PESQUISA DE LEPTOSPIRA EM FETOS DE VACAS
ABATIDAS NO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL
F.S. Magajevski, R.J.S. Gírio, R.B. Meirelles
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/no, CEP
14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: f_magajevski@yahoo.com.br RESUMO
Amostras de sangue de 212 vacas prenhas foram coletadas no momento do abate, em um abatedouro do Estado de São Paulo, para investigar a ocorrência de anticorpos contra Leptospira spp. pela prova de soroaglutinação microscópica (SAM). As fêmeas e seus respectivos fetos foram marcados, o sangue dos fetos foi colhido para a realização da SAM. Conteúdo estomacal, rim e fígado desses fetos e a placenta das fêmeas foram colhidos para detecção de leptospiras por meio de cultivo microbiológico e PCR. Noventa e cinco das 212 vacas avaliadas (44,81%) foram reagentes para pelo menos um dos 24 sorovares de leptospiras utilizados na SAM. Foram encontrados anticorpos para os sorovares Hardjo (44,7%), Wolffi (28,5%), Icterohaemorrhagiae (22,9%), Pomona (2,2%) e Grippotyphosa (1,7%); e os títulos variaram de 50 (24,6%) a 1.600 (0,6%). Nenhum soro fetal foi reagente na SAM a partir da diluição de 1/10. Pelo PCR não foi detectado leptospira em nenhuma das amostras clínicas, no entanto três isolamentos foram confirmados por essa técnica, duas de rim e uma de fígado. Os dados obtidos sugerem que, em muitos casos, mesmo com a mãe sororreagente, o feto pode não desenvolver anticorpos, embora possa albergar leptospiras em seus órgãos.
PALAVRAS-CHAVE: leptospira, feto, bovinos, frigorífico. ABSTRACT
INVESTIGATION OF LEPTOSPIRA IN FOETUSES OF COWS SLAUGHTERED IN THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL. Blood samples of 212 pregnant cows were collected, at the moment of slaughter, in a slaughterhouse of the State of São Paulo, Brazil, to investigate the occurrence of antibodies to leptospira by the microscopic agglutination test (MAT). The cows and their respective foetuses were marked, and the blood of the foetuses was collected to carry out the MAT. Stomach contents, kidney and liver of the foetus, and the placenta of the cows were collected for leptospira detection by microbiologic culture and PCR. Ninety-five of 212 evaluated cows (44.81%) reacted to at least one of the 24 leptospira serovars used in the MAT. Antibodies were found to serovars Hardjo (44.7%), Wolffi (28.5%), Icterohaemorrhagiae (22.9%), Pomona (2.2%) and Grippotyphosa (1.7%); and the titres varied from 50 (24.6%) to 1,600 (0.6%). No fetal serum reacted in the MAT in the dilutions of 1/10 or higher. PCR did not detect leptospira in the clinical samples, however three culture isolates were confirmed by this technique from kidney and from liver. The data obtained suggest that, in many cases, even when the mother is a seroreactor, the foetus may not develop antibodies, although it may have leptospiras in its organs.
KEY WORDS: Leptospira, foetus, bovine, slaughterhouse.
Projeto financiado pela Fapesp. INTRODUÇÃO
A leptospirose é uma das principais doenças da esfera reprodutiva, causando principalmente abor-tos, infertilidade, natimortos e retenção placentária, participando como uma das grandes responsáveis
pela baixa produtividade da pecuária mundial (GIVENS,
2006).
A transmissão da Leptospira spp. na espécie bovi-na pode ocorrer de forma indireta, pelo contato com água e solos contaminados, e pelo modo direto, prin-cipalmente pela via venérea (AMATREDJO et al., 1975). A
transmissão transplacentária também é comum entre os animais (BRASIL, 1995). Uma vez infectados, os
bovinos eliminam o agente na urina por um período de tempo variável, que pode chegar a mais de um ano
(HANSON, 1982; THIERMANN, 1984); a leptospirúria em
bovinos pode persistir por dez dias a quatro meses, tendo caráter intermitente (REBHUN, 1995).
FREITAS et al. (2004), utilizando um protocolo
dife-renciado de cultivo, obteviveram o isolamento de leptospiras da urina de 3 bovinos naturalmente infectados, com 100% de eficiência.
