Formulação de meio de cultura livre de proteinas animais para celulas de Drosophila melanogaster produtoras da glicoproteina G do virus da raiva

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FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO:

DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS

Formulação de Meio de Cultura Livre de Proteínas Animais

para Células de Drosophila melanogaster Produtoras da

Glicoproteína G do Vírus da Raiva

Autora: Fabiana Regina Xavier Batista (DPB/FEQ/UNICAMP)

Orientadora: Profa_Dra_{Ângela Maria Moraes (DPB/FEQ/UNICAMP)}

Co-Orientador: Dr. Ronaldo Zucatelli Mendonça (LIV/Instituto Butantan) Co-Orientador: Prof. Dr. Thomas Noll (Universidade de Bielefeld/Alemanha)

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Engenharia Química.

Campinas - SP Setembro de 2007

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA

BIBLIOTECA DA ÁREA DE ENGENHARIA E ARQUITETURA - BAE - UNICAMP

B32f Batista, Fabiana Regina Xavier Formulação de meio de cultura livre de proteínas animais para células de Drosophila melanogaster

produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva / Fabiana Regina Xavier Batista.--Campinas, SP: [s.n.], 2007. Orientadores: Ângela Maria Moraes, Ronaldo Zucatelli Mendonça, Thomas Noll.

Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química. 1. Células – Cultura e meios de cultura. 2. Hidrofobia. 3. Drosofila melanogaster. 4. Proteínas virais. 5. Metabolismo. I. Moraes, Ângela Maria. II. Mendonça, Ronaldo Zucatelli. III. Noll, Thomas. IV. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. V. Título.

Título em Inglês: Animal protein-free medium formulation for Drosophila melanogaster cells producting the G glycoprotein from rabies vírus.

Palavras-chave em Inglês: Drosophila cells, Culture medium, Recombinant protein, Rabies, GPV, Metabolism.

Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos. Titulação: Doutor em Engenharia Química

Banca examinadora: Soraia Attie Calil Jorge, Rosane Aparecida Moniz Piccoli, José Luiz Caldas Wolff e Carlos Augusto Pereira.

Data da defesa: 25/09/2007

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Agradecimentos

Ao querido Dr. Álvaro Paiva Braga de Sousa, por todo carinho, paciência e respeito que me foram dedicados.

À querida amiga Dra_{. Adriana Lages Lima Galesi pela contribuição e incentivo na}

realização deste estudo.

Aos companheiros do Laboratório de Imunologia Viral, que sempre me incentivaram e contribuíram na realização deste trabalho.

Aos companheiros do Departamento de Processos Biotecnológicos da Unicamp que foram sempre motivo de alegria e descontração.

À Dra. Kamilla Swiech e equipe da Universidade Federal de São Carlos e a Saul Nitsche Rocha da Escola Politécnica da USP pela disponibilidade e colaboração na realização de diversas análises.

Às queridas companheiras Betina da Silva Ribeiro e Rosa Alida Rodriguez Mercado que me confortaram na ausência da família e proporcionaram momentos inesquecíveis de alegria e muita emoção na longínqua cidade de Bielefeld na Alemanha...muitas saudades!

Ao grupo de pesquisadores e alunos do projeto temático pela colaboração na realização de experimentos e na análise de resultados.

Aos meus familiares que sempre torceram por meu sucesso.

À Dra Elisabeth Furusho Pral pela utilização do Laboratório de Biologia Celular e Bioquímica de Protozoários do Instituto de Ciências Médicas da USP.

À Profa Dra Elisabeth de Fátima Pires Augusto do Instituto de Pesquisas Tecnológicas de São Paulo pela assessoria científica e pela utilização de seu laboratório, e aos colegas deste instituto, Renato e Marcelo pela colaboração.

Ao Prof. Dr. Aldo Tonso da Escola Politécnica da USP pela colaboração na análise dos resultados obtidos neste estudo.

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Ao Dr. Heino Büntemeyer da Universidade de Bielefeld na Alemanha pela realização de diversas análises e a interpretação dos resultados obtidos.

Ao Dr. Carlos Augusto Pereira pela assessoria científica e a cessão das dependências do Laboratório de Imunologia Viral do Instituto Butantan.

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Thomas Noll pela assessoria científica, apoio financeiro e pela cessão das dependências de seu laboratório na Universidade de Bielefeld na Alemanha, e aos companheiros Stefan, Marc, Tobias, Kerstin, Angela, e Ulrike pela colaboração.

Ao meu co-orientador Dr. Ronaldo Zucatelli Mendonça pela colaboração através de novos conhecimentos fora de minha área de atuação.

Em especial, à minha orientadora de mestrado e agora de doutorado Profa Dra Ângela Maria Moraes pela confiança e incentivo, mesmo nos momentos de dificuldades e desânimo.

À Capes, Fapesp e ao Laboratório de Imunologia Viral do Instituto Butantan, pelo auxílio financeiro.

A todos que de alguma maneira contribuíram para o sucesso desta difícil etapa de minha vida.

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Resumo

Células embrionárias de dípteros como as de Drosophila melanogaster S2 estão sendo utilizadas com sucesso na expressão de diversas proteínas recombinantes. Em comparação a células de mamíferos, este sistema de expressão mostra-se capaz de realizar modificações pós-tradução na complexidade requerida, apresentando maior facilidade de cultivo.

O objetivo deste trabalho foi formular um meio de cultura livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, que proporcionasse o crescimento de células S2, aplicável a linhagens transfectadas (S2AcGPV2) produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Para tal, foi empregado o meio basal IPL-41 e avaliados os efeitos das concentrações de glicose, frutose, lactose, glutamina, metionina e tirosina, do hidrolisado de leveduras yeastolate, do agente Pluronic F68, assim como de uma emulsão lipídica, sobre a concentração de células viáveis e a viabilidade celular. Em adição, foram avaliadas a velocidade específica de crescimento, a produtividade celular e a produção de GPV nas formulações testadas. Os ensaios foram realizados primeiramente em frascos do tipo schott, e, após a obtenção da formulação do meio de cultura mais adequada, realizaram-se ensaios cinéticos, em maior escala, em frascos do tipo spinner, nos quais se pode estudar a influência da concentração de oxigênio dissolvido e do pH no cultivo. Durante o estudo foram empregados dois modos de operação de cultivo, batelada e batelada alimentada.

Nos estudos enfocando a formulação do meio de cultura, verificou-se que o meio IPL-41 suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de frutose, 2 g/L de lactose, 3,5 g/L de glutamina, 0,6 g/L de tirosina, 1,48 g/L de metionina, 6 g/L de yeastolate, 1 % de emulsão lipídica e 0,05 % de Pluronic F68 mostrou-se como o mais adequado para a obtenção de elevadas concentrações celulares (superiores a 300 x105 células/mL). Com esta formulação, foram realizados os ensaios em frascos spinner, no sistema Cellferm-pro®. Neste sistema as células S2AcGPV2 atingiram a maior concentração (368 x105 células/mL) e o maior teor de GPV (9,39 ng/106 células) quando mantidas na concentração de 40 % de oxigênio dissolvido e pH 6,3. A avaliação do metabolismo celular mostrou que asparagina, serina, prolina, glutamina, glicose e a maltose foram os principais nutrientes consumidos e que alanina, lactato e amônia foram os principais metabólitos produzidos.

