, 2012; MENDONÇA, 2016).
Estudos indicam que os maiores percentuais de resistência a antimicrobianos para cepas de Salmonella isoladas de carcaças de frango no Brasil são:
estreptomicina (89,3%), sulfonamidas (72,4%), ampicilina (44,8%) e ácido nalidíxico (44,0%) (BRASIL, 2012). O Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango estudou a susceptibilidade aos antimicrobianos em Salmonella, identificando 98 perfis de multirresistência e contabilizando o total de 76,8% cepas resistentes a três ou mais classes de antibióticos (BRASIL, 2012).
A determinação do perfil de resistência e a caracterização genotípica das cepas de Salmonella são aplicáveis não apenas na medicina humana como também na veterinária, sendo uma questão de suma importância no que diz respeito à minimização da incidência de salmonelose oriunda da cadeia produtiva de aves contaminadas. Esses estudos são instrumentos valiosos na epidemiologia do gênero Salmonella, proporcionando conhecimento acerca da fonte de disseminação em sorovares de importância em saúde pública (BRASIL, 2012; MENDONÇA, 2016).
20 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral:
O objetivo deste trabalho foi realizar a pesquisa de Salmonella spp. em carnes de frango comercializadas em supermercados do Distrito Federal e avaliar a susceptibilidade a antimicrobianos das cepas isoladas.
2.2 Objetivos específicos:
Realizar genotipagem através da técnica de PCR para confirmação de genes de virulência de Salmonella spp.
Realizar teste de susceptibilidade antimicrobiana utilizando o método de difusão com disco.
21 3. JUSTIFICATIVA
As salmoneloses são um dos maiores problemas de saúde pública nos casos de Doenças Transmitidas por Alimentos. Nas aves, o estado de portador de Salmonella spp. é um importante fator epidemiológico, sendo as aves de corte uma fonte de contaminação do meio ambiente e dos produtos de origem animal.
Adicionalmente, as operações de transporte pré-abate e processamento da carcaça na indústria podem, por meio da contaminação cruzada, aumentar o percentual de positividade. Estes fatores têm contribuído para que a Salmonella spp. continue a ser um dos patógenos mais identificados em produtos avícolas expostos ao consumo. As carcaças de frango bem como seus cortes e outros derivados chegam ao momento do preparo culinário com percentuais variados de contaminação por Salmonella spp. (KOWALSKI et al., 2011; SANTOS et al., 2013; STERZO et al., 2008).
22 4. ARTIGO ELABORADO CONFORME AS NORMAS DE SUBMISSÃO DA
REVISTA HIGIENE ALIMENTAR
Susceptibilidade a antimicrobianos de bactérias Salmonella enterica isoladas de carnes de frango comercializadas no Distrito Federal
Fábya Nepomuceno de Lima, Daniela Castilho Orsi, Izabel Cristina Rodrigues da Silva
Universidade de Brasília (UNB/FCE), Faculdade de Farmácia, Laboratório de Controle de Qualidade, Ceilândia, Brasília - DF, Brasil
RESUMO
No Brasil, apesar do programa de controle e monitoramento de Salmonella spp. na produção avícola, essa bactéria continua a ser um dos patógenos mais identificados em produtos avícolas expostos ao consumo. O objetivo deste trabalho foi determinar a presença de Salmonella spp. em carnes de frango comercializadas em supermercados do Distrito Federal e traçar seu perfil de susceptibilidade a antimicrobianos. Foram coletadas 18 amostras de carne de frango resfriadas de diferentes cortes (peito, coxa, sobrecoxa, coxinha da asa, asa, filé e miúdos). Foram realizados testes bioquímicos para triagem de Salmonella spp. e os isolados suspeitos foram identificados através da técnica de PCR. A susceptibilidade das cepas aos antimicrobianos foi avaliada pela técnica de disco-difusão (método de Kirby-Bauer). O presente estudo mostrou alta prevalência de Salmonella enterica nas carnes de frango (10 amostras positivas de 18 amostras analisadas, ou seja, 55,6% de positividade). Todos os isolados de Salmonella apresentaram o gene invA após análise molecular. Das 24 cepas testadas, os antibióticos aos quais as cepas apresentaram maior resistência foram: tetraciclina, amoxacilina com ácido clavulânico e sulfonamida. Nove cepas (37,5%) classificaram-se como multirresistentes, isto é, cepas resistentes ou com resistência intermediária a três antibióticos ou mais. A utilização de antibióticos na medicina veterinária de forma indiscriminada leva a indução de cepas resistentes/multirresistentes com a
23 possibilidade de transmissão tanto para outras aves quanto para homens saudáveis, gerando prejuízos financeiros aos abatedouros e à saúde pública.
