DOUGLAS FONSECA BARBOSA
EVOLUÇÃO DA MECÂNICA E HISTOLOGIA PULMONARES
EM CAMUNDONGOS EXPOSTOS CRONICAMENTE À
FUMAÇA DE CIGARRO
Dissertação submetida à Pós-graduação do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro visando à
obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2009
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EVOLUÇÃO DA MECÂNICA E HISTOLOGIA PULMONARES EM
CAMUNDONGOS EXPOSTOS CRONICAMENTE À FUMAÇA DE
CIGARRO
DOUGLAS FONSECA BARBOSA
ORIENTADORA: DÉBORA SOUZA FAFFE
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre.
APROVADA POR:
________________________________________________________________ Prof. Walter Araújo Zin
Prof. Titular UFRJ
_________________________________________________________________ Prof. José Hamilton Matheus Nascimento
Prof. Adjunto UFRJ
_________________________________________________________________ Prof. Samuel dos Santos Valença
Prof. Visitante UERJ
_________________________________________________________________ Prof. Marcelo Marcos Morales – Revisor e suplente interno
Prof. Adjunto UFRJ
_________________________________________________________________ Prof. Jennifer Lowe – Suplente externo
Prof. Adjunto UFRJ
Fevereiro de 2009 Barbosa, Douglas Fonseca
Evolução da mecânica e histologia pulmonares em camundongos expostos cronicamente à fumaça de cigarro / Douglas Fonseca Barbosa
Rio de Janeiro: UFRJ / Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2009. xvi, 118 f. : il. ; 31 cm.
Orientadora: Débora Souza Faffe
Dissertação (mestrado) – UFRJ/Instituto de Biofísica Carlos chagas Filho Programa de Pós - Graduação em Ciências Biológicas, (Fisiologia), 2009.
Referências bibliográficas: f. 87-144
1. Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) - Enfisema Lesão Pulmonar induzida por fumaça de cigarro. 2. Mecânica respiratória - fisiologia. 3. 4. Modelos de enfisema - camundongos. 5. Fumaça de cigarro. 6. Principais mecanismos da DPOC. 7.
Tese.I. Faffe, Débora Souza. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Pós-Graduação Ciências Biológicas, Fisiologia. III. Evolução da mecânica e histologia pulmonares em camundongos expostos cronicamente à fumaça de cigarro.
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Respiração do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
na vigência de auxílios concedidos pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
(FAPERJ), Conselho de Ensino para Graduados e Pesquisa da UFRJ (CEPG-UFRJ), Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX), e Coordenação de
Aos meus pais e aos meus queridos irmãos, pelo amor, paciência, imensa dedicação e apoio em todos os momentos de minha vida.
AGRADECIMENTOS
Nesta importante fase da minha vida, não poderia deixar de agradecer a todas as pessoas que, de alguma forma, me ajudaram no decorrer deste trabalho.
Primeiramente agradeço a Deus por tudo o que tem feito em minha vida e por tudo o que ainda irá fazer, pois Nele tenho encontrado forças para prosseguir.
À Profª. Débora Souza Faffe, por todos os momentos que se dedicou a mim, sempre me auxiliando e compartilhando sua sabedoria em todas as etapas deste trabalho, pela oportunidade de estar realizando este desejo, pela confiança, pela compreensão nos momentos difíceis, pela atenção a qualquer momento que precisasse, sempre ouvindo as minhas dúvidas, por sempre me incentivar e com isto aumentar ainda mais minha vontade de aprender, pelo exemplo profissional que tanto admiro e, sobretudo, pela pessoa maravilhosa que me recebe sempre com boa vontade. Muito obrigada pela oportunidade e confiança depositada em mim.
Ao Prof. Walter Araújo Zin, por seus ensinamentos, conselhos e auxílios, por sua disponibilidade em ajudar e pela oportunidade de poder estar aqui.
Às colaboradoras do Laboratório de Fisiologia da Respiração, Clarissa Bichara Magalhães e Mariana Nascimento Machado por serem sempre disponíveis nos experimentos.
Aos queridos colegas do Laboratório de Fisiologia da Respiração e em especial ao grande Douglas Riva, pela preocupação, compreensão, paciência, carinho e, também, pelos momentos de descontração. Com certeza, nesses poucos dois anos e meio de convivência no laboratório, foram criados laços de amizade que perdurarão para o resto da vida. Que a vida lhes retorne em dobro todas as coisas boas que fizeram por mim.
Aos funcionários do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, em especial aos técnicos de laboratório Sr. Antônio Carlos de Souza Quaresma e ao Sr. João Luiz Coelho Rosas Alves, sempre dispostos a ajudar.
Aos meus queridos e maravilhosos pais, Cleobes e Carmerinda, pelo amor, educação e criação, amizade e tamanha ajuda, sem a qual eu não estaria aqui. Amo vocês.
À minha querida irmã, Liliane, pela amizade, carinho, compreensão e paciência. Amo você demais.
Ao meu querido irmão, Rodrigo, pelo amor, ajuda nos momentos difíceis, carinho, amizade, respeito e compreensão.
A minha querida e amada Primeira Igreja Batista de Itatiaia e em especial ao meu querido Pastor Anderson Camino Rodrigues, obrigado pelas orações, pois estas me sustentaram nesta tarefa.
E finalmente aos meus grandes e queridos amigos de Itatiaia, Thiago, Marcos, Felipe, Daniel, Motta e Amilton, pelos vários momentos de alegria em que recordamos o ontem, e vivemos o hoje lutando por um amanhã de muito sucesso.
RESUMO
EVOLUÇÃO DA MECÂNICA E HISTOLOGIA PULMONARES EM CAMUNDONGOS EXPOSTOS CRONICAMENTE À FUMAÇA DE CIGARRO
Introdução: O tabagismo está intimamente ligado a problemas de saúde pública. Diversos modelos de exposição à fumaça de cigarro são encontrados na literatura. No entanto, há escassez de informação acerca das alterações funcionais que acompanham esses modelos. Este trabalho analisa os efeitos da exposição crônica à fumaça de cigarro sobre os componentes elástico, viscoso e viscoelástico da mecânica pulmonar.
Métodos: 29 Camundongos C57BL/6 (20-25 g) foram expostos a ar ambiente ou à fumaça de cigarro comercial light (4 cigarros/d, 5 d/sem) por 2 e 4 meses (grupos CTRL, FUM2 e FUM4, respectivamente, n = 5-9 em cada grupo). Os animais dos grupos FUM foram expostos em uma câmara fechada de 10 cm de altura, 15 cm de largura e 20 cm de profundidade, receberam “puffs” de fumaça intercalados com ar ambiente. 72 h após a última exposição, os camundongos foram sedados, anestesiados e ventilados mecanicamente com fluxo e volume constantes. Analisou-se a mecânica pulmonar pelo método de oclusão ao final da inspiração, determinando-se: elastância estática (Est), componente viscoelástico da elastância (∆E), e pressões resistiva (∆P1), viscoelástica (∆P2) e total (∆Ptot). Os pulmões foram fixados em formol para análise histológica (HE), sendo determinada, celularidade total e diferencial, fibras colágenas e elásticas, diâmentro alveolar médio, relação superfície-volume e capacidade residual funcional. Além disso, 14 animais foram adicionados para análise do índice de carboxihemoglobina.
Resultados: O grupo FUM4 apresentou aumento significativo de Est (37,9±3,3 cmH2O/mL), ΔE (6,20±0,45 cmH2O/mL) e ΔP2 (1,20±0,07 cmH2O) quando comparado ao grupo CTRL (29,5±0,8 cmH2O, 4,35±0,2 cmH2O/mL, 0,99±0,08 cmH2O). Em relação ao grupo FUM2 foi observado aumento significativo em ΔP2(0,94± 0,04 cmH2O). O grupo FUM2 não apresentou aumento significativo de nenhum parâmetro da mecânica pulmonar em relação ao grupo CTRL. O grupo FUM4 apresentou significativo aumento no influxo de células polimorfonucleares no parênquima pulmonar, aumento no conteúdo de fibras colágenas e elásticas e aumento do diâmetro alveolar médio e da capacidade residual funcional quando comparado ao grupo controle. O índice de carboxihemoglobina de animais expostos à fumaça de cigarro também aumentou significativamente quando comparado com animais expostos a ar ambiente.