Palavras-chave: Células de Drosophila, Meio de Cultivo, Proteína Recombinante, Raiva, GPV, Metabolismo.

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Abstract

Drosophila melanogaster Schneider 2 cells have been used with success to produce several recombinant proteins. This expression system presents several advantages when compared with mammalian cells expression system, and usually provide an adequate pos-tradutional protein processing, being easier to culture.

The aim of this work was to produce an animal component-free medium for S2 cells growth, and also for transfected cells (S2AcGPV2) producing the G glycoprotein from rabies virus (GPV). The basal IPL-41 medium was used and the effects of supplements glucose, fructose, lactose, glutamine, methionine, tyrosine, yeastolate ultrafiltrate, Pluronic F68 and lipid emulsion on viable cell concentration and cellular viability were evaluated. In addition, the cell specific growth rate, cellular productivity and GPV production were analyzed in the formulations studied. The experiments were carried out in schott flasks, as well as in spinner flasks. The effects of dissolved oxygen concentration and pH were evaluated in spinner flasks. During the study, batch and fed- batch mode operation were used.

In the studies focusing media formulation developed, IPL-41 supplemented with 10 g/L of glucose, 0.5 g/L of fructose, 2 g/L of lactose, 3.5 g/L of glutamine, 0.6 g/L of tyrosine, 1.48 g/L of methionine, 6 g/L of yeastolate, 1 % of lipid emulsion and 0.05 % of Pluronic F68 provided high cell density (above 300 x105 cells/mL). In the experiments performed in spinner flasks, using the Cellferm-pro® system, S2AcGPV2 cells reached the highest cell concentration (368 x105 cells/mL) and protein content (9.39 ng/106 cells), at 40 % of dissolved oxygen concentration and pH of 6.3. The cell metabolism shown that, amino acids as asparagine, serine, proline, glutamine, and carbohydrates as glucose and maltose were consumed. The main metabolities produced were alanine, ammonia and lactate.

Key words: Drosophila cells, Culture medium, Recombinant Protein, Rabies, GPV, Metabolism.

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Sumário

Agradecimentos ...vii Resumo ...xi Abstract...xiii Sumário...xv Lista de Figuras...xix Lista de Tabelas...xxv

Lista de Abreviaturas ...xxix

1. Introdução ... 1

2. Objetivo ... 5

3. Revisão da Literatura ... 7

3.1. Tecnologia de Cultivo de Células Animais: Células de Mamífero versus Células de Inseto ... 7

3.2. Meios de Cultura e Sua Importância no Cultivo de Células de Inseto... 11

3.2.1. Meios Empregados no Cultivo de Células de Drosophila melanogaster... 17

3.3. Planejamento Fatorial e seu Papel na Formulação de Meios de Cultivo... 21

3.4. Aumento de Escala no Cultivo em Suspensão de Células de Inseto... 22

3.5. Obtenção de Produtos Recombinantes por Diferentes Sistemas de Expressão... 25

3.6. Relevância da Raiva como Problema de Saúde Pública... 27

3.6.1. A Produção de Vacinas Contra Raiva ... 28

4. Materiais e Métodos ... 31

4.1. Materiais ... 31

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4.2. Métodos ... 32

4.2.1. Obtenção do Banco de Células... 32

4.2.2. Preparo do Inóculo Celular... 33

4.2.3. Avaliação do Crescimento das Linhagens Selvagem e Transfectada nos Meios de Cultivo Comerciais Selecionados... 34

4.2.4. Avaliação Preliminar do Efeito dos Suplementos Selecionados no Crescimento Celular ... 35

4.2.5. Análise Detalhada do Metabolismo das Células S2AcGPV2 ... 37

4.2.5.1. Análise da Influência do pH, da Concentração de Oxigênio Dissolvido e do Modo de Operação no Cultivo Celular ... 38

4.3. Metodologia Analítica ... 41

4.3.1. Monitoramento do Crescimento e da Viabilidade Celular ... 41

4.3.2. Determinação das Variáveis Cinéticas de Crescimento Celular ... 41

4.3.3. Determinação das Concentrações de Açúcares no Meio de Cultura... 42

4.3.4. Determinação das Concentrações de Aminoácidos no Meio de Cultura... 43

4.3.5. Determinação das Concentrações de Metabólitos no Meio de Cultura... 43

4.3.6. Determinação da Osmolalidade dos Meios de Cultivo Avaliados ... 44

4.3.7. Determinação da Glicoproteína G do Vírus da Raiva ... 44

5. Resultados e Discussão ... 47

5.1. Desempenho da Linhagem S2 Selvagem nos Meios Comerciais Empregados... 47

5.2. Cultivo da Linhagem S2AcGPV2 nos Meios Comerciais Empregados... 50

5.2.1. Variáveis Cinéticas de Crescimento Celular para as Linhagens S2 Selvagem e S2AcGPV2 nos Meios de Cultura Comerciais Avaliados... 52

5.3. Formulação de Meios de Cultivo com Reduzida Concentração de SFB Através da Adição de Suplementos ... 54

5.4. Estudo do Efeito das Concentrações de Yeastolate e SFB avaliado através de um Planejamento Completo 22_{Expandido em Estrela... 57}

(12)

5.5. Avaliação do Efeito das Concentrações de Frutose, Lactose, Tirosina, Metionina e

Emulsão Lipídica através de um Planejamento Fracionário 25-2... 61

5.6. Efeito da Redução da Concentração da Emulsão Lipídica no Cultivo das Células Transfectadas ... 63

5.7. Análise da Influência do Efeito das Concentrações de Frutose, Lactose, Tirosina e através do Planejamento Completo 24... 65

5.7.1. Estudo de Validação dos Resultados Obtidos no Planejamento Completo 24... 68

5.7.1.1. Teste de Tukey... 70

5.8. Comparação do Comportamento das Células de Drosophila melanogaster S2 Selvagens e Transfectadas no Meio IPL-41 Suplementado ... 72

5.9. Avaliação da Variabilidade Observada entre os Ensaios Controle Empregados ... 80

5.9.1. Avaliação da Confiabilidade dos Resultados Obtidos nos Planejamentos Fatoriais.. 81

5.10. Avaliação do Metabolismo das Células S2AcGPV2 nos Meios Empregados ... 83

5.11. Avaliação do efeito do pH no Cultivo das Células S2AcGPV2 em Meio de Cultura IPL-41 Suplementado... 90

5.12. Avaliação da Concentração de Oxigênio Dissolvido no Cultivo das Células S2AcGPV2 em Meio IPL-41 Suplementado Utilizando o Sistema Cellferm-pro® ... 98

5.13. Cultivo das Células S2AcGPV2 em Modo Batelada Alimentada em Meio IPL-41 Suplementado Utilizando o Sistema Cellferm-pro®... 105

5.14. Análise Preliminar da Viabilidade Econômica da Produção da GPV pelas Células S2AcGPV2 em Meio IPL-41 Suplementado... 114

6. Conclusões... 121

7. Sugestões para Trabalhos Futuros... 123

8. Referências Bibliográficas ... 125

Anexo ... 135

Anexo 1. Resultados Complementares Referentes à Seção 5.1 ... 135

(13)