Palavras-chave: Frango de Corte. Contaminação de Alimentos. Salmonella enterica. Antibiograma. Cepas Resistentes.
ABSTRACT
In Brazil, despite the control and monitoring program of Salmonella spp. in poultry production, this bacterium continues to be one of the most identified pathogens in poultry products exposed to consumption. The objective of this work was to determine the presence of Salmonella spp. in chicken meat commercialized in supermarkets in the Federal District and to trace their antimicrobial susceptibility profile. Eighteen samples of chilled chicken meat were collected from different cuts (breast, thigh, leg quarter, wing, fillet and hearts, livers and gizzards). Biochemical tests were performed to isolate Salmonella spp. and the suspected isolates were identified using the PCR technique. The susceptibility of the strains to the antimicrobials was evaluated by the disc-diffusion technique (Kirby-Bauer method).
The present study showed a high prevalence of Salmonella enterica in chicken meat (10 positive samples from 18 samples analyzed, ie 55.6% positive). All Salmonella isolates showed the invA gene after molecular analysis. Of the 24 strains tested, the antibiotics to which the strains showed the greatest resistance were: tetracycline, amoxicillin with clavulanic acid and sulfonamide. Nine strains (37.5%) were classified as multiresistant, ie strains resistant or with intermediate resistance to three or more antibiotics. The use of antibiotics in veterinary medicine indiscriminately leads to the induction of resistant / multiresistant strains with the possibility of transmission to other healthy birds and men, causing financial losses to slaughterhouses and public health. The use of antibiotics in veterinary medicine indiscriminately leads to the induction of resistant / multiresistant strains with the possibility of transmission to other healthy birds and men, causing financial losses to slaughterhouses and public health.
Keywords: Broiler Chicken. Food Contamination. Salmonella enterica. Antibiogram.
Resistant strains.
24 INTRODUÇÃO
A elevada dinâmica da agroindústria avícola no Brasil vem gerando resultados progressivos e há 30 anos esse setor se destaca nos quesitos de produtividade, volume de abate e desempenho financeiro, impactando positivamente a economia brasileira e consolidando o Brasil, mundialmente, como o 2º país com maior produção de carne de frango e 1º maior exportador do produto (ABPA, 2017). Sendo o Brasil um influente consumidor, produtor e exportador de carne de frango, é de suma importância à modernização e aperfeiçoamento do setor aviário, garantindo desta forma a qualidade do produto final e a lucratividade da agroindústria avícola (MAPA, 2014).
Entre os patógenos bacterianos veiculados na avicultura, destaca-se o gênero Salmonella. Dentro deste gênero, a espécie Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Enteritidis é caracterizada, desde a década de 90, como a principal causadora de infecções alimentares em seres humanos, através do consumo, principalmente, de produtos de origem avícola, tais como carne, ovos e seus derivados (KOWALSKI et al., 2011; SANTOS et al., 2013; STERZO et al., 2008).
A epidemiologia de Salmonella spp. na cadeia de produção de aves envolve a transmissão vertical, dos reprodutores para os embriões, desencadeando o nascimento de aves já infectadas. Envolve também a transmissão horizontal, com contaminação através da presença da bactéria no ambiente e na ração, além da existência de diferentes animais que atuam como reservatório para a bactéria, como roedores e aves silvestres. As aves de corte estão entre os principais carreadores de Salmonella spp. em abatedouros, elas constituem um importante reservatório do patógeno e apresentam alta correlação com a contaminação cruzada (KOWALSKI et al., 2011; SANTOS et al., 2013; STERZO et al., 2008).
O “Programa de redução de patógenos: Monitoramento microbiológico e controle de Salmonella spp. em carcaças de frangos e perus” é uma iniciativa pioneira, do governo brasileiro, em prol da redução de zoonoses alimentares. Esse programa objetiva a implementação do monitoramento constante do nível de contaminação por Salmonella em abatedouros e frigoríferos no Brasil. Esse projeto foi estabelecido através da Instrução Normativa nº. 70, atendendo os princípios de
25 Boas Práticas de Fabricação (BPF), o Procedimento Padrão de Higiene Operacional (PPHO) e a Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle (APPCC), a fim de conferir um controle minucioso sobre o processo de abate e atentar simultaneamente às exigências de segurança do alimento (BRASIL, 2003; BRASIL, 2016; SANTOS et al., 2013).
