PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
LIMIAR DE DETECÇÃO DE OVOS DE Toxocara canis EM SOLO POR
TÉCNICA DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO
IARA GIORDANO ROSA XAVIER
Presidente Prudente – SP 2009
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
LIMIAR DE DETECÇÃO DE OVOS DE Toxocara canis EM SOLO POR
TÉCNICA DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO
IARA GIORDANO ROSA XAVIER
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Área de Concentração: Fisiopatologia Animal.
Orientador: Prof. Dr. Vamilton Alvares Santarém
.
Presidente Prudente – SP 2009
.
636.089 695 9 Rosa Xavier, Iara Giordano.
R788l Limiar de detecção de ovos de Toxocara canis em solo por técnica de centrífugo-flutuação / Iara Giordano Rosa Xavier. – Presidente Prudente: [s.n.], 2009.
37 f.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) – Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE: Presidente Prudente – SP, 2009.
Bibliografia
IARA GIORDANO ROSA XAVIER
LIMIAR DE DETECÇÃO DE OVOS DE Toxocara canis POR TÉCNICA
DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Presidente Prudente,09de fevereiro de 2009.
BANCA EXAMINADORA
___________________________________ Prof. Dr Vamilton Alvares Santarém
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE Presidente Prudente - SP
___________________________________ Prof. Dra Lúcia Helena O’Dwyer
Universidade Estadual Paulista – UNESP Botucatu - SP
__________________________________ Prof. Dra Rosa Maria Barilli Nogueira
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE Presidente Prudente - SP
Dedico este trabalho a Deus
pelo dom da vida e pelas bençãos concedidas.
Aos meus queridos pais José e Clarice
pelo exemplo de vida, esforço, trabalho e perseverança.
Ao meu esposo e amigo Murilo, sempre presente,
apoiando-me e incentivando-me, dispensando paciência e
compreensão ao longo do curso e pesquisa,
por ter acreditado nos meus sonhos e, ainda mais,
por ter me ajudado a torná-los realidade.
AGRADECIMENTOS
A Deus por iluminar e abençoar meu caminho e a Nossa Senhora pela
intercessão permanentemente concedida.
Ao professor, orientador e amigo Dr. Vamilton Alvares Santarém, pela atenção,
apoio, dedicação e amor concedidos à vida acadêmica. Sua humildade e
bondade trouxeram-me profundos ensinamentos!“Se pude ver mais longe foi
porque me apoiei em ombros de gigantes”
(
Isaac Newton).
À professora Dra. Rosa Maria Barilli Nogueira, pela amizade, carinho, atenção
e competência imensuráveis.
À professora
Dra Lúcia Helena O’Dwyer pelas sugestões que enriqueceram
grandemente este estudo.
À professora Dra. Cecília Braga Laposy, membro da banca de qualificação,
pelo apoio, companheirismo e palavras de ânimo durante o experimento.
À equipe do Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva II do Hospital
Veterinário da Unoeste, onde foram processadas as amostras.
À amiga Beatriz de Cristo Ramos pela parceria e auxílio no processamento das
amostras e leitura das lâminas.
Às queridas amigas Bianca Arnone e Luciane Cazella pelo companheirismo e
momentos alegres compartilhados.
À amiga e irmã Vilma pelo interesse e apoio em minhas atividades de pesquisa.
A todos que de alguma maneira colaboraram para a concretização desta
importante etapa em minha vida!
“Sei que meu trabalho é uma gota no oceano,
porém sem ele, o oceano seria menor”.
RESUMO
Limiar de recuperação de ovos de Toxocara canis em solo por técnica de centrífugo-flutuação
O objetivo do estudo foi avaliar o limiar de detecção de ovos de Toxocara canis em amostras de solo previamente esterilizadas e contaminadas com 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ovos. As amostras de solo foram divididas em alíquotas de um grama e contaminadas com 20 µL de solução contendo os ovos. O limiar foi avaliado por uma técnica de centrífugo-flutuação, utilizando-se as soluções de sulfato de zinco (Zn2SO4) e nitrato de sódio (Na2NO3), na densidade 1.20. A recuperação foi diretamente proporcional ao número de ovos na amostra.
Observou-se a contaminação em amostras contendo três ovos para ambas as soluções. No caso do Zn2SO4, foi possível detectar a contaminação em duas alíquotas contendo apenas um ovo. Considerando-se o número de repetições positivas, o sucesso de 100% foi observado com o sulfato para amostras contendo a partir de 10 ovos, enquanto que para o Na2NO3, ele foi verificado em amostras que possuíam a partir de 25 ovos. Não houve diferença significativa na recuperação dos ovos quando as soluções e as leituras foram comparadas entre si. A técnica de centrífugo-flutuação é eficiente na recuperação de ovos mesmo em material com baixa contaminação.
