MỤC LỤC
Trang
Mở đầu 1
Chương 1 Tổng quan
4
1.1. Giới thiệu về protein và axít amin 4
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin 13
1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin 14 1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin 17
Chương 2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
29
2.1. Nội dung và mục tiêu nghiên cứu 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 31
2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thuốc thử sử dụng 42 2.4. Phương pháp thu thập mẫu thực phẩm để phân tích 44
Chương 3.Kết quả và thảo luận 46
3.1. Khảo sát chọn loại chất dẫn xuất cho axít amin 47 3.2. Tối ưu hóa các điều kiện tách và xác định axít amin bằng HPLC 49 3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng và xây dựng đường
chuẩn của phương pháp phân tích 62
3.4. Tối ưu hóa các điều kiện thủy phân mẫu 69 3.5. Lược đồ quy trình phân tích đối với các mẫu thực phẩm 84 3.6. Đánh giá thống kê phương pháp phân tích 87
3.7. Phân tích mẫu thực tế 103
Kết luận
133
Danh mục công trình tác giả
114
Tài liệu tham khảo
116
Phụ lục 1
125
Phục lục 2
127
Phục lục 3
128
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Tên đầy đủ
ACN Acetonitril
Ala Alanin
AQC Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat
Arg Arginin
Asp Axít Aspartic
Cys Cystin
FMOC 9-florenylmethylcloroformat
GC Sắc ký khí
Glu Axít Glutamic
Gly Glycin
His Histidin
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Ile Isoleucin
KPH Không phát hiện (dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp)
Leu Leucin
Lys Lysin
Met Methionin
Ninhydrin Tricetohydrinđen hydrat
OPA Ortho-phthalaldehyd / ortho-phthaldialdehyd
Phe Phenylalanin
PITC Phenylisothiocyanat
Pro Prolin
RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược
Ser Serin
Thr Threonin
Tyr Tyrosin
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết 11Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu 12
Bảng 1.3: Tổng hợp các chất dẫn xuất xác định axít amin bằng RP-HPLC [76] 27 Bảng 3.1: ảnh hưởng pha động đến thời gian lưu của các axít amin 55
Bảng 3.2: Thành phần và tỷ lệ pha động theo chế độ gradient 57
Bảng 3.3: ảnh hưởng của nồng độ trietylamin trong pha động đến thời gian lưu 57 Bảng 3.4: Các điều kiện đo RP-HPLC cho xác định các axít amin 61
Bảng 3.5: Tỷ lệ thành phần pha động 62 Bảng 3.6: Giới hạn phát hiện của các axít amin 64
Bảng 3.7: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 65 Bảng 3.8: Sự phụ thuộc của chiều cao píc sắc ký vào nồng độ của axít amin 67
Bảng 3.9: ảnh hưởng của môi trường đến hiệu suất thủy phân axít amin 70 Bảng 3.10: ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi của axít amin 71
Bảng 3.11: ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của axít amin 73 Bảng 3.12: ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 75 Bảng 3.13: Sự phụ thuộc của hiệu suất dẫn xuất các axít amin vào pH môi trường
80
Bảng 3.14: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào nhiệt độ tạo dẫn xuất huỳnh quang 82
Bảng 3.15: Sự phụ thuộc của hiệu suất axít amin vào thời gian dẫn xuất 83 Bảng 3.16: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 1 (150 - 30ppb) 88 Bảng 3.17: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 2 (790 - 80ppb) 89 Bảng 3.18: Độ đúng của phương pháp ở nồng độ thứ 3 (1490 - 150 ppb) 89 Bảng 3.19: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu cá quả 91 Bảng 3.20: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu cá quả 92
Bảng 3.21: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin đối với mẫu cá thu 93 Bảng 3.22: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin đối với mẫu cá thu
93
Bảng 3.23: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu hạt đậu 94 Bảng 3.24: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu tương
95
Bảng 3.25: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng của các axít amin trong mẫu đậu phụ 96 Bảng 3.26: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu của các axít amin trong mẫu đậu phụ 97
Bảng 3.27: Độ lặp lại (n = 6) hàm lượng các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 97 Bảng 3.28: Độ lặp lại (n = 6) thời gian lưu các axít amin trong mẫu sữa đậu nành
98
Bảng 3.29: Độ thu hồi ở nồng độ thứ nhất 100 Bảng 3.30: Độ thu hồi ở nồng độ thứ hai 101
Bảng 3.31: Độ thu hồi ở nồng độ thứ ba 102
Bảng 3.32: Hàm lượng axít amin trong cá nước ngọt (g/100g) 104 Bảng 3.33: Hàm lượng axít amin trong cá nước mặn (g/100g) 105 Bảng 3.34: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu hạt đậu tương 109
Bảng 3.35: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu đậu phụ 110 Bảng 3.36: Hàm lượng trung bình các axít amin trong mẫu sữa đậu nành 111
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 32Hình 2.2: Sắc đồ một chất 32 Hình 2.3 Tính bất đối của píc 34
Hình 3.1: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất OPA trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 340; em = 455)
47
Hình 3.2: Sắc đồ tách axít amin bằng dẫn xuất AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em =
395) 47
Hình 3.3: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ
huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 50
Hình 3.4: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 5mM dẫn xuất với AQC trước cột, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ PDA
(= 254nm) 50
Hình 3.5: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 5m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
52
Hình 3.6: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 10 mM,cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex=250; em=395)
52
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn axít glutamic, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53
Hình 3.8: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 53
động không thêm trietylamin, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 58
Hình 3.10: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axít amin ở nồng độ 50 mM khi chạy với pha động có thêm trietylamin 17mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 59
Hình 3.11: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1,2ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động chạy theo chế độ gradient 60
Hình 3.12: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395), pha động theo chế độ gradient 60
Hình 3.13: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,8ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 60
Hình 3.14: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 17 axít amin, nồng độ 10mM, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 0,5ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex =
250; em = 395), pha động theo chế độ gradient 61
Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Asp từ 0,149 đến 1,493 (g/ml) 68 Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng His từ 0,015 đến 0,155 (g/ml) 68 Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,046 đến 0,461 (g/ml) 68 Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,149 đến 1,49 (g/ml) 68 Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Arg từ 0,092 đến 0,461 (g/ml) 69 Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Cys từ 0,298 đến 1,49 (g/ml) 69 Hình 3.21: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, thêm chuẩn ở nồng độ HCl 4,5M, ở 125 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x
3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 71 Hình 3.22: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nồng độ HCl thủy
Hình 3.23: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu tương bằng HCl 6M ở 110 oC, trong 24 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 73
Hình 3.24: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào nhiệt độ thủy phân đậu nành bằng HCl 6M 74
Hình 3.25: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương bằng HCl 6M, ở 125oC, trong 20 giờ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 74
Hình 3.26: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axít amin vào thời gian thủy phân 75 Hình 3.27: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành sau khi được làm giàu bằng cách thuỷ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 78
Hình 3.28: Sắc đồ 7 chuẩn axít amin được điều chỉnh pH bằng NaOH 0,5M, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang
(ex=250; em=395) 79
Hình 3.29: Sắc đồ chuẩn 7 axít amin điều chỉnh pH bằng Na2B4O7 0,25M, cột RP18
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex= 250;
em = 395) 80
Hình 3.30: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn xuất ở 65oC, thời gian 10 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 81
Hình 3.31: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương được dẫn xuất ở 65oC, thời gian 5 phút, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng
1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250; em = 395) 83
Hình 3.32: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu cá quả, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 104
(150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 105
Hình 3.34: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu hạt đậu tương, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex
= 250; em = 395) 107
Hình 3.35: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu đậu phụ, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 108
Hình 3.36: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu sữa đậu nành, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
em = 395) 108
Hình 3.37: Sắc đồ tách axít amin trong dịch thuỷ phân mẫu thịt gà, cột RP18 (150mm x 4,6mm x 3,9m), tốc độ dòng 1ml/phút, detectơ huỳnh quang (ex = 250;
MỞ ĐẦU
Hiện nay, không chỉ riêng nước ta mà nhiều nước trên thể giới đang phải tiếp tục giải quyết tình trạng nghèo đói và suy dinh dưỡng. Trong khi đó, thừa dinh dưỡng kèm theo các bệnh mãn tính như tim mạch và tiểu đường đang trở nên một thách thức lớn trong giai đoạn chuyển tiếp hiện nay. Vấn đề thừa cân và béo phì ở một bộ phận dân cư đô thị (trẻ em, học sinh, lứa tuổi trung niên) và một số bệnh mãn tính có liên quan đến dinh dưỡng như tăng huyết áp và đái tháo đường đang nổi lên có ý nghĩa sức khỏe cộng đồng [3]. Để giải quyết vấn đề này cần thiết phải kết hợp nhiều giải pháp chiến lược, trong đó đảm bảo một chế độ ăn lành mạnh và phù hợp là một trong những giải pháp rất quan trọng. Các nghiên cứu về vai trò các chất có hoạt tính sinh học trong chế độ ăn đối với các bệnh mãn tính như tim mạch, béo phì và tiểu đường là rất cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Để thực hiện những nghiên cứu này, cần thiết phải xây dựng các cơ sở dữ liệu đối với các hoạt chất sinh học trong tự nhiên như các vitamin và axít amin,...
