RIDASCREEN
®Adenovirus IgA, IgG
N° do art.: K1011 (IgA) K1021 (IgG)
1. Finalidade
Para diagnóstico in vitro. Os testes RIDASCREEN® Adenovirus são enzima-imuno-ensaios para a detecção quantitativa de anticorpos IgA ou IgG contra adenovírus no soro humano. O teste deve ser feito no caso de suspeita fundada de uma infecção com adenovírus ou para o esclarecimento do estado imunitário.
2. Resumo e explicação do teste
Após a infecção com adenovírus, formam-se anticorpos específicos contra o agente patogênico devido à reação do sistema imunológico. Estes anticorpos podem ser determinados no soro por meio de métodos imunológicos. O método de teste utilizado e a escolha do antígeno específico para o agente patogênico são importantes para a força probatória do teste.
3. Princípio do teste
Antígenos limpos são colocados em uma microplaca. Nas amostras dos pacientes, os anticorpos presentes se ligam aos antígenos e são, numa segunda etapa, comprovados com um anticorpo anti-humano marcado com enzima (conjugado). Através da enzima, um substrato sem cor (H2O2/TMB) é convertido em um produto final azul. A reação enzimática é finalizada
4. Conteúdo da embalagem
Tab. 1: Conteúdo da embalagem (os reagentes de uma embalagem são suficientes para 96 doses)
K 2511 IgA
K 2521 IgG Plate 96 doses Microplaca;
12 tiras (divisíveis) no quadro de suporte; revestidas com antígenos hexon de adenovírus
X X
SeroPP 110 ml Tampão de amostra, pronta para o uso;
solução NaCl tamponada de fosfato, de cor amarela
X X
SeroWP 100 ml Tampão de lavagem, conc. de 10X; solução de NaCl tamponada com Tris
X X
Control IgA │+
tampa azul
2,5 ml Controle padrão IgA, pronto para o uso; soro humano diluído, coloração azul
X Control IgG │+
tampa verde
2,5 ml Controle padrão IgG, pronto para o uso; soro humano diluído, coloração verde
X Control IgA │
tampa incolor
1,2 ml Controle negativo IgA, pronto para o uso; soro humano diluído
X
Control IgG │
tampa incolor
1,2 ml Controle negativo IgG, pronto para o uso; soro humano diluído
X Control IgA │A
tampa azul
1,2 ml Controlo de qualidade A IgA, pronto para uso; soro humano diluído;
X Control IgA │B
tampa azul
1,2 ml Controlo de qualidade B IgA, pronto para uso; soro humano diluído;
X Control IgG │A
tampa verde
1,2 ml Controlo de qualidade A IgG, pronto para uso; soro humano diluído;
X
Control IgG │B
tampa verde
1,2 ml Controlo de qualidade B IgG, pronto para uso; soro humano diluído;
X
SeroA LD
tampa azul
12 ml Conjugado anti-humano IgA LD (cabra), pronto para uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução proteica estabilizada
X
SeroG HD
tampa verde
12 ml Conjugado anti-humano IgG HD (cabra), pronto para uso; anticorpos conjugados com peroxidase em solução proteica estabilizada;
X
SeroSC 12 ml Substrato,
H2O2/ tetrametilbenzidina; pronto para o uso
X X
Stop 12 ml Reagente bloqueador,
1 N ácido sulfúrico; pronto para o uso
X X
5. Reagentes e a sua armazenagem
O kit deve ser armazenado de 2 - 8 °C e pode ser utilizado até a data de validade impressa no rótulo. Solução de lavagem diluída pode ser utilizada por no máximo 4 semanas quando armazenadas de 2 - 8 °C ou por 5 dias quando armazenados em temperatura ambiente (20 - 25 °C). A garantia do kit não é válida após o vencimento do kit.
O saco de alumínio, no qual a microplaca se encontra, deve ser aberto de um modo que o fecho zipper não seja arrancado. As tiras não necessárias devem ser armazenadas no saco de alumínio fechado a 2 – 8 °C.
Uma contaminação do reagente deve ser evitada bem como a luz direta sobre o substrato incolor.