Palavras-chave: Toxocara canis - contaminação de solo, Toxocara canis - diagnóstico
ABSTRACT
Threshold of Toxocara canis eggs recovery from soil by a centrifuge-flotation technique
The purpose of this study was to evaluate the threshold of a technique of centrifuge-flotation used to recovery Toxocara canis eggs from artificially contaminated soil with 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 and 200 eggs. Soil samples were previously sterilized. Aliquots of one gram were contaminated with 20 µL of a solution containing the eggs. For each trial, 10 contaminated samples were tested. Threshold was evaluated based on a centrifuge-flotation technique by using zinc sulphate (Zn2SO4) and sodium nitrate solutions (Na2NO3), specific gravity 1.20. The recovery of eggs was directly proportional to the number of eggs. By using both solutions, it was possible to reach the success in samples containing three eggs. Only Zn2SO4 showed efficacy in soil contaminated with a single egg. The recovery of 100% in all tests was obtained for samples containing 10 and 25 eggs, respectively, for Zn2SO4 and Na2NO3. There was no difference in the mean of recovered eggs both for the efficacy of solutions and for the repetition of evaluations in a same trial. The centrifuge-flotation technique shows efficiency even in samples containing low number of eggs.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA 10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15
2 ARTIGO CIENTÍFICO: LIMIAR DE DETECÇÃO DE OVOS DE Toxocara canis EM SOLO POR TÉCNICA DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO 22
10
1 INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Toxocara canis e Toxocara cati, são nematódeos da família Ascaridae que parasitam, respectivamente, cães e gatos (FOREYT, 2005). Nesses animais, considerados hospedeiros definitivos, as fêmeas adultas presentes no intestino delgado são capazes de produzir diariamente até 200.000 ovos, que serão eliminados juntamente com as fezes dos animais, tornando-se infectantes em duas a cinco semanas, sob condições de temperatura e umidade adequadas (SCHANTZ, 1989).
Uma vez presentes no solo, os ovos larvados podem ser ingeridos pelo ser humano. As larvas de segundo estágio eclodem no intestino delgado, atingem a circulação pela via hepática após atravessar a sua mucosa, migrando para diversos órgãos (DESPOMMIER, 2003), como fígado, pulmões, coração e cérebro, uma vez que o homem é hospedeiro acidental desses ascarídeos (MAGNAVAL et al., 2001).
No processo de migração, as larvas de Toxocara spp. podem causar traumatismo mecânico nos órgãos ou gerar um processo inflamatório desencadeado pela liberação de antígenos secretórios/excretórios (DESPOMMIER, 2003).
Dependendo da região lesionada, a toxocaríase humana pode ser considerada visceral (síndrome de larva migrans visceral) quando há comprometimento de órgãos (BEAVER et al., 1952), ou ocular (síndrome de larva migrans ocular) quando há comprometimento oftálmico (ZINKHAM, 1978).
Os aspectos clínicos da toxocaríase no homem são variáveis e dependentes de fatores como resposta imune do hospedeiro, padrão de migração, dose infectante e distribuição das larvas nos diferentes tecidos (SCHANTZ, 1989).
Na forma visceral, podem ocorrer distúrbios respiratórios como tosse persistente e asma (ALDERETE et al., 2003; TONELLI, 2005), efusão pleural (ASHWATH et al., 2004), e dermatopatias, como prurigo, urticária, eczema (GAVIGNET et al., 2008) e abcessos piogênicos (RAYES et al., 2001). Há registros de alterações neurológicas, incluindo convulsões (MOREIRA-SILVA et al., 2004), meningoencefalite (VIDAL et al., 2003) e epilepsia (BÄCHLI et al., 2004). Outros relatos descrevem a presença de hepatomegalia (ALTCHEH et al., 2003), pancreatite (D’ONOFRIO et al., 2006), miocardite (ABE et al., 2002) e ascite (CHIRA et al., 2005).
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Na forma ocular, existem casos de endoftalmite (PARK et al., 2000; ESPINOZA et al., 2003), estrabismo e uveíte (AZAR et al., 2004). Estima-se que, por ano, mais de 700 pessoas infectadas por Toxocara spp. têm perda parcial da visão (CDC, 2008).