Conclusão: Nosso estudo demonstrou que a exposição crônica à fumaça de cigarro induziu de forma tempo-dependente significativa alteração na mecânica e histologia pulmonares.
Palavras-chave: Doença pulmonar obstrutiva crônica, fumaça de cigarro, mecanismos de lesão do enfisema pulmonar, mecânica pulmonar.
Rio de Janeiro Fevereiro de 2009
ABSTRACT
DEVELOPMENT OF PULMONARY MECHANICS IN MICE CHRONICALLY EXPOSED TO CIGARETTE SMOKE
Introduction: Cigarette smoking is closely linked to public health problems. Several models of exposure to cigarette smoke are found in the literature. However, there is a shortage of information about the functional changes that accompany these models. This study analyses the effects of chronic exposure to cigarette smoke on the elastic, viscoelastic and viscous components of pulmonary mechanics.
Methods: 29 Mice C57BL / 6 (20-25 g) were exposed to environment air or to cigarette smoke light commercial (4 cigarettes / d, 5 d / week) for 2 and 4 months (CTRL, FUM2 and FUM4 groups respectively, n = 4-6 in each group). FUM groups were exposed in a closed chamber of 10 cm high, 15 cm wide and 20 cm deep, were received "Puffs" of smoke interspersed with ambient air. 72 h after the last exposure, the mice were sedated, anesthetized and mechanically ventilated with constant flow and volume. We analyzed the pulmonary mechanics by the end-inflattion occlusion method, by providing: static elastance (Est), viscoelastic component of the elastance (ΔE) and resistive pressures (ΔP1), viscoelasticity (ΔP2) and total ( ΔPtot). The lungs were fixed in formalin for histological analysis (HE), being determined, total cellularity and differential, elastic and collagen fibers, alveolar medium diamiter, surface-volume ratio and functional residual capacity. In addition, 14 animals were added to the index analysis of carboxyhemoglobin.
Results: FUM4 showed a significant increase in Est (37.9 ± 3.3 cmH2O/mL), ΔE (6.20 ± 0.45 cmH2O/mL) and ΔP2 (1.20 ± 0.07 cmH2O) compared the CTRL group (29.5 ± 0.8 cmH2O, 4.35 ± 0.2 cmH2O/mL, 0.99 ± 0.08). In group FUM2 significant increase was observed only in ΔP2 (0.94 ± 0.04 cmH2O). The group FUM2 showed no significant increase in any parameter of pulmonary mechanics in the CTRL group. The group FUM4 showed significant increase in the influx of polymorphonuclear cells, increased content of collagen and elastic fibers and increased average alveolar diameter and functional residual capacity when compared to the control group. The level of carboxyhemoglobin in animals exposed to cigarette smoke also increased when compared with animals exposed to air.
Conclusion: Our study showed that chronic exposure to cigarette smoke induced in a time-dependent significant changes in lung mechanics and histology.
ÍNDICE
FICHA CATALOGRÁFICA ... iii
AGÊNCIAS FINANCIADORAS ... iv
AGRADECIMENTOS ... v
RESUMO ... viii
ABSTRACT ... ix
ÍNDICE... x
ÍNDICE DE FIGURAS ... xiii
ÍNDICE DE TABELA ... xiv
ABREVIATURAS ... xv
1 INTRODUÇÃO ... 1
1.1 ASPECTOS GERAIS ... 2
1.1.1 Doença pulmonar obstrutiva crônica ... 2
1.1.2 Fumaça de cigarro ... 3
1.2 COMPOSIÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR PULMONAR ... 4
1.2.1 Fibras colágenas ... 4
1.2.2 Fibras elásticas ... 5
1.2.3 Proteoglicanos e glicosaminoglicanos ... 6
1.3. PRINCIPAIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA DPOC ... 7
1.3.1 Hipótese protease-antiprotease ... 8
1.3.2 Inflamação pulmonar ... 10
1.3.3 Estresse oxidativo ... 13
1.4 RELAÇÃO ESTRUTURA-FUNÇÃO ... 16
1.5 MODELOS DE ESTUDOS DOS EFEITOS DA FUMAÇA DE CIGARRO ... 19
1.6 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ... 23
1.6.1 Noções básicas ... 23
1.6.2 Estudo da mecânica respiratória ... 27
2 JUSTIFICATIVA ... 38 3 OBJETIVOS ... 41 3.1 OBJETIVO GERAL ... 42 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 42 4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 43 4.1 ANIMAIS UTILIZADOS ... 44
4.2 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 44
4.3 MODELO DE EXPOSIÇÃO À FUMAÇA DE CIGARRO ... 45
4.4 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ... 47
4.4.1 Método de oclusão ao final da inspiração ... 52
4.5 ESTUDO HISTOLÓGICO ... 56
4.5.1 Fixação e preparo das lâminas para microscopia óptica ... 56
4.5.2 Análise histológica ... 57
4.5.3 Determinação da capacidade residual funcional (CRF) ... 58
4.6 ÍNDICE DE CARBOXIHEMOGLOBINA ... 60 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 62 5 RESULTADOS ... 63 5.1 MECÂNICA RESPIRATÓRIA ... 65 5.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ... 70 5.2.1 Análise qualitativa ... 70
5.2.2 Análise quantitativa ... 72 5.5 ÍNDICE DE CARBOXIHEMOGLOBINA ... 76 6 DISCUSSÃO ... 77 7 CONCLUSÕES ... 85 8 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 87 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 89 ANEXOS ... 102
Anexo A Parâmetros da mecânica pulmonar em cada animal ... 103
Anexo B Celularidade total e diferencial em cada animal ... 104 Anexo C Diâmetro alveolar médio e relação superfície/volume em cada animal ... Anexo D Contagem de fibras colágenas em cada animal ... Anexo E Contagem de fibras elásticas em cada animal ... Anexo F Análise do índice de carboxihemoglobina em cada animal ... Anexo G Acompanhamento temporal de peso e análise da capacidade residual
funcional em cada animal... 105 106 111 116
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo linear unicompartimental ... 29
Figura 2. Esquema do método de oclusão ao final da inspiração ... 30
Figura 3. Modelo de molas e amortecedores para interpretação da mecânica do sistema respiratório... 33
Figura 4. Caracterização dos grupos experimentais ... 45
Figura 5. Modelo de exposição dos camundongos à fumaça de cigarro ... 47
Figura 6. Montagem experimental ... 51
Figura 7. Método de oclusão ao final da inspiração ... 55
Figura 8. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para análise histológica ... 60
Figura 9. Elastância estática (Est) e componente viscoelastico da elastância do pulmão (E)... 67
Figura 10. Variações de pressões pulmonares resistiva (P1), viscoelástica/inomogênea (P2) e total (Ptot) ... 68
Figura 11 Capacidade residual funcional ... 69
Figura 12. Fotomicrografias representativas de parênquima pulmonar (H-E)... 71
Figura 13. Número de células polimorfonucleares (PMN), mononucleares (MN) e totais (Cel tot) ... 73
Figura 14. Percentual de fibras elásticas e fibras colágenas em relação à área de tecido pulmonar... 75
ÍNDICE DE TABELA
Tabela 1. Prós e contras de modelo de enfisema induzido por fumaça de cigarro ... 21
Tabela 2. Concentrações médias de carboxihemoglobina ... 22
Tabela 3. Peso Corporal dos animais... 64
Tabela 4. Fluxo e volume dos animais utilizados nos grupos experimentais... 66
ABREVIATURAS
E – componente elástico da viscoelasticidade
P – variação de pressão
P1 – pressão relativa ao componente viscoso pulmonar
P2 – pressão relativa ao componente viscoelástico e/ou inomogêneo pulmonar
Ptot – pressão total pulmonar
AR -- relação dos valores de absorbância
V – variação de volume gasoso mobilizado BAL – lavado broncoalveolar
CEUA comissão de ética na utilização de animais CO – monóxido de carbono
COHb -- carboxihemoglobina
CRF – capacidade residual funcional
Crs – complacência do sistema respiratório CVF – capacidade vital forçada
DPOC – doença pulmonar obstrutiva crônica E – elastância
Edyn – elastância dinâmica do pulmão Est – elastância estática do pulmão Est,L – componente elástico do pulmão
Est,w – componente elástico da parede torácica
FEF25-75% - fluxo expiratório forçado entre 25 e 75% da CVF FGF – família de fatores de crescimento
GOLD – Global strategy for the diagnosis HE – hematoxilina e eosina
IL -- interleucina i.p. – intraperitoneal KC -- quimiocinas
MCP – proteína quimiotática de monócitos MEC – matriz extracelular
MIP – proteína inflamatória macrofágica MMP – metaloprotease de matriz
MN – células mononucleares NF-B – fator nuclear kappa B
OMS – Organização Mundial de Saúde
PDGF -- fator de crescimento derivado de plaquetas P – pressão
PEEP – pressão positiva ao final da expiração PEF – pico de fluxo expiratório
Pel – pressão de retração elástica do pulmão PGE2 – prostaglandina E 2
Pi – pressão pulmonar no ponto de inflexão PL – pressão transpulmonar
Pmáx – pressão máxima ou de pico inspiratório PMN – células polimorfonucleares
Pres – pressão resistiva Ptr – pressão traqueal
Raw – resistência de vias aéreas Req – resistência do equipamento
Rinit,L – resistência intrínseca do pulmão
Rinit,w – resistência intrínseca da parede torácica Rinit,rs – resistência intrínseca do sistema respiratório ROS – espécies reativas de oxigênio
Rtis – resistência tecidual
Rtot – resistência pulmonar total
Rrs – resistência do sistema respiratório
TGF- -- fator de transformação de crescimento beta TIMP – inibidor de metaloprotease de matriz de tecido TNF-fator de necrose tumoral alfa
TI – tempo inspiratório V’ – fluxo aéreo
VEF1 – volume expiratório forçado no primeiro segundo VT – volume corrente
1 INTRODUÇÃO
1.1 ASPECTOS GERAIS
1.1.1 Doença pulmonar obstrutiva crônica
A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é a quinta causa de mortalidade no mundo, com estimativa de se tornar a terceira causa em 2020 (Pauwels e cols., 2004; Lopez e cols., 1998). Estudo envolvendo mais de 20 países demonstra prevalência de 9-10% entre adultos na faixa de 40 anos, afetando aproximadamente 17 milhões de indivíduos apenas nos Estados Unidos (Halbert e cols., 2006; Stang e cols., 2000).