No dia 25 de outubro de 2016, o MAPA publicou a Instrução Normativa nº 20 e revogou a Instrução Normativa nº 70. As alterações almejam melhorar o controle e o monitoramento de Salmonella spp. nos produtores e abatedouros avícolas registrados no Serviço de Inspeção Federal, a fim de minimizar a prevalência desse agente e estabelecer um nível adequado de proteção ao consumidor (BRASIL, 2016).
A resistência bacteriana a antibióticos é um problema clínico e de saúde pública, havendo evidências de que o tratamento de animais com antibióticos de forma indiscriminada torne seus produtos e derivados fonte de resistência para microrganismos na espécie humana. É preocupante o aumento dos isolados de Salmonella spp. resistentes aos principais antibióticos utilizados nos tratamentos de surtos causados por este microrganismo (PINHEIRO et al., 2010; SILVA et al; 2014).
Considerando que apesar do estabelecimento do programa de controle de Salmonella spp. na produção avícola, essa bactéria continua a ser um dos patógenos mais identificados em produtos avícolas expostos ao consumo, o objetivo deste trabalho foi realizar a pesquisa de Salmonella enterica em carnes de frango comercializadas em supermercados do Distrito Federal e avaliar a resistência antimicrobiana das bactérias isoladas.
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Coleta, preparo das amostras e análises microbiológicas:
As amostras de carne de frango foram coletadas em 10 diferentes supermercados do Distrito Federal, contabilizando o total de 18 amostras de diferentes cortes de refrigerados carne de frango (peito, coxa, sobrecoxa, coxinha da asa, asa, filé e miúdos). As coletas foram realizadas no período de julho a agosto de 2018, sendo todas as amostras transportadas resfriadas dos locais de estudo para o laboratório no tempo de 30-50 min. e no prazo máximo de 1 hora, após a coleta,
26 foram iniciadas as análises microbiológicas no Laboratório de Controle de Qualidade da Faculdade De Ceilândia, UnB. Para a pesquisa de Salmonella spp., primeiro foram pesadas 25 gramas de cada amostra em 225 mL de água peptonada 1% (p/v) e após 18 horas de incubação em estufa a 36ºC (variando aproximadamente 1ºC), alíquotas desse caldo de enriquecimento foram transferidas para os caldos seletivos selenito cistina e tetrationato e encubadas a 37ºC por 24 horas. Após a incubação, alíquotas foram transferidas dos caldos seletivos para os meios ágar Salmonella Shiguella (SS) e Ágar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD). As colônias não fermentadoras de lactose (com ou sem pigmento preto) foram transferidas do SS e do XLD para o meio de cultivo Agar TSI (três açúcares e ferro). Os tubos de TSI que apresentaram reações típicas de Salmonella spp. foram novamente repicadas para os meios SS e XLD e levados para a estufa a 37ºC por 24 horas. As colônias puras isoladas do SS e XLD com característica típica de Salmonella spp. foram repicadas nos meios bioquímicos LIA (Lysina Iron Agar) e FA (Fenilalanina Agar) e incubadas na estufa bacteriológica entre 18 e 24 horas. Todas as análises foram realizadas em triplicata.
5.2 Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos das bactérias isoladas:
A susceptibilidade das cepas aos antimicrobianos foi avaliada pela técnica de disco-difusão (método Kirby-Bauer), utilizando protocolo recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). Os antimicrobianos e as concentrações em microgramas testados foram: amoxacilina com ácido clavulânico (10 µg) (β-lactâmico/penicilina), ceftazidima (30 µg) (β-lactâmico/cefalosporina), cefotaxima (30 µg) (β-lactâmico/cefalosporina), gentamicina (10 µg) (aminoglicosídeo), cloranfenicol (30 µg) (fenicol), imipenem (10 µg) (β- lactâmico/carbapenem), tetraciclina (30 µg) (tetraciclina), ciprofloxacina (5 µg) (quinolona) e sulfonamida (300 µg) (sulfonamida) (NEWPROV®). Os critérios de escolha para as drogas testadas incluíram pontos como utilização de antimicrobianos e ocorrência de resistência no meio avícola/humana. Quanto às zonas de inibição, estas foram determinadas pelas medidas dos halos formados, em milímetros, e classificadas como sensível, intermediário e resistente de acordo com as recomendações do CLSI (2013).