A toxocaríase é uma zoonose de distribuição mundial e considerada a helmintíase mais prevalente em países industrializados (MAGNAVAL, et al., 2001), entretanto, é pouco reconhecida como problema de saúde pública (ALTCHEH et al., 2003) e subestimada principalmente em locais favoráveis ao desenvolvimento de Toxocara spp. (ALDERETE et al., 2003). Atualmente, consta na lista das enfermidades negligenciadas pelas autoridades sanitárias (HOTEZ et al., 2008).
Nos países tropicais e em desenvolvimento a freqüência da enfermidade é considerada maior devido aos baixos níveis sócio-econômicos da população (LYNCH et al., 1988).
O diagnóstico da toxocaríase humana é realizado pela pesquisa de anticorpos anti-Toxocara pelo método de ELISA, e a freqüência no Brasil varia de 8,7 a 54.8% (Quadro 1).
QUADRO 1 – Freqüência de anticorpos anti-Toxocara spp. em população humana, no Brasil
Local Número de
amostras Frequência (%) Autor (es)
São Paulo (SP) 208 54,8 Figueiredo et al.
(2005) Presidente Figueiredo
(Am) 100 52,0
Damian et al. (2007)
Recife (Pe) 386 39,4 Aguiar-Santos
et al. (2004)
Sorocaba (SP) 180 38,3 Coelho et al.
(2004)
Maringá (Pr) 450 28,8 Paludo et al.
(2007) Teodoro Sampaio (SP) 79 20,2 Prestes-Carneiro et al. (2008) Jaboatão dos Guararapes (Pe) 215 12,1 Coêlho et al. (2005)
Uberlândia (MG) 242 8,7 Teixeira et al.
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Embora a transmissão da toxocaríase possa ocorrer também por ingestão de hospedeiros paratênicos como coelho (STÜRCHLER, et al., 1990), suíno (FAN et al., 2004), ovino (SALEM, SCHANTZ, 1992) e frango (MORIMATSU et al., 2006), a principal via de transmissão de Toxocara spp. ao homem é a ingestão de ovos (ACHA, SZYFRES, 1986; SCHANTZ, 1989).
As crianças compõem o principal grupo de risco por ingerirem ovos presentes em ambientes contaminados, como praças e parques públicos, em virtude de hábitos geofágicos e onicofágicos (ACHA, SZYFRES, 1986).
No Brasil, diversos estudos foram realizados para verificação da freqüência de contaminação de áreas públicas de lazer (Quadro 2).
QUADRO 2 - Contaminação de áreas públicas por ovos de Toxocara spp
Local Número de
amostras/praças Freqüência (%) Autor(es)/Ano Santa Maria/RS 24 praças 91,7 Corrêa et al. (1995)
Mirante do
Paranapanema/SP 13 praças 76,9 Dias (2007)
Londrina/Pr 15 praças 60,0 Chieffi e Muller (1976) Sorocaba/SP 30 praças 53,3 Coelho et al. (2001) São Paulo/SP 37 amostras 29,7 Muradian et al.
(2005)
Vitória/ES 266 amostras 25,0 Carden et al.
(2003) Salvador/Ba 298 amostras 24,8 Alcântara et al.
(1989) Ribeirão Preto/SP 78 praças 20,5 Capuano e Rocha
(2005)
Botucatu/SP 10 praças 17,5 Santarém et al.
(1998) Lavras/MG 23 praças 17,4 Alves et al. (2004)
A contaminação do solo pode depender de vários fatores: condições climáticas e ambientais, textura do solo, presença de cães e gatos (MURADIAN et al., 2005). Além disso, há uma extensa variedade de metodologias empregadas na
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recuperação dos ovos de Toxocara spp., podendo levar a interpretações imprecisas de seus resultados (COELHO et al., 2001).
No Brasil e no exterior, as técnicas de centrífugo-flutuação são as mais comumente aplicadas para recuperação de ovos de Toxocara spp. em solo. Os estudos realizados apresentaram diferenças entre as técnicas empregadas por diversos pesquisadores (QUINN et al., 1980; KAZAKOS, 1983; OGE, OGE, 2000).
A solução utilizada para lavagem do material apresenta-se bastante variável. Água destilada foi empregada por Vásquez Tsuji et al. (1996), Nunes et al. (2000) e Habluetzel et al. (2003). O detergente aniônico Tween tem sido adotado amplamente para essa finalidade (DUBIN et al., 1975; KAZAKOS, 1983; DUNSMORE et al., 1984; CHILDS, 1985; FONROUGE et al., 2000; CAPUANO, ROCHA, 2005; DUBNÁ et al., 2007; GAWOR et al., 2008). O hidróxido de sódio a 2.13% e a 0.1N foi empregado por Ferreira et al. (1976) e Santarém et al. (1998) na segunda lavagem do solo antes do processo de centrífugo-flutuação. Quinn et al. (1980) e Kazacos (1983) verificaram que não houve diferença entre o uso de água destilada e o hidróxido de sódio.