Embora fatores como exposição a poeiras, material particulado e queima de biomassa pareçam estar associados à DPOC, a exposição à fumaça de cigarro representa o principal fator de risco para o desenvolvimento da doença (Barnes e cols., 2003; Halbert e cols., 2006; Harber e cols., 2007; Dennis, 1996). A susceptibilidade e distribuição do enfisema também têm sido associadas à predisposição genética, uma vez que apenas uma minoria de fumantes evolui com DPOC.
A DPOC é uma doença progressiva e irreversível, caracterizada por limitação de fluxo aéreo, inflamação crônica das vias aéreas e destruição alveolar. Clinicamente, a DPOC pode se apresentar como bronquite crônica (com predomínio de hiperprodução de muco), doença de pequenas vias aéreas ou enfisema, onde predomina a destruição dos espaços alveolares. A destruição alveolar característica do enfisema se inicia nos espaços aéreos distais ao bronquíolo terminal, levando à destruição da parede alveolar e perda de unidades alveolares, não associado à fibrose pulmonar significativa (Berge e cols., 2003; Celli e cols., 2007; Pauwels, 2001). (Aoshiba e cols., 2003; Snider e cols., 1985; Vlahovic e cols., 1999).
Existe grande interesse em melhor entender os mecanismos envolvidos na DPOC, o que tem sido realizado através de modelos experimentais utilizando animais, principalmente camundongos.
1.1.2 Fumaça de cigarro
A fumaça do cigarro é uma mistura heterogênea, contendo diversos componentes químicos - como hidrocarbonetos, fenóis, ácidos graxos, isopropenos, ésteres e minerais inorgânicos (Hoffmann e cols., 2001). Cada puff de fumaça de cigarro contém aproximadamente 5.000 componentes tóxicos, incluindo material particulado (principal componente da poluição ambiental) e lipopolissacarídeo (endotoxina capaz de induzir lesão pulmonar aguda) (MacNee, 2000). A fumaça de cigarro representa, ainda, fonte concentrada de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio, além de inúmeros radicais livres na fase gasosa e associada a partículas. Os malefícios provocados pelo fumo estão relacionados com tempo de exposição à fumaça de cigarro, quantidade de cigarros consumidos por dia, característica do cigarro consumido e eficiência da inalação da fumaça que ocorre pelo ato de tragar (Ezzati e cols., 2003). As alterações no tecido pulmonar frequentemente associadas aos efeitos da fumaça de cigarro envolvem: (1) modificações na fisiologia e estrutura pulmonar, levando ao comprometimento da troca gasosa; (2) aumento do número de células inflamatórias, como macrófagos, neutrófilos e linfócitos; e (3) aumento de liberação de mediadores inflamatórios, como citocinas, quimiocinas e proteases (Cotran e cols., 1994; McCrea e cols., 1994; Kuschner e cols., 1996; Finlay e cols., 1997; van der Vaart e cols., 2004).
1.2 COMPOSIÇÃO DA MATRIZ EXTRACELULAR PULMONAR
A destruição alveolar presente no enfisema engloba não só a morte de células epiteliais alveolares, mas principalmente a destruição da matriz extracelular (MEC) que compõe a estrutura do parênquima pulmonar.
Colágeno, elastina, proteoglicanos e glicosaminoglicanos são os principais constituintes do tecido conjuntivo pulmonar (Mercer e cols., 1990; Weibel e cols., 1986). Em tecidos distensíveis contendo fibras elásticas e colágenas, o componente elástico controla o grau de distensão e confere o recolhimento passivo do tecido após remoção da força aplicada. Enquanto que o colágeno se distende facilmente até seu comprimento de repouso, resistindo vigorosamente a maiores distensões.
No pulmão normal, as proteínas da MEC são secretadas por células da própria matriz, como fibroblastos e células mesenquimais, e organizadas em rede nos espaços que circundam as células. A MEC ocupa um volume significativo no tecido e não representa apenas um material inerte, de suporte estrutural. Pelo contrário, possui informações que orientam a organização das células e são determinantes para o comportamento mecânico do pulmão (Raghow e cols., 1994; (Goldstein e cols., 1991; Alberts e cols., 1994; Cotran e cols., 1999; Park e cols., 2001; Chen e cols., 2001; Suki e cols, 2005; Pelosi, 2007).
1.2.1 Fibras colágenas
O turnover de colágeno no pulmão compõe um processo dinâmico, necessário para a manutenção de sua arquitetura normal (Armstrong e cols., 1999; Rocco e cols., 2003; Suki e cols, 2005). Em presença de agressões leves, a produção de colágeno é limitada e capaz de restaurar a arquitetura pulmonar. Por outro lado, lesões graves podem resultar em cicatriz generalizada, com consequente
destruição da arquitetura e função pulmonares, indicando que o processo biomecânico implicado na sua síntese reage muito rapidamente à agressão (Chesnutt e cols., 1997; Armstrong e cols., 1999; Marshall e cols., 2000, Rocco e cols., 2001; Rocco e cols., 2004). A substituição de colágeno tipo III por tipo I, mais rígido, pode responder por distúrbios nas trocas gasosas e alterações fisiológicas em estágios tardios de fibrose (Entzian e cols., 1990).
Colágeno é sintetizado como pró-colágeno. Fibroblastos e outras células mesenquimais secretam pró-colágenos recém-formados, que são, então, clivados por endopeptidases (Pugin e cols., 1999). A quantidade de colágeno depositada depende da extensão do dano tecidual, da intensidade de proliferação de fibroblastos e de substâncias efetoras presentes na inflamação (Meduri, 1999). Diversos agentes intensificam a síntese de colágeno, como: fatores de crescimento [fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), família de fatores de crescimento (FGF), TGF-] e citocinas [interleucinas 1 (IL-1), 4 (IL-4) e 6 (IL-6)], secretados por leucócitos e fibroblastos. Entretanto, o acúmulo final de colágeno não depende apenas de sua síntese, mas também de sua degradação (Cotran e cols., 1999; Suki e cols., 2005).