Giá trị của một loại thức ăn không những phụ thuộc vào số lượng chất đạm có trong thức ăn ấy mà còn phụ thuộc vào số lượng và tỷ lệ cân đối các axít amin, nghĩa là chất lượng của protein thức ăn. Đối với các nước đang phát triển, thức ăn động vật mà protein có chất lượng tốt còn chưa đủ, mà cần bổ sung thêm những loại thức ăn thực vật giàu protein lại càng cần thiết. Nó giúp chúng ta có định hướng để phối hợp các thức ăn với nhau nhằm nâng cao chất lượng của protein trong khẩu phần hàng ngày của người dân.
Hàm lượng protein (chất liệu căn bản của cơ thể) mà mọi người cần được cung cấp mỗi ngày là 1g/kg trọng lượng cơ thể. Thịt và cá có lượng protein ngang nhau (15 - 25g) cho 100g thực phẩm ăn vào. Điều cần lưu ý, những loại thịt có màu đỏ (thịt bò, thịt cừu, thịt ngựa) có chứa nhiều lipít. Một miếng thịt bò 150g chứa nhiều lipít hơn cả một miếng bơ 10g; còn thịt màu trắng (thịt lợn, thịt bê, thịt gà, thịt vịt) được xem là ít lipít nhưng lại kém về chất sắt.
Cá là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, lượng protein trong cá giao động từ 16 - 17g/100g [12]. Cá có các axít béo cần thiết tốt cho phòng chống các bệnh tim mạch. Đặc biệt mỡ gan cá có chứa nhiều vitamin A và D ngoài ra trong cá
cũng có nhiều nhóm vitamin B, axít folic, vitamin B12, vitamin E, bên cạnh đó cá cũng là nguồn cung cấp các chất khoáng quý, dao động từ 1 - 1,7g/100g, có khi lên tới 3g/100g, gồm các yếu tố vi lượng như: đồng, kẽm, i ốt. Mỡ cá không những có đầy đủ thành phần axít béo không no mà nó còn chứa axít béo thiết yếu DHA. Ngoài ra trong mỡ cá còn chứa axít béo Omega-3, có tác dụng bảo vệ hệ thống tim mạch. Việc tiêu thụ axít béo này cũng làm giảm nguy cơ xơ cứng động mạch và cao huyết áp [12]. Theo nhận định của FAO mức tiêu thụ cá tại Việt Nam vào khoảng 18,72 kg/người/năm. Cá là nguồn thực phẩm quý bổ sung lượng protein đáp ứng nhu cầu sinh hoạt của người dân.
Trong chế độ ăn của người Châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, các thực phẩm từ đậu tương chiếm một vị trí quan trọng. Theo kết quả tổng điều tra dinh dưỡng năm 2000 của Viện Dinh dưỡng, mức tiêu thụ thực phẩm nhóm đậu, đỗ đã tăng lên đáng kể trong năm 2000, với khoảng 6g/người/ngày so với 2,8g/người/ngày trong năm 1990. Đậu phụ, loại thực phẩm giàu đạm thực vật thông dụng ở Việt Nam cũng có mức tiêu thụ tăng lên đến 13,4g/người/ngày trong năm 2000 so với 6,8g/người/ngày trong năm 1990 [13].
Axít amin là một thành phần quan trọng của cơ thể. Axít amin tạo nên tế bào, phục hồi mô, tạo nên các kháng thể chống lại vi khuẩn và virus. Axít amin là một phần của enzym và hệ thống hormon. Nó tạo nên ARN (axit ribo nucleic), ADN (axit deoxy nucleic) vận chuyển oxy đi khắp cơ thể và tham gia vào hoạt động của các cơ. Axít amin cung cấp cho cơ thể từ thực phẩm giàu protein. Protein khi vào cơ thể được chuyển hóa thành 20 axít amin, trong đó có 8 axít amin thiết yếu không được tạo ra từ cơ thể, isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan và valin. Sự thiếu hụt axít amin dẫn đến cơ thể mệt mỏi, hạ đường huyết, dị ứng [81].
Trên thế giới, phương pháp truyền thống phân tích axít amin được đưa ra và phát triển bởi Moore và Stein [63, 64, 65, 66] là tách và xác định các axít amin tự do bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion với dẫn xuất sau cột (ninhydrin hoặc O-phtalaldehyd). Kỹ thuật này đã được áp dụng hơn 40 năm cho kết quả tốt trong giới hạn phân tích. Mặc dù vậy trong thời gian qua đã có nhiều phương pháp áp
dụng để phân tích axít amin như điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS), sắc ký khí (GC/FID), sắc ký khí khối phổ [20, 21, 22, 23, 26, 32, 58]. Nhưng mỗi phương pháp có hạn chế riêng. Trong điều kiện phòng thí nghiệm của Viện Dinh dưỡng, phương pháp dẫn xuất trước cột với 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamat cho phép xác định cả axít amin bậc 1 và bậc 2 với detectơ huỳnh quang (ex = 250 nm; em = 395 nm). Trên thế giới AQC chỉ mới được sử dụng làm dẫn xuất để xác định axít amin trong nhiều đối tượng thực phẩm phức tạp như xác định axít amin trong thức ăn trẻ em [58].