MAGAJEVSKI et al. (2005), estudando amostras
pareadas de sêmen e de urina de 10 touros natural-mente infectados com Leptospira interrogans sorovar Hardjo, detectaram DNA de leptospira em apenas uma amostra de urina e em nenhuma das amostras de sêmen. No entanto, 15% dessas amostras foram posi-tivas no isolamento em meio de cultivo, alertando para o fato de que diferentes técnicas de extração de DNA e os “primers” utilizados podem fornecer dife-rentes resultados.
ELLIS et al. (1982), examinando fetos bovinos
abor-tados, constataram que em 41,6% havia a presença do sorovar Hebdomadis e que 68% desses fetos eram provenientes de propriedades com problemas reprodutivos.
KOLEV et al. (1983) investigaram 231 amostras de
sangue de vacas que haviam abortado, dado à luz bezerros mortos ou que apresentaram falhas na con-cepção, constatando que 6,06 % foram atribuídos à leptospirose.
ELDER et al. (1985) investigaram a relação entre
abortamentos e títulos de anticorpos antileptospira em rebanhos bovinos de leite e de corte. Os títulos sorológicos encontrados foram significativamente relacionados com a alteração reprodutiva, e o sorovar Pomona foi mais freqüente que o Hardjo.
ELLIS et al. (1986) detectaram a presença do sorovar
Hardjo no útero, nas tubas uterinas, nos ovários e na vagina de vacas não prenhes, infectadas experimen-talmente. De 60 vacas examinadas, 39 (65%) apresen-taram o microorganismo no trato genital, e 35 (62%), nas vias urinárias.
KIRKBRIDE et al. (1989) testaram 773 soros fetais
bovinos verificando que 52 foram positivos à prova de soroaglutinação microscópica para pelo menos um dos cinco sorovares de leptospira utilizados. Pelo teste com anticorpos fluorescentes, não foi detectada leptospira nos fetos que apresentaram título de anticorpos, porém, por essa técnica, a leptospira foi detectada em 15 bezerros abortados, mas negativos na soroaglutinação microscópica (SAM).
Em um surto de leptospirose bovina no Estado de Minas Gerais, MOREIRA et al. (1993) verificaram que a
ocorrência de abortamento, mastite, morte fetal e
infertilidade foi mais freqüente nos animais que apre-sentaram aglutininas contra os sorovares Hardjo e Wolffi.
DHALIWAL et al. (1996) estudaram a importância do
sorovar Hardjo no desempenho reprodutivo de vacas leiteiras de diferentes rebanhos com leptospirose. Concluíram que esse sorovar pode causar alterações na reprodução, provocando principalmente casos de abortamento e queda de fertilidade.
SMYTH et al. (1999) examinaram 356 vacas que
pariram natimortos ou animais com síndrome do bezerro debilitado, verificaram que nos animais em que foram detectadas leptospiras na placenta houve um emagrecimento de seis a dez Kg de peso vivo, o que não ocorreu nas vacas com placenta negativa; além disso, as vacas com placenta positiva foram mais susceptíveis a outras infecções por agentes como
Actinomyces pyogenes e Bacillus sp. Nesse trabalho, em 8,9% das placentas examinadas foi detectado antígeno de leptospira.
GUITIÁN et al. (2001) em vacas leiteiras com
desen-volvimento reprodutivo deficiente na Galícia – Espanha, constataram que 81 (18,33%) de 442 vacas foram positivas na prova de SAM.
MOORE et al. (2003) observaram que entre 95 fetos
abortados no sétimo mês de gestação, cinco (5,2%) apresentaram anticorpos contra Leptospira spp. em rebanhos leiteiros e de corte dos pampas Argentinos.
ATXAERANDIO et al. (2005), no norte da Espanha,
encontraram um percentual de 25,4% de animais sororreagentes para o sorovar Bratislava, seguido dos sorovares Hardjo (8,2%), Pomona (7,7%), Autumnalis (0,7%) e Copenhageni (0,1%) e um significativo núme-ro de abortos entre as fêmeas com títulos igual ou superior a 300.