27 5.3 Identificação molecular de bactérias suspeitas de serem patogênicas:
Os isolados suspeitos de serem Salmonella spp. foram identificados através da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), partindo-se de culturas puras ressuspendidas em caldo Luria Bertani. As colônias isoladas foram inoculadas, individualmente, e incubadas a 37ºC por 18 horas. A extração do DNA foi realizada de acordo com o protocolo proposto no kit comercial NucleoSpin Food Kit (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha). A qualidade e a quantidade de DNA extraído foram determinadas por eletroforese em gel de agarose, em comparação com o padrão de massa molecular DNAl/HindIII marcador de 100 pb (JENA®). Após a extração do DNA, a amplificação de fragmentos de genes foi realizada utilizando o termociclador Techne® modelo TC-512. As condições de termociclagem foram 95˚C por 2 minutos e 35 ciclos de desnaturação a 95˚C por 1 minuto, seguida de 60˚C por 1 minuto, para o anelamento dos oligonucleotídeos e 72˚C por 1 minuto para a extensão dos fragmentos. Os produtos de PCR submetidos à eletroforese em gel de agarose, contendo brometo de etídeo foram visualizados sob iluminação ultra-violeta. O marcador de massa molecular utilizado foi o 100 pb DNAl/HindIII (JENA®). Para a identificação de Salmonella enterica foi utilizado o fragmento de 103 pares de base referente ao gene invA.
A Tabela 1 apresenta a sequência do primer para identificação do gene invA (anotação descrita para o gene que codifica as proteínas de invasão celular de Salmonella enterica).
Tabela 1. Sequência do primer e tamanho do produto amplificado na PCR para identificação do gene invA
Primer Sequência 5´- 3´ Produto
amplificado
Espécie
invA foward GCTGATGCCGGTGAAATTAT 103 pb Salmonella enterica invA reverse TGTCACCGTGGTCCAGTTTA
28 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No presente estudo, do total de 18 amostras de diferentes cortes de carne de frango resfriadas, 10 amostras (55,6%) apresentaram o gene invA após análise molecular (Tabela 2).
Tabela 2. Prevalência de bactérias Salmonella enterica isoladas das amostras de carne de frango
Cortes de carne de frango
Número de amostras analisadas
Número de amostras positivas no teste molecular
(gene invA)
Asa 2 1
Coxa e sobrecoxa 6 2
Coxinha da asa 4 3
Coxa 3 2
Peito (inteiro com pele e osso) 1 1
Miúdos 2 1
Total 18 (100%) 10 (55,6%)
A escolha da detecção do gene invA para confirmação molecular de Salmonella, se deu a partir do fato deste estar entre os genes necessários para invasão, característica importante para virulência de Salmonella (GALDINO, et. al., 2013). O operon inv (invasibility) é composto de sete genes invA-B-C-D-E-F-G, sendo o gene invA o primeiro no operon, com função evidente na invasão de células epiteliais, desta forma, sorotipos de Salmonella que não o possuem são incapazes de expressar os genes invA-B-C, excluindo o papel de invasor e agente infeccioso celular (DE OLIVEIRA et al., 2013).
Outros estudos na literatura também fizeram a confirmação molecular de Salmonella através da detecção do gene invA. No estudo de ROWLANDS et al.
(2014), o gene invA esteve presente nas 237 cepas de Salmonella Enteriditis, ou seja, encontrou-se o gene em 100% das cepas testadas. No estudo de GALDINO, et. al (2013), foram analisadas 18 amostras de Salmonella spp. isoladas a partir de swabes de arrasto provenientes de aviários de frango de corte do estado de São
29 Paulo. Verificou-se que 17 amostras (94,4%) apresentaram o gene invA. Desta forma, o gene invA foi qualificado como um marcador confiável, específico e gene alvo para identificação deste gênero.
Apesar da variabilidade de microrganismos relacionados às doenças transmitidas por alimentos, no Brasil, a salmonelose vem liderando os rankings epidemiológicos desta categoria (BRASIL, 2012). Entretanto, os dados da prevalência e da ecologia microbiana de Salmonella spp. na produção de frangos de corte se mantém dispersos e pouco conclusivos, sobretudo quanto à sua participação nas diferentes fases da cadeia produtiva (GALDINO, et. al., 2013).
Estudos em países como Estados Unidos, Canadá e Japão indicaram que os relatos de ocorrência de salmonelose de origem alimentar vêm aumentando a cada ano, enquanto na Inglaterra e países circunvizinhos 90% dos casos são causados pela referida bactéria (PACHECO, 2013).
O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das 24 cepas de Salmonella enterica isoladas das amostras de carnes de frango, determinado através do teste de difusão em discos, está apresentado na Tabela 3. É de suma importância a determinação da resistência destas cepas dentro da cadeia produtiva do frango, visto que os antibióticos são fortemente empregados durante o processo da etapa de criação das aves.