1.2.2 Fibras elásticas
As fibras elásticas são sintetizadas por muitos tipos celulares no pulmão, incluindo condroblastos, miofibroblastos e células musculares lisas (Starcher, 2000). O sistema elástico possui diferentes componentes definidos de acordo com a quantidade crescente de elastina e orientações das fibrilas (Gerli e cols., 1990). As fibras elásticas maduras são formadas por um cilindro central sólido, composto por abundante material amorfo e homogêneo (elastina), envolto por microfibrilas.
Durante o desenvolvimento da fibra, surge, inicialmente, um simples feixe de microfibrilas, a seguir, ocorre deposição gradual de elastina entre as microfibrilas, até a maturação completa. As propriedades das fibras elásticas dependem de seu componente amorfo. Nos processos de reparação pulmonar, após a destruição de fibras maduras do sistema elástico, ocorre gradual substituição por fibras mais imaturas, pobres em elastina e, portanto, menos extensíveis.
A elastina é extremamente estável e resistente à ação de proteases. A renovação da elastina faz-se necessária para o crescimento tecidual e remodelamento. Esse processo, porém, é muito lento e requer enzimas específicas para iniciar sua degradação. Dessa forma, sob condições normais, ocorre pouco remodelamento de fibras elásticas na vida adulta (Montes, 1992).
Após uma agressão, as fibras elásticas, assim como as fibras colágenas, se reorganizam durante o processo de remodelamento da MEC. A fibroelastose pode resultar de reparo e remodelamento subsequentes à inflamação septal e fragmentação de fibras elásticas. Além disso, esse processo pode ser parcialmente responsável pela perda da arquitetura normal das paredes alveolares, contribuindo para a tendência ao colapso e para a resolução da inflamação. A destruição intensa do sistema elástico leva à reativação da síntese de elastina, porém de forma desorganizada, com prejuízo às propriedades mecânicas do pulmão (Negri e cols., 2000).
1.2.3 Proteoglicanos e glicosaminoglicanos
Proteoglicanos são constituídos por um centro proteico com longas cadeias laterais de polissacarídeos, os glicosaminoglicanos. Glicosaminoglicanos interagem com colágeno, elastina e células, provavelmente modulando a formação e/ou
remodelamento do tecido conjuntivo (Huang e cols., 1999). Os proteoglicanos apresentam natureza hidrofílica, atraindo íons e fluido para a matriz e, potencialmente, alterando o turgor tecidual (Al Jamal e cols., 2001; Schmidt e cols., 1990).
Fibroblastos, monócitos, células endoteliais e outras células produzem glicoproteínas, cuja principal função consiste em promover a ligação entre os diversos componentes da MEC, bem como potencializar a resposta celular a fatores de crescimento (Snyder e cols., 1990; Cotran e cols., 1999). Glicoproteínas também exercem papel chave no extravasamento de leucócitos e agregação plaquetária. Como algumas células requerem adesão para sua proliferação, a ausência de fixação a elementos da MEC pode induzir apoptose (Cotran e cols., 1999). Os proteoglicanos e glicosaminoglicanos estão envolvidos em uma variedade de processos biológicos, incluindo interações célula-matriz e ativação de quimiocinas, enzimas e fatores de crescimento (Taylor & Gallo, 2006). Esses processos são mediados através da capacidade de interagirem com numerosas proteínas, incluindo proteases, citocinas, moléculas de adesão e fatores de crescimento (Handel e cols., 2005; Miserocchi e cols., 2001). Adicionalmente, fornecem suporte mecânico ao tecido, permitindo a difusão de moléculas hidrossolúveis e migração celular, além de participarem da organização da MEC (Alberts e cols., 1994; Miserocchi e cols., 2001).
1.3 PRINCIPAIS MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA DPOC
Os principais mecanismos descritos como responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do enfisema incluem a hipótese de desequilíbrio entre proteases e antiproteases, mecanismo inflamatório, estresse oxidativo, apoptose celular alveolar
e remodelamento da matriz extracelular, com desequilíbrio lesão-reparo (Suki e cols., 2003; Yoshida e cols., 2007; Barnes e cols., 2000).
1.3.1 Hipótese protease-antiprotease
A teoria clássica sobre o mecanismo de destruição tecidual do enfisema se baseia no desequilíbrio entre proteases e antiproteases (Barnes e cols., 2000). Várias enzimas proteolíticas, como elastase neutrofílica e diferentes metaloproteases (MMP), juntamente com enzimas antiproteolícas, como 1-antitripsina e inibidores teciduais de metaloproteases de matriz (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase - TIMP), são responsáveis pela manutenção e reparo da matriz extracelular pulmonar normal, regulando a deposição e destruição de fibras elásticas e colágenas. A hipótese de desequilíbrio protease-antiprotease foi formulada a partir da observação de que indivíduos com deficiência de 1-antitripsina, potente inibidor endógeno da elastase neutrofílica, desenvolviam enfisema precocemente, particularmente quando fumantes (Laurell e col., 1963). Esses achados levaram ao uso de diferentes proteases no desenvolvimento de modelos experimentais de enfisema, confirmando sua importância na fisiopatologia da doença. Shapiro e colaboradores (2003) observaram 59% de proteção contra o desenvolvimento de enfisema em camundongos knock out para elastase neutrofílica, submetidos à exposição crônica à fumaça de cigarro. Outros autores descreveram proteção de 67 e 72% contra o desenvolvimento de enfisema após administração de antiproteases (Churg e cols., 2003; Pemberton e cols., 2006).
A destruição alveolar secundária ao desequilíbrio entre proteases e antiproteases tem sido estreitamente relacionada à inflamação pulmonar desencadeada pela exposição à fumaça de cigarro. A fumaça de cigarro provoca
uma cadeia de resposta inflamatória com participação de macrófagos alveolares e influxo de neutrófilos no parênquima pulmonar, levando à grande liberação de proteases, que, por sua vez, sobrepuja as defesas antiproteolíticas do trato respiratório inferior, com consequente destruição do parênquima pulmonar (Gross e cols., 1965; Laurell e cols., 1963). A formulação original da hipótese protease-antiprotease postulou o neutrófilo, e em particular a elastase neutrofílica, como fatores principais no enfisema (Janoff e cols., 1985). Entretanto, posteriormente, outros estudos apontaram controvérsias em relação à absoluta preponderância da elastase neutrofílica na fisiopatologia da doença. Embora alguns estudos demonstrem a presença de neutrófilos em áreas de destruição de tecido em pacientes com enfisema, outros não observaram correlação entre o número de neutrófilos e gravidade da destruição pulmonar (Damiano e cols., 1986; Eidelman e cols., 1990; Finkelstein e cols., 1995), sugerindo que outras proteases, além da elastase neutrofílica, pudessem participar do mecanismo de lesão. Estudos de exposição aguda à fumaça de cigarro apontam correlação entre os níveis de neutrófilos no lavado broncoalveolar (BAL) e níveis de desmosina, marcador de degradação de fibras elásticas, bem como com o nível de hidroxiprolina, marcador de degradação de fibras colágenas. Adicionalmente, a administração de anticorpos antineutrófilos, antes da exposição à fumaça de cigarro, provoca redução da degradação da matriz extracelular pulmonar (Churg e cols., 2003; Dhami e cols., 2000; Wright e cols., 2002; Pemberton e cols., 2002). Por outro lado, diferentes metaloproteases, como MMP-9 e MMP-12, foram reconhecidas como capazes de degradar elastina (Parks e cols., 2001), a partir da identificação de aumento de MMPs no BAL e tecido pulmonar de fumantes (Demedts e cols., 2006; Grumelli e cols., 2004; Imai e cols., 2001), bem como pela observação de que camundongos
com ausência de MMP-12 não desenvolviam enfisema após exposição à fumaça de cigarro (Haumataki e cols., 1997).