Tại Việt Nam, việc phân tích các thành phần có hoạt tính sinh học trong thực phẩm còn hạn chế, chủ yếu mới có số liệu của một số loại carotenoid trong rau, quả. Số liệu phân tích các axít amin trong thực phẩm Việt Nam còn thiếu, đặc biệt đối với một số axít amin quan trọng như lysin, cystin,... Những nghiên cứu, phân tích về thành phần dinh dưỡng và đặc biệt các thành phần có hoạt tính sinh học trong một số loại thực phẩm như một số loại thịt; một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn; nhóm hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ hạt đậu tương ở nước ta còn chưa đầy đủ. Cho đến nay, tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về tách và xác định đồng thời 17 axít amin trong một số nhóm thực phẩm thông dụng (gồm: một số loại thịt, một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương) bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Việc tách và xác định 17 axít amin trong một số loại thịt, một số loại cá nước ngọt, cá nước mặn, cũng như hạt đậu tương và các sản phẩm chế biến từ đậu tương giúp chúng ta có được cách phối hợp hiệu quả các thực phẩm với nhau để nâng cao chất lượng của protein trong khẩu phần và như vậy là vấn đề cần thiết có tính thời sự và thực tiễn phục vụ cho khảo sát nguồn thực phẩm giàu axít amin ở Việt Nam. Đồng thời việc này cũng góp phần bổ sung, hoàn thiện số liệu của bảng thành phần thực phẩm Việt Nam và cung cấp số liệu cho các nghiên cứu dinh dưỡng.
Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mục tiêu nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện để tách và xác định một số axít amin trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về protein và axít amin
1.1.1. Lịch sử phát hiện ra protein và axít amin [3, 6, 54]
Khái niệm protein (protit hay đạm) ngày nay rất quen thuộc với chúng ta, song trước đây chỉ mới đầu thế kỷ thứ 19 người ta vẫn coi protein là một vấn đề bí ẩn và khó hiểu.
Quan niệm xưa của Hypocrates cho rằng mọi thức ăn chỉ có một chất dinh dưỡng phổ biến đã tồn tại cho đến thế kỷ 19. Tuy nhiên vào năm 1816 nhà y học Pháp Franois Magendie (1783-1855) đã chỉ ra rằng các hợp chất chứa nitơ trong thực phẩm là thiết yếu đối với chó và nhà y học Anh William Prout (1785-1850) năm 1834 đã phân biệt được saccarin, chất béo và albumin trong nhóm các chất dinh dưỡng. Nhà hóa học và y học Hà Lan Gerard Mulder (1802-1880) đã dùng thuật từ protein lần đầu tiên vào năm 1839 (từ tiếng Hy Lạp protos nghĩa là đầu tiên) từ đó protein được xem là chất dinh dưỡng quan trọng nhất.
Trong thế kỷ 19 phần lớn các axít amin được phân lập và xác định được cấu trúc. Vào năm 1906, nhà hóa sinh Anh F. G. Hopkins (1861-1947) đã thấy rằng dùng ngô là nguồn protein duy nhất không thể duy trì sự sống của súc vật thí nghiệm trừ phi được bổ sung thêm tryptophan, điều đó xác định tính thiết yếu của một số axít amin. Phát hiện đó đã mở đường cho rất nhiều công trình xác định giá trị sinh học của protein, chủ yếu bởi các nhà khoa học Mỹ trong khoảng thời gian từ 1890 - 1924 (K. Thomas 1909, Osborn et al. 1919, Mitchell 1924).
Sau khi 2 axít amin cuối cùng được xác định (methionin vào năm 1922 và threonin vào năm 1935) người ta đã có thể điều chỉnh chất lượng protein dựa vào thành phần các axít amin cần thiết và tiến hành các thực nghiệm xác định nhu cầu các axít amin cho động vật thực nghiệm và người (W. C. Rose 1957).
1.1.2. Phân loại protein [6, 54]
Chủng loại protein rất phức tạp, đại đa số các kết cấu hóa học vẫn chưa được làm rõ, chỉ có thể dựa vào mức độ phức tạp về thành phần hóa học của chúng, mà
chia ra thành 2 loại là protein đơn thuần và protein kết hợp. Protein đơn thuần là loại protein chỉ có các axít amin hợp thành, còn protein kết hợp là do protein đơn thuần kết hợp với phần không phải protein tạo thành, như các loại liprotein có chứa lipit, hemoglobin có chứa sắc tố, glycoprotein có chứa đường.
Nếu dựa theo tính chất lý hóa, protein còn có thể được chia thành 7 loại là anbumin, globulin, prolamin, glutelin, histon, protamin và scleroprotein. Về mặt dinh dưỡng học, thường dựa vào giá trị dinh dưỡng của protein để chia protein thức ăn ra thành:
Protein hoàn toàn: Chứa tất cả các loại axít amin cần thiết, số lượng đầy đủ, tỷ lệ thoả đáng, không chỉ có thể duy trì được sức khoẻ của người lớn, mà còn có thể thúc đẩy sự sinh trưởng phát triển của trẻ nhỏ. Như casein, lecithoprotein trong các loại sữa; ovalbumin trong các loại trứng; anbumin, myoprotein trong các loại thịt; protein trong đậu nành, glutelin trong ngô. Protein nửa hoàn toàn: Có chứa đủ tất cả các loại axít amin cần thiết, nhưng
có loại số lượng không đủ, tỷ lệ không hợp lý, có thể duy trì được sự sống, nhưng không thể thúc đẩy sinh trưởng, phát triển, như gliadin trong tiểu mạch, đại mạch.
Protein không hoàn toàn: Các loại axít amin cần thiết có chứa trong đó không đầy đủ, vừa không thể duy trì được sự sống lại vừa không thể thúc đẩy được sự sinh trưởng, phát triển. Như protein trong ngô, protein chất keo trong mô liên kết và da thịt động vật, legumin trong đậu Hà Lan,...
1.1.3. Sự tiêu hóa và hấp thu protein [6, 54]
Protein phân tử lớn được hấp thu trong ruột, dưới tác dụng của nhiều loại enzim tiêu hóa (như pepsin, tripsin, peptase) phân giải thành peptid ngắn và axít amin trong dạ dày. Sau đó được hấp thu trong ruột non, theo tĩnh mạch chủ vào bên trong gan.
Axít amin trong máu có 3 nguồn là từ protein trong thức ăn, từ sự phân giải protein mô và từ sự chuyển hóa hydrat carbon và lipit.
Hợp thành protein mô.
Hợp thành các protein đặc thù như enzim, hormon, kháng thể,… Sản sinh ra urê, muối amoni và các chất có chứa nitơ khác.
Ôxy hóa thành khí carbonic, nước và urê, đồng thời sinh ra năng lượng. Trong tình trạng bình thường tốc độ ra vào của các axít amin trong máu gần như là ngang nhau, cho nên hàm lượng axít amin trong máu của người bình thường là tương đối ổn định.
1.1.4. Công dụng sinh lý của protein [6, 54]
Chủ yếu có những mặt sau:
Cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể
Thành phần cấu thành các enzim và các hormon Cấu thành các kháng thể
Điều tiết áp lực thẩm thấu Cung cấp năng lượng
Thiếu protein sẽ làm cho trẻ nhỏ sinh trưởng, phát triển chậm và không tốt; ở người lớn sẽ gây sút cân, teo cơ, thiếu máu, dễ mệt mỏi, sức đề kháng thấp dễ bị chấn thương, gẫy xương lâu liền, sau khi bị bệnh, phục hồi chậm; thiếu protein nặng sẽ xuất hiện phù nề do dinh dưỡng.