Anexo 8. Resultados Complementares Referentes à Seção 5.12. ... 148

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Lista de Figuras

Figura 3.1. Estrutura química do Pluronic F68. ... 10

Figura 3.2. Rotas metabólicas propostas por Shuler e Kargi (1992)... 12

Figura 3.3. Estrutura protéica do vírus da raiva. ... 28

Figura 4.1. Sistema de cultivo celular Cellferm-pro (DASGIP, Jülich, Alemanha). ... 39

Figura 5.1. Cinética de crescimento (A) e viabilidade celular (B) da linhagem S2 selvagem nos meios TC100, Grace, IPL-41 acrescidos de 10 % de SFB e em meio Sf900 II... 48

Figura 5.2. Consumo de glicose (A) e evolução da concentração de lactato (B) durante o cultivo da linhagem S2 selvagem nos meios TC100, Grace, IPL-41 suplementado com 10% de SFB e em meio Sf900 II. ... 49

Figura 5.3. Cinética de crescimento (A) e viabilidade celular (B) da linhagem S2AcGPV2 nos meios TC100, Grace, IPL-41 suplementados com 10 % de SFB e em meio Sf900 II. . 50

Figura 5.4. Consumo de glicose (A) e evolução da concentração de lactato (B) durante o cultivo da linhagem S2AcGPV2 nos meios TC100, Grace, IPL-41 e Sf900 II. ... 52

Figura 5.5. Desempenho das células S2AcGPV2 em diferentes meios (1 a 4) formulados a partir do meio basal IPL-41. Foram monitoradas a concentração (A) e a viabilidade (B) celular. ... 55

Figura 5.6. Superfície de resposta obtida para o planejamento 22_{... 60}

Figura 5.7. Influência de diferentes concentrações de emulsão lipídica (0,5 e 1 %) sobre a concentração celular (A), viabilidade (B), consumo de glicose (C) e evolução da concentração de lactato (D). Foram empregados os meio IPL-41 suplementado com yeastolate (6g/L), glicose (10g/L), glutamina (3,5g/L), frutose (0,75g/L), lactose (3g/L), tirosina (0,86g/L), metionina (1,68g/L) e Pluronic F68 (0,05%). ... 65

Figura 5.8. Concentrações de células viáveis cultivadas em meio Sf900 II e nas formulações correspondentes aos níveis inferior e superior obtidas do planejamento 24. ... 68

Figura 5.9. Acompanhamento da concentração de células viáveis (A e C) e da viabilidade celular (B e D) durante o cultivo utilizando as formulações correspondentes aos níveis inferior (ensaios A1, A2 e A3) e superior (ensaios B1, B2 e B3) do planejamento fatorial 24 anterior, respectivamente... 69

(15)

Figura 5.10. Influência de diferentes meios de cultivo sobre o crescimento celular, o

consumo de glicose (B), frutose (C), lactose (D), tirosina (E), metionina (F) e a formação de metabólitos, lactato (G) e amônia (H) para as células selvagens cultivadas em meio IPL-41 suplementado, TC100 suplementado com 10 % de SFB e Sf900 II... 73

Figura 5.11. Influência de diferentes meios de cultivo sobre o crescimento celular, o

consumo de glicose (B), frutose (C), lactose (D), tirosina (E), metionina (F) e a formação de metabólitos, lactato (G) e amônia (H) para as células S2AcGPV2 cultivadas em meio IPL-41 suplementado, TC100 suplementados com 10 % de SFB e Sf900 II... 74

Figura 5.13. Produção de GPV em meio IPL-41 suplementado e em meio Sf900 II. ... 77 Figura 5.14. Cinéticas de crescimento celular das triplicatas dos pontos centrais dos

planejamentos realizados e suas correspondentes médias. (A) planejamento 22, (B) planejamento 25-2 e (C) planejamento 24. ... 82

Figura 5.15. Cinéticas de crescimento celular (A), produção de proteína (B), consumo de

glicose (C), maltose (D); lactose (E); sacarose (F); evolução da concentração de lactato (G), produção de amônia (H) para os ensaios realizados em meio IPL-4 suplementado e em meio Sf900 II... 84

Figura 5.16. Monitoramento da concentração de glutamina (A), amônia (B), glicose (C) e

lactato (D) em meio IPL-41 suplementado e em meio Sf900 II isentos de células... 89

Figura 5.17. (A) Sistema de cultivo celular Cellferm-pro (DasGip, Jülich/Alemanha) e (B) spinners mantidos a 28ºC e 55 rpm... 90

glicose (C), consumo de maltose (D), consumo de lactose (E), consumo de sacarose (F), evolução da concentração de lactato (G) e produção de amônia (H) obtidos em meio IPL-41 suplementado, empregando o sistema Cellferm-pro. A concentração de oxigênio no set

point foi de 40% e o pH variado (6,0 e 6,3). ... 92

Figura 5.19. Controle do pH e do oxigênio dissolvido (40%) e monitoramento da

temperatura no cultivo das células S2AcGPV2 mantidas em meio IPL-41 suplementado empregando o sistema Cellferm-pro. (A e B) spinner mantido em pH 6,0 e (C e D)

spinner mantido em pH 6,3. ... 94

Figura 5.20. Comportamento da taxa de consumo de oxigênio (OUR) nos spinners

(16)

glicose (C), consumo de maltose (D), consumo de lactose (E), consumo de sacarose (F), produção de lactato (G), produção de amônia (H), e monitoramento da osmolalidade (I) obtidos em meio IPL-41 suplementado com glicose (10 g/L), frutose (0,5 g/L), lactose (2 g/L), glutamina (3,5 g/L), tirosina (0,6 g/L), metionina (1,48 g/L), emulsão lipídica (1 %) e Pluronic F68 (0,05 %) empregando frasco agitado, utilizando pH inicial de 6,9. ... 96

Figura 5.22. Cinéticas de crescimento celular (A), produção de GPV (B), consumo de

glicose (C), consumo de maltose (D), consumo de lactose (E), consumo de sacarose (F), evolução da concentração de lactato (G) e produção de amônia (H) obtidos em meio IPL-41 suplementado, empregando o sistema Cellferm-pro. O pH foi mantido em 6,3...99

Figura 5.23. Controle do oxigênio dissolvido e monitoramento da taxa de consumo de

oxigênio (OUR) no cultivo das células S2AcGPV2 mantidas em meio IPL-41 suplementado empregando o sistema Cellferm-pro mantido em pH 6,3 para (A) 5%, (B) 20%, (C) 40%, (D) 60% e (E) 95% de demanda de oxigênio. ... 104

glicose (C), consumo de maltose (D), consumo de lactose (E), consumo de sacarose (F), evolução da concentração de lactato (G) e produção de amônia (H) obtidas em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro mantido o pH de 6,3 e a DO de 40 %, em diferentes estratégias de alimentação. ... 107

Figura 5.25. Variação da osmolalidade do meio de cultura, em sistemas empregando

diferentes estratégias de alimentação. ... 108

Figura 5.26. Controle de oxigênio dissolvido (fixo em 40%) e monitoramento da taxa de

consumo de oxigênio no cultivo das células S2AcGPV2 empregando o sistema Cellferm-pro. (A) estratégia de alimentação sob vazão constante (B) estratégia de alimentação segundo perfil sigmoidal. ... 109