A exposição à fumaça de cigarro provoca aumento dos níveis de MMPs no tecido pulmonar, bem como em macrófagos alveolares (Churg e cols., 2004; Selman e cols., 1996), sendo creditado às MMPs um papel importante no processo de extravasamento e migração de leucócitos (Nagase e cols., 1999; McQuibban e cols., 2002). A inibição ou deleção de MMPs reduz significativamente ou mesmo abole o desenvolvimento de enfisema, indicando um claro papel para as MMPs nesse processo (Haumataki e cols., 1997; Martin e cols 2001). No entanto, a participação exata das MMPs, assim como da elastase neutrofílica, na patogênese do enfisema não é completamente clara. Elastase neutrofílica e MMPs parecem interagir no processo da doença. Resultados prévios demonstram que a inibição de MMP reduz o influxo de neutrófilos e macrófagos induzidos pela fumaça de cigarro (Pemberton e cols., 2006; Shapiro e cols., 2003), enquanto que a elastase neutrofílica é capaz de ativar MMPs e degradar inibidores de metaloproteases, sugerindo uma cooperação entre elastase neutrofílica e MMPs no sentido de aumentar a atividade proteolítica de ambas (Shapiro e cols., 2003).
1.3.2 Inflamação pulmonar
A inflamação pulmonar continua a dominar o atual entendimento da fisiopatologia da DPOC, incluindo o enfisema. A inalação de fumaça de cigarro induz respostas inflamatórias agudas e crônicas, que potencialmente levam à destruição alveolar (Yoshida & Tuder, 2007). A limitação progressiva de fluxo aéreo tem sido associada à resposta inflamatória anormal dos pulmões a agentes nocivos, como a fumaça de cigarro. O processo inflamatório da DPOC caracteriza-se por ativação e
infiltração de linfócitos T CD8+, macrófagos e neutrófilos (Jeffery e cols., 2002; Cosio e cols., 1999). Em contraste com a inflamação presente na asma, um predomínio de linfócitos CD8+ é característico de biópsias brônquicas, de pequenas vias aéreas e de parênquima pulmonar de fumantes com DPOC (O’Shaughnessy e cols., 1997; Lams e cols., 2000; Hogg e cols., 2004; Saetta e cols., 1999). Adicionalmente, a inflamação na DPOC não responde ao tratamento com corticosteróide, o que poderia ser potencialmente explicado pelo efeito da droga em aumentar a sobrevida de neutrófilos, através da inibição de apoptose (Keatings e cols., 1997; Cox e cols., 1995).
A inflamação crônica na DPOC esta associada a aumento na expressão gênica e de proteínas no lavado broncoalveolar de diferentes quimiocinas e mediadores pró-inflamatórios, incluindo TNF-, IL1-, IL-8, MIP-2, MCP-1, MIP-1, MIP-1, MCP-3, KC, PGE2, IL-12, IL-18 (Churg e cols., 2008). Muitos desses genes inflamatórios são regulados pelo fator de transcrição fator nuclear (NF)-B. De fato, o NF-B se encontra ativado nos pulmões e em células inflamatórias (particularmente macrófagos alveolares) de indivíduos com DPOC (Barnes, 2006; Di Stefano e cols., 2002).
Pacientes com DPOC apresentam aumento do número de macrófagos e neutrófilos tanto em tecido pulmonar e de vias aéreas quanto no lavado broncoalveolar ou escarro (Pesci e cols., 1998; Keatings e cols., 1996; Retamales e cols, 2001), sendo descrito uma correlação positiva entre número de macrófagos e neutrófilos nas vias aéreas e gravidade da doença (Keatings e cols., 1996; Di Stefano e cols., 1998). Essas células liberam mediadores inflamatórios e espécies reativas de oxigênio em resposta à fumaça de cigarro e a outros irritantes (Keatings e cols., 1996), bem como uma variedade de enzimas elastolíticas - incluindo
elastase neutrofílica, MMP-2, -8, -9, -12 e catepsina G, K, L e S, e proteinase-3 - que contribuem para destruição do parênquima pulmonar (Barnes e cols., 2003). Achados experimentais recentes reforçam a correlação entre destruição de fibras elásticas, células e mediadores inflamatórios, e distensão alveolar (Churg e cols., 2007). Por outro lado, fragmentos de elastina liberados durante a degradação das fibras elásticas recrutam mais células inflamatórias para o parênquima pulmonar, aumentando a inflamação e destruição do tecido pulmonar (Hautamaki e cols., 2002).
Outros estudos, porém, demonstram correlação entre destruição da parede alveolar em fumantes com aumento do número de macrófagos alveolares e linfócitos T, mas não com o número de neutrófilos (Finkelstein et al., 1995). Saetta e cols (1998) também observaram relação entre aumento de células CD8+ nas vias aéreas periféricas e redução da função pulmonar de indivíduos fumantes, submetidos à ressecção cirúrgica de carcinoma pulmonar periférico isolado. Adicionalmente, níveis de mieloperoxidase e IL-8 estão frequentemente aumentados no BAL de pacientes com DPOC e em fumantes normais em comparação com não-fumantes, sugerindo que o fumo per se, ao invés da DPOC, possa induzir essas alterações (Barnes et al., 2006).
Estudo com explantes de pulmão obtidos de pacientes com DPOC leve e moderado (classificação de GOLD I e II) ressalta, ainda, a participação de redução da resposta anti-inflamatória nesses indivíduos, com menor liberação da citocina anti-inflamatória IL-10 em resposta a lipopolissacarídeo (Hackett e cols., 2008).
Embora seja claro que a exposição à fumaça de cigarro evoca resposta inflamatória tanto em seres humanos quanto em animais, existe grande variabilidade entre espécies em relação aos tipos celulares mais envolvidos, magnitude de efeito
e evolução temporal (Churg e cols., 2008). Presença de variabilidade substancial na celularidade total também é descrita entre indivíduos com o mesmo grau de doença, uma vez que a DPOC é reconhecida como uma condição heterogênea, onde vários fatores intrínsecos e extrínsecos (e.g. história de tabagismo, tabagismo atual, poluentes ambientais, diferentes tratamentos) podem influenciar a infiltração de células inflamatórias na mucosa brônquica (Churg e cols., 2002). O papel fisiopatológico específico de cada tipo celular envolvido no enfisema ainda permanece por ser determinado (Yoshida &Turner., 2007).
1.3.3 Estresse oxidativo
Outro importante evento na patogênese da DPOC é representado pela presença de estresse oxidativo. A fumaça de cigarro contém altas concentrações de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (Pryor e cols., 1993). O aumento dos níveis de ROS nas vias aéreas e tecido pulmonar após inalação de fumaça de cigarro pode originar-se diretamente de oxidantes presentes na fumaça ou indiretamente, a partir da liberação de ROS por macrófagos e neutrófilos que infiltram os pulmões. Adicionalmente, macrófagos e neutrófilos de fumantes apresentam maior liberação de ROS do que células de indivíduos não-fumantes (Bridges e cols., 1985; Hoidal e cols., 1981; Ludwig e cols., 1982; Macnee e cols., 2005). Células epiteliais das vias aéreas e células epiteliais alveolares tipo II constituem fontes adicionais de ROS, contribuindo para o desequilíbrio entre oxidantes-antioxidantes e consequente estresse oxidativo (Comhair e cols., 2000). Estudo recente, comparando a resposta oxidante induzida por fumaça de cigarro e por lipopolissacarídeo, demonstra que os perfis de atividade de enzimas pulmonares que participam desse desequilíbrio diferem dependendo do estímulo inflamatório
desencadeante (Valença e cols., 2008).
Estudos bioquímicos reportam presença de estresse oxidativo em fumantes e níveis maiores de estresse naqueles com DPOC (Bowler e cols., 2004; Macnee e cols., 2004). As alterações observadas incluem aumento de H2O2 e 8-isoprostano no ar exalado, diminuição de antioxidantes plasmáticos, bem como aumento dos níveis plasmáticos e teciduais de proteínas oxidantes e de vários produtos de peroxidação lipídica, além de indicadores de lesão provocada por espécies reativas de nitrogênio. Os níveis de enzimas antioxidantes também se encontram alterados. A lesão oxidativa pode inativar antiproteases (Cavarra e cols., 2001) e prolongar a resposta inflamatória (Barnes e cols., 2005; Cavarra e cols., 2001; Ito K e cols., 2005).
Evidências de lesão oxidante também são descritas em modelos animais de exposição à fumaça de cigarro, com aumento da expressão de superóxido dismutase e catalase em macrófagos (McCusker & Hoidal, 1990), aumento de produtos de peroxidação lipídica e marcadores de dano oxidativo ao DNA em vias aéreas e células epiteliais alveolares (Aoshiba e cols., 2003), bem como depleção de substâncias antioxidantes, como glutationa e ácido ascórbico (Cavarra e cols., 2001). Achados experimentais também estabelecem ligação entre deficiência de proteção antioxidante e a hipótese protease-antiprotease. A ausência do fator de transcrição Nrf2, que regula uma variedade de genes detoxificantes e antioxidantes, provoca aumento de inflamação e destruição tecidual induzida por exposição à fumaça de cigarro em camundongos (Iizuka e cols., 2005; Rangasamy e cols., 2004; Singh e cols., 2006).
