449 449 449 449 449 Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS) – São Leopoldo
Correspondência: Dilson J. E. Rassier - UNISINOS - Centro de Ciências da Saúde (02) – Av. Unisinos, 950 - 93022-000 - São Leopoldo, RS
Recebido para publicação em 14/10/99 Aceito em 29/12/99
Dilson J. E. Rassier
São Leopoldo, RS
Dependência do Grau de Ativação do Músculo Cardíaco do
Comprimento Muscular
A lei de Frank-Starling do coração 1-3 pode ser descrita
na relação entre força e comprimento do músculo cardíaco. Com o advento da teoria das pontes cruzadas de contração muscular 4,5 e o clássico estudo de Gordon e cols. 6,
descre-vendo a adequação desta teoria à relação força-comprimen-to no músculo esquelético, vários investigadores passaram a estudar esta relação no músculo cardíaco.
A relação força-comprimento no músculo cardíaco é observada em uma pequena variedade de comprimentos de sarcômero, aproximadamente entre 1,8µm a 2,3µm. Esta re-gião corresponde a parte ascendente da relação força-com-primento do músculo esquelético, investigada por Gordon e cols. 6, e os níveis de força do miocárdio variam de zero
(1,8µm) até valores de força máxima (2,3µm). Esta grande variação de força resulta em uma relação força-comprimento de inclinação muita acentuada, principalmente quando com-parada ao músculo esquelético (fig. 1). Para se ter uma idéia, quando a tensão desenvolvida pelo miocárdio em diferen-tes comprimentos de sarcômero é normalizada em relação à sua força máxima (Fmáx) no comprimento em que ocorre (Lmáx), a tensão desenvolvida é de aproximadamente 10-15% quando o miocárdio é medido a 80% de Lmáx. Já no músculo esquelético, a força normalizada nas mesmas condições se-ria de aproximadamente 80-85% de Fmáx7 (fig. 1).
Esta diferença entre os músculos esquelético e cardía-co evidencia que a relação força-cardía-comprimento no miocárdio não é uma função simples do grau de superposição dos mentos actina e miosina, já que comprimento desses fila-mentos são semelhantes nos dois músculos; outros fatores devem estar envolvidos na relação força-comprimento mus-cular. Nos últimos anos, esta diferença na relação força-com-primento nos dois músculos passou a ser atribuída a uma dependência do grau de ativação muscular do comprimento dos sarcômeros 8.
Ativação muscular tem sido utilizada na literatura para referir-se coletivamente a diversos processos que podem
dar início à contração muscular, modificando o estado mus-cular de “inativo” para “ativo”. Assim, a ativação musmus-cular tem sido associada à freqüência de estimulação muscular ou de potenciais de ação das membranas, para descrever a concentração intracelular de Ca2+ [Ca2+]
i, ou para descrever
a ocupação da proteína troponina C (TnC) com o Ca2+. Neste
artigo, o termo ativação muscular será utilizado para descre-ver a proporção de TnC associada ao Ca2+. Esta associação
TnC/Ca2+ representa um evento fundamental na contração
muscular e, portanto, a sensibilidade da TnC ao Ca2+ será
discutida em maiores detalhes no contexto deste artigo. Além disso, esta escolha é proveniente a mudanças de força do miocárdio causadas pelas alterações no comprimento muscular não relacionadas à concentração de [Ca2+]
i 9,10.
Este artigo revisa os estudos relacionados à depen-dência da força e, mais importante, do processo de ativação muscular do miocárdio do comprimento muscular. Especifi-camente, este artigo pretende investigar mecanismos pro-postos na literatura que sejam os responsáveis pela depen-dência da sensibilidade dos filamentos ao Ca2+ do
compri-mento muscular.
Dependência da sensibilidade dos filamentos ao Ca2+ do comprimento muscular - Evidências de que a ativação
do miocárdio é dependente do comprimento muscular são encontradas em estudos demonstrando que intervenções inotrópicas (por exemplo, aumento da freqüência de estimu-lação muscular) induzem um deslocamento da reestimu-lação força-comprimento do miocárdio à esquerda. Como resultado de tal deslocamento, a inclinação da relação força-comprimen-to muscular assemelha-se à relação observada no músculo esquelético (fig. 1) 7,11,12.