Os antibióticos aos quais as cepas apresentaram maior resistência, considerando também isolados com resistência intermediária, foram: tetraciclina (45,83% cepas resistentes), amoxacilina com ácido clavulânico (45,83% cepas resistentes) e sulfonamida (25,00% cepas resistentes). Todos estes antimicrobianos são pertencentes às classes de uso veterinário exclusivo em terapêutica, sendo vedada a sua utilização como melhoradores de desempenho ou como conservantes de alimentos para animais (BRASIL, 2017).
Notou-se ainda que para os antibióticos cefotaxima (95,83 % de cepas sensíveis e 4,16 % de cepas resistentes), gentamicina (83,33 % de cepas sensíveis e 16,66% cepas de resistentes) e ciprofloxacina (83,33 % de cepas sensíveis e 16,66% cepas resistentes) as cepas apresentaram maior sensibilidade, ainda assim, ocorreu a presença de algumas cepas resistentes.
30 Tabela 3. Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos das bactérias Salmonella enterica isoladas das amostras de carnes de frango
Antibióticos S n (%)
I n (%)
R n (%)
HALO S (mm)
HALO I (mm)
HALO R (mm) Amoxacilina 13 (54,16) 0 11 (45,83) >18 - < 18 Sulfonamida 16 (66,66) 2 (8,33) 6 (25) >17 12-17 < 12 Gentamicina 20 (83,33) 1 (4,16) 3 (12,5) >15 12-15 < 12 Tetraciclina 12 (50) 1 (4,16) 11 (45,83) >21 17-21 < 17 Cloranfenicol 17 (70,83) 3 (12,5) 4 (16,66) >18 12-18 < 12 Ciprofloxacina 20 (83,33) 3 (12,5) 1 (4,16) >21 15-21 < 15 Imipenem 19 (79,16) 5 (20,83) 0 >23 19-23 < 19 Ceftazidima 17 (70,83) 2 (8,33) 5 (20,83) >26 22-26 < 22 Cefotaxima 23 (95,83) 0 1 (4,16) >21 17-21 < 17 S = sensível; I = intermediário; R = resistente; n = número de cepas; % = porcentagem em relação ao total de 24 cepas.
Estudos anteriores realizados no Brasil como os de BESSA et al. (2007), GHILARDI et al. (2006) e MEDEIROS et al. (2011) também relataram elevados níveis de resistência às penicilinas em isolados de Salmonella provenientes de carcaças de frangos resfriadas. O emprego das tetraciclinas como aditivos na alimentação animal é proibido no Brasil desde 1998, entretanto, ainda são utilizadas terapeuticamente no meio avícola, explicando assim sua inclusão no ranking de cepas resistentes à antimicrobianos (BRASIL 2017, VOSS-RECH et al. 2015). Por outro lado, de acordo com LAI et. al. (2014), na China, a tetraciclinas, bem como a sulfonamidas, são drogas utilizadas com fins de promoção do crescimento, impulsionando, desta maneira, o aumento da resistência às mesmas.
É notável o elevado número de cepas resistentes às penicilinas, amoxacilina e ampicilina, desta forma, a adoção de medidas preventivas na saúde pública se torna imprescindível, de maneira a evitar a transferência destas cepas resistentes aos humanos, via alimentos contaminados, uma vez que estes antimicrobianos são adotados como primeira escolha no tratamento de diversas patologias na medicina humana, o que precederia a uma possível ineficácia terapêutica pelo uso indiscriminado destas drogas (WHO, 2011).
31 A Tabela 4 mostra as cepas de Salmonella isoladas de carne de frango com resistência aos antimicrobianos testados.
Tabela 4. Número de cepas de Salmonella enterica isoladas das amostras de carnes de frango com resistência aos antimicrobianos testados
Número de cepas
Cepas (%)*
Números de antimicrobianos aos quais as cepas apresentaram resistência 2
3
8,33 12,50
6 5
3 12,50 4
1 4,16 3
5 20,83 2
7 3
29,16 12,50
1 0
24 100 Total
* % = porcentagem em relação ao total de 24 cepas.
Das 24 cepas de Salmonella testadas, três (12,50%) mostraram-se sensíveis a todos os nove antimicrobianos testados. Sete cepas (29,16%) apresentaram-se resistentes a um tipo de antimicrobiano, enquanto que cinco isolados apresentaram resistência a dois antibióticos (20,83%). Nove cepas (37,5%) classificaram-se como multirresistentes, isto é, cepas resistentes ou com resistência intermediária a três antibióticos ou mais. As cepas de Salmonella com perfil de multirresistência foram isoladas dos cortes de coxa-sobrecoxa, coxa, coxinha da asa e asa dos frangos.