1.3.4 Mecanismo de lesão-reparo
Inúmeras evidências confirmam que a fumaça de cigarro provoca resposta inflamatória, acompanhada por liberação de vários mediadores, incluindo proteases, oxidantes e peptídeos tóxicos, culminando em destruição do tecido pulmonar (Churg e cols., 2002). No entanto, em presença de lesão, o pulmão, como vários outros tecidos, é capaz de iniciar mecanismos de reparo. Processos de reparo parecem estar ativos mesmo no pulmão normal, com renovação diária de cerca de 5% das fibras colágenas. A manutenção da estrutura tecidual normal requer um equilíbrio entre quantidade de colágeno sintetizado e degradado, o que é consistente com um mecanismo de reparo ativo no tecido pulmonar normal (Rennard e cols., 2006). Dessa forma, a destruição tecidual que caracteriza o enfisema representa um desequilíbrio entre os processos de destruição e reparo teciduais, de forma análoga ao desequilíbrio protease-antiprotease, sendo a parede alveolar incapaz de regenerar sua matriz (Churg e cols., 2008).
Vários mecanismos têm sido propostos para explicar essa “falência de manutenção/reparo pulmonar”, como: aumento de apoptose celular (Imai e cols., 2001; Majo e cols., 2001; Tuder e cols., 2003; Yokohori e cols., 2004); redução de proliferação e quimiotaxia celular (Carnevali e cols., 1998; Rennard e cols., 2006); depressão da produção e atividade de lisil oxidase, uma enzima crucial para a configuração final das fibras elásticas e colágenas (Gao e cols., 2005; Laurent e cols., 1983); e aumento da expressão de marcadores associados ao envelhecimento (Nyunoya e cols., 2006; Tsuji e cols., 2006). Evidências em modelos animais sugerem, ainda, que a falência de reparo representa um processo dependente do tempo e dose de exposição à fumaça de cigarro (Churg e cols. 2008). A fumaça de cigarro é diretamente tóxica às células pulmonares, sendo capaz de reduzir funções
de reparo de fibroblastos, células epiteliais e células mesenquimais. Esses efeitos podem resultar, também, de alterações de vias bioquímicas, afetando diferentes funções de reparo, como quimiotaxia e proliferação celular, bem como produção e remodelamento da matrix extracelular (Rennard e cols., 2006). Adicionalmente, as fibras elásticas representam o componente de matriz com maior dificuldade de reparo. A incapacidade das células pulmonares em restaurar as fibras elásticas degradadas exacerba o processo da doença, levando a comprometimento permanente da função pulmonar e degeneração tecidual progressiva (Shifren & Mecham, 2006).
1.4 RELAÇÃO ESTRUTURA-FUNÇÃO
As principais características patológicas da DPOC, inflamação de pequenas vias aéreas e destruição do parênquima pulmonar, apresentam como consequência funcional a limitação de fluxo expiratório. O fluxo expiratório é determinado pela pressão motriz que promove a saída de ar dos pulmões (gerada pelo recolhimento elástico do pulmão) e pela resistência ao fluxo de ar (obstrução das vias aéreas). A destruição da matriz pulmonar presente no enfisema, com degradação das fibras que compõem o parênquima e consequente desarranjo da rede de interdependência alveolar, contribui para a limitação de fluxo aéreo, reduzindo o recolhimento elástico pulmonar, bem como a sustentação das vias aéreas. Por outro lado, a inflamação de pequenas vias aéreas também contribui para as alterações funcionais observadas no enfisema. O processo inflamatório provoca aumento de espessura da parede das vias aéreas, juntamente com indução de fibrose e hipertrofia da camada muscular lisa, resultando em estreitamento do espaço luminal (Saetta e cols., 2001).
Fibras colágenas, fibras elásticas, proteoglicanos e glicosaminoglicanos constituem os principais componentes do tecido conjuntivo (Mercer e cols., 1990; Weibel e cols., 1986). Embora a contribuição exata de cada um desses elementos permaneça desconhecida, o comportamento mecânico da matriz colágeno-elastina-proteoglicanos provavelmente representa a principal porção de dissipação de energia durante a respiração (Al Jamal e cols., 2001; Fredberg e cols., 1989; Mijailovich e cols., 1994; Stamenovic e cols., 1988; Fung e cols., 1993). As propriedades elásticas do colágeno e fibras elásticas diferem, em grande medida. O colágeno, elemento mais abundante, admite apenas alongamento mínimo, mostrando grande resistência à tração. Inversamente, as fibras elásticas são altamente distensíveis, apresentando menor resistência à tração (Hoppin e cols., 1986; Mijailovich e cols., 1993; Weibel e cols., 1986). No parênquima pulmonar, a elastina oferece elasticidade, especialmente em níveis mais baixos de estresse, enquanto que as fibras colágenas se encontram dispostas de forma mais solta e ondulada, sendo progressivamente recrutadas com o aumento do estresse, conferindo suporte contra a ruptura do tecido (Garcia e cols., 2004; Maksym e cols., 1997).
A microestrutura do parênquima pulmonar atua como um suporte de tensão (Lai-Fook e cols., 1977; Mead e cols., 1957), a pressão transpulmonar (força de distensão do pulmão) é transmitida através do parênquima, distendendo todas as estruturas intrapulmonares (Mead e cols., 1957). Fibras dispostas em rede podem exibir propriedades viscoelásticas e histeréticas (Brown e cols., 1994; Bull e cols., 1957; Sasaki e cols., 1993). Estudos prévios sugerem que o conteúdo de colágeno e elastina influencia diretamente a rigidez e viscosidade do parênquima pulmonar (Faffe e cols., 2002; Faffe e cols., 2006; Fust e cols., 2004; Mercer & Crapo, 1990).
Entretanto, não só o número absoluto de fibras constitui um importante fator que influencia o comportamento mecânico, mas sim a organização e/ou interação entre essas fibras (Mijailovich e cols., 1994; Yuan e cols., 1997)
Embora a maioria dos estudos aponte a elastina como principal alvo de destruição no enfisema, as alterações fisiopatológicas também podem resultar de anormalidades na matriz de colágeno (Ito e cols., 2005). As fibras colágenas, mais rígidas, protegem o pulmão contra ruptura em grandes volumes. Assim, a presença de destruição alveolar no enfisema implica em comprometimento da rede de colágeno (Suki e cols., 2003). Em um modelo de enfisema induzido por elastase, Ito e cols observaram aumento do conteúdo pulmonar de colágeno, acompanhado, porém, de menor resistência do tecido ao estresse (Ito e cols., 2005), indicando alteração do processo de remodelamento. Neste modelo, camundongos também apresentaram aumento de histeresividade e redução de elastância. Embora o tecido pulmonar normal apresente associação positiva entre histeresividade e relação elastina/colágeno, camundongos enfisematosos apresentam aumento de histeresividade acompanhado de aumento do conteúdo de colágeno. Esses resultados sugerem que o remodelamento anormal do colágeno pode desempenhar um papel significativo nas alterações funcionais observadas no enfisema (Ito e cols., 2005). Brewer e colaboradores (2003) reportaram, ainda, que pulmões de ratos com enfisema apresentavam histeresividade constante com o aumento pressão transpulmonar, em contraste com animais normais, onde era observada redução da histeresividade com o aumento da pressão transpulmonar. Em pulmões normais, a natureza volume-dependente da histeresividade pode ser atribuída à contribuição progressiva de colágeno em presença de maior volume pulmonar (Sly e cols., 2003; Mijailovich e cols., 1994; Yuan e cols., 2000).