1.1.5. Giá trị dinh dưỡng của protein [6, 54, 68]
Hàm lượng và chất lượng của thức ăn, chủ yếu chỉ giá trị protein trong thức ăn đó. Thức ăn có hàm lượng cao, chất lượng tốt thì giá trị dinh dưỡng của protein cao, còn ngược lại sẽ thấp. Giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn chủ yếu được quyết định bởi tỷ lệ hấp thu tiêu hóa và tỷ lệ tận dụng nó trong cơ thể; và tỷ lệ tận dụng lại được quyết định bởi sự tạo thành các axít amin cần thiết (chủng loại, số lượng và tỷ lệ của các axít amin cần thiết có trong đó). Khi sự tạo thành axít amin cần thiết tiếp cận được với nhu cầu của cơ thể thì cả tỷ lệ tận dụng và giá trị dinh dưỡng đều cao, còn ngược lại sẽ thấp.
nitơ trong đó. Hàm lượng nitơ trong protein ở thức ăn tương đối ổn định. Nhân lượng tổng nitơ đo được trong thức ăn với 6,25 sẽ có được hàm lượng protein. Tất nhiên, hàm lượng nitơ trong các loại protein thức ăn có hơi chênh lệch nhau một chút.
Tác dụng bổ sung lẫn nhau của protein
Khi ăn hỗn hợp 2 loại hoặc 2 loại protein thức ăn trở lên, giữa các loại axít amin trong đó sẽ có sự bổ sung cho nhau, từ đó nâng cao được tác dụng của giá trị dinh dưỡng trong protein thức ăn. Tác dụng bổ sung lẫn nhau này cũng thường được vận dụng trong cuộc sống thường ngày của con người.
Giá trị dinh dưỡng trong protein thức ăn cao hay thấp sẽ được quyết định bởi chủng loại, số lượng axít amin tạo thành protein và tỷ lệ tương hỗ giữa chúng.
Những loại protein có axít amin đầy đủ, số lượng đầy đủ, tỷ lệ tương hỗ giữ chúng hợp lý, thì giá trị sinh học (tức giá trị dinh dưỡng) sẽ cao. Nếu biết kết hợp ăn hỗn hợp các protein thức ăn có giá trị sinh học tương đối thấp thì sẽ nâng cao được giá trị sinh học của chúng. Khi ăn thức ăn hỗn hợp để phát huy được tác dụng tương hỗ của các loại protein, thường là phải tuân theo một số nguyên tắc sau:
- Thuộc tính sinh học của các loại thức ăn càng xa nhau càng tốt, như khi ăn hỗn hợp các thức ăn từ động vật và thực vật, thì giá trị sinh học của protein sẽ vượt quá sự hỗn hợp giữa các loại thức ăn từ thực vật đơn thuần.
- Chủng loại thức ăn phối hợp với nhau càng nhiều càng tốt.
- Các loại thức ăn phải ăn cùng đồng thời, bởi vì sau khi một axít amin đơn nhất được hấp thu vào cơ thể, thường cần phải dừng lại trong máu gần 4 tiếng; sau đó đến các cơ quan tổ chức, rồi mới hợp thành protein của các cơ quan tổ chức; và các axít amin mà protein được hợp thành ở các tổ chức cơ quan đòi hỏi phải đến một cách đồng thời thì mới phát huy được tác dụng tương hỗ giữa các axít amin để tạo nên protein của các cơ quan tổ chức.
Lượng cung cấp protein.
protein chịu sự ảnh hưởng của cường độ lao động, nhưng khi sự hấp thu năng lượng từ bữa ăn tăng lên thì lượng hấp thu protein cũng tăng lên. Lượng cung cấp protein trong bữa ăn hàng ngày do Hiệp hội dinh dưỡng Trung Quốc đề ra được tính toán dựa theo mức năng lượng chiếm 11- 14% tổng năng lượng, trong đó ở trẻ em và thanh thiếu niên là 13 - 14%, để đảm bảo cho nhu cầu sinh trưởng phát triển; ở người lớn là 11 - 12% tức có thể bảo đảm duy trì được chức năng sinh lý bình thường. Việc bổ sung năng lượng của những người lao động chân tay cực nặng chủ yếu là từ thức ăn loại hạt cốc, mức protein chiếm trong đó tương đối thấp, nhưng vẫn có thể đạt được 11% tổng năng lượng.
1.1.6. Nguồn protein [6]
Các thức ăn chủ yếu cung cấp protein cho cơ thể có thể là: các loại thịt gia cầm, gia súc và các loại thuỷ sản, hàm lượng protein trong đó thường là 10 - 20%; trong sữa tươi các loại là 1,5 - 3,8%; trong trứng các loại là 11 - 14%; trong đậu khô các loại là 20 - 40% - là loại có hàm lượng protein tương đối cao trong các loại thức ăn từ thực vật; các loại quả cứng như lạc, hồ đào, hạt sen,.... cũng chứa 15 - 30% protein; hạt cốc các loại thường chỉ chứa 6 - 10% protein; khoai các loại chiếm 2 - 3% protein. Về việc cung cấp protein trong bữa ăn hiện nay nên xem xét trên cơ sở lương thực mà gia giảm thêm một lượng nhất định protein từ động vật và protein từ đậu các loại. Nếu lượng protein hấp thu mỗi ngày về mặt số lượng đạt tới tiêu chuẩn lượng cần cung cấp, trong đó có trên 30% có nguồn gốc từ protein động vật và đậu các loại thì sẽ có thể đáp ứng được nhu cầu dinh dưỡng một cách rất tốt.
1.1.7. Axít amin thiết yếu và không thiết yếu [6]
Cơ thể con người chỉ khi được cung cấp các loại axít amin thì mới có thể hợp thành được protein. Có những loại axít amin có thể tổng hợp được trong cơ thể, gọi là các “axít amin không thiết yếu”, có những loại axít amin không thể tổng hợp được trong cơ thể, hoặc tốc độ tổng hợp không thể đáp ứng được nhu cầu sinh lý sinh trưởng phát triển bình thường của cơ thể, mà đòi hỏi lấy từ trong thức ăn, gọi là các “axít amin thiết yếu”.
Các axít amin không thiết yếu tuyệt đối không được hiểu lầm là không cần, mà chỉ vì chúng có thể tổng hợp được trong cơ thể, nếu trong thức ăn có thiếu cũng không quan trọng lắm. Các axít amin thiết yếu trong cơ thể bao gồm isoleusin, leucin, valin, lysin, methionin, phenylalanin, threonin, tryptophan. Ngoài ra, histidin là loại axít amin thiết yếu cho trẻ dưới một tuổi. Axít amin không thiết yếu bao gồm alanin, arginin, axít aspartic, cystin, axít glutamic, glycin, serin, prolin và tyrosin,...
Công dụng chủ yếu của axít amin trong cơ thể là tạo thành protein. Ngoài ra, có những loại axít amin còn có những đặc tính quan trọng khác. Xin đưa ra một số ví dụ:
- Lysin: Một trong những loại axít amin cần thiết. Có thể cung cấp thành phần cấu tạo hợp thành cytocilin, cytocilin là chất quan trọng thúc đẩy sự hợp thành các axít béo trong tế bào. Trong phần lớn các loại hạt, hàm lượng lysin tương đối thấp, thường ảnh hưởng đến tỷ lệ tận dụng sinh học (tức giá trị dinh dưỡng) protein hạt ngũ cốc. Ngoài ra chất lysin về mặt hóa học có chứa 2 gốc amin, đây là trường hợp duy nhất trong số các axít amin cần thiết. Một gốc amin thừa ra trong đó có thể hoàn nguyên thành gốc aldehyd của đường glucose hoặc đường sữa, tạo thành hợp chất đường amino, là loại mà các enzim tiêu hóa không thể phân giải được và cũng không thể hấp thu được. Phản ứng này gọi là phản ứng Melade, xảy ra trong khi tàng trữ và tăng nhiệt quá mức đối với thức ăn, sẽ làm cho hàm lượng lysin vốn đã có tương đối ít trong sản phẩm hạt ngũ cốc lại càng giảm xuống. Vì vậy, tăng thêm một lượng lysin thích hợp vào trong thức ăn sẽ cải thiện được tình trạng dinh dưỡng của những người sống ở vùng dùng hạt ngũ cốc làm lương thực chính.