A maior parte das pesquisas com fetos relaciona-dos à leptospirose se refere àqueles que foram abor-tados naturalmente, ou seja, aqueles em que a infec-ção na mãe não permitiu a continuainfec-ção da prenhes. Este estudo é inovador no sentido de ter avaliado fetos que provavelmente chegariam a termo em vacas com títulos até 1.600, em diferentes estágios da ges-tação.
MATERIAL E MÉTODOS
No momento do abate, foi colhido sangue de fêmeas bovinas gestantes em um abatedouro do Estado de São Paulo. O sangue colhido foi dessorado, identificado e encaminhado para o exa-me sorológico para o diagnóstico de leptospirose pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM). Os fetos, de três a sete meses de gestação, foram marcados com a mesma numeração de suas mães antes de serem enviados para a sala de fetos
e lá foi coletado sangue para a realização de SAM e colheita de amostras de rim, fígado e conteúdo estomacal do feto e placenta da fêmea. A idade dos fetos foi estimada a partir de medidas tomadas no sentido crânio-caudal e aplicadas à fórmula pro-posta por REXROAD et al. (1974).
As fêmeas prenhes e seus fetos foram identifica-dos, e os resultados da sorologia foram comparados com os resultados do cultivo de leptospiras e da avaliação macroscópica dos materiais coletados. Es-ses materiais foram analisados posteriormente pela técnica de PCR multiplex (mPCR) para Leptospira spp. e Brucella spp.
Os soros foram diluídos em solução tamponada de Sörensen (SANTA ROSA, 1970), com diluição inicial
de 1/25 para as fêmeas e 1/5 para os soros fetais. Os soros foram testados frente a antígenos de 24 sorovares de leptospira (Australis, Bratislava, Autumnalis, Butembo, Castellonis, Bataviae, Canicola, Whitcombi, Cynopteri, Grippotyphosa, Hebdomadis, Copenhageni, Icterohaemorrhagiae, Javanica, Panama, Pomona, Pyrogenes, Hardjo, Wolffi, Shermani, Tarassovi, Andamana, Patoc e Sentot), resultando na diluição de 1/50 e 1/10. Após incuba-ção em estufa bacteriológica à temperatura de 28oC
por duas horas, foi efetuado o exame em microscópio de campo escuro. O critério adotado para um animal ser considerado como reagente foi o de 50% de aglutinação. Os soros reagentes na triagem inicial foram reexaminados com sete diluições seriadas de razão dois. O título do soro foi considerado como a recíproca da sua maior diluição que apresentou 50% de aglutinação.
Para cultivo e isolamento de leptospira foram, utilizados rins, fígados e conteúdo estomacal de fetos e placenta e cotilédone das fêmeas bovinas abatidas. O cultivo de leptospira foi efetuado pela semeadura de 0,5 mL de material suspeito em 5 mL de meio semi-sólido de Fletcher acrescido de 5-fluorouratil, na pro-porção de 400 mL/mL de meio, nas primeiras 24h de cultivo, seguido de repicagem e cultivo em meio livre de antibiótico. Após a semeadura, os tubos foram incubados à temperatura de 28° C durante 12 sema-nas, observando-se a ocorrência de anel de opalescência e leituras semanais em microscopia de campo escuro, com objetiva de 40x e ocular de 15x. Foi efetuada por PCR a confirmação do isolamento de leptospira, nos meio que apresentaram formação do anel de opalescência e estruturas semelhantes a espiroquetas na observação em microscópio de cam-po escuro.
A extração do DNA foi realizada com o reagente comercial DNAzol (Invitrogen®), adaptado de
CHOMCZYNSKI (1993).
A técnica de PCR seguiu a metodologia emprega-da por RICHTZENHAIN et al. (2002) de Leptospira spp. e
Brucella spp. simultaneamente (multiplex-PCR). Os primers empregados foeram gênero específicos, para
Brucella spp. foi utilizado um primer com fragmento de 223 bp (BAILY et al., 1992) (B4: 5’TGG CTC GGT TGC
CAA TAT CAA3’, B5: 3’CGC GCT TGC CTT TCA GGT CTG5’) e para Leptospira spp. com fragmento de 331 bp
(MÉRIEN et al., 1992) (Lep 1: 5’GGC GGC GCG TCT TAA
ACA TG3’,Lep 2: 3’TTC CCC CCA TTG AGC AAG ATT5’)
Como controle da extração foram contaminadas experimentalmente amostras de órgãos com 100 mL de cultura pura de leptospira sorovar Hardjo estirpe Hardjoprajitino e com 10 mL de cultura escala 8 Mc Farland ( 2,3 X 109 bact/mL) de Brucella abortus ATCC
544.