No entanto, as alterações funcionais descritas se restringem a modelos de enfisema induzidos por elastases, havendo escassez de informações sobre alterações funcionais relacionadas à exposição à fumaça de cigarro, principal causa de enfisema. Evidências da literatura ressaltam a característica variável do enfisema, com variabilidade de tipos de células inflamatórias, proteases, grau de oxidação entre espécies e mesmo interlaboratórios utilizando a mesma espécie (Wright e cols., 2008). O processo fisiopatológico desenvolvido também se mostra dependente do agente agressor e tipo de protocolo utilizado (Valença e cols., 2008). Adicionalmente, as medidas clássicas de função pulmonar se mostram pouco sensíveis às alterações induzidas pela fumaça de cigarro (Vlahos e cols., 2006).
1.5 MODELOS DE ESTUDO DOS EFEITOS DA FUMAÇA DE CIGARRO
Os modelos animais são importantes na determinação dos mecanismos subjacentes à DPOC uma vez que reproduzem aspectos envolvendo respostas integradas de todo o organismo. Muitas espécies têm sido utilizadas, incluindo roedores, cães, cobaias, macacos e ovelhas (Mahadeva e cols., 2002; Shapiro e cols., 2000; (Auerbach e cols., 1967; Mawdesley-Thomas e cols., 1970; Gilman e cols., 1981; Petersen e cols., 1984; Rogers e cols., 1985; Nishikawa e cols., 1998; Terashima e cols., 1999; Ofulue e Ko., 1999; Dhami e cols., 2000; Ejaz e cols., 2005).). No entanto, os camundongos oferecem maior vantagem para investigação das vias patogênicas da doença, devido aos avanços na engenharia genética, grande quantidade de informações sobre o genoma de camundongos e abundância de anticorpos disponíveis (Vlahos e cols., 2006).
Em camundongos, as características da DPOC humana podem ser modeladas pela administração de proteases, agentes químicos, partículas e
exposição à fumaça de cigarro. Apesar de ser a principal causa da doença, a utilização de modelos animais induzidos por exposição à fumaça é relativamente recente (Vlahos e cols., 2006; Wright e cols., 2008). Um modelo ideal de DPOC permitiria reproduzir todas as diferentes lesões anatômicas associadas à doença, em um curto período de tempo. No entanto, os modelos disponíveis reproduzem apenas alguns aspectos da DPOC. Camundongos apresentam características anatômicas, como a concentração de glândulas mucosas na traquéia proximal, que dificultam a reprodução de bronquite crônica, logo, os modelos de exposição à fumaça de cigarro representam modelos de enfisema. Embora esses animais não apresentem bronquíolos respiratórios, foco inicial da destruição, a exposição prolongada à fumaça de cigarro produz lesões compatíveis com a forma leve de enfisema centrolobular observada em seres humanos (Wright & Churg, 1990; Wright e cols., 2008). Os prós e contras dos modelos de enfisema induzidos por fumaça de cigarro se encontram listados na tabela 1 (Tabela 1).
Vários fatores dificultam a comparação entre os achados obtidos por diferentes grupos, como uso de diferentes cigarros (comercial ou de referência), número de cigarros e instrumentos utilizados, bem como protocolo de exposição e linhagem de camundongos empregada no estudo (Churg e cols., 2008; Vlahos e cols., 2006; Wright e cols, 2008). Algumas linhagens de camundongos apresentam relativa resistência aos efeitos da fumaça de cigarro, existindo também variabilidade entre quais células/proteases são crucias para o processo (Guerassimov e cols., 2004). Por outro lado, essa variabilidade reproduz a heterogeneidade observada em seres humanos, podendo potencialmente auxiliar no melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na doença.
Tabela 1. Prós e contras de modelo de enfisema induzido por fumaça de cigarro
Prós
Induzido pelo mesmo agressor importante para humanos
Produz enfisema, remodelamento de vias aéreas e remodelamento vascular/hipertensão em algumas espécies
Produz alterações fisiológicas semelhantes as observadas em humanos
Contras
Não reproduz a forma grave de doença observada em humanos Necessita de vários meses de exposição
Lesões parecem não progredir após interrupção da exposição à fumaça de cigarro Adaptada de Wright JL e cols. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008; 295: L1-15
Em modelos de exposição à fumaça de cigarro, níveis sanguíneos de metabólitos da nicotina ou de carboxihemoglobina (COHb) são utilizados como biomarcadores, com o objetivo principal de determinar precisamente a dose de fumaça utilizada (i.e., a quantidade de fumaça captada por dia ou por cigarro) (Wright e cols., 2008). Em seres humanos, a meia-vida da COHb varia entre 1-4 h, dependendo da frequência respiratória e atividade física. A concentração média de COHb observada em fumantes é de cerca de 4-7%, em comparação com níveis de 1-2% em não-fumantes. Fumantes pesados podem atingir concentrações de COHb >12% (Scherer, 2006) (Tabela 2).
Tabela 2. Concentrações médias de carboxihemoglobina (COHb), biomarcador para monóxido de carbono, em não-fumantes e fumantes.
Adaptado de Scherer G. Exp Toxicol Pathol 2006; 58: 101-124
Embora a presença de enfisema seja observada apenas após exposição crônica à fumaça de cigarro (em torno de 6 meses), modelos de exposição aguda já são capazes de demonstrar processo inflamatório, com ativação de mediadores sabidamente importantes para o desenvolvimento da lesão (Churg e cols. 2003; Castro e cols., 2008; Castro e cols., 2004). Adicionalmente, em seres humanos, mecanismos determinantes da fase aguda podem ser substancialmente diversos dos participantes na fase crônica da doença. Esses achados indicam que respostas agudas à fumaça podem ser úteis como preditores do desenvolvimento de enfisema e, também, como forma de rastreamento para identificação de novos alvos terapêuticos (Vlahos e cols., 2006). No entanto, apesar da vasta quantidade de informações sobre as alterações inflamatórias e estruturais relacionadas com a exposição à fumaça de cigarro, não há relatos sobre a evolução temporal da função pulmonar nesses modelos.
Autores [referência] Não-fumantes (N) Fumantes (N) Carboxihemoglobina (COHb) (%) Cole (1975) 0,97 (120) 5,5 (100) Szadkowski e cols (1976) 0,72 (37) 3,37 (115) Saloojee e cols (1982) 0,73 (79) 7,09 (360) Jarvis e cols (1984b) 0,9 (46) 3,9 (94) Pojer e cols (1984) 0,93 (181) 4,36 (187) Heinemann e cols (1984) 2,2 (171) 6,9 (472)
1.5 MECÂNICA RESPIRATÓRIA
1.5.1 Noções básicas
A respiração é um processo cíclico, que envolve trabalho mecânico dos músculos respiratórios para a movimentação do sistema respiratório. O sistema respiratório é formado por dois componentes: o pulmão e a parede torácica. Como parede torácica subentende-se todas as estruturas que se movimentam durante o ciclo respiratório à exceção dos pulmões. A pressão motriz, gerada pela contração muscular durante a inspiração, precisa vencer forças de oposição, tais como: a) forças elásticas dos tecidos pulmonares e parede torácica; b) forças resistivas resultantes do fluxo de gás pelas vias aéreas e movimentação das moléculas constituintes dos tecidos pulmonar e da parede torácica (D’Angelo e cols., 1994); c) forças viscoelásticas dos tecidos pulmonares e da parede torácica; d) forças plastoelásticas responsáveis pela histerese (Hildebrandt, 1970); e) forças inerciais (dependentes da massa dos tecidos e dos gases) (Mead, 1961); f) forças gravitacionais (incluídas nas forças elásticas) (Milic-Emili, 1977); e g) forças de distorção da parede torácica. Contudo, durante a respiração basal, as forças inerciais e de distorção da parede são consideradas desprezíveis (Rodarte & Rehder, 1986).
Elasticidade é uma propriedade da matéria que permite ao corpo retornar à sua forma original após ter sido deformado por uma força sobre ele aplicada. Um corpo perfeitamente elástico, como uma mola, obedecerá à lei de Hooke, onde, a variação de comprimento é diretamente proporcional à força aplicada, até que seu limite elástico seja atingido. Em visão tridimensional, teríamos volume proporcional à pressão.
A parede torácica e o tecido pulmonar possuem propriedades elásticas e obedecem à Lei de Hooke, de modo que quanto maior a pressão motriz, maior o volume de gás inspirado. A inclinação da curva volume-pressão ou a relação entre a variação de volume gasoso mobilizado (V) e a pressão necessária para manter o sistema respiratório insuflado naquele volume é conhecida como complacência do sistema respiratório (Crs). Logo, Crs = V/Pel,rs, onde Pel,rs corresponde à pressão de retração elástica do sistema respiratório.