- Trytophan: Một trong những loại axít amin cần thiết, một loại chất dẫn truyền thần kinh quan trọng có thể tạo ra trong não người, chất 5- hydroxytryptamin có tác dụng trung hoà adrenalin và noradrenalin, đồng thời cải thiện được thời gian liên tục của giấc ngủ. Khi chất 5-hydroxytryptamin trong não động vật giảm, sẽ có biểu hiện hành vi không bình thường, kể cả mất ngủ,... Ngoài ra, chất 5-hydroxytryptamin còn có trong các tổ chức tiểu cầu và tế bào niêm mạc ruột,...
có tác dụng làm co mạch máu rất mạnh. Con người khi bị thương trong cơ thể sẽ phóng thích chất 5-hydroxytryptamin để cầm máu.
- Phenylalanin và tyrosin: Phenylalanin là loại axít amin cần thiết. Cơ thể có thể chuyển hóa phenylalanin thành tyrosin, nhưng không thể xảy ra phản ứng ngược lại. Trong những cơ thể bình thường, hầu như tất cả các phenylalanin chưa được dùng để hợp thành protein đều sẽ chuyển hóa thành tyrosin. Cho nên, khi tyrosin trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được phenylalanin. Tyrosin trong cơ thể sẽ chuyển hóa thành noradrenalin và adrenalin do adrenal medlla tiết ra, và chất mẫn triiodothryonin. Ngoài ra, hắc sắc tố được sinh ra ở da và võng mạc mắt cũng là do tyrosin chuyển hóa thành nhờ tác dụng của các enzim. Những người thiếu phenylalanin decarboxylase do nhân tố di truyền sẽ không thể chuyển hóa phenylalanine thành tyrosine được, và sẽ mắc một loại bệnh khiếm khuyết bẩm sinh, gọi là chứng phenylceton niệu. Bệnh nhân loại này không thể tận dụng được protein trong thức ăn và không thể ăn uống được bình thường.
- Methionin, cystein và cystin. Ba loại axít amin có lưu huỳnh này là nguồn chủ yếu của lưu huỳnh trong thức ăn. Lưu huỳnh là chất không thể thiếu trong việc hình thành nên coenzim A và taurin trong cơ thể. Sự chuyển hóa của 3 loại axít amin này có mối quan hệ tương hỗ với nhau, cystein và cystin có thể chuyển hoán cho nhau. Trong cơ thể, methionin có thể biến thành cystein và cystin lại không thể biến thành methionin được, cho nên cystein và cystin là các loại axít amin không thiết yếu, còn methionin là loại axít amin thiết yếu. Khi cystein và cystin được cung cấp trong bữa ăn dồi dào thì sẽ tiết kiệm được sự tiêu hao methionin.
Sự chuyển hóa methionin có liên quan tới rất nhiều quá trình sinh hóa quan trọng trong quá trình chuyển hóa, trước tiên hình thành một axít amin cung ứng gốc methyl hoạt tính, đó là S-adenosin methionin (còn gọi là methione hoạt tính). Theo nghiên cứu, trong cơ thể có 50 loại chất đòi hỏi S-adenosin methionin cung cấp gốc methyl, như sự sản sinh các chất adrenalin, cholin,
creatin,... axit đều có liên quan đến việc di chuyển gốc methyl.
- Isoleucin, leucin và valin: Cả 3 loại này đều là các axít amin thiết yếu. Trong kết cấu của chúng đều là mạch nhánh (mạch bên hoặc phần nhánh); gọi là các axít amin mạch nhánh.
Các axít amin mạch nhánh chủ yếu là các axít amin tiến hành sự ôxy hóa ở cơ xương, còn các axít amin khác phần nhiều là ôxy hóa ở gan. Trong các trạng thái kích ứng như phẫu thuật, chấn thương,... thì sự hợp thành và phân giải protein có vai trò quan trọng riêng biệt. Các axít amin mạch nhánh có thể làm nguyên liệu để tổng hợp protein cơ bắp; và sẽ bị cơ bắp dùng làm nguồn cung ứng ôxy hóa cho các chất là nguồn năng lượng; ngoài ra, người ta còn phát hiện thấy leucin có thể kích thích sự tổng hợp riêng protein, đồng thời khống chế sự phân giải nó, những năm gần đây đã khiến cho rất nhiều học giả phải chú ý tới trong nghiên cứu về dinh dưỡng ngoại khoa và dinh dưỡng cho vận động viên. - Axit Glutamic: Là một loại hợp chất có liên quan tới công năng của hệ thần
kinh - tiền chất của r- reanal; dinatri glutamat là loại bột ngọt thường dùng. - Histidin: Khử carboxyl (khử COOH) dưới tác dụng của histidin decarbo-
xylase để hình thành nên histamin. Histamin có tác dụng giãn mạch rất mạnh, đồng thời có liên quan tới rất nhiều phản ứng biến thái và chứng viêm.
Lượng nhu cầu các axít amin cần thiết được chỉ ra trong bảng 1.1 sau:
Bảng 1.1: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axít amin cần thiết
(mg/kg cân nặng/ngày) Axít amin Trẻ dưới
1 tuổi Trẻ 2 tuổi 10-12 tuổi Người lớn Tỷ lệ Histidin 28 ? ? (8- 12) (2,9) Isoleucin 70 31 30 10 2,9 Leucin 161 73 45 14 4,0 Lysin 103 64 60 12 3,4 Methionin + Cystin 58 27 27 13 3,7 Phenylalanin+ 125 69 27 14 4,0
Tyrosin
Threonin 87 37 35 7 2,0
Tryptophan 17 12,5 4 3,5 1,0
Valin 93 38 33 10 2,9
Tổng cộng 714 352 261 84
Theo FAO/ WHO, 1983 * Tính theo người lớn
Trị số ước lượng về lượng nhu cầu axít amin được tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO) đưa ra căn cứ theo các tài liệu nghiên cứu khác nhau, xem bảng 1.1.
Bảng 1.2: Đối chiếu các loại axít amin thiết yếu
Axít amin Gạo Tỷ lệ lượng đòi hỏi các axít
amin thiết yếu ở người lớn Hàm lượng (%) Tỷ lệ Ile 5,4 2,1 2,9 Leu 9,0 5,6 4,0 Lys 3,8 2,4 3,4 Met + Cys 4,1 2,7 3,7 Phe + Tyr 4,7 2,9 4,0 Thr 3,9 2,4 2,0 Try 1,6 1,0 1,0 Val 5,5 3,4 2,9
Mô thức axít amin thiết yếu: thường lấy lượng nhu cầu về axít amin trong cơ thể làm cơ sở. Thường là lấy một axít amin có lượng nhu cầu ít nhất là 1,0 rồi so sánh với các axít amin cần thiết khác để tìm ra tỷ lệ của mỗi loại. Chẳng hạn như lấy lượng nhu cầu axít amin cần thiết của người lớn làm ví dụ, thì lượng nhu cầu về tryptophan là ít nhất, lượng nhu cầu mỗi ngày cho mỗi kilôgam cân nặng là 3,5 mg, lượng nhu cầu về isoleucin là 10mg, vậy tryptophan : isoleucin = 3,5:10; nếu
tryptophan là 1,0 thì isoleucin là 2,8, cứ dựa vào đây mà suy ra (bảng 1.2). Với loại Protein hấp thu được trong thức ăn, sau khi tiêu hóa, hấp thu mà càng tiếp cận được với nhu cầu protein được tổng hợp trong cơ thể, thì hiệu suất tận dụng trong cơ thể sẽ càng cao. Cho nên giá trị dinh dưỡng của protein thức ăn được quyết định bởi axít amin cần thiết.