Diversos pesquisadores realizaram re-suspensão do material antes da centrifugação (FERREIRA et al., 1976; DUNSMORE et al., 1984; SHIMIZU et al., 1993; VÁSQUEZ TSUJI et al., 1996; SANTARÉM et al., 1998; NUNES et al., 2000; CAPUANO, ROCHA, 2005), enquanto outros aboliram esse procedimento (DUBIN et al., 1975 ; CHILDS, 1985 ; FONROUGE et al., 2000; COELHO et al., 2001 ; QUEIROZ et al., 2006).
Quanto à solução de flutuação, o sulfato de zinco foi utilizado por Capuano e Rocha (2005) e Childs (1985) na densidade 1.20. Gawor et al. (2008) utilizaram a mesma solução na densidade 1.52. O nitrato de sódio foi empregado por Ferreira et al. (1976) e Shimizu (1993) e Dubná et al. (2007) nas concentrações 1.38, 1.39 e 1.30. O dicromato de sódio foi adotado por Santarém et al. (1998), Nunes et al. (2000), Queiroz et al. (2006), em concentrações de 1.35, 1.35 e 1.40, respectivamente. Oge e Oge (2000) verificaram que os melhores resultados de recuperação dos ovos foram alcançados ao utilizar o nitrato de sódio na densidade 1.22, que foi superior aos obtidos quando da utilização do cloreto de sódio, sulfatos de zinco e de magnésio na mesma densidade.
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Em relação ao número de lâminas confeccionadas para leitura microscópica, há pesquisas com leitura de uma (DUBIN et al., 1975; VÁSQUEZ TSUJI et al., 1996; FONROUGE et al., 2000; CAPUANO, ROCHA, 2005), duas (DUNSMORE et al., 1984 ; CHILDS, 1985 ; NUNES et al., 2000), três (SANTARÉM et al., 1998; QUEIROZ et al., 2006), cinco (PAQUET-DURAND et al., 2007) e seis lâminas (COELHO et al., 2001).
Magoti (2008), ao comparar as variáveis que poderiam interferir no processo de centrífugo-flutuação para recuperação de ovos de Toxocara canis em solo artificialmente contaminado, observou que a filtragem do solo reduziu a recuperação de ovos, enquanto que a re-suspensão do sedimento antes da centrifugação das amostras aumenta a eficiência da técnica,, de forma significativa.
Com base no trabalho de padronização conduzido por Magoti (2008), verificou-se a necessidade de avaliação do limiar de detecção de ovos de Toxocara spp. em solo, ratificada pela ausência dessa informação na literatura. Essa falta de dados fundamentou o objetivo do presente estudo, que visou estudar o limiar de detecção de ovos de Toxocara canis em solo artificialmente contaminado.
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2 ARTIGO CIENTÍFICO
LIMIAR DE DETECÇÃO DE OVOS DE Toxocara canis EM SOLO POR TÉCNICA DE CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO
THRESHOLD OF Toxocara canis EGGS RECOVERY FROM SOIL BY CENTRIFUGE-FLOTATION TECHNIQUE
IARA GIORDANO ROSA XAVIER1, BEATRIZ DE CRISTO RAMOS2, VAMILTON ALVARES SANTARÉM3
RESUMO
O objetivo do estudo foi avaliar o limiar de detecção de ovos de Toxocara canis em amostras de solo previamente esterilizadas e contaminadas com 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ovos. As amostras de solo foram divididas em alíquotas de um grama e contaminadas com 20 µL de solução contendo os ovos. O limiar foi avaliado por uma técnica de centrífugo-flutuação, utilizando-se as soluções de sulfato de zinco (Zn2SO4) e nitrato de sódio (Na2NO3), na densidade 1.20. A recuperação foi diretamente proporcional ao número de ovos na amostra.
Observou-se a contaminação em amostras contendo três ovos para ambas as soluções. No caso do Zn2SO4, foi possível detectar a contaminação em duas alíquotas contendo apenas um ovo. Considerando-se o número de repetições positivas, o sucesso de 100% foi observado com o sulfato para amostras contendo a partir de 10 ovos, enquanto que para o Na2NO3, ele foi verificado em amostras que possuíam a partir de 25 ovos. Não houve diferença significativa na recuperação dos ovos quando as soluções e as leituras foram comparadas entre si. A técnica de centrífugo-flutuação é eficiente na recuperação de ovos mesmo em material com baixa contaminação.