Três linhas principais de investigação têm sido utiliza-das na avaliação da dependência da ativação e sensibilida-de do sistema regulatório ao Ca2+ do comprimento muscular:
1) estudos com a utilização de marcadores intracelulares de Ca2+ e encurtamento rápido de fibras intactas do miocárdio;
2) estudos com a utilização de fibras sem membrana; e 3) estudos com marcadores isótopos de proteínas.
Os estudos com a medição de [Ca2+]
i após mudanças
bruscas no comprimento de fibras são utilizados para avali-ar a afinidade da TnC ao Ca2+. Nesses estudos, substâncias
fluorescentes marcadoras de Ca2+ são introduzidas nas
for-450 450 450 450 450
necem informações referentes à quantidade intracelular de Ca2+. Esses estudos assumem que uma redução da
afinida-de TnC/Ca2+ resultaria em uma maior concentração de
[Ca2+]
i, já que uma menor quantidade de [Ca 2+]
i estaria
asso-ciada à TnC. Por sua vez, isto induziria uma menor ativação muscular (conforme conceito utilizado neste artigo).
Diferentes autores demonstram que um encurtamen-to abrupencurtamen-to do músculo cardíaco intacencurtamen-to em estágios finais de uma contração resultam em uma diminuição de tensão mus-cular, acompanhada de um aumento nos níveis de [Ca2+]
i.
Esta observação sugere uma diminuição da associação TnC/Ca2+, i.e. a afinidade da TnC ao Ca2+ é diminuída
quan-do o músculo é encurtaquan-do 10,13-15.
Nos estudos com fibras sem membranas, as células do miocárdio são estudadas sem o sarcolema que envolve as proteínas responsáveis pela contração muscular. Neste tipo de preparação, a contração muscular é iniciada pela adição de Ca2+ ao meio líquido no qual as fibras estão sendo
investigadas (que contém várias substâncias para manter a viabilidade dos experimentos, e.g., a glicose). Desta forma, a ativação induzida por Ca2+ pode ser controlada pelo
inves-tigador através das concentrações extracelulares de Ca2+, e
é possível estabelecer-se a relação força/Ca2+ em diferentes
situações (fig. 2).
A relação força/Ca2+ é extremamente eficiente no
estu-do estu-do músculo cardíaco, uma vez que permite a investiga-ção da sensibilidade do sistema regulatório ao Ca2+. De
acordo com essa relação, uma quantidade aumentada de Ca2+ é associada com um aumento na força desenvolvida
pelo miocárdio, até um determinado platô. Se a quantidade de Ca2+ necessária para produzir um determinado nível de
força é diminuída, a relação força/Ca2+ é deslocada à esquerda
(fig. 2), e a sensibilidade do sistema ao Ca2+ fica aumentada.
Neste contexto, estudos têm demonstrado que a quantidade de Ca2+ necessária para a obtenção de
determi-nada força é diminuída quando a resposta é avaliada em sar-cômeros alongados 16,17. Por exemplo, em um destes estudos
Hibberd e Jewell 16 demonstraram que a quantidade de Ca2+
necessária para que a força do miocárdio chegasse a 50% da Fmáx em sarcômero fixado com comprimento de ~2,5µm era significativamente menor do que quando o sarcômero esti-vesse fixado em um comprimento de ~1.9µm. De acordo com esses resultados, Kentish e cols. 17 demonstraram que cada
aumento no comprimento de sarcômero era seguido por aumento na força muscular em paralelo a um pequeno deslo-camento da relação força/pCa para a esquerda, que significa uma menor quantidade de Ca2+ necessária para a mesma
produção de força.