A literatura aponta uma crescente presença de bactérias com múltipla resistência a agentes antimicrobianos. No estudo de DUARTE et al. (2009) 6 cepas de Salmonella testadas (31,5%) foram multirresistentes. No estudo ZIECH et. al.
(2016), foi descrito um total de 86% dos isolados de Salmonella spp. de ambientes de abates de frango no Paraná apresentando padrão de multirresistência. Por fim, PERIN (2017) relatou um quantitativo de 86,7% de cepas resistentes a antibióticos.
Desta forma, implica-se a necessidade de um monitoramento contínuo a fim de conter a antibioticoterapia indiscriminada, precursora de linhagens bacterianas
32 resistentes, seja ela visando propósitos terapêuticos e/ou na promoção de crescimento em rações de consumo para animais de produção (BEZERRA, 2017).
A Tabela 5 apresenta os perfis de resistência antimicrobiana das cepas de Salmonella isoladas de carne de frango e dezoito perfis de resistência foram identificados.
Tabela 5. Perfis de resistência antimicrobiana das cepas de Salmonella enterica isoladas de carne de frango
* Número de antimicrobianos aos quais as cepas apresentaram resistência; Número de cepas (%)** = número de cepas com perfil de resistência e porcentagem em relação ao total de 24 cepas; AMC = amoxacilina, SUL = sulfonamida, TET = tetraciclina, CLO = cloranfenicol, CAZ = ceftazidima, CTX = cefotaxima, GEN = gentamicina, IMP = imipenem.
Perfis Resistência antimicrobiana Número de antimicrobianos*
Número de cepas (%)**
1 AMC, TET, CTX, IMP, CLO, CIP 6 1 (5,26%) 2 AMC, SUL, CAZ, IMP, CIP, GEN 6 1 (5,26%)
3 AMC, SUL, TET, CLO,GEN 5 1 (5,26%)
4 SUL, TET, CAZ, CLO, CIP 5 1 (5,26%)
5 SUL, TET, CLO, CIP, GEN 5 1 (5,26%)
6 AMC, TET, CAZ, IMP 4 1 (5,26%)
7 AMC, TET, IMP, CLO 4 1 (5,26%)
8 AMC, SUL,TET, CLO 4 1 (5,26%)
9 SUL, TET, IMP 3 1 (5,26%)
10 SUL, TET 2 1 (5,26%)
11 AMC, SUL 2 1 (5,26%)
12 AMC, CLO 2 1 (5,26%)
13 TET, CAZ 2 1 (5,26%)
14 AMC, CAZ 2 1 (5,26%)
15 TET 1 2 (10,52%)
16 CAZ 1 2 (10,52%)
17 AMC 1 2 (10,52%)
18 GEN 1 1 (5,26%)
33 A existência de amostras de Salmonella spp. resistentes, com resistência intermediária ou multirresistência indica que a necessidade de maior controle no uso de antimicrobianos, minimizando a contaminação e disseminação dessas cepas em aves e consequentemente no consumidor (GALDINO et. al., 2013).
7. CONCLUSÃO
Nesse estudo verificou-se uma alta prevalência de Salmonella enterica em carnes de frango comercializadas em supermercados do Distrito Federal (10 amostras positivas de 18 amostras analisadas, 55,6%). Das 24 cepas de Salmonella testadas, os antibióticos aos quais as cepas apresentaram maior resistência, considerando também isolados com resistência intermediária, foram: tetraciclina (45,83% cepas resistentes), amoxacilina com ácido clavulânico (45,83% cepas resistentes) e sulfonamida (25,00% cepas resistentes). Nove cepas (37,5%) classificaram-se como multirresistentes, isto é, cepas resistentes ou com resistência intermediária a três antibióticos ou mais. Fica evidente que as medidas adotadas visando minimizar a prevalência de zoonoses alimentares são de suma relevância para a segurança alimentar e o estabelecimento de um nível adequado de proteção ao consumidor. A utilização de antibióticos na medicina veterinária de forma indiscriminada leva a indução de cepas resistentes/multirresistentes com a possibilidade de transmissão tanto para outras aves quanto para homens saudáveis, gerando prejuízos financeiros aos abatedouros e à saúde pública.
Os resultados deste estudo colocam em questionamento pontos importantes como a distribuição de carne de frango com segurança alimentar para o consumidor, a presença de cepas resistentes e multirresistentes nos alimentos e seus impactos diretos e indiretos ao ser humano através do consumo desses alimentos contaminados, e por fim, os desafios futuros na terapêutica de microrganismos com multirresistência.