6. Reagentes e equipamentos adicionais necessários 6.1. Reagentes
água destilada ou deionizada 6.2. Equipamento
Câmera úmida a 37 °C / incubador Tubos de amostra
Mixer Vortex
Micropipetas para volumes de 10 – 100 µl e 100 – 1000 µl Cilindro de medição (1000 ml)
Cronômetro
Aparelho de lavagem para as microplacas ou pipetas de vários canais Fotômetro para as microplacas (450 nm, filtro de referência 620 nm) Filtro de papel (lenços de laboratório)
Contentor para lixo com uma solução de hipocloreto de 0,5% 7. Medidas de precaução
Somente para diagnóstico in vitro.
Os soros de controle contidos no kit (controle padrão, controle negativo, controlo de calidade A e controlo de calidade B) foram testados para HIV e HCV-Ak, bem como HbsAg, e considerados negativos. Porém, eles devem, bem como as amostras de pacientes e todos os materiais que entrem em contato com eles, ser considerados como potencialmente infecciosos e manejados de acordo com as respectivas regras de segurança nacionais.
Para mais informações, consulte as Folhas de Dados de Segurança de Materiais (MSDS) em www.r-biopharm.com
Todos os reagentes e materiais utilizados devem ser descartados corretamente após o uso. Consulte os regulamentos nacionais relevantes para a eliminação.
8. Coleta e armazenagem das amostras
O teste é desenvolvido para a análise de amostras de soro humano. Após a coleta de sangue, o soro deve ser rapidamente tirado do coágulo para evitar uma hemólise do soro . As amostras devem ser armazenadas frias ou congeladas até serem usadas para o teste. Deve-se absolutamente evitar um novo congelamento e descongelamento, bem como a contaminação microbial. A utilização de amostras escurecidas, ictéricas, hemolíticas, lipêmicas inativadas do calor pode produzir falsos resultados.
Tab. 2: Armazenagem das amostras
Soro não diluído Soro diluído
2 – 8 °C –20 °C 2 – 8 °C
1 semana > 1 semana 7 horas
9. Execução do teste 9.1. Generalidades
Antes de serem utilizados, todos os reagentes e as tiras de microtitulação têm de estar a temperatura ambiente (20 – 25 °C). As tiras de microtitulação não devem ser retiradas da embalagem de alumínio antes de atingirem a temperatura ambiente. Os reagentes devem ser bem misturados pouco antes de serem utilizados. Após a utilização, o kit deve ser armazenado de novo imediatamente entre 2 – 8 °C.
Alguns dos reagentes incluídos no kit não são específicos para o teste. Estes reagentes marcados com Sero (por ex. SeroPP) também podem ser utilizados em outros testes RIDASCREEN® Sero ELISA com os reagentes correspondentes.
Os soros de controle são específicos do lote. Não é permitido trocar os soros de controle dos kits com um número de lote diferente.
Os controlos de qualidade A e B RIDASCREEN® Sero ELISA são fornecidos adicionalmente como componentes específicos para o respectivo kit de teste RIDASCREEN® Sero ELISA. Trata-se de controles que podem ser aplicados opcionalmente para segurança adicional da qualidade. Eles contêm soro de controle humano com diferentes concentrações de anticorpos.
9.2. Fabricação do tampão de lavagem
1 parte do concentrado do tampão de lavagem SeroWP é misturada com 9 partes de água destilada. Para isso, coloca-se 100 ml do concentrado em um cilindro de mesa de 1000 ml e enche-se com 1000 ml de água destilada. Cristais eventualmente disponíveis no concentrado devem ser dissolvidos anteriormente com calor (banho-maria a 37 °C). El buffer de lavado diluido se puede conservar 4 semanas si se mantiene a 2 – 8 °C, o cinco dias a temperatura ambiente (20 – 25 °C).
9.3. Preparação das amostras
As amostras de soro a serem examinadas serão diluídas a 1 : 100 antes do início do teste com o tampão de amostra SeroPP.
p. ex. 10 µl de soro + 990 µl de SeroPP Atenção!
O controle negativo e controle padrão, Controlo de qualidade A e Controlo de qualidade B estão prontos para uso e não devem ser diluídos ou absorvidos.
9.4. Primeira incubação
Durante este processo, o exterior do fundo dos poços não deve estar em contato com materiais de boa condutibilidade térmica. A microplaca deve estar coberta durante o processo de incubação.
Devem ser utilizados os controles que correspondem à determinação (IgA ou IgG). A1 Valor em branco do reagente
B1 Controle negativo C1 Controle padrão D1 Controle padrão
E1 Controlo de qualidade A F1 Controlo de qualidade B G1,H1 Soro do paciente 1, 2 etc. Atenção!