Axít amin hạn chế
Chỉ loại axít amin tương đối thiếu hụt khi đối chiếu giữa hàm lượng axít amin cần thiết trong protein thức ăn, với mô thức axít amin cần thiết, loại axít amin thiếu hụt nhất trong đó được gọi là axít amin hạn chế thứ nhất, tiếp đó là axít amin thứ hai, thứ ba. Chẳng hạn các loại axít amin hạn chế thứ nhất, thứ hai, thứ ba trong gạo sẽ lần lượt là lysin, methionin và phenylalanin (bảng 1.2).
1.2. Định nghĩa và cấu trúc axít amin
Trong hóa học, một axít amin là một phân tử chứa cả nhóm amin và nhóm carboxyl (nhóm axít). Trong hóa sinh, thuật ngữ này còn để chỉ alpha axít amin: những axít amin mà trong đó nhóm amin và carboxylic gắn vào cùng một carbon, gọi là αcarbon
.
Công thức tổng quát của một axít amin như sau:
Trong tự nhiên axít amin tồn tại chính ở dạng α-axít amin, phần lớn các axít amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα). Nguyên tử carbon α không có trung tâm đối xứng nên các axít amin có đồng phân quang học là L - và D - axít amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang học (R=H). Trong tự nhiên chủ yếu tìm thấy là dạng L - axít amin, D - axít amin chỉ tìm thấy trong vi khuẩn, vách tế bào vi khuẩn.
Tất cả các axít amin có ít nhất hai nhóm ion hóa, điện tích chuẩn của axít amin phụ thuộc vào giá trị pH. Nhóm COOH ở nguyên tử α-C có pKa vào khoảng 1,8 đến 2,8 do đó nó có độ axit hơn các monocarboxylic thông thường khác. Tính
bazơ của α-amin cũng thay đổi, pKa vào khoảng 8,8 đến 10,6 tùy thuộc vào từng axít amin. Bảng chức năng của axít amin và tên gọi, cấu tạo của các axít amin tạo nên protein được chỉ ra tại Phụ lục 1.
1.3. Tính chất hóa lý của protein và axít amin
1.3.1. Tính chất biến tính
Protein dưới tác dụng của các tác nhân vật lý như nhiệt độ cao, áp suất lớn hoặc các tia UV, tia X hoặc các chấn động cơ học, các tác nhân hóa học (kiềm hay axít) ion kim loại nặng Cu2+, Pb2+,… làm cho cấu trúc bậc 2, 3, 4 bị phá huỷ cấu trúc bậc 1 vẫn giữ nguyên làm cho tính chất của protein bị thay đổi đó là hiện tượng protein bị biến tính.
Tính chất của protein sau khi biến tính:
- Giảm khả năng hòa tan do làm lộ các nhóm kỵ nước - Giảm khả năng giữ nước - Mất các hoạt tính sinh học - Tăng khả năng tấn công Protease - Làm giảm sức căng bề mặt - Tăng độ nhớt nội tại - Mất khả năng kết dính
1.3.2. Các tác nhân gây biến tính
* Nhiệt độNhiệt độ cao làm biến tính protein làm các mạch của protein bị dãn ra. Vận tốc biến tính phụ thuộc vào nhiệt độ, vận tốc tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 100C như vậy năng lượng liên kết làm bền cấu trúc của protein là yếu. Sự biến tính của protein do nhiệt độ phụ thuộc vào bản chất và nồng độ của protein, hoạt độ nước, độ pH, bản chất của các ion có mặt trong đó.
Sau khi biến tính nhiệt độ phân huỷ của protein bị giảm xuống là do xuất hiện các nhóm kỵ nước ở bề mặt phân tử làm cho các phân tử protein bị giãn mạch và tập hợp lại.
* Biến tính do xử lý cơ học
Các xử lý cơ học như nhào trộn cũng làm biến tính protein do phá huỷ cấu trúc xoắn của protein.
* Biến tính bởi các tia UV, X
Dưới tác dụng của tia UV và tia X các axít amin mạch vòng bị đứt vòng và đứt liên kết disulfid S S phá huỷ cầu đồng hóa trị tạo thành các gốc protein tự do gây ra phản ứng trùng hợp protein.
* Biến tính bởi các ion kim loại nặng
Ion kim loại nặng có khả năng tạo phức với nhóm (S H) trong phân tử axít amin và làm cho protein bị biến tính.
* Biến tính bởi dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ làm biến đổi hằng số điện môi của môi trường và như vậy cũng làm biến đổi lực hút tĩnh điện của protein.
Các dung môi hữu cơ không phân cực sẽ xâm nhập vào các vùng kỵ nước phá huỷ các tương tác kỵ nước và làm biến tính protein.
Các yếu tố làm biến tính protein thường được để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch và làm ngưng phản ứng enzym.
1.3.4. Tính chất lưỡng tính
Axít amin và protein đều có tính chất lưỡng tính tức là vừa có tính axít vừa có tính bazơ. Phân tử axít amin có nhóm amin và nhóm carboxyl trong phân tử. Ở pH trung tính axít amin tồn tại ở dạng ion lưỡng cực và trạng thái ion phụ thuộc vào pH của môi trường. Khi đặt axít amin trong điện trường thì tuỳ thuộc vào pH mà di chuyển về catot hay anot, ở một pH nào đó thì axít amin không di chuyển về bên nào, đó là điểm đẳng điện của axít amin.
Như vậy protein cũng là lưỡng tính vì trong phân tử có nhiều nhóm axít amin.
1.3.5. Tính kỵ nước
từ protein hoặc biết được vị trí của protein trong hay ngoài màng phospholipit. Mức độ kỵ nước trung bình được tính theo công thức G0= n G
0 Trong đó: G0: là năng lượng vận chuyển tự do n : số gốc axít amin Nếu G0> 5.85 kJ thì dịch thuỷ phân có vị đắng 0 G < 5.43 kJ thì dịch thuỷ phân không có vị đắng1.3.6. Tính chất hóa học của protein và axít amin
Do trong phân tử protein có nhiều chuỗi polipeptid nên ta có thể chia thành các nhóm phản ứng sau:
- Phản ứng của liên kết peptid - Phản ứng thủy phân bởi enzym
- Phản ứng đặc trưng của một số gốc axít amin trong phân tử - Phản ứng của nhóm - amin tự do của chuỗi polipeptid Phản ứng thủy phân bởi enzym
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thủy phân thành các axít amin và mỗi một phản ứng phải cần một enzym đặc hiệu để xúc tác cho phản ứng đó. Phản ứng Biurê
Phản ứng Biurê là phản ứng đặc trưng của liên kết peptid. Trong môi trường kiềm mạnh liên kết peptid trong phân tử protein phản ứng với CuSO4 tạo
thành phức chất có màu tím hoặc đỏ. Phản ứng này được dùng để phát hiện định tính và định lượng Protein.
Phản ứng với thuốc thử Folin
Protein có khả năng phản ứng với thuốc thử Folin tạo thành dung dịch có màu xanh da trời có cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng protein trong một giới hạn nhất định và có thể đo được bằng máy đo quang và dựa vào đường chuẩn ta có thể tính được hàm lượng của protein thành phần.