34 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DO ARTIGO
Bessa, M. C., Michael, G. B., Canu, N., Canal, C. W., Cardoso, M., Rabsch, W., &
Rubino, S. Phenotypic and genetic characterization of Salmonella enterica subsp.
enterica serovar Typhimurium. Research in veterinary science, v. 83, n. 3, p. 302- 310. 2007.
Bezerra, W. G. A. Fatores de virulência e resistência à antimicrobianos em Escherichia coli e Salmonella spp. em granjas de frangos de corte.
Universidade estadual do Ceará – Faculdade de Veterinária. Programa de pós- graduação em ciências veterinárias. Tese de Doutorado em ciências veterinárias.
2017
BRASIL, MAPA, Lista de substâncias proibidas e legislação correspondente (Atualizado em 02/10/2017). Disponível em:
http://www.agricultura.gov.br/assuntos/insumos-agropecuarios/insumos- pecuarios/arquivos-de-insumos-pecuarios/Substnciasproibidas.pdf
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 20, 21 outubro de 2016. Estabelece o controle e o monitoramento de Salmonella spp. nos estabelecimentos avícolas comerciais de frangos e perus de corte e nos estabelecimentos de abate de frangos, galinhas, perus de corte e reprodução, registrados no Serviço de Inspeção Federal (SIF), com objetivo de reduzir a prevalência desse agente e estabelecer um nível adequado de proteção ao consumidor. 2016.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA. Relatório do monitoramento da prevalência e do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos em enterococos e salmonelas isolados de carcaças de frango congeladas comercializadas no Brasil. Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango. Brasília, 2012.171 p.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 70, 10 outubro de 2003. Dispõe sobre o Programa de Redução de Patógenos
35 - Monitoramento Microbiológico no Controle da Salmonella sp. em carcaças de frangos e perus. Diário Oficial da União, Brasília. 2003.
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. 2013. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-third informational supplement.
CLSI M100-S23, Wayne.
De Oliveira, A. P., Sola, M. C., Feistel, J. C., Moreira, N. M., & de Oliveira, J.
J. Salmonella enterica: genes de virulência e ilhas de patogenicidade, Enciclopédia Biosfera, v.9, n.16, p. 1947-1972, 2013.
Duarte, D. A. M., Ribeiro, A. R., Vasconcelos, A. M. M., Santos, S. B., Silva, J. V. D., Andrade, P. L. A. D., & Falcão, L. S. P. D. C. Occurrence of Salmonella spp. in broiler chicken carcasses and their susceptibility to antimicrobial agents. Brazilian Journal of Microbiology, São Paulo, v.40, p.569-573, 2009.
Galdino, V. M. C. A., de Melo, R. T., Oliveira, R. P., Mendonça, E. P., Nalevaiko, P.
C., Rossi, D. A. Virulência de Salmonella spp. de origem avícola e resistência a antimicrobianos. Bioscience Journal, v. 29, n. 4, p. 932-939, 2013.
Ghilardi, A. C.; Tavechio, A. T.; Fernandes, S. A. Antimicrobial susceptibility, phage types, and pulsetypes of Salmonella Typhimurium, in São Paulo, Brazil. Memorial do Instituto Oswaldo Cruz, v. 101, n. 3, p. 281-286, 2006.
Kowalski, L. H., Fernandes, S. R., Silva, A. P., Bredt, R. C., Cruz, T. A., & da Silva, M. G. B. Salmoneloses emergentes de origem aviária. Pubvet, 5, Art-1218, 2011.
Lai, J., Wu, C., Wu, C., Qi, J., Wang, Y., Wang, H., ... & Shen, J.Serotype distribution and antibiotic resistance of Salmonella in food-producing animals in Shandong province of China, 2009 and 2012. International Journal of Food Microbiology, v. 180, p. 30-38, 2014.
Medeiros, M. A. N.; Oliveira, D. C. N.; Rodrigues, D. P.; Freitas D. R. C. Prevalence and antimicrobial resistance of Salmonella in chicken carcasses at retail in 15
36 Brazilian cities. Revista Panamericana de Salud Publica, v. 30, n. 6, p. 555–560, 2011.
Pacheco, D. O. Qualidade microbiológica da cadeia de carne de aves da região Sul do Rio Grande do Sul, Brasil. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Pelotas. 2013.
Perin, A. P. Ocorrência e quantificação de Salmonella sp. em cortes de frango congelados: levantamento epidemiológico no Estado do Paraná e perfil de suscetibilidade e antimicrobianos. Universidade Federal do Paraná – Dissertação de mestrado, Paraná. 2017.
