Técnicas de isolamento de organelos

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Técnicas de isolamento de

organelos

Estudo de

processos

metabólicos

Fraccionamento

celular e

isolamento de

organelos ou

partículas

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Estrutura duma célula animal

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Organelos duma célula eucariótica

• Lisossomas • Peroxissomas • Mitocôndrias • Cloroplastos

• Retículo endoplásmico (ER) • Complexo de Golgi • Núcleo • (Citosol)

Lisossomas

• Responsáveis pela degradação de: alguns componentes celulares material captado do meio extracelular • Características: – membrana única – pH do lumen ≅5 – hidrolases ácidas catalisam reacções de degradação

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Peroxissomas

• Responsáveis pela degradação de: ácidos gordos compostos tóxicos • Características: – membrana única – contém oxidases e catalase

Mitocôndrias

• Local da produção aeróbica de ATP • Características: – membrana externa – espaço intermembranar – membrana interna – matriz

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Cloroplastos

• Local da fotossíntese nas plantas e algas verdes • Características: – membrana externa – espaço intermembranar – membrana interna – estroma – membranas tilacóides – lumen dos tilacóides

Retículo endoplásmico (ER)

• Responsável por:

parte da síntese lipídica maioria da síntese proteica armazenamento do ião Ca++ destoxificação

• Características:

– rede de túbulos e vesículas membranares fechadas e interligadas

– composto por regiões lisas e rugosas

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Complexo de Golgi

• Modifica e exporta muitos produtos do ER

• Características:

– compartimentos e vesículas achatadas

– composto por 3 regiões: cis (entrada), media, trans (saída)

– cada região contem um conjunto de enzimas diferente

Núcleo

• Separa: – o DNA do citosol – a transcrição e a tradução • Características: – membrana externa – membrana interna – poros nucleares – nucléolo

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Citosol

• Porção da célula envolvida pela membrana plasmática mas que não é parte de nenhum organelo

• Características: – citoesqueleto – polirribossomas – diversidade de enzimas do metabolismo

Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

- dispersão do tecido

- ruptura controlada das células - libertação dos organelos

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Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

2. Fraccionamento

- separação do homogenato em partículas - recorre, p.ex., a diferenças de tamanho/forma, densidade, carga superficial

Fraccionamento celular

1.Disrupção/homogenização

2. Fraccionamento

3. Análise

- microscopia - enzimas marcadores

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1.Disrupção/homogenização

-dispersãodo tecido e ruptura controladadas células -métodoe dimensões do aparelho adaptadas a cada caso

(eficiênciaeficiênciaeficiência da ruptura vs. minimizar danos mecânicoseficiência minimizar danos mecânicosminimizar danos mecânicosminimizar danos mecânicos)

m m m

méééétodostodostodostodos

osmóticos (lise hipotónica) digestão enzimática (ex. lipases, proteases) mecânicos ex. métodos mecânicos: homogenizador tipo Potter misturador comercial homogenizador de lâminas

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RUPTURA DO RUPTURA DO RUPTURA DO RUPTURA DO TECIDO/C TECIDO/C TECIDO/C

TECIDO/CÉÉÉÉLULAS:LULAS:LULAS:LULAS:

Organelos retirados do meio envolvente

utiliza utiliza utiliza

utilizaçççção de meio ão de meio ão de meio ão de meio de extrac

de extrac de extrac

de extracççççãoãoãoãoisoisoiso iso----osm

osm osm

osmóóóóticoticoticoticop.exp.exp.exp.ex., ., ., ., com sacarose ou com sacarose ou com sacarose ou com sacarose ou sorbitol sorbitol sorbitol sorbitol Solu Solu Solu

Soluçççção tampãoão tampãoão tampãoão tampão

mant mant mant mantéééém pHm pHm pHm pH libertação de proteases, lipases, (ex.dos lisossomas)

realizar todo o processo a realizar todo o processo a realizar todo o processo a realizar todo o processo a

baixa temperatura baixa temperatura baixa temperatura baixa temperatura((((≈≈≈≈4444ººººC)C)C)C) libertação de ácidos e outras substâncias acumuladas nalguns organelos desnaturação proteica oxidações (>O2, oxidases) Substâncias SubstânciasSubstâncias Substâncias antioxidantes antioxidantes antioxidantes antioxidantes

((((ex.cex.cex.c/SH)ex.c/SH)/SH)/SH)

2. Fraccionamento

- separação dos homogenato em partículas com base essencialmente em diferenças nas suas propriedades físicas alguns alguns alguns alguns m mm

méééétodostodostodostodos

centrifugação (≠tamanho/forma e/ou densidade) electroforese (≠carga eléctrica) cromatografia (≠ solubilidade, dimensão, etc)

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-podem usar-se vários métodos em sequência - separação de organelos quase sempre recorre àcentrifugação

CENTRÍFUGA

(ou CENTRIFUGADORA):

Geralmente tem um motor, que faz rodar um

rotor

que contém tubos com as amostras

experimentais.

Pode ser refrigerada.

CENTRIFUGAÇÃO

Utilização da força centrífuga para separar

componentes biológicos com base nas suas

propriedades de sedimentação.