Phản ứng với Ninhydrin:
Đây là phản ứng màu dùng để định tính và định lượng axít amin. Tất cả các - axít amin của protein đều có phản ứng với ninhydrin tạo thành hợp chất có màu xanh tím, riêng prolin thì tạo thành màu vàng. Do phản ứng này rất nhạy, có thể phát hiện đến ppm.
Phản ứng của nhóm - amin với formaldehyd: đây là phản ứng quan trọng dùng để đánh giá mức độ thủy phân của protein. Phương pháp xác định nitơ theo phương pháp này gọi là phương pháp định lượng nitơ formol. Ngoài ra axít amin còn có một số tính chất riêng như sau:
- Axít amin có khả năng kết tinh
- Bền với nhiệt độ khoảng 1000C đến 2000C trong 2 giờ
- Khá bền trong môi trường axít, không bền trong môi trường kiềm (trong môi axít chỉ có trytophan bị phá huỷ)
- Tính chất đồng phân quang học (hoạt quang)
-
Tất cả các axít amin đều có đồng phân quang học (trừ Glycin)-
Đa số các axít amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axít amin (chỉ ở dạng này thì các axít amin giá trị dinh dưỡng con người và động vật).1.4. Tổng quan về các phương pháp định lượng protein và axít amin
Các phương pháp thông thường định lượng axít amin dựa chủ yếu vào sự có mặt của nitơ trong phân tử axít amin. Vì khối lượng phân tử của các axít amin khác nhau, nên kết quả thường biểu thị bằng nitơ axít amin.
1.4.1. Định lượng nitơ toàn phần bằng phương pháp Kjeldahl [9]
Phương pháp định lượng nitơ toàn phần đơn giản và chính xác là phương pháp Kjeldahl. Thực phẩm được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc có chất xúc tác.
Sau khi vô cơ hóa, nitơ tồn tại ở dạng muối amoni sunfat (NH4)2SO4, dùng một
kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 thành NH3 tự do và
phần trong mẫu thử.
Phương pháp Kjeldahl định lượng nitơ toàn phần nghĩa là nitơ của protít thô (gồm nitơ protein, péptit, polypeptid và nitơ của các chất phi protein).
1.4.2. Định lượng protein hòa tan [9]
Phương pháp định lượng protein hòa tan dựa vào việc tách và kết tủa protein ra khỏi chất thử, rồi định lượng nitơ trong kết tủa protein theo phương pháp Kjeldahl.
1.4.2.1. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp thông thường Phương pháp Stutzer-Barnstein [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng đun sôi với nước. Kết tủa protein bằng CuSO4
trong môi trường kiềm. Tách kết tủa bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp dùng axit tricloacetic (theo Greenwald) [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng axít tricloacetic để qua đêm. Tách kết tủa bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng axít tricloacetic loãng. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng tananh (theo Mothes) [9]
Chiết protein từ thực phẩm bằng nước. Kết tủa protein bằng tananh. Tách kết tủa bằng cách lỏng qua giấy lọc, rửa sạch tủa bằng nước cất. Định lượng nitơ toàn phần trong kết tủa bằng phương pháp Kjeldahl.
Phương pháp sử dụng natrisulfat và cồn ở môi trường axit [9]
Kết tủa protein bằng dung dịch natri sulfat bão hòa và cồn 78oC ở môi trường axit. Định lượng phần nitơ phi protein trong dịch lọc bằng phương pháp Kjeldahl. Nitơ protein được tính bằng nitơ tổng số trừ nitơ phi protein.
1.4.2.2. Định lượng protein hòa tan bằng phương pháp so màu [9]
Trong môi trường kiềm, protein kết hợp với Cu2+ thành phức chất màu tím (phản ứng này còn gọi là phản ứng Biurê) có công thức như sau:
N Cu N OH OC NH OC NNa OH OC NH OC NNa OH OH
Màu sắc của phức tỷ lệ với số lượng mạch peptid (-CONH-) của protein và gần như không phụ thuộc vào nồng độ tương đối giữa albumin và globulin. Dựa vào việc so sánh tỷ lệ màu của dãy chuẩn protein và mẫu thử protein đã được tách ra khỏi thực phẩm bằng máy quang kế ở bước sóng λ = 550 nm tính được hàm lượng protein hòa tan trong mẫu thực phẩm.
1.4.3. Định lượng protein tiêu hóa bằng pepsin [9]
Mẫu thực phẩm được trộn cùng với men pepsin trong một cốc thủy tinh, ủ trong tủ ấm 37 - 40OC trong 48 giờ, thỉnh thoảng lắc. Lọc lấy phần không hòa tan loại protein tiêu hóa bằng pepsin, định lượng nitơ trong phần không hòa tan bằng phương pháp Kjeldahl. Nitơ của protein tiêu hóa bằng pepsin được tính bằng hiệu nitơ toàn phần trừ đi nitơ của phần không hòa tan.
1.4.4. Định lượng nitơ axít amin bằng phương pháp chuẩn độ
1.4.4.1. Định lượng nitơ formol [9]Các axít amin trong dung dịch nước thường trung tính, không những do hai nhóm chức axit (-COOH) và nhóm amin (-NH2) trung hoà lẫn nhau, mà còn do cả
hai nhóm chức ấy đều yếu, quá trình điện ly rất kém. Khi gặp formol nhóm NH2,
kết hợp với formol thành nhóm metylenic - N = CH2 mất tính chất kiềm, do đó tính
chất của nhóm axit COOH nổi bật lên và có thể định lượng được bằng cách chuẩn độ kiềm dùng phenolphtalein làm chỉ thị màu. Phản ứng như sau:
R CH COOH NH2 + OCH2 R CH N CH2 COOH H2O
1.4.4.2. Định lượng nitơ axít amin bằng iốt [9]
Trong môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các axít amin phản ứng với muối đồng tạo thành một phức chất “axít amin - đồng” hòa tan, theo phản ứng: COOH NH2 R CH Cu2+ COOH CH H2N R CH N H2 Cu O C N H2 CH C O O O R R
Định lượng Cu2+ trong phức chất theo phương pháp định lượng gián tiếp bằng iốt.
2Cu
2+4KI
2CuI
I
2I
2Na
2S
2O
3Na
2S
4O
62NaI
Từ đó tính ra được hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.
1.4.4.3. Định lượng axít amin theo phương pháp Van Slyke [9]
Axít amin trong môi trường axít nitric sẽ phản ứng tạo ra khí N2 ở thể tự do
theo phản ứng: R CH NH2 COOH R CH COOH OH H2O O N OH N2
Khí N2 giải phóng một nửa là từ axít amin, một nửa từ axit nitric. Xác định thể
tích N2 ở điều kiện nhiệt độ và áp suất, tra bảng tính sẵn, sẽ có trọng lượng nitơ. Từ
đó tính ra hàm lượng nitơ axít amin trong mẫu thử.
1.4.5. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axít amin
Nhược điểm của các phương pháp xác định protein và axít amin đã đề cập ở trên là chỉ xác định được tổng số nitơ mà không thể xác định được riêng rẽ từng axít amin. Để khắc phục nhược điểm này thì phải tách từng chất nhóm axít amin trước khi xác định chúng. Điều này ngoài việc xác định được từng axít amin riêng biệt mà còn tránh được ảnh hưởng của các nitơ khác đến việc xác định axít amin. Có nhiều phương pháp để định lượng axít amin, mỗi phương pháp có độ nhạy và khả năng
phân tích rất khác nhau. Phần lớn các phương pháp phân tích định lượng riêng biệt từng axít amin dựa trên việc tách axít amin thành dạng tự do bằng sắc ký trao đổi ion sau đó phát hiện bằng dẫn xuất sau cột hoặc trước cột. Kỹ thuật xác định sau cột được áp dụng với mẫu có hàm lượng muối tạp thấp. Kỹ thuật tách và xác định axít amin bằng phản ứng dẫn xuất trước cột và sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược cho độ nhạy cao hơn so với dẫn xuất sau cột và đặc biệt là kỹ thuật trước cột có thể áp dụng phân tích với các mẫu có chứa nhiều muối.