Como controle negativo da PCR foi utilizado a mistura da reação da PCR sem DNA, contendo 10 mL de água ultra pura.
A freqüência de alterações observadas em fetos de fêmeas reagentes a leptospira foi comparada com a freqüência observada em fetos de vacas não reagentes, por meio de teste de qui-quadrado (BERQUÓ et al., 1980).
RESULTADOS
Foram realizadas dez colheitas produtivas de material para a pesquisa de Leptospira spp. em fetos de vacas abatidas em um frigorífico do Estado de São Paulo, de um total de 212 vacas e 213 fetos (uma gestação gemelar). Das 212 vacas avaliadas, 95 (44,81%) foram reagentes para pelo menos um dos 24 sorovares utilizados na SAM, com títulos que variaram de 50 (24,58%) a 1.600 (0,58%) (Tabela 1). Nenhum dos 213 fetos examinados (com idade gestacional de 3 a 7 meses) apresentou reação nas provas de diagnóstico sorológico para Leptospira spp.
Dos 95 fetos de vacas reagentes na SAM, 42 apre-sentaram formação de anel de opalescência e estrutu-ras semelhantes a espiroquetas no cultivo em meio Fletcher de rim, fígado ou conteúdo estomacal, no entanto apenas 3 cultivos foram confirmados pela PCR, 2 de rim e um de fígado de fetos diferentes. Apesar da discrepância, entre o número de cultivos considerados suspeitos de isolamento e os que foram confirmados, os resultados positivos, juntamente com a análise estatística da avaliação macroscópica de alterações patológicas nos órgãos dos fetos, apresen-tados na Tabela 2, sugerem que fetos de mães reagentes já estavam afetados por esses agentes, embora não apresentassem anticorpos. Para o PCR dos órgãos e do conteúdo estomacal, não houve nenhuma amostra positiva. Não houve isolamento de leptospira das placentas e o PCR também foi negativo para esse órgão. (Tabela 2).
DISCUSSÃO
Das 212 fêmeas bovinas avaliadas, 95 (44,81%) apresentaram reação sorológica para um ou mais dos 24 sorovares de leptospira utilizados. O sorovar pre-dominante foi o Hardjo, presente em 80 animais e uma prevalência de 44,7% em relação aos demais sorovares encontrados. Os sorovares Wolffi (28,5%), Icterohaemorrhagiae (22,9%), Pomona (2,2%) e Grippotyphosa (1,7%) também foram observados. A predominância dos sorovares Hardjo e Wolffi concor-da com MOREIRA et al. (1993) que pesquisaram
reba-nhos no Estado de Minas Gerais, Brasil, mas discorda
de ATXAERANDIO et al. (2005), que afirmam que na região
norte da Espanha o principal sorovar encontrado é o Bratislava (25,4%) seguido do Hardjo (8,2%), na com-paração desses trabalhos pode-se observar a variação
que há de uma região para outra quanto a predomi-nância de sorovares. ELDER et al. (1985) e GÍRIO et al.
(1990), observaram uma superioridade na incidência dos sorovares Wolffi e Pomona sobre o sorovar Hardjo, no entanto esses trabalhos foram realizados a mais de 16 anos e a incidência de um ou outro sorovar pode variar conforme o tempo.
Nenhum dos soros sanguíneos dos fetos foi reagente à SAM, mesmo em diluições consideradas baixas como 1/10 até 1/200. Este dado difere dos encontrados por ELLIS et al. (1982), KIRKBRIDE et al.