PALAVRAS-CHAVE: Toxocara canis, contaminação de solo, diagnóstico.
1 Mestranda no Programa de Ciência Animal - Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade do
Oeste Paulista (Unoeste).
2Discente do Curso de Medicina Veterinária da Unoeste.
3Docente Mestrado em Ciência Animal - Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa da Universidade do Oeste
Paulista (Unoeste). Rodovia Raposo Tavares, km 572 – Bairro Limoeiro – Presidente Prudente, SP, 190167-175, Brasil. E-mail: vamilton@unoeste.br
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ABSTRACT
The purpose of this study was to evaluate the threshold of a technique of centrifuge-flotation used to recovery Toxocara canis eggs from artificially contaminated soil with 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 and 200 eggs. Soil samples were previously sterilized. Aliquots of one gram were contaminated with 20 µL of a solution containing the eggs. For each trial, 10 contaminated samples were tested. Threshold was evaluated based on a centrifuge-flotation technique by using zinc sulphate (Zn2SO4) and sodium nitrate solutions (Na2NO3), specific gravity 1.20. The recovery of eggs was directly proportional to the number of eggs. By using both solutions, it was possible to reach the success in samples containing three eggs. Only Zn2SO4 showed efficacy in soil contaminated with a single egg. The recovery of 100% in all tests was obtained for samples containing 10 and 25 eggs, respectively, for Zn2SO4 and Na2NO3. There was no difference in the mean of recovered eggs both for the efficacy of solutions and for the repetition of evaluations in a same trial. The centrifuge-flotation technique shows efficiency even in samples containing low number of eggs.
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INTRODUÇÃO
Pouco reconhecida como problema de saúde pública (ALTCHEH et al., 2003), a toxocaríase é uma zoonose de distribuição mundial causada pelos geohelmintos Toxocara canis
ou Toxocara cati que parasitam cães e gatos, respectivamente (MAGNAVAL et al., 2001). No ser humano, a infecção se dá principalmente pela ingestão de ovos larvados. As larvas eclodem no intestino delgado, atingem a circulação pela via hepática após atravessar a sua mucosa, migrando para diversos órgãos (DESPOMMIER, 2003), podendo ocasionar a síndrome larva migrans visceral, acometendo diversos órgãos (BEAVER et al., 1952), ou provocar danos ao sistema oftálmico, conhecidos como síndrome de larva migrans ocular (ZINKHAM, 1978).
A freqüência de anticorpos anti-Toxocara encontrada em crianças em São Paulo (SP) foi de 54,8% (FIGUEIREDO et al., 2005), Recife (Pe), 39,4% (AGUIAR-SANTOS et al., 2004), Maringá (Pr), 28,8% (PALUDO et al., 2007), Teodoro Sampaio (SP), 20,2% (PRESTES-CARNEIRO et al., 2008) e Uberlândia (MG) 8,7% (TEIXEIRA et al., 2006).
As praças e parques públicos são as principais fontes de infecção da população, principalmente de crianças, cujos hábitos geofágicos e onicofágicos levam-nas a ingerirem ovos presentes em ambientes contaminados (ACHA, SZYFRES, 1986).
No Brasil, estudos revelam importante contaminação de áreas públicas de lazer em vários estados, com variação de 17,5% em Botucatu, SP (SANTARÉM et al., 1998) a 91,7% em Santa Maria, RS (CORRÊA et al., 1995).
A contaminação do solo pode depender de vários fatores como, condições climáticas e ambientais, textura do solo, presença de cães e gatos (MURADIAN et al., 2005). Há também uma extensa variedade de metodologias empregadas para recuperação dos ovos de Toxocara spp., que pode levar a interpretações imprecisas de seus resultados (COELHO et al., 2001).
Segundo os dados da literatura, as técnicas de centrífugo-flutuação são as mais comumente utilizadas para recuperação de ovos de Toxocara spp. em solo. Magoti (2008) observou, com base na comparação das variáveis que poderiam interferir na metodologia, que a filtragem do solo interferiu negativamente na recuperação de ovos, enquanto que a re-suspensão de sedimento antes da centrifugação das amostras aumenta a eficiência da técnica.
Entretanto, nenhum estudo até o presente momento avaliou o limiar de detecção de ovos de Toxocaraspp. em amostras de solo contaminadas artificialmente, que foi o objetivo do presente estudo.