Finalmente, alguns estudos utilizam marcadores isóto-pos específicos para analisar o grau de associação TnC/ Ca2+, e relacioná-lo ao comprimento muscular 18,19. Estes
isótopos unem-se a determinadas moléculas da proteína TnC e fornecem informações referentes ao grau de associa-ção TnC/Ca2+. Em um desses estudos 19, os autores
utiliza-ram fibras sem membranas do ventrículo de bovinos marca-das com estes isótopos, e os resultados do estudo demons-traram uma forte associação de Ca2+ à TnC durante geração
de força. Entretanto, esta associação foi relacionada direta-mente ao comprimento muscular: em sarcômeros mais cur-tos, uma redução da associação TnC/Ca2+ foi observada.
Estes resultados estão de acordo com os estudos citados anteriormente, nos quais a dependência da sensibilidade do Ca2+ do comprimento muscular é relacionada à TnC.
Fig. 1 - Ilustração esquemática da relação força-comprimento dos músculos esquelé-tico (linha cheia) e cardíaco (linha tracejada) a partir de 80% L
máx. Neste ponto, o mús-culo esquelético produz 80-85% Fmáx, enquanto que o músculo cardíaco produz 10-15% F
máx . Em 90% Lmáx o músculo esquelético produz força próxima à Fmáx, enquanto o músculo cardíaco produz 50% Fmáx. Isto é traduzido em uma inclinação aumentada do ramo ascendente da relação força/comprimento muscular no miocárdio (a zona em que o miocárdio normalmente opera) quando comparada ao músculo cardíaco.
Fig. 2 - A relação força/Ca2+. Ca2+ é representado por pCa2+ ((-log
10(Ca
2+)). A figura de-monstra que a quantidade de Ca2+ necessária para produção de força é diminuída quando a relação força/pCa2+ é deslocada à esquerda (seta direcionada do círculo vazio para o círculo cheio). Este deslocamento da relação força/pCa2+ para a esquerda é um indicativo de aumento na sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+.
451 451 451 451 451 A principal questão a ser respondida seria como a
TnC, uma subunidade protéica associada a ligação de íons Ca2+ e Mg2+, recebe informações a respeito das mudanças
estruturais no comprimento muscular? Para responder esta pergunta, existem diferentes linhas de investigação e hipóteses sendo testadas atualmente. Alguns autores su-gerem que a própria TnC seria o aparelho sensor das mu-danças no comprimento muscular 20-22. Esta hipótese é
ba-seada nas diferenças moleculares que existem entre a TnC do músculo cardíaco e do músculo esquelético, que esta-riam associadas à diferença na relação força-comprimento nos dois músculos. Entretanto, vários estudos têm re-chaçado esta hipótese 23,24.
Em um deste estudos, Moss e cols. 23 caracterizaram a
relação entre força produzida e ativação induzida por Ca2+
em fibras musculares sem membrana do músculo esqueléti-co do esqueléti-coelho, em esqueléti-comprimentos de sarcômeros de 2.32µm e 1.87µm. Essas medidas foram realizadas antes e após a TnC ser substituída por TnC do músculo cardíaco, para provar se essa era a principal razão das diferenças na relação força-comprimento nos músculos esquelético e cardíaco. Quando >95% de substituição das fibras esqueléticas com a TnC car-díaca foi realizada, mudanças significativas na sensibilida-de ao Ca2+ não foram observadas nos comprimentos
inves-tigados. Portanto, a TnC não é o principal mecanismo res-ponsável pela dependência da sensibilidade do sistema muscular à força do comprimento muscular.
A outra hipótese que vem sendo testada com sucesso é a de que a associação das pontes cruzadas da miosina com a actina e, conseqüente geração de força, é responsá-vel pela dependência do grau de ativação do comprimento muscular 18,19,25-29. A justificativa e trabalhos relacionados a
esta hipótese serão apresentados a seguir.
Relação força-comprimento do músculo cardíaco e associação das pontes cruzadas com a actina - Quando o
músculo cardíaco é alongado no ramo ascendente da rela-ção força-comprimento, existe um aumento da superposi-ção dos filamentos de actina e miosina. Com isto a possibili-dade de interação entre as pontes cruzadas e a actina, e con-seqüente geração de força, é aumentada. Atualmente, exis-tem fortes evidências favorecendo um sisexis-tema no qual esta associação aumenta a sensibilidade do sistema regulador de força ao Ca2+ e, conseqüentemente, a ativação muscular.