1.4.5.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển 1.4.5.1.1. Phương pháp sắc ký bản mỏng
Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey, J. L., [20] rất dễ thực hiện. Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axít amin. Tác giả Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Như Thuận [9] đã dùng pyridin làm dung môi triển khai chạy sắc ký bản mỏng, sau khi các axít amin được tách riêng trên bản mỏng, dựa vào chiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axít amin. Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác không cao. Ngày nay với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axít amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa.
1.4.5.1.2. Phương pháp sắc ký cột
Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ bản đơn giản, nó là nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này.
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W. H., [64, 65] và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axít amin ở nhiều đối tượng khác nhau [17, 20, 21, 42, 43, 56, 63, 64, 65, 66, 71, 76]. Nguyên lý cơ bản là axít amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, phản ứng với ninhydrin tạo phức chất màu vàng, đo độ hấp thụ quang của phức màu thu được bằng quang kế có bước sóng 440 nm và 570 nm cho giới hạn xác định đến 10 pM với hầu hết các axít amin và 50 pM với prolin. Mặc dù phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã thực sự phát triển và áp dụng xác định axít amin ở nhiều
đối tượng, nhưng phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột ninhydrin vẫn được áp dụng và tiếp tục hoàn thiện cho tận đến ngày nay do sử dụng thiết bị rẻ tiền, thuận tiện cho phân tích lượng lớn. Bằng việc thay chuẩn hóa thời gian, ổn định nhiệt độ, nhiệt độ dẫn xuất, pH và môi trường đệm chạy sắc ký, đặc biệt là thay thế dung dịch rửa giải là hỗn hợp lithi hydroxyd/axit acetic được thay thế bằng natri hydroxyt/axit acetic Shi-Wen Sun, Yi-cheng Lin & cộng sự [73] đã rút ngắn được thời gian chỉ còn 30 phút khi tách và xác định đồng thời 10 axít amin.
Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột là o-phthalaldehyd (OPA), các axít amin sau khi được tách ra khỏi cột trao đổi ion được dẫn xuất bằng OPA tạo phức chất có tính chất phát huỳnh quang, đo huỳnh quang ở bước sóng kích thích 348nm và bước sóng phát xạ là 450 nm. Phương pháp có thể tách và xác định đồng thời các axít amin bậc 1 với giới hạn phát hiện đạt tới 20 pM [43]. Dẫn xuất OPA có hạn chế lớn là không phản ứng được với các axít amin bậc 2.
Phương pháp tách sắc ký cột cổ điển là phương pháp đơn giản có thể áp dụng cho bất kỳ phòng thí nghiệm nào. Tuy nhiên, do thời gian tách lâu, khả năng tách không cao so với các kỹ thuật hiện đại nên nó chỉ được áp dụng trong các đối tượng tách đơn giản.
1.4.5.1.3. Phương pháp chuẩn độ điện thế [19]
Trong phương pháp này, sau quá trình xử lý mẫu để tách các axít amin ra khỏi nền mẫu và loại các chất ảnh hưởng, các axít amin sẽ được tách trên cột sắc ký: 500 - 22 mm, 30 ml, Dowex 50W-X8 (dạng H+) và chuẩn độ điện thế theo từng phân đoạn tách. Ser, Thr, Asp sẽ được rửa giải với HCl 0,8M với tốc độ dòng qua cột là 0,5ml/phút, sau khi HCl 0,8M đi ra khỏi cột. Thêm HCl 1M và điều chỉnh tốc độ dòng đến 25-30 giọt/phút để rửa giải Glu và Gly. Các phần dịch rửa giải ở các phân đoạn khác nhau được được cho vào các cốc thuỷ tinh và điều chỉnh pH=7 với NaOH 0,1M. Dung dịch HCHO 37% cũng được điều chỉnh về pH=7 với NaOH 0,1M. Sau đó phần mẫu thử và dung dịch HCHO được trộn với nhau theo tỷ lệ 1:9 bằng máy khuấy từ 10 phút. Chuẩn độ hỗn hợp trên bằng phương pháp đo điện thế với NaOH 0,1M. Song song mẫu trắng được tiến hành bằng việc chuẩn độ tới pH =
8,9 hỗn hợp của HCHO với HCl 1M (1:9) đã được trung hòa tới pH = 7.
Từ lượng NaOH 0,1M tiêu tốn để chuẩn độ mẫu thử và mấu trắng tính ra được hàm lượng các axít amin bằng bảng quy đổi [19].
1.4.5.2. Phương pháp sắc ký khí
Sắc ký khí (Gas chromatography: GC) là một kỹ thuật tách và phân tích đồng thời các chất trong một hỗn hợp mẫu ở trạng thái khí, phương pháp này rất phát triển trong những năm gần đây sử dụng để phân tích định tính và định lượng các chất hữu cơ trong một hỗn hợp mẫu phức tạp.
Tác giả Y. C. Fiamegos, C. D. Stalikas [82] đã tách và xác định được 19 axit amin trong nước tiểu, nước hoa quả và bột mì bằng phương pháp sắc ký khí với detectơ khối phổ (GC/MS) và detectơ ion hóa ngọn lửa (GC/FID). Theo phương pháp này, các axít amin tự do được chuyển thành dạng pentaflorobenzyl nhờ xúc tác chuyển pha tetrabutylamoni bromua, được dẫn xuất hóa thành dạng dễ bay hơi với pentaflorobenzyl bromid, chiết bằng diclormetan rồi phân tích bằng phương pháp GC/MS và GC/FID. Còn đối với các axít amin liên kết với protein sẽ được phân tích sau bước thủy phân bằng NaOH 5M. Giới hạn phát hiện của phương pháp nằm trong khoảng 0,7 - 2,3 pM với GC/MS và từ 1,7 - 6,9 pM với GC/FID.
Cũng với detectơ khối phổ nối tiếp, nhưng tách bằng hệ thống sắc ký lỏng mao quản, tác giả Y. Song và cộng sự [81] đã tách và xác định được 12 axít amin được dẫn xuất với 7-floro-4-nitrobenzoxadiazol trong các mẫu sinh học. Quá trình dẫn xuất được thực hiện ở nhiệt độ cao, nồng độ axít amin đem dẫn xuất có thể thấp tới 2,5 × 10-7 M. Độ thu hồi của phương pháp này đạt trên 97%.
Tác giả H. Ali và cộng sự [36] đã tách và định lượng được các đồng phân hình học D, L của các axít amin trong thuốc lá và các sản phẩm thuốc lá sử dụng sắc ký khí khối phổ (GC-SIM-MS). Các axít amin được tách ra khỏi các mẫu thuốc lá bằng dung dịch metanol 70% và được làm sạch qua cột trao đổi cation. Sau đó, chúng được chuyển thành dạng este N(O)-pentafloropropionyl axít amin (2)-propyl và các đồng phân hình học được tách và định lượng bằng GC-SIM-MS trên cột mao quản Chirasil-L-Val.