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MATERIAL E MÉTODOS
Colheita de amostras e esterilização do solo
As amostras de solo foram obtidas do Campus Universitário da Universidade do Oeste Paulista (Unoeste), a uma profundidade de 5,0 a 10,0 cm da superfície, retirando-se toda a sujidade superficial.
O material foi distribuído em alíquotas de 50 g, em placas de Petri e colocado em estufa a 150ºC por 30 minutos, para eliminação de possíveis ovos de nematódeos presentes nas mesmas (QUINN et al., 1980).
Contaminação das amostras de solo
Os ovos foram obtidos de fêmeas adultas de Toxocara canis, recuperadas de filhotes do canil da Unoeste (Universidade do Oeste Paulista, Presidente Prudente/SP) infectados naturalmente. As fêmeas do parasito foram acondicionadas em coletores universais de plástico e encaminhadas ao Laboratório de Medicina Veterinária Preventiva II (Parasitologia Veterinária) do Hospital Veterinário da mesma instituição.
As fêmeas do nematódeo sofreram secção do terço anterior do útero para obtenção dos ovos (FAN, SU, 2004), que foram mantidos sob refrigeração a 70C em solução fisiológica estéril. A contaminação do solo foi realizada de acordo com Nunes et al. (1994), com algumas modificações. A solução contendo os ovos era re-suspensa em 20 µl e disposta sobre lâmina para contagem dos ovos, em microscopia ótica (10X). Após esse procedimento, o material era utilizado para contaminação direta da amostra. Para garantir a umidade das mesmas, 480 µl de solução fisiológica eram dispersos sobre o solo.
Cada amostra foi contaminada com partidas contendo 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ovos de T. canis. Dez alíquotas com o mesmo número de ovos foram preparadas para avaliar o limiar da técnica para cada teste (avaliação da recuperação em cada partida) e comparação das médias de ovos recuperados com o uso das soluções.
Recuperação de ovos de Toxocara canis em amostras de solo
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Cada alíquota de um grama de solo recebeu adição de 10,0 ml de água destilada, ficando em repouso durante doze horas. Após esse período, cada amostra foi transferida para um tubo cônico de centrífuga graduado e submetida à homogeneização por dois minutos, em homogeneizador de sangue. Após homogeneização, as amostras foram centrifugadas por cinco minutos a 2.500 r.p.m. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento recebeu 10,0 ml de água destilada, com re-suspensão do material. Após dois minutos de homogeneização, o tubo foi centrifugado por cinco minutos a 2.500 r.p.m. O sobrenadante foi descartado e acrescentado ao sedimento 11,0 ml de solução de flutuação (d=1.20) que consistiu na etapa de flutuação dos ovos. Após re-suspensão do material, ocorreu mais uma centrifugação com o mesmo padrão descrito anteriormente. Após esse processo, o tubo foi preenchido com a mesma solução até a formação de um menisco. Sobre este, colocou-se uma lamínula de vidro de 22X22mm, e o tubo ficou em repouso na posição vertical por cinco minutos, para a flutuação de ovos, quando a lamínula foi transferida para uma lâmina histológica lida à microscopia ótica em objetiva de 10X.
Todo processo foi realizado utilizando-se o nitrato de sódio (Na2NO3) e sulfato de zinco (Zn2SO4) como soluções de flutuação na densidade 1.20. Houve repetição da técnica por três vezes para cada alíquota de solo, significando a leitura das amostras em triplicata. Uma alíquota de um grama de solo esterilizado foi utilizada como controle, para assegurar a esterilização do solo.
Análise Estatística
Para comparação das médias de ovos em cada teste, os dados foram submetidos ao tratamento estatístico pelo teste de Wilcoxon para amostras pareadas. A análise de variância (ANOVA), pelo teste não-paramétrico Kruskal-Wallis, foi empregada para comparação das médias entre uma mesma solução, dentro de um mesmo teste. Adotou-se nível de significância de 5% (TRIOLA, 1999).
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RESULTADOS
Na Tabela 1 estão representados o percentual de positividade nos testes, bem como das médias das três leituras por repetição. Observou-se que a recuperação com o uso de Zn2SO4 ocorreu em todas as partidas, enquanto que com o Na2NO3 foi verificada em todas, com exceção das alíquotas contaminadas com um ovo.