Esta hipótese tem sido testada detalhadamente nos elegantes estudos de Fuchs e cols. 18,19,26,27. Em um desses
estudos, Hofmann e Fuchs 18 mediram a associação TnC/
Ca2+ em fibras cardíacas sem membrana com a utilização de
isótopos (como explicado anteriormente). Como esperado, os resultados confirmam que a associação TnC/Ca2+ é
de-pendente do comprimento muscular na faixa de sarcômeros compreendida entre 1,7µm to 2,4µm. Entretanto, em alguns experimentos, os autores utilizaram uma substância análoga ao fosfato (Pi), o vanadato de sódio (Vi). Esta substância atua como uma enzima ATPase e deprime a interação asso-ciação das pontes cruzadas com a actina, formando um com-plexo estável miosina·ADP·Vi. Quando utilizada esta
subs-tância, a relação entre a associação TnC/Ca2+ e
comprimen-to do sarcômero foi deprimida, e o grau de ativação muscular não apresentou dependência do comprimento do sarcôme-ro. Desta forma, a dependência da afinidade de Ca2+ à TnC
do comprimento muscular seria na verdade uma dependên-cia do número de pontes cruzadas em assodependên-ciação à actina.
Outra evidência da associação pontes cruzadas e afi-nidade TnC ao Ca2+ é o estudo de Saeky e cols.30 que
utiliza-ram fibras musculares cardíacas intactas. No estudo, as fi-bras foram injetadas com substâncias marcadoras de Ca2+,
para realizar as manobras de encurtamento muscular rápido, como já explicado. Em um grupo de experimentos extra Ca2+
não foi detectado quando a fibra foi encurtada, partindo de um estado de relaxamento muscular (sem a produção de for-ça). Em outro grupo de experimentos onde o ciclo das pon-tes cruzadas foi bloqueado por substância química especí-fica (2,3 butaneodione monoxime), foi constatado que mu-danças no comprimento muscular também não resultaram na aparição de extra Ca2+ no espaço intracelular, embora a
força tenha sido diminuída de forma considerável. Em ou-tras palavras, quando a associação entre pontes cruzadas e actina foi bloqueada, pelo estado de relaxamento muscular ou por substância química específica, a associação TnC/ Ca2+ não dependente do comprimento muscular.
Desta forma, conclui-se que o aumento da sensibilida-de do sistema regulador ao Ca2+ induzido por um aumento
no comprimento do sarcômero é relacionado a um número aumentado de pontes cruzadas associadas à actina, tanto em fibras cardíacas sem membrana, como em fibras cardía-cas com as membranas intactas.
Pontes cruzadas e regulação da atividade da troponina C - Embora a associação das pontes cruzadas, a força e a
sensibilidade da TnC ao Ca2+ estejam relacionados, cabe
ainda estudar-se a natureza desta relação. Em outras pala-vras, como a associação das pontes cruzadas da miosina com a actina aumenta a afinidade da TnC ao Ca2+, e
conse-qüentemente a sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+?
Estudos nos quais a TnC é marcada em alguns de seus do-mínios reguladores com provas fluorescentes, através de substituição de moléculas específicas, fornecem algumas evidências neste sentido 31-33.
Hannon e cols. 33 utilizaram TnC cardíaca marcada com
as provas fluorescentes específicas que fornecem informa-ções a respeito da estrutura da TnC resultantes da associação TnC/Ca2+. Ainda os autores mediram as respostas da
sen-sibilidade do sistema muscular ao Ca2+ relacionadas com a
associação de pontes cruzadas, para associar com alterações na estrutura da TnC, e observaram que a associação entre pontes cruzadas e actina induziu a modificações na conforma-ção de TnC, e que esta alteraconforma-ção foi acompanhada de um au-mento da sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+.