A microplaca não deve ser colocada em um contênier de incubação frio que só aquece a 37 °C durante a incubação. O contêiner tem de estar previamente adaptado a 37 °C.
9.5. Lavagem
Os poços devem ser esvaziados em um recipiente de lixo com solução de hipoclorito para desinfecção. Em seguida bate-se na placa sobre papel absorvente para remover o resto da umidade. Depois disso, lava-se a placa 4 vezes com 300 µl de tampão de lavagem de cada vez. Assegurar que ela é esvaziada completamente batendo-lhe depois de cada uma das quatro lavagens sobre uma parte do papel ainda não usada.
Utilizando-se uma lavadora de microplacas deve-se verificar se ela está corretamente programada para o tipo de placa em questão. Depois da lavagem, deve-se bater na placa sobre papel absorvente limpo para remoção do resto da umidade.
9.6. Segunda incubação
Adicionar 100 µl de conjugado anti-humano IgA LD SeroA LD ou conjugado anti-humano IgG HD SeroG HD nos poços correspondentes (inclusivamente A1). Em seguida incubar a placa 30 minutos a 37 °C na incubadora (ver ponto 9.4.).
9.7. Lavagem
Lavar 4 vezes de acordo com o ponto 9.5. 9.8. Terceira incubação
Depois, a reação é bloqueada com a adição de 100 µl de solução bloqueadora Stop em todas as profundidades. Após a cuidadosa mistura (batida suave na beira da placa) a absorbância é medida em um fotômetro de placa a 450 nm (comprimento das ondas de referência 620 nm). A compensação do valor zero é feita com o o valor vazio do reagente (posição A1).
10. Controle de qualidade – Sinais da expiração do reagente
Para fins de controle de qualidade, devem ser sempre utilizados o controle padrão (duplamente) e o controle negativo cada vez que se efetuar um teste. O teste foi realizado corretamente quando a extinção média do controle padrão a 450/620 nm estiver na gama indicada na folha de dados anexa. Se ambas as medições individuais apresentarem desvios à média superiores a 20%, o teste tem de ser repetido. O controle negativo a 450/620 nm tem de apresentar um valor de extinção < 0,3.
Os controlos de qualidade A e B RIDASCREEN® Sero ELISA são controles adicionais que podem ser utilizados opcionalmente para fins de controle da qualidade. As gamas-alvo devem ser consultadas no certificado de garantia de qualidade anexo, específico do lote. Os valores (U/ml, IU/ml ou mIU/ml) obtidos são recomendados aos usuários como valores de referência para a garantia de qualidade do laboratório.
Se os valores divergirem dos requeridos ou se os reagentes estiverem turvos ou o substrato estiver azulado antes de serem adicionados nos poços, pode ser sinal de que os reagentes já caducaram.
Se os valores estipulados não forem atingidos, há que verificar os pontos seguintes antes da repetição do teste:
Data de validade dos reagentes utilizados
Funcionalidade do equipamento utilizado (calibração, por exemplo) Realização correta do teste
Controle visual dos componentes do kit quanto a contaminação ou má vedação; uma solução de substrato com coloração azulada já não deve ser utilizada
Se após a repetição do teste as condições continuarem insatisfatórias, contate o fabricante. 11. Avaliação e interpretação
A avaliação do teste pode ser feita de três modos diferentes: 1. através da curva padrão anexa
2. através da tabela de valores (veja a folha de dados anexa)
3. matematicamente de acordo com o método dos 4 parâmetros ou o método
11.1. Avaliação através da curva padrão
Para se poder realizar a avaliação mediante a curva padrão há que efetuar primeiro, através da média do controle padrão, uma correção das flutuações que podem ocorrer de um dia para o outro. Do valor teórico do controle padrão e do valor do controle atualmente medido, calcula-se o fator de correção F. O valor teórico dependente do lote está mencionado na folha de dados anexa.
F = Valor médio de absorbância do controle padrãoValor teórico do controle padrão
Todos os valores OD das amostras são multiplicados pelo fator F. Com estes valores corrigidos, lê-se depois o valor U/ml correspondente na curva padrão.