Levando-se em consideração a recuperação, os testes com 10, 25, 50, 100 e 200 de ovos apresentaram 100% de positividade quando do uso de Zn2SO4. Naquelas contendo um, três e cinco ovos, estas estruturas foram recuperadas, respectivamente, em 20%, 50% e 70%. No caso do Na2NO3, os 100% de positividade foram obtidos no solo com 25, 50, 100 e 200. Naquelas contendo 3, 5 e 10 ovos, observou-se 80%, 60% e 60%, respectivamente.
A recuperação foi diretamente proporcional ao número de ovos utilizado para contaminação do solo (Tabela 2). Ao comparar as soluções de Zn2SO4 e Na2NO3, não houve diferença estatística significativa nas médias de ovos recuperados em cada teste. Não foi possível a comparação do teste avaliando as amostras contendo um ovo, uma vez que o número médio de ovos recuperados pelo Zn2SO4 foi baixo (0,6) e não houve recuperação quando da utilização de Na2NO3.
Na tabela 3 são apresentados os resultados da recuperação média de ovos, considerando-se as três leituras efetuadas para cada teste. Apenas nos testes onde as amostras foram contaminadas com 25 e 10 ovos, respectivamente com o uso de Zn2SO4 e deNa2NO3, houve diferença significativa entre as leituras.
A leitura das amostras em triplicata permitiu observar que na segunda e terceira leituras, o número de ovos recuperados foi superior a primeira leitura, embora este fato não seja estatisticamente significativo.
Verificou-se que quando se empregou a solução de Na2NO3, o material apresentou ressecamento rápido, formação de cristais, assim como a presença de ovos com casca rompida e conteúdo liberado, fato também observado por Magoti (2008).
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DISCUSSÃO
No presente estudo, avaliou-se o limiar de detecção de ovos de T. canis em amostras de solo contaminadas artificialmente com partidas de 1, 3, 5, 10, 25, 50, 100 e 200 ovos, pela técnica de centrífugo-flututação padronizada por Magoti (2008). Optou-se pelo emprego de Zn2SO4 e Na2NO3 (d=1.20), uma vez que as soluções foram consideradas as mais fáceis de serem obtidas e com os melhores resultados.
Com a finalidade de aumentar a eficácia da técnica, autores adotaram o uso de soluções hiper-saturadas com densidades superiores a 1.20, como dicromato de sódio (SANTARÉM et al., 1998; NUNES et al., 2000; QUEIROZ et al., 2006); nitrato de sódio (FERREIRA et al., 1976; DUNSMORE et al., 1984; SHIMIZU, 1993, DUBNÁ et al., 2007); sulfato de magnésio (QUINN et al., 1980; COELHO et al., 2001) e sulfato de zinco (GAWOR et al., 2008). Magoti (2008) observou que não houve influência da densidade na recuperação dos ovos e que a solução de sulfato de zinco (d= 1.20) foi considerada a de escolha para o processamento das amostras, corroborando Oge e Oge (2000).
No presente trabalho, não houve diferença entre a recuperação de ovos quando do uso de Zn2SO4 ou Na2NO3 (d= 1.20), como observado por Magoti (2008).
Ao comparar o limiar da técnica, observou-se que com o Zn2SO4 foi possível constatar a contaminação do solo quando a partida continha apenas um ovo, enquanto que com o Na2NO3 a detecção foi possível a partir da presença de três ovos. Entretanto, a média de cada teste foi diminuindo proporcionalmente à medida que o número de ovos contido nas amostras era menor.
Alguns fatores podem influenciar no sucesso da técnica, como a textura do solo (NUNES et al, 1994), lavagem do material (DUBIN, et al., 1975; QUINN et al., 1980; KASACOS, 1983; DUNSMORE et al., 1984; CHILDS, 1985; SANTARÉM et al., 1998; FONROUGE et al., 2000; CAPUANO, ROCHA, 2005), filtragem do solo antes do processamento (SANTARÉM et al., 1998; MATSUO; NAKASHIO, 2005) e a re-suspensão do material (OGE, OGE, 2000). Neste estudo, foi utilizada a técnica descrita por Magoti (2008). A autora observou que a re-suspensão aumenta o número de ovos recuperados, enquanto que a filtragem diminui a eficiência da técnica.