Frequentemente utiliza-se a elastância ao invés da complacência. Esta corresponde ao inverso da complacência (Ers = 1/Crs), ou seja, é a relação entre a variação de pressão e o volume mobilizado resultante.
O comportamento elástico do pulmão é atribuído a dois fatores: presença de componentes elásticos e tensão superficial. O tecido pulmonar é composto por fibras elásticas e colágenas, as quais apresentam características elásticas, obedecendo à Lei de Hooke. Acredita-se que o comportamento elástico do pulmão não dependa do simples alongamento das fibras de tecido conjuntivo, mas, principalmente, do seu arranjo geométrico. Todas as estruturas pulmonares encontram-se interligadas pela trama de tecido conjuntivo pulmonar, de forma que, durante a insuflação, todos esses componentes se dilatam uniformemente, fenômeno conhecido como “interdependência”.
Além das propriedades elásticas dos tecidos pulmonares, os pulmões ainda apresentam um importante fator que contribui para as suas características elásticas: a tensão superficial exercida pelas moléculas que recobrem a zona de troca gasosa. A tensão superficial em uma interface ar-líquido aparece porque as moléculas do líquido são atraídas com maior intensidade ao longo da superfície do próprio líquido do que para a fase gasosa acima deste. A tensão superficial pode ser definida como
a força que age sobre uma linha imaginária de 1 cm de comprimento na superfície de um líquido. Essa tensão surge porque as forças atuando entre as moléculas do líquido são muito maiores do que aquelas entre líquido e gás, fazendo com que a área líquida se torna a menor possível.
Em uma estrutura esférica como uma bolha de sabão, a tensão superficial tem a propriedade importante de gerar pressão no interior da bolha. A relação entre a tensão superficial na parede e a pressão desenvolvida dentro da bolha de sabão é dada pela Lei de Laplace. Essa afirma que, para cada superfície de uma bolha, a pressão (P) é igual ao dobro da tensão (T) dividida pelo raio (r), ou, para ambas as superfícies, P = 4T/r. Entretanto, quando somente uma interface está envolvida, como em um alvéolo esférico revestido por líquido na sua face interna, o numerador tem a constante 2 em lugar de 4. Considerando-se dois alvéolos de diferentes tamanhos conectados através de uma via aérea comum, e com tensão superficial semelhante, pode-se depreender, com base na Lei de Laplace, que a pressão no alvéolo menor seria maior do que no alvéolo maior. Desta forma, os alvéolos menores esvaziar-se-iam nos maiores, resultando em vários alvéolos colapsados e outros hiperinsuflados. Contudo, isso não ocorre nos pulmões normais, pois a tensão superficial do surfactante, líquido de composição protéica (≅10%) e, principalmente, fosfolipídica (≅90%) secretado pelos pneumócitos tipo II, é consideravelmente menor do que a da solução salina que recobre as mucosas pulmonares. Dessa forma, há um equilíbrio entre os alvéolos maiores e menores, com uma mesma pressão mantida em seus interiores.
Durante a movimentação do sistema respiratório, quando ocorre fluxo de gás, um elemento adicional ao elástico precisa ser vencido pela pressão motriz: a
resistência. A resistência do sistema respiratório (Rrs) pode ser calculada dividindo-se Pres,rs pelo fluxo aéreo. Pres,rs é a pressão resistiva do sistema respiratório, ou seja, a pressão necessária para vencer seus componentes resistivos. Semelhantemente à complacência, e pelas mesmas razões, a resistência do sistema respiratório pode ser subdividida em seus componentes pulmonar e de parede.
A resistência pulmonar, por sua vez, pode ser subdividida em dois subcomponentes: resistência das vias aéreas (Raw), que depende do fluxo de ar no interior dos pulmões; e resistência tecidual (Rtis), determinada pelas perdas energéticas geradas pela viscosidade (isto é, atrito) pertinentes à movimentação do pulmão. A resistência das vias aéreas pode ser influenciada pela geometria da árvore traqueobrônquica, pelo volume pulmonar, pela complacência das vias aéreas, pela viscosidade do gás mobilizado e pela musculatura lisa dos brônquios. A resistência tecidual depende da velocidade de deslocamento, tanto durante a inspiração como na expiração. A resistência da parede torácica também é determinada pelas perdas energéticas geradas pela viscosidade pertinente à movimentação das moléculas que constituem os tecidos da parede torácica.
Além dos componentes elásticos e resistivos, o sistema respiratório apresenta, também, propriedades viscoelásticas, que atuam no tecido pulmonar e na parede torácica. A viscoelasticidade foi descrita, a partir do comportamento de fios de seda, por Wilhelm Weber em 1835. Esse tipo de material obedece à lei da proporcionalidade entre a força aplicada e o alongamento resultante (Lei de Hooke), porém apenas por um curto período de tempo após a aplicação da força. Quando a carga permanece por um tempo prolongado, o alongamento passa a aumentar continuamente. O alongamento tempo-dependente representa uma propriedade universal, presente em vários tecidos animais (Dorrington, 1980).
Substâncias viscoelásticas, quando mantidas sob deformação constante, apresentam queda da tensão, chamada de relaxamento de tensão (stress relaxation), ou simplesmente, relaxamento, quando o corpo é estirado. Por outro lado, sob tensão constante, o corpo tende a se deformar continuamente com o decorrer do tempo, fenômeno chamado creep. Faz-de notar que esta deformação não se mostra irreversível, mas sim reprodutível, podendo ser repetida, desde que seja precedida por um período de tempo durante o qual o material permaneça em condições de repouso, a fim de apagar a memória do evento anterior. Do ponto de vista morfofuncional, a viscoelasticidade ocorre ao nível do tecido pulmonar e da parede torácica, permitindo o intercâmbio de energia (pressão) entre os componentes elástico e resistivo. Por exemplo, durante uma pausa inspiratória, a energia potencial (pressão) acumulada no componente elástico pode ser dissipada sob a forma de calor pelo componente resistivo.
1.5.2 Estudo da Mecânica Respiratória
Na tentativa de compreender a complexidade do sistema respiratório e seus componentes (pulmão e parede torácica), além dos diversos mecanismos envolvidos durante a respiração, foram utilizados modelos matemáticos relativamente simples, que se aproximam da realidade. Para tanto, faz-se necessária a interpretação fisiológica de variáveis mensuráveis como fluxo, volume e pressão na abertura das vias aéreas.
O modelo mais simples utiliza 2 elementos, uma resistência (representada por um tubo) e uma elastância (representada por um balão) (Figura 3). Esse modelo baseia-se na assertiva de que as propriedades mecânicas do sistema respiratório independem do volume pulmonar e do fluxo, e que os fatores inerciais são
desprezíveis. Considerando-se o sistema respiratório normal, esse modelo pode ser utilizado, e tornou-se tão popular que geralmente refere-se à equação a ele associada como "equação de movimento do sistema respiratório". Essa equação é dada por P(t) = E.V(t) + R.V’(t), onde, em qualquer instante t, E e R representam, respectivamente, a elastância e a resistência do sistema respiratório e P significa a pressão motriz capaz de produzir volume (V) e fluxo aéreo (V’). Entretanto, apesar do modelo de compartimento único continuar sendo amplamente utilizado, não é possível empregá-lo com precisão para o estudo da mecânica em presença de doenças pulmonares, sendo necessário um modelo de dois ou mais compartimentos, que apresentem diferentes constantes de tempo para descrever o comportamento mecânico do sistema respiratório. Além disso, essa equação de movimento não explica o decaimento lento da pressão traqueal observado após oclusão das vias aéreas ao final da inspiração (Bates e cols., 1985a; 1985b; Don & Robson, 1965), a dependência de freqüência de R e E na faixa de 0-2 Hz (Barnas e cols., 1987; Bates e cols., 1989; Brusasco e cols., 1989; Hantos e cols.,1986; 1987), bem como a presença de histerese na curva volume-pressão quase-estática em pulmões isolados (Similowski & Bates, 1991).
Passa-se, então, ao estudo da mecânica respiratória utilizando-se modelos bicompartimentais que consideram a heterogeneidade de distribuição de gás nos pulmões (Mead, 1961) e a viscoelasticidade dos tecidos (Mount, 1955).