(1989) e MOORE et al. (2003), encontraram,
respectiva-mente, 41,6%, 6,73% e 5,2% de soros fetais reagentes. Ressalta-se que os mesmos examinaram fetos aborta-dos naturalmente. Não houve no presente trabalho a possibilidade de comprovar se as reações sorológicas nas vacas em questão foram causadas por vacinação, Tabela 1 - Fêmeas sorologicamente positivas, com títulos que variam de 50 a 1.600 para um ou mais dos seguintes sorovares: Wolffi, Hardjo, Icterohaemorrhagiae, Pomona e Grippotyphosa.
Sorovar Títulos Total
50 100 200 400 800 1.600 Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Nº % Wolffi 13 7,3 15 8,4 09 5,0 10 5,6 04 2,2 00 0,0 51 28,5 Hardjo 17 9,5 25 13,9 22 12,3 10 5,6 05 2,8 01 0,6 80 44,7 Icterohaemorrhagiae 12 6,7 19 10,6 07 3,9 03 1,7 00 0,0 00 0,0 41 22,9 Pomona 00 0,0 01 0,6 00 0,0 03 1,7 00 0,0 00 0,0 04 2,2 Grippotyphosa 02 1,1 00 0,0 01 0,6 00 0,0 00 0,0 00 0,0 03 1,7 Total 44 24,6 60 33,5 39 21,8 26 14,5 09 5,0 01 0,6 179 100
Tabela 2 - Resultados dos cultivos, com crescimento suspeito de isolamento de leptospiras, de rim, fígado, conteúdo estomacal dos fetos e placenta das fêmeas abatidas em um frigorífico do Estado de São Paulo e do qui-quadrado (x2) e significância estatística (P) observados conforme as alterações morfológicas nos órgãos de fetos e da placenta de vacas soropositivas e soronegativas, na reação de soroaglutinação microscópica para Leptospira spp.
Orgão Cultivoc PCR X2 P Alterações Alterações
Patológicas Patológicas Vacas + (95) Vacas - (117) Nº Tipo Nº Tipo Rim 28 2 003,77 >0,05 03 A,B 00 -Fígado 32 1 028,38 <0,01 30 A,B,G 05 B,G CE 6 0 107,13 <0,01 70 H,I 06 H,I Placenta 2 0 013,08 <0,01 33 B,C,D,E,F 16 B,D Total órgãosa 68 3 - - 145 - 27 -Total animaisa 42 3 122,39 <0,01 88 - 19 --: não avaliado.
CE: conteúdo estomacal; A: icterícia, B: hemorragia, C: palidez, D: disformidade, E: formações fibrosas, F: granulomatose, G: friável, H: coloração amarelo-ouro, I: pastoso.
aafetados.
porém reações sorológicas devidas à vacinação geral-mente induzem títulos baixos de até 200 (ARDUINO et
al., 2004), no entanto, 20,1% dos títulos obtidos nos soros das vacas prenhes foi igual ou superior a 400. Em relação à presença de leptospiras no rim, fíga-do ou conteúfíga-do estomacal fíga-dos fetos os resultafíga-dos fíga-dos testes utilizados foram contraditórios, pois nenhuma amostra foi positiva ao PCR, no entanto foram confir-mados três isolamentos de leptospira pela essa mes-ma técnica, dois em rim e um em fígado de diferentes fetos. Embora teoricamente a técnica de PCR possa detectar até uma única bactéria (MÉRIEN et al.,1993) a
quantidade de material processado é muito pequena e corre-se o risco de não utilizar nenhuma leptospira; no entanto após o cultivo (quando se utiliza uma quantidade maior do material que se pretende avali-ar) a concentração de leptospiras aumenta, aumen-tando também a possibilidade de existir pelo menos uma leptospira que será amplificada na reação de PCR. O fato dos fetos não sororreagentes para leptospira pela técnica de SAM apresentarem a bac-téria em algum órgão também foi observado por
KIRKBRIDE et al. (1989). Os dados obtidos nos levam a
acreditar que em muitos casos, mesmo com a mãe sororreagente o feto pode não desenvolver anticorpos, mas albergar as leptospiras em seus órgãos.
As placentas avaliadas não indicaram a presença de leptospira no cultivo e no PCR, resultado esse sugestivo, pois, em alguns casos, a placenta, mesmo em um animal com título de 1.600, pode não estar comprometida.
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Recebido em 12/9/06 Aceite em 28/5/07