UTILIZAÇÕES PRINCIPAIS:

separar matéria sólida separar estruturas ou macromoléculas de diferente massa ou densidade, presentes numa solução.

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Rotor basculante

-mais fácil retirar o sobrenadante sem deslocar o resíduo do fundo do tubo

-MAS… não permite velocidades de rotaçãotão elevadas como rotores de ângulo fixo.

sobrenadante sobrenadante

resíduo resíduo resíduo

Rotor de ângulo fixo

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PRINCÍPIOS DA CENTRIFUGAÇÃO

F_c=mω2_r força de sedimentação duma partícula de

massa m; ωωωω-velocidade angular do rotor;

r-distância da partícula ao eixo de rotação

OU SEJA, QUANTO MAIOR FOR A MASSA DE UMA PARTÍCULA E MAIOR A FORÇA CENTRÍFUGA, MAIS RAPIDAMENTE ELA SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA.

-

Forças que se opõem

à centrifugação:

1. força de impulsão

ou flutuação

2. Resistência da fricção (atrito)

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1. força de impulsão

ou flutuação

:

F

_i

=m

ω

2

_r

νρ

ν_{−volume parcial específico da partícula;}

ρ−densidade da solução

Fc= m

ω

2

_r

−

_m

ω

2

_r

νρ =

_m

ω

2

_r(1-

νρ)

OU SEJA:

- QUANTO MAIS DENSA FOR UMA PARTÍCULA (i.e., menor for ν), MAIS RAPIDAMENTE SE DESLOCA NUM CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA

- QUANTO MAIS DENSA FOR A SOLUÇÃO, MAIS

LENTAMENTE UMA PARTÍCULA SE DESLOCA NUM

CAMPO DE FORÇA CENTRÍFUGA.

2. força de atrito

- depende de factores como a

viscosidade do

meio, a forma da partícula, etc

QUANTO MAIOR FOR O COEFICIENTE DE

ex:

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TIPOS DE CENTRIFUGAÇÃO

-

Centrifugação diferencial

-

Centrifugação em gradientes de densidade

-

Centrifugação diferencial:

-centrifugações sequenciais, a velocidades cada vez mais elevadas

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Fraccionamento celular por centrifugação

diferencial

-

Centrifugação em gradientes de densidade

inicial _final

força centrífuga

partículas mais densas partículas de densidade intermédia

partículas menos densas aumento

da densidade do meio

- a densidade da solução aumenta ao longo do tubo - as partículas distribuem-se de acordo com as densidades

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Separação de organelos por

centrifugação em gradientes de

densidade

CONVERSÃO RCF/r.p.m

- Aceleração duma centrífuga expressa normalmente

em

RCF

(força centrífuga relativa à aceleração da

gravidade)

- RCF expresso em xg

- centrífugas regulam-se em rotações por minuto

(r.p.m.)

para obter a mesma força centrífuga em rotores

de diferentes raios r, e centrífugas diferentes:

RCF=1,19x10

-5

_(r.p.m.)

2

_r

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3. Análise

microscopia (c/ corantes específicos) alguns algunsalguns alguns m mm

méééétodostodostodostodos actividade de enzimas _{marcadores (específicos}

dum determinado organelo)

pigmentos ou proteínas específicas concentração de proteína

Alguns marcadores:

Componente Componente Componente

Componente celularcelularcelularcelular MarcadorMarcadorMarcadorMarcador

Núcleo DNA

Mitocôndrias Succinato desidrogenase citocromo oxidase

Lisossomas fosfatase ácida

Peroxissomas catalase

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1. Homogenizar num meio isotónico (MI)

2. Filtrar através de gaze para um tubo de centrífuga

3. Centrifugar 1000x g , 5 min sobrenadante pos - nuclear fracção nuclear 4. Deitar sobrenadante num tubo limpo

5. Centrifugar 10.000x g , 5 min sobrenadante pos - mitocondrial fracção mitocondrial 6. decantar sobrenadante e ressuspender fracção mitocondrial Pr PrPr

Próóóóximo trabalho:ximo trabalho:ximo trabalho:ximo trabalho:

disrup disrup disrup

disrupççççãoãoão////homogenizaãohomogenizahomogenizaççççãohomogeniza ãoãoão (almofariz + areia de quartzo) (almofariz + areia de quartzo) (almofariz + areia de quartzo) (almofariz + areia de quartzo)

aten aten aten

atençççção aos componentes do meio de ão aos componentes do meio de ão aos componentes do meio de ão aos componentes do meio de homogeniza

homogeniza homogeniza homogenizaççççãoãoão!!!!ão

1. Homogenizar num meio isotónico (MI)

2. Filtrar através de gaze para um tubo de centrífuga

3. Centrifugar 1000x g , 5 min sobrenadante pos - nuclear fracção nuclear 4. Deitar sobrenadante num tubo limpo

5. Centrifugar sobrenadante pos - mitocondrial fraccionamento fraccionamento fraccionamento fraccionamento (centrifuga (centrifuga (centrifuga (centrifugaçççção ão ão ão diferencial) diferencial) diferencial) diferencial)

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análise de:

• Consumo de oxigénio

• Proteína

• Actividade da succinatosuccinatosuccinatosuccinato desidrogenase desidrogenasedesidrogenase desidrogenase