Figura A1. Performance das células S2 selvagens, crescimento celular e consumo de

glicose, cultivadas em meio Grace (A) e em meio IPL-41 (B), ambos contendo 10 % de SFB. A figura ilustra o espalhamento em torno da média (desvio padrão) calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata... 135

Figura A2. Performance das células S2 selvagens, crescimento celular e consumo de

glicose, cultivadas em meio TC100 com 10 % de SFB (A) e em meio Sf900 II (B). A figura ilustra o desvio padrão calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata. ... 136

(17)

Figura A3. Performance das células S2AcGPV2, crescimento celular e consumo de

glicose, cultivadas em meio Grace (A) e em meio IPL-41 (B), ambos contendo 10 % de SFB. A figura ilustra o desvio padrão (espalhamento em torno da média) calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata... 137

glicose, cultivadas em meio TC100 com 10 % de SFB (A) e em meio Sf900 II (B). A figura ilustra o espalhamento em torno da média calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata. ... 138

glicose, cultivadas em meio IPL-41 contendo 0,5 % (A) e 1 % (B) de emulsão lipídica. As formulações empregadas continham ainda yeastolate (6 g/L), glicose (10 g/L), glutamina (3,5 g/L), frutose (0,75 g/L), lactose (2 g/L), tirosina (0,86 g/L) e metionina (1,68 g/L). A figura ilustra o desvio padrão calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata... 139

glicose, cultivadas em TC100 com 10 % de SFB (A) e em meio Sf900 II (B). As culturas correspondem aos ensaios controle do experimento que avaliou o efeito de diferentes percentuais da emulsão lipídica (0,5 e 1 %) no cultivo celular. A figura ilustra o desvio padrão calculado a partir das culturas efetuadas em duplicata... 140

Figura A7. Cinética de viabilidade celular para a linhagem selvagem (A) e transfectada (B)

cultivadas em meio TC100 com 10 % de SFB, Sf900 II e IPL-41 suplementado com yeastolate (6g/L), glicose (10g/L), glutamina (3,5g/L), emulsão lipídica (1%), frutose (0,5g/L), lactose (2g/L), metionina (1,48g/L), tirosina (0,6g/L) e Pluronic F68(0,05%)... 141

Figura A8. Cinética de crescimento das células S2AcGPV2 cultivadas em meio TC100

com 10 % de SFB (A, replicatas 1 a 4) e Sf900 II (B, replicatas 1 e 2)... 142

Figura A9. Cinética de crescimento celular e produção de GPV (A), consumo de glicose,

evolução da concentração de lactato, produção de amônia e o monitoramento da osmolalidade (B) para a linhagem transfectada cultivadas em meio IPL-41 suplementado com yeastolate (6g/L), glicose (10g/L), glutamina (3,5g/L), emulsão lipídica (1%), frutose (0,5g/L), lactose (2g/L), metionina (1,48g/L), tirosina (0,6g/L) e Pluronic F68(0,05%). A figura ilustra o espalhamento em torno da média calculado a partir das culturas efetuadas em triplicata. ... 143

Figura A10. Cinética de crescimento celular e produção de GPV (A), consumo de glicose,

(18)

osmolalidade (B) para a linhagem transfectada cultivadas em meio Sf900 II. A figura ilustra o desvio padrão calculado a partir das culturas efetuadas em triplicata... 144

Figura A11. Monitoramento da osmolalidade no cultivo das células S2AcGPV2 mantidas

em pH 6,0 e 6,3, cultivadas em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro..147

Figura A12. Descrição dos spinners utilizados no sistema Cellferm-pro. (A) Adição de ar realizada na superfície do meio de cultura e (B) adição de ar realizada através de borbulhamento no meio de cultura. ... 147

Figura A13. Monitoramento do pH e da temperatura no cultivo das células S2AcGPV2

mantidas com 5 % de oxigênio dissolvido, em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro. ... 148

Figura A18. Monitoramento da osmolalidade no cultivo das células S2AcGPV2 mantidas

em diferentes concentrações de oxigênio dissolvido, em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro. ... 150

Figura A19. Controle do pH e monitoramento da temperatura no cultivo das células

S2AcGPV2 mantidas em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro sob vazão constante de alimentação... 156

Figura A20. Controle do pH e monitoramento da temperatura no cultivo das células

S2AcGPV2 mantidas em meio IPL-41 suplementado, no sistema Cellferm-pro sob vazão segundo perfil sigmoidal de alimentação. ... 156

(19)

Lista de Tabelas

Tabela 3.1. Comparação entre células de insetos e de mamíferos em termos de tecnologia

de propagação celular (adaptada de Agathos, 1991). ... 8

Tabela 3.2. Composição da emulsão lipídica empregada no cultivo de células de inseto. . 15 Tabela 3.3. Principais componentes do soro fetal bovino (Freshney, 1992)... 16 Tabela 3.4. Composição dos principais meios basais potencialmente empregados no cultivo

de células de Drosophila. ... 19

Tabela 3.5. Produtos recombinantes produzidos através de células de Drosophila... 26 Tabela 4.1. Suplementos adicionados aos meios basais Grace e IPL-41. ... 35 Tabela 4.2. Concentração dos suplementos empregados no cultivo realizado em batelada

alimentada. O meio IPL-41 foi empregado como meio basal, mantendo-se constantes as concentrações dos nutrientes não inclusos na tabela... 39

Tabela 4.3. Resumo dos experimentos realizados... 40 Tabela 5.1. Variáveis cinéticas das linhagens S2 e S2AcGPV2 nos meios avaliados. ... 53 Tabela 5.2. Variáveis cinéticas obtidas para as células S2AcGPV2 cultivadas nas

formulações com reduzidas concentrações de SFB... 56

Tabela 5.3. Faixa de valores empregados no planejamento 22_{para o estudo da produção de}

células. ... 58

Tabela 5.4. Planejamento fatorial 22_{com 4 pontos axiais e 3 replicatas no ponto central.. 58} Tabela 5.5. Efeitos principais das variáveis do planejamento 22_{em X}

máx. ... 59 Tabela 5.6. Análise de variância (ANOVA) do planejamento 22_{para X}

máx... 59 Tabela 5.7. Faixa de valores empregados no planejamento 25-2_{para o estudo da produção}

de células. ... 61

Tabela 5.8. Planejamento fatorial fracionário 25-2_{com três replicatas no ponto central... 62} Tabela 5.9. Efeitos principais das variáveis do planejamento 25-2_{para X}

(20)

Tabela 5.10. Influência de diferentes percentuais de emulsão lipídica nas variáveis

cinéticas de crescimento celular. Foram realizados simultaneamente ensaios comparativos em meio TC100 suplementado com 10% de SFB e em Sf900 II... 64

Tabela 5.11. Faixa de valores empregados no planejamento 24_{para o estudo da produção}

de células ... 66

Tabela 5.12. Planejamento fatorial 24 completo... 66

Tabela 5.13. Efeitos principais das variáveis avaliadas no planejamento 24 para Xmáx. ... 67 Tabela 5.14. Máxima concentração celular obtida nos ensaios utilizando o nível inferior do

planejamento 24_{(ensaios A1, A2 e A3) e nível superior (ensaios B1, B2 e B3). ... 70} Tabela 5.15. Análise de variância para o teste de Tukey a 95% de confiança. ... 70 Tabela 5.16. Estudo comparativo das linhagens cultivadas em meio IPL-41 suplementado.