Pinheiro, L., de Melo, R. T., Mendonça, E. P., Coelho, L. R., Monteiro, G. P., & Rossi, D. A.Perfil de suscetibilidade antimicrobiana de cepas de Salmonella spp. isoladas de granjas avícolas. PUBVET, Londrina, v. 4, n. 34, p. 938-943, 2010.
Rowlands, R. E. G., Ristori, C. A., Ikuno, A. A., Barbosa, M. L., Jakabi, M., & Franco, B. D. G. D. M. Prevalence of drug resistance and virulence features in Salmonella spp. isolated from foods associated or not with salmonellosis in Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 56, n. 6, p. 461-567, 2014.
Santos, J. R., Meza, S. K. L., Martini, K. C., & Nunes, R. V.A importância do controle da Salmonella na cadeia produtiva de frango de corte. Scientia Agraria Paranaensis, v. 12, n. 3, p.167-174, 2013.
Sterzo, V. et al. Salmoneloses aviárias. Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde. v. 12, n. 2, p. 129-138, 2008.
Silva, C. J., Tejada, T. S., & Timm, C. D. Resistência de Salmonella isoladas de humanos e de frangos a antimicrobianos, Revista Brasileira de Higiene e Sanidade Animal, Fortaleza, v.8, n.4, p. 120 – 131, 2014.
WHO, World Health Organization, Critically Important Antimicrobials for Human Medicine. Rev. Geneva: Switzerland, 2011.
37 Voss-Rech, D., Vaz, C. S., Alves, L., Coldebella, A., Leão, J. A., Rodrigues, D. P., &
Back, A.A temporal study of Salmonella enterica serotypes from broiler farms in Brazil. Poultry Science, v. 94, n. 3, p. 433-441. 2015.
Ziech, R. E. et al. Multidrug resistance and ESBL-producing Salmonella spp. isolated from broiler processing plants. Brazilian Journal of Microbiology, v. 47, n. 1, p.
191-195, 2016.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS DA REVISÃO DE LITERATURA
ABPA. 2017. Associação Brasileira de Proteína Animal. Relatório anual. 2016.
Disponível em: <http://abpa-
br.com.br/storage/files/versao_final_para_envio_digital_1925a_final_abpa_relatorio _anual_2016_portugues_web1.pdf> Acesso em: 16.10.2017
BACK, A. Manual de doenças de aves. 2.ed. Editora Integração: Cascavel, PR.
2010.
BERCHIERI JÚNIOR, A.; FREITAS NETO, O. C Salmoneloses. In: BERCHIERI JÚNIOR, A. et al. (Ed.). Doenças das aves. 2 ed. Campinas: Fundação APINCO de Ciência e Tecnologia Avícolas, 2009. p. 435-454.
BRASIL. 2016. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 20, 21 outubro de 2016. Estabelece o controle e o monitoramento de Salmonella spp. nos estabelecimentos avícolas comerciais de frangos e perus de corte e nos estabelecimentos de abate de frangos, galinhas, perus de corte e reprodução, registrados no Serviço de Inspeção Federal (SIF), com objetivo de reduzir a prevalência desse agente e estabelecer um nível adequado de proteção ao consumidor. Diário Oficial da União, Brasília.
Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/assuntos/inspecao/produtos- animal/controle-de-patogenos/salmonella>
38 BRASIL. 2003. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa Nº 70, 10 outubro de 2003. Dispõe sobre o Programa de Redução de Patógenos - Monitoramento Microbiológico no Controle da Salmonella sp. em carcaças de frangos e perus. Diário Oficial da União, Brasília.
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Relatório do monitoramento da prevalência e do perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos em enterococos e salmonelas isolados de carcaças de frango congeladas comercializadas no Brasil. Programa Nacional de Monitoramento da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango. Brasília, 2012.171 p.
CDC, Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2013. Atlanta, USA. 2014.
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. 2013. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-third informational supplement.
CLSI M100-S23, Wayne.
EFSA, European Food Safety Authority. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food-borne outbreaks in 2013.
EFSA Journal, v. 13, n. 1, 162 p., 2015.
FERREIRA, L. L., MENDES, F. R., DOS SANTOS, B. M., ANDRADE, M. A., CAFÉ, M. B. Salmonelose em sanidade avícola e saúde pública. Revista Eletrônica Nutrime, v. 10, n. 5, p. 2716-2751, 2013.
FERREIRA, E. O.; CAMPOS, L. C. Salmonella. In: TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. (Ed.). Microbiologia. 5 ed. São Paulo: Atheneu, 2008. p. 329-338.
FILHO, R.L.A.; OKAMOTO, A.S. Salmonella e saúde intestinal. In: Conferência Facta - Prêmio Lamas, Anais. Campinas: FACTA, 2013.