Na mesma linha de investigação, Liou e Fuchs 31
mar-caram dois resíduos da TnC de fibras cardíacas de bovinos com alguns compostos reativos. Medindo os sinais fluores-centes destes compostos, os autores observaram que pon-tes cruzadas “in rigor” e ponpon-tes cruzadas cíclicas têm
efei-452 452 452 452 452
tos diferenciados na conformação da TnC, sugerindo que mecanismos pelos quais as pontes cruzadas afetam TnC são através de conformações moleculares.
Esses dois estudos sugerem uma explicação para o mecanismo responsável pela dependência da sensibilidade ao Ca2+ do comprimento muscular, no qual um aumento no
comprimento muscular induz alterações na conformação molecular da TnC, resultando em um aumento de sua afini-dade ao Ca2+.
Evidências para outros mecanismos responsáveis pe-la dependência da ativação do miocárdio do comprimento muscular - Embora as evidências apontem para um
meca-nismo envolvendo as pontes cruzadas, como mecameca-nismo responsável pela dependência da força e sensibilidade dos filamentos ao Ca2+ do comprimento muscular, esta hipótese
encontra uma dificuldade óbvia. A sensibilidade ao Ca2+ é
aumentada em fibras cardíacas sem membranas 34 quando
estas são alongadas na porção descendente da relação for-ça-comprimento, onde o potencial para a interação miosina-actina está diminuído.
A hipótese levantada na literatura é que, além da as-sociação de pontes cruzadas, força e afinidade TnC/Ca2+,
as mudanças no comprimento de sarcômero per se são responsáveis por alterações na sensibilidade do sistema muscular ao Ca2+. Essas mudanças seriam evidenciadas
no espaço entre os filamentos musculares compostos de miosina e actina. Estudos que utilizam difração de raio-x têm demonstrado que os filamentos de actina e miosina são posicionados mais próximos quando o músculo é alongado e o volume muscular não é modificado 35,36. É
ra-zoável supor-se que a probabilidade de interações entre pontes cruzadas e actina seria aumentada nesta situação, onde a distância para a associação entre os filamentos é diminuída. Esta possibilidade aumentada de interação
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contrac-tion with skeletal fast muscle troponin C. J Biol Chem 1987; 262: 5815-22. tre os filamentos aumentaria a força em determinada con-centração de Ca2+, aumentando a sensibilidade do sistema
muscular ao Ca2+.
Nesta linha de investigação, diferentes autores estu-daram os efeitos de compressão osmótica dos filamentosa miosina e actina, utilizando o polímero de alto peso molecu-lar dextran T-5000, polyvinylpyrrolidone-40. Este composto não penetra no espaço compreendido entre os filamentos miosina e actina, mas causa aproximação lateral entre eles. Alguns autores 26,37 observaram que após a utilização desta
substância, a sensibilidade ao Ca2+ foi aumentada de forma
significativa no músculo cardíaco.
Wang e Fuchs 26 investigaram especificamente a
hipó-tese de que alterações no espaço entre os filamentos miosi-na e actimiosi-na contribuem para a dependência da sensibilidade do miocárdio ao Ca2+ do comprimento muscular. Esses
auto-res estudaram simultaneamente os efeitos de compauto-ressão osmótica (Dextran T-5000, 5 e 10%), comprimento de sarcô-mero (1,7µm a 2,3µm) e o grau de associação TnC/Ca2+. Os
resultados são convincentes: a utilização de 5% dextran na fibra estabilizada em um comprimento de sarcômero de 1.7µm resultou em uma redução no diâmetro (~13%) da fibra muscular, equivalente a situação na qual o sarcômero é alongado a um comprimento de 2,3µm. Mais importante, esta intervenção foi acompanhada de um aumento signifi-cativo na sensibilidade muscular ao Ca2+ [alteração de ~0,25
pCa2+, (fig. 2)] e na associação TnC/Ca2+ nos níveis de
ati-vação compreendidos entre 6,0 e 5,0 pCa.
Conclusão - Os estudos revisados neste artigo
suge-rem que a dependência da sensibilidade ao Ca2+ do
compri-mento muscular é um resultado associado da interação de pontes cruzadas e actina, que induzem alterações na afinida-de TnC/Ca2+, e de mudanças no espaço entre os filamentos,
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