Ensaios controle em meio TC100 com 10% de SFB e em meio Sf900 II... 72

Tabela 5.17. Comparação da produção de GPV em meio IPL-41 suplementado. Ensaio

controle em meio Sf900 II... 78

Tabela 5.18. Variáveis cinéticas das células S2AcGPV2 observadas nos meios TC100 com

10 % de SFB e Sf900 II, cultivadas em frasco schott. Inóculo de 7,5 x105 céls./mL. ... 80

Tabela 5.19. Concentração de aminoácidos (mM) no cultivo celular em meio IPL-41

suplementado em frasco agitado, em pH inicial de 6,3... 85

Tabela 5.20. Concentração de aminoácidos (mM) no cultivo celular em meio Sf900 II em

frasco agitado, em pH inicial de 6,3. ... 87

Tabela 5.21. Concentração de aminoácidos (mM) no cultivo celular em meio IPL-41

suplementado em frasco agitado, em pH inicial de 6,9... 97

Tabela 5.22. Concentração de aminoácidos (mM) em meio IPL-41 suplementado, no

sistema Cellferm-pro®, sob diferentes concentrações de oxigênio. ... 103

Tabela 5.23. Concentração de aminoácidos (mM) no cultivo celular sob diferentes

(21)

Tabela 5.24. Tabela comparativa das variáveis cinéticas de crescimento, metabólicas e de

produção de GPV das células S2AcGPV2 mantidas em meio IPL-41 suplementado e em meio Sf900 II... 112

Tabela 5.25. Quantificação de GPV empregando diferentes técnicas de lise celular... 114 Tabela 5.26. Estimativa de custo dos equipamentos empregados na etapa de cultivo celular

para a produção de GPV... 117

Tabela 5.27. Índices médios de composição do investimento total a partir do custo dos

equipamentos (Petrides, 2000). ... 118

Tabela 5.28. Estimativa do custo de matéria-prima. ... 119 Tabela 5.29. Análise econômica global para a produção de GPV a partir das células

S2AcGPV2 no meio IPL-41 suplementado e em meio Sf900 II... 119

Tabela A1. Concentração de aminoácidos (mM) no cultivo celular em meio IPL-41

suplementado, mantido a pH 6,0 no sistema Cellferm-pro®. ... 145

suplementado, mantido a pH 6,3 no sistema Cellferm-pro®. ... 146

suplementado, mantido a 5 % de oxigênio dissolvido no sistema Cellferm-pro®... 151

(22)

Lista de Abreviaturas

µmáx: máxima velocidade específica de crescimento celular;

AF: filtros de ar;

ANOVA: Análise de Variância;

B.O.D: do inglês Biochemistry Oxygen Demand; B: bombas;

BTI-EAA: linhagem celular insect - Estigmene agrea, larvae; C: compressores;

CE: centrífugas;

CHAPS: abreviação da fórmula química

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate.

CHO: linhagem celular Chinese Hamster Ovary; DMSO: do inglês Dimethyl sulfoxide;

DNA: do inglês Deoxyribonucleic Acid;

DS-2: linhagem de células Drosophila Schneider 2; EL: emulsão lipídica;

ELISA: do inglês Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay; F1: filtro tipo dead-end;

Fru: frutose;

GL: grau de liberdade;

GPV: do inglês G glycoprotein from rabies virus;

HPLA: do inglês High Performance Liquid Chromatography; IPL: do inglês Insect Pathology Laboratory;

(23)

Lac: lactose;

MDS: mínima diferença significativa; Met: metionina;

MQ: média quadrática; Mtn: metalotioneína; n: número de eventos;

NBD: reagente 4-chloro-7-nitro benzofurazane; NPV: nucleoproteína N do vírus da raiva; OD: oxigênio dissolvido;

OPA: reagente ortoftaldeído; OUR: do inglês oxygen uptake rate; pH: potencial hidrogeniônico;

PMSF: do inglês Phenylmethyl sulfonyl fluoride; Prod.máx: máxima produtividade celular;

qGlc: consumo específico de glicose;

qGln: consumo específico de glutamina;

qO2: velocidade específica de respiração celular;

R1: biorreator;

RNA: ácido ribonucléico

S2: linhagem de células Schneider 2;

Sf9: linhagem celular Spodoptera frugiperda clone 9; SFB: soro fetal bovino;

SQ: soma quadrática;

T1 e T2: tanques de aço inoxidável; TCA: do inglês Tricarboxilic Cicle Acids;

(24)

T-ni: linhagem celular Trichoplusia ni;

TNM-FH: do inglês Trichoplusia-ni medium Formulation Hink; Try: tirosina;

Xmáx: máxima concentração de células viáveis;

Ylac/Glc: rendimento da produção de lactato a partir do consumo de glicose;

YX/Glc: rendimento celular com relação ao consumo de glicose;

(25)

1. Introdução

Culturas de células animais em grande escala tem sido empregadas nas últimas décadas na obtenção de uma grande variedade de produtos destinados à investigação, uso diagnóstico, terapêutico e também controle biológico na agricultura. Dentre as células animais que têm sido utilizadas para este fim, destacam-se as células de mamíferos. Contudo, o cultivo destas células exige meios de cultura complexos e dispendiosos. Assim, o emprego de células de insetos, que requerem meios de cultivo menos complexos, destacou-se nos últimos anos, uma vez que estas células são capazes de realizar modificações pós-traducionais na complexidade requerida (Jarvis, 1998) e produzir proteínas recombinantes de grande interesse na área farmacológica. As células de insetos apresentam também elevado crescimento celular (Sondegaard, 1996; Valle e col., 2001) e estabilidade apropriada quando submetidas a processos de transfecção (Santos, 2007).

Células de insetos embrionárias de dípteros como Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2) estão sendo utilizadas com sucesso na expressão destas proteínas (Deml e col., 1999a; Deml e col., 1999b). O sistema Drosophila de expressão é um sistema não lítico que utiliza plasmídeos simples para a expressão estável de proteínas (Lim e Cha, 2006; Cha e col., 2005; Shin e Cha, 2003). Segundo Yokomizo e col. (2007), a expressão protéica que emprega este sistema ocorre em células viáveis em crescimento logarítmico.

As células S2 são similares às Sf9, no entanto, atingem densidades celulares superiores às observadas para as de lepidópteros (Agathos, 1991). A linhagem S2, em particular, tem sido utilizada para a expressão e o estudo de proteínas recombinantes como transferrina humana (Lim e Cha, 2006), interleucina-2 (Cha e col., 2005), antígeno de superfície do vírus da hepatite B (Deml e col., 1999b), eritropoietina humana (Shin e Cha, 2003), neuroserpina (Hill e col., 2001), moléculas de adesão celular, oncogenes, fatores transcricionais e antígenos virais (Lee e col., 2000). Destaca-se que devido ao crescente interesse neste sistema de expressão alguns trabalhos foram realizados empregando células S2 para a produção da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Nestes trabalhos, a produção desta glicoproteína, potencialmente utilizada na composição de vacinas virais de uso humano e veterinário, foi avaliada no âmbito da biologia molecular (Yokomizo, 2007),

(26)

assim como no estudo de variáveis de processo (Swiech, 2007; Pamboukian, 2007) e formulação de meio de cultivo (Galesi, 2007).

A raiva tornou-se um sério problema global de saúde nas últimas décadas. A transmissão viral ocorre por mordedura de animais contaminados, uma vez que o vírus rábico também é encontrado na saliva. Uma vez diagnosticada, a enfermidade mostra-se fatal (Sato e col., 2004). O vírus rábico possui uma glicoproteína (GPV) que atua ativando o sistema imune e induzindo a produção de anticorpos neutralizantes que protegem o organismo contra o ataque viral (Perrin e col., 1985). A GPV forma o envelope viral e apresenta uma conformação trimérica (3 x 65 KDa), situando-se ancorada à membrana viral através de uma seqüência transmembrana (Da Poian e col., 2005).

A vacina anti-rábica tem sido tradicionalmente produzida empregando-se tecidos nervosos de animais adultos, ovos embrionados e cérebro de animais lactentes como camundongos e ratos (Pérez e Paolazzi, 1997). Entretanto, esta vacina pode causar reações adversas, como alergia, além de meningoencefalomielite e paralisia.

Atualmente, o Instituto Butantan em São Paulo produz uma vacina anti-rábica na qual está presente o vírus da raiva em sua forma inativada. O vírus cresce num substrato composto por células Vero mantidas em meio livre de soro (Frazatti-Gallina e col., 2004), sendo posteriormente inativado através do uso da beta-propiolactona. Contudo, embora a vacina apresente, em comparação com a tradicionalmente produzida, um material biológico estável e com menor risco de provocar problemas de saúde no homem (Frazatti-Gallina e col., 2004), esta vacina ainda possui traços de DNA animal em sua composição, podendo promover reações alérgicas.

Neste sentido, o foco do presente trabalho está fundamentado na elaboração de meios de cultivo que apresentam formulação aberta, de composição livre de fontes de proteínas de origem animal, como o soro fetal bovino, e que possibilitem a obtenção da GPV de forma segura. Assim, o estudo contribui de maneira significativa para a redução da quantidade de material genético de origem animal na produção de vacina anti-rábica para uso humano, além de disponibilizar uma alternativa ao emprego do vírus inativado. O trabalho assegura então uma qualidade requerida em termos de requisitos de segurança, já que as Farmacopéias Européia e a Americana recomendam a remoção de produtos de origem animal em processos de produção de vacinas (van der Valk e col., 2004).

(27)

A suplementação ou a fortificação de carboidratos como glicose, frutose e lactose, empregadas como fontes de carbono, ou ainda de aminoácidos como glutamina (fonte de nitrogênio), além de metionina e tirosina (agentes de manutenção e estimulantes do crescimento celular), do yeastolate (hidrolisado de leveduras) e de uma emulsão lipídica quimicamente definida (contendo ácidos graxos, tocoferol e colesterol) no meio de cultivo para células de Drosophila transfectadas mostrou-se fundamental neste estudo para a completa substituição do soro no meio de cultivo e na obtenção de uma maior concentração de GPV. Ressalta-se, contudo, que a escolha dos suplementos empregados neste estudo foi baseada fundamentalmente em dados da literatura, que abordavam o metabolismo de células de lepidópteros (Sf9 e T-ni), uma vez que informações nutricionais relacionadas à linhagem Drosophila melanogaster ainda são limitadas.

O soro sangüíneo, principal suplemento empregado no cultivo celular, é um componente complexo e seu uso apresenta desvantagens como o aumento do custo do meio de cultura, problemas de reprodutibilidade associados à variabilidade entre lotes, além da possibilidade de introdução de contaminantes de difícil detecção como micoplasma e prions, aumentando significativamente a dificuldade no processo de recuperação e purificação do bioproduto de interesse.

Além da produção da proteína-alvo, é de grande importância à escolha correta das condições de operação do sistema empregado para suprir as condições necessárias para um eficiente desempenho das células. Neste sentido, estudos complementares para a avaliação do metabolismo celular e da influência de diferentes condições de cultivo foram realizados na Universidade de Bielefeld na Alemanha, objetivando o aumento da produção da GPV. O consumo de aminoácidos essenciais e de outros carboidratos como a maltose e a sacarose foi também avaliado, além de se ter estudado a influência do pH e da concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Adicionalmente, outro modo de operação do cultivo celular, a batelada alimentada, foi empregado, uma vez que este modo de operação pode proporcionar elevada produtividade celular e da proteína-alvo, quando comparado ao modo de operação batelada, comumente utilizado (Wlaschin e Hu, 2006). Em adição, um fator ambiental relevante para o aumento da produção de proteínas recombinantes, a osmolalidade, foi avaliado, já que se dispõe de pouca informação publicada com respeito à propagação das células S2 e a estratégias de obtenção de proteínas recombinantes por elas produzidas.

(28)

A viabilidade econômica da produção industrial de compostos recombinantes obedece a muitos critérios, dentre os quais se inclui a disponibilidade tecnológica (favorecida pela disponibilidade de meio de cultura alternativo) que este projeto procurou realizar. O emprego de componentes conhecidos, controláveis e reprodutíveis, vai ao encontro dos esforços das indústrias biotecnológicas, que não trabalham com meios de cultura adquiridos comercialmente, mas os formulam e produzem no interior da empresa. Em vista disto, este estudo visou propiciar uma potencial independência laboratorial (acadêmica ou industrial) na área de cultura celular.

Destaca-se que as células S2 empregadas neste trabalho foram modificadas geneticamente no Laboratório de Imunologia Viral do Instituto Butantan, São Paulo, e que o presente estudo está inserido em um projeto temático elaborado com o objetivo geral de clonagem dos genes da glicoproteína G do vírus da raiva e do antígeno de superfície do vírus da hepatite B em vetores de expressão, para construção de células de dípteros estavelmente transformadas que expressem estes genes, a otimização do bioprocesso de produção destes antígenos pelo cultivo celular em biorreatores e a avaliação de suas propriedades antigênicas e imunogênicas.

(29)

2. Objetivo

Este estudo buscou a formulação de um meio de cultivo livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, assim como a avaliação da influência de condições de cultivo celular, como do pH e da concentração de oxigênio dissolvido, que propiciassem o crescimento adequado das células da linhagem Drosophila melanogaster S2 modificadas geneticamente para a produção da glicoproteína G do vírus da raiva. Inseridos neste objetivo global buscaram-se os seguintes objetivos específicos:

1. Avaliação do comportamento das células selvagens e modificadas geneticamente quanto ao crescimento celular em meios basais (Grace, IPL-41 e TC100) suplementados com soro fetal bovino e meio comercial livre de soro (Sf900 II);

2. Avaliação da influência da concentração de determinados componentes suplementados ao meio IPL-41, como a glicose, a frutose, a lactose, a glutamina, a metionina, a tirosina, o yeastolate, assim como uma emulsão lipídica, sobre a máxima concentração de células viáveis e a viabilidade celular, além da produtividade celular e subseqüentemente sobre a produção de GPV;

3. Avaliação do comportamento metabólico em relação ao consumo de nutrientes como a glicose, a frutose, a lactose, a maltose e a sacarose, assim como sobre o consumo de aminoácidos essenciais, a osmolalidade e a formação de metabólitos como o lactato e a amônia;

4. Avaliação do comportamento celular em maior escala, empregando-se frascos do tipo

spinner, através do uso do sistema Cellferm-pro®;

5. Análise preliminar da viabilidade técnico-econômica da produção da glicoproteína G do vírus da raiva através do cultivo das células S2AcGPV2, empregando-se a formulação de meio de cultura desenvolvida neste trabalho.

(30)

(31)

3. Revisão da Literatura

3.1. Tecnologia de Cultivo de Células Animais: Células de Mamífero versus Células de Inseto

O cultivo de células animais tornou-se na última década uma fonte, in vitro, de fácil acesso, para a produção de biofármacos. Diversos fatores devem ser avaliados no cultivo destas células, destacando-se a composição do meio de cultivo, a densidade do inóculo celular e, em se tratando de células aderentes, o tipo de suporte para adesão celular. Destacam-se também dentre os fatores que influenciam o cultivo celular a temperatura, o pH, a pressão osmótica, a agitação e a concentração de oxigênio dissolvido (Mitsuhashi, 1989). A combinação destes fatores determina o sucesso do cultivo in vitro das células, tanto de mamíferos quanto de insetos.

Em geral, as células de mamíferos necessitam de um suporte para ancoragem, isto é, para crescer necessitam aderir a uma superfície adequada. A adesão das células é mediada por receptores de membrana específicos para moléculas na matriz extracelular. A adesão é precedida pela secreção dessa matriz de proteínas e glicanas extracelulares por parte das células. A necessidade básica de um suporte para ancoragem orienta todas as escolhas de processos produtivos (Fresnhey, 1994). Segundo Fresnhey (1992), células de mamíferos apresentam temperatura ótima para o desenvolvimento celular em torno de 37 ºC, enquanto que células de insetos desenvolvem-se na faixa de 27 a 29 ºC, dependendo da linhagem (Mitsuhashi, 1989). O pH adequado para o bom desenvolvimento de células de mamíferos situa-se na faixa de 6,8 a 7,8. Para tal, ainda segundo Fresnhey (1992), utilizam-se agentes tamponantes como Hepes, bicarbonato de sódio e ar acrescido de 5 % de CO2 para a

manutenção do pH ótimo de operação.

Células de insetos, geralmente, são cultivadas em suspensão. Em vista disto, não necessitam de suporte sólido, desenvolvendo-se livremente no meio de cultura. As células são mantidas através de repiques sucessivos, pela substituição do meio de cultura já metabolizado por meio fresco. O pH adequado no cultivo de células de insetos situa-se, geralmente, entre 6,1 e 6,4, não havendo a necessidade de acréscimo de dióxido de

(32)

carbono, o que reduz a complexidade e os custos do cultivo (Mitsuhashi, 1989). A Tabela 3.1 apresenta uma breve comparação, em termos de tecnologia de propagação, do cultivo de células de mamíferos e de insetos.

Tabela 3.1. Comparação entre células de insetos e de mamíferos em termos de tecnologia

de propagação celular (adaptada de Agathos, 1991).

Fatores Células de Insetos Células de Mamíferos

Manutenção fácil difícil

Versatilidade de suspensão / aderência maior / pouco recorrente menor / recorrente Imortalidade presente somente linhagens _{transformadas}

Inibição por contato ausente

presente, exceto para linhagem de linfócitos e células CHO

adaptadas em suspensão Remoção do suporte de adesão mecânica mecânica (hibridomas) e tratamento enzimático

Demanda de oxigênio alta moderada

Sensibilidade a mudanças de pH,

temperatura e a choque osmótico moderada alta Velocidade de crescimento celular (µmáx) alta moderada

Sensibilidade ao cisalhamento alta alta

Dependência do crescimento com a

concentração do inóculo presente presente

Muitas outras vantagens podem ser destacadas da Tabela 3.1 quando se compara o cultivo de células de mamíferos ao de insetos. Células de insetos revelam-se significativamente mais robustas quanto ao cultivo, principalmente em relação à manutenção, facilidade de adaptação na mudança de sistemas aderentes para suspensos, e principalmente por apresentarem maior resistência a estresse ambiental, como mudanças de pH e de osmolalidade (Ikonomou e col., 2003).

A osmolalidade é um dos parâmetros físico-químicos que merece atenção especial no meio de cultura. Este parâmetro leva em conta o número total de partículas

(33)

presentes nesta solução. A maioria dos meios de cultivo para células é formulada para ter uma osmolalidade entre 260 e 330 mOsm/kg de água (Freshney, 1994).

Células de mamíferos em condições de hiperosmolalidade aumentam a atividade metabólica e a secreção de metabólitos secundários como discutido previamente por Oh e col. (1995), Lin e col. (1999), Takagi e col. (2000), Olejnik e col. (2003). Já células de inseto como a Sf9 toleram osmolalidade superior a 350 mOsm/kg (Batista e col., 2006).

Olejnik e col. (2003) verificaram que células de Tricoplusia ni (linhagem Tn-5) suportam osmolalidades superiores a 450 mOsm/kg. Além disso, estes autores observaram que as células compensavam o desbalanço osmótico aumentando a taxa de consumo de aminoácidos, já que, estes compostos atuam como osmoprotetores e precursores para o metabolismo celular e na síntese de proteínas.

Destaca-se também no cultivo de células animais como fator essencial, a necessidade do fornecimento adequado de oxigênio dissolvido. Devido à sua baixa solubilidade em água, o oxigênio necessita ser continuamente fornecido ao meio líquido de maneira suave, para evitar danos celulares por cisalhamento, a fim de suprir a necessidade celular na realização de processos metabólicos.

Freshney (1992) menciona ainda que, no cultivo estático de células animais, é recomendável manter uma relação entre o volume de ar e o volume de meio de cultura de cerca de 9:1, para o provimento de oxigênio em quantidade suficiente. Contudo, em razão do alto requerimento de oxigênio no cultivo celular em reatores de maior capacidade, faz-se necessária a agitação e a injeção de ar rigorosamente controladas. É relevante mencionar, no entanto, que taxas elevadas como 100 % de saturação ou maiores (em condições hiperbáricas) e inferiores a 10 %, podem causar inibição do crescimento celular e da produção de proteínas recombinantes (Agathos, 1991).

As células Sf9, por exemplo, consomem de aproximadamente 4 a 8 x10-17_{moles de}

O2/célula*s (Tramper e col., 1992; Marques e col., 2005), ocorrendo aumento significativo

após infecção viral, devido à intensificação metabólica para a produção de novas partículas virais. Wang e col. (1993) verificaram um aumento de 100 % no rendimento específico da proteína epoxi hidrolase, produzida por células Sf9 infectadas com baculovírus recombinante, quando a concentração de oxigênio dissolvido foi mantida em 35 % da

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saturação. Os autores realizaram uma comparação direta com culturas celulares mantidas em frascos spinner sem controle da oxigenação.

Valle e col. (2001) observaram que células de Drosophila cultivadas em biorreator, em meio livre de soro, com 30 % de oxigênio dissolvido e agitação de 90 rpm, atingiram 30 x106 _{células/mL. Valores superiores (57 x10}6 _{células/mL) foram obtidos por Sondergaard}

(1996) em biorreator aerado com 50 a 60 % de oxigênio dissolvido, em meio Schneider com 10 % de SFB, mostrando a influência deste parâmetro no crescimento celular. Em adição, Butler (2006) verificou que o oxigênio dissolvido apresenta influência na realização de processos de glicosilação de proteínas recombinantes produzidas por células CHO modificadas geneticamente.

Dentro deste contexto, para casos onde a dispersão de oxigênio no meio de cultura é efetuada através de agitação intensa do meio ou através de borbulhamento de ar, passa a ser de relevância o emprego do composto Pluronic F68. Este agente é utilizado para diminuir efeitos de cisalhamento na membrana celular, viabilizando o cultivo de células de inseto tanto em contínuo quanto em batelada. A Figura 3.1 apresenta a estrutura química deste componente.

HO (CH₂CH₂O)₇₈ (CH₂CHO)₃₀ (CH₂CH₂O)₇₈ H CH₃

Figura 3.1. Estrutura química do Pluronic F68.

Nas culturas sob aeração, o Pluronic F68 atua minimizando a ligação das células às bolhas, diminuindo danos celulares que ocorrem quando aquelas são transportadas até a superfície. O surfatante tem também efeito sobre culturas não aeradas por borbulhamento, nas quais os danos celulares ocorrem em razão dos vórtices formados durante a agitação, impedindo a adesão celular à nova superfície. Em adição, o Pluronic F68 tem ação tensoativa e é capaz de acumular-se na interface gás-líquido, formando um filme na superfície celular, protegendo, com isso, as células dos efeitos do rompimento das bolhas na superfície do meio durante a aeração do mesmo (van der Pol e Tramper, 1998).

Wu e col. (1997) atribuíram o efeito protetor do Pluronic F68 à redução da hidrofobicidade celular ocasionada por interações entre o aditivo e as células. A redução da

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hidrofobicidade evitaria a adesão celular às bolhas, minimizando assim os efeitos danosos às células decorrentes da ruptura das mesmas.

A adição deste composto ao meio é indicada em concentrações de até 0,2 %m/v, dependendo de sua toxicidade à linhagem celular em estudo (van der Pol e Tramper, 1998). Entretanto, estudos realizados por Galesi (2007) mostraram que as células S2 produtoras de GPV, cultivadas em biorreator, com aeração livre de bolhas e agitação realizada por duas turbinas tipo pitched blade, apresentam elevado crescimento celular (cerca de 1x107 células/mL) somente após o emprego de 0,3 % de Pluronic F68 no meio de cultivo. Galesi (2007) observou ainda que as células S2 apresentam elevada tolerância à presença deste aditivo no meio de cultivo, quando adicionado em concentração de até 0,6 %m/v.

Por outro lado, segundo Palomares e col. (2000), para células Sf9, a adição de Pluronic F68 mostrou-se vantajosa, pois não só este composto interagiu com a membrana celular, como também modificou a capacidade de produção de proteínas recombinantes e de vírus por estas células, embora tais observações fundamentem-se no emprego de apenas 0,05 % do agente no meio.

3.2. Meios de Cultura e Sua Importância no Cultivo de Células de Inseto

Historicamente, o cultivo de células animais obteve pronunciado avanço através do emprego de um meio de cultivo proposto por Harry Eagle (1955), que continha fundamentalmente uma mistura de sais, aminoácidos, carboidratos e vitaminas suplementadas com soro sangüíneo. Atualmente, este meio ainda é usado na cultura de células de mamíferos, permitindo o cultivo de uma ampla variedade de linhagens sob condições definidas. Já o cultivo de células de insetos foi definitivamente implementado após a proposição de meio de cultura realizada por Grace em 1959.

Para a manutenção das condições do tecido original do qual a célula de inseto é oriunda, faz-se necessária a presença de um meio de cultivo que possua, dentre as substâncias anteriormente citadas, sais inorgânicos (importantes na manutenção do balanço iônico e pressão osmótica), açúcares, aminoácidos, vitaminas, lipídios, ácidos orgânicos, proteínas, hormônios, fontes de carbono, fontes de nitrogênio, soro sangüíneo, antibióticos, micronutrientes (íons orgânicos e minerais) e água (Mitsuhashi, 1989).

(36)

O meio de cultivo deve conter nutrientes essenciais para a síntese de novas células, substratos para a realização do metabolismo, além de compostos que desempenhem funções fisiológicas, catalíticas ou que atuem como cofatores. A cultura deve ser mantida livre de componentes com efeitos inibidores ou tóxicos. Neste sentido, informações sobre o metabolismo celular são fundamentais para a formulação de novos meios de cultivo, assim como para a definição da melhor estratégia de alimentação de nutrientes (batelada alimentada e contínua). A Figura 3.2 apresenta as vias principais do metabolismo de células animais.

A glicose é considerada o carboidrato fundamental para o crescimento de células animais, atuando como fonte de carbono e energia (Mendonça e col., 1999; Drews e col., 1995; Bédard e col., 1993; Öhman e col., 1995). Mendonça e col. (1999) observaram que a frutose é consumida por células Sf9 somente quando a concentração de glicose é inferior a 0,02 g/L. Nestas condições, carboidratos alternativos podem ser consumidos resultando, entretanto, em menores velocidades específicas de crescimento celular. Bédard e col. (1993) verificaram que em meio TNM-FH suplementado com SFB e glicose, os açúcares frutose e maltose podem ser empregados como fonte de carbono pelas células Sf9 e BTI-EAA, entretanto, a glicose mostrou-se como o componente de maior relevância.

Glicose Glicose-6-fosfato Gliceraldeído

...

Piruvato Acetil-CoA

6-P-gluconato Ribose-5-fosfato Ciclo da Pentose Ácidos nucléicos Oxaloacetato Malato α-cetoglutarato Glutamato Glutamina NH₄+ NH4+ Alanina Ciclo TCA Dihidroxiacetona Fosfolipídios Lactato Ácidos graxos Aspartato Proteínas Ácidos nucléicos

...

Glicose Glicose-6-fosfato Gliceraldeído

...

Piruvato Acetil-CoA

6-P-gluconato Ribose-5-fosfato Ciclo da Pentose Ácidos nucléicos Oxaloacetato Malato α-cetoglutarato Glutamato Glutamina NH₄+ NH4+ Alanina Ciclo TCA Dihidroxiacetona Fosfolipídios Lactato Ácidos graxos Aspartato Proteínas Ácidos nucléicos

...

(37)

Estudos realizados por Batista e col. (2006) mostraram que a lactose, quando empregada no cultivo de células Sf9, proporcionou um aumento na densidade e viabilidade celular. O emprego de lactose sob a forma de permeado de soro de leite liofilizado aumentou cerca de 3,5 vezes a concentração final de células Sf9 quando comparada àquela obtida em meio Grace acrescido de 10 % de SFB. A lactose empregada na concentração de até 50 mM proporcionou também o aumento da expressão de ricina em células Sf9 modificadas, conforme observações de Ferrini e col. (1995).

Por outro lado, segundo Ikonomou e col. (2003) e Drews e col. (1995), os aminoácidos como a glutamina, glutamato, aspartato, serina, arginina, asparagina e metionina podem ser utilizados por células de insetos como fonte de energia.

Mendonça e col. (1999) verificaram ainda que a suplementação do meio de cultivo TNM-FH com metionina e tirosina pode proporcionar o retardo de morte celular em culturas de células Sf9. A adição de metionina e cisteína foi um fator crítico para o