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De acordo com a literatura, o número de lâminas estudadas por análise é muito variável, com estudos realizando apenas uma (DUBIN et al., 1975; VÁSQUEZ TSUJI et al., 1996; FONROUGE et al., 2000; CAPUANO, ROCHA, 2005), duas (CHILDS, 1985; DUNSMORE et al., 1994; NUNES et al., 2000; HABLUETZEL et al., 2003), três (SANTARÉM et al., 1998; QUEIROZ et al., 2006; MAGOTI, 2008; SANTARÉM et al., 2008), cinco (PAQUET-DURAND et al., 2007) ou seis (COELHO et al., 2001) leituras. No presente estudo realizou-se três leituras do material para cada teste, não havendo diferença significativa, com exceção de Zn2SO4 (teste com 25 ovos) e Na2NO3 (com 10 ovos). Seria esperado que a quantidade de ovos na primeira análise fosse superior ao da segunda e terceira leituras. Entretanto, a quantidade de ovos recuperados parece ocorrer aleatoriamente; ou seja, a leitura em triplicata pode aumentar as chances de recuperação em amostras cujo grau de contaminação seja baixo.
Segundo Coelho et al. (2001), a falta de padronização impede que a comparação de resultados sobre a contaminação natural de solo em áreas de lazer possa ser realizada de forma confiável. A técnica de centrífugo-flutuação utilizada nesse estudo tem o limiar de detecção diretamente proporcional ao número de ovos contidos no solo, sendo eficiente na recuperação dessas estruturas mesmo em material com baixa contaminação, podendo proporcionar uma maior confiabilidade nos resultados quando são realizadas quantidades superiores a uma leitura de lâminas por amostra de solo.
O sulfato de zinco,quando utilizado na técnica de centrífugo-flututação, demonstrou ser a solução de escolha pela sua acessibilidade e manipulação, preservando os ovos de Toxocara canis. Dessa forma, a técnica permite a recuperação destas estruturas em solo com baixa contaminação, podendo ser indicada em futuros estudos sobre a presença de ovos de T. canis e de outros ascarídeos em áreas públicas de recreação.
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Tabela 1 – Percentual de positividade de recuperação de ovos de Toxocara canis pela técnica de centrífugo-flutuação com soluções de sulfato de zinco e nitrato de sódio (d=1.20), em 10 amostras de um grama de solo contaminadas artificialmente.
Solução
Sulfato de Zinco Nitrato de Sódio
Teste
(ovos/g de solo) Amostras positivas/repetições (%) Amostras positivas/ repetições (%)
200 10/10 (100) 10/10 (100) 100 10/10 (100) 10/10 (100) 50 10/10 (100) 10/10 (100) 25 10/10 (100) 10/10 (100) 10 10/10 (100) 6/10 (60) 5 7/10 (70) 6/10 (60) 3 5/10 (50) 8 (80) 1 2/10 (20) 0 (0)
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Tabela 2 – Número (média±desvio-padrão) e recuperação relativa de ovos (%) de Toxocara canis em amostras de um grama de solo contaminadas artificialmente, pela técnica de centrífugo-flutuação com soluções de sulfato de zinco e nitrato de sódio (d=1.20).
Solução Sulfato de Zinco Nitrato de Sódio
Número de ovos/grama de
solo Número Recuperação Número Recuperação P
200 13,43 ±4,01 6.72 9,7±4,22 4,85 0,0645 100 7,10 ±1,80 7.1 7,10±1,85 7,1 0,9999 50 3,95 ±1,60 7.9 4,25±2,40 8,5 0,9219 25 1,42 ±0,10 5.68 1,23±0,63 4,92 0,4961 10 0,85 ±0,88 8.5 0,38±0,48 3,8 0,1563 5 0,30 ±0,67 6.0 0,44±0,53 8,8 0,9102 3 0,18 ±0,32 6.0 0,18±0,32 6,0 0,3125
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Tabela 3 – Média de recuperação de ovos de Toxocara canis em três leituras em amostras de 1 grama de solo contaminadas artificialmente, pela técnica de centrífugo-flutuação com soluções de sulfato de zinco e nitrato de sódio (d=1.20).
Sulfato de Zinco Nitrato de Sódio
Leitura Leitura Teste (ovos/g de solo) 1 2 3 p 1 2 3 p 200 11,3 14,8 14,4 0,2565 7,5 8,8 12,5 0,1106 100 6,1 8,0 7,3 0,3699 5,8 7,8 7,5 0,1910 50 3,1 4,1 4,7 0,4140 4,1 4,6 4,1 0,9640 25 2,0 0,5 1,9 0,0288* 1,0 1,3 1,5 0,4465 10 0,6 1,4 0,7 0,1581 0 0,7 0,5 0,0428* 5 0,4 0,2 0,8 0,1633 0 0,8 0,6 0,1009 3 0,2 0,2 0,2 0,9999 0,5 0,3 0,1 0,2876 1** 0,1 0 0,1 - 0 0 0 - * ANOVA – Kruskal-Wallis (p<0,05) ** Não calculado