11.2. Avaliação através da tabela de valores
U/ml Área do valor do controle padrão
0,89 - 0,94 - < 17,0 < 0,49 ? 17,0 - 20,0 0,49 - 0,56 20,1 - 35,0 0,57 - 0,85 35,1 - 60,0 0,86 - 1,20 + 60,1 - 100,0 1,21 - 1,55 100,1 - 150,0 1,56 - 1,81 150,1 - 400,0 1,82 - 2,39 > 400,0 > 2,39
Fig. 1: Exemplo para uma dose IgG (extrato de uma folha de dados específica da carga) O valor médio de absorbância do controle padrão define na tabela de valores a coluna com a área de valor que é válida para a medição atual. Dentro da coluna o valor de absorbância medido da amostra é relacionado à área de absorbância adequada e lido na segunda coluna à esquerda do título adequado em U/ml.
O valor médio de absorbância do padrão controle em uma medição é, por exemplo, de 0,91. Neste caso, a coluna com a área de 0,89 a 0,94 da tabela é decisiva para a determinação do resultado. Uma amostra de paciente com um valor de absorbância de 0,61 fica então em uma área de título de 20,1 a 35,0 Unidades/ml. (Os valores nominados devem ser vistos como exemplo e podem desviar dos valores atuais da folha de dados.)
11.3. Avaliação matemática
Os valores necessários para uma avaliação matemática de acordo com a avaliação do 4 parâmetros e com o método são indicados na folha de dados anexa.
11.4. Resultado do teste
Tab. 3: Avaliação das unidades obtidas
IgA IgG
negativo < 16 U/ml < 17 U/ml
duvidoso 16 – 20 U/ml 17 – 20 U/ml
positivo > 20 U/ml > 20 U/ml
12. Limites do método
Os testes RIDASCREEN® Adenovirus ELISA detectam anticorpos IgA ou IgG contra adenovírus. Uma relação entre a altura de um valor de absorbância alcançado e dos sintomas presentes ou altamente clínicos não pode ser ignorada aqui. Os resultados alcançados devem sempre ser interpretados em conjunto com o quadro clínico.
Um resultado negativo não exclui uma infecção com adenovírus. Nos tempos iniciais da infecção, a formação de anticorpos podem ser tão pequena que o teste resulta como negativo. Se a suspeita clínica continuar, um soro de repetição deve ser examinado depois de duas a quatro semanas.
No caso de infecções oculares e intestinais com adenovírus, a resposta imunitária pode ser tão baixa, que a detecção de anticorpos seja negativa.
Os anticorpos IgA indicam uma possível ocupação das mucosas com adenovírus. Uma presença maior de IgA indica, portanto, uma infecção aguda. Em casos isolados, a presença de IgA pode também persistir por um longo período de tempo.
Geralmente, para um melhor resultado diagnóstico, nos exames sorológicos dois soros consecutivos de um paciente devem ser examinados. Importante para a interpretação de um resultado é o procedimento do título.
13. Características de desempenho Tab. 4: Variação inter-ensaio (n=30)
Variação inter-ensaio IgA IgG
OD VK OD VK
Soro 1 0,253 17,0% 0,353 4,9%
Soro 2 0,696 11,4% 0,710 6,6%
Soro 3 1,238 7,9% 1,199 5,4%
Tab. 5: Variação intra-ensaio (n=24)
Variação intra-ensaio IgA IgG
OD VK OD VK
Soro 1 0,155 8,0% 0,133 8,2%
Soro 2 0,580 6,8 % 0,649 4,5%
Soro 3 1,240 2,8% 1,076 4,1%
Tab. 6: Sensibilidade e especificidade em comparação com dois outros ELISAs comerciais
IgA IgG
Sensibilidade 98,3 % 100,0 %
Especificidade 100,0% 100,0 %
Tab. 7: Resultados com 200 soros de doadores examinados de um centro de doação de sangue na Alemanha
200 soros de doadores IgA IgG
negativo 86,5% 30,5%
duvidoso 4,0% 5,5%
Literatura
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6. Herrmann, J. E., Perron-Henry, D. M., Stobbs-Walro, D. and Blacklow, N. R.: Preparation and characterization of monoclonal antibodies to enteric adenovirus types 40 and 41. Arch. Virology 94, 259 - 265 (1987).
7. Uhnoo, I., Wadell, G., Svensson, L. and Johansson, M. E.: Importance of enteric adenoviruses 40 and 41 in acute gastroenteritis in infants and young children. J. Clin. Microbiol. 20, 365 - 372 (1984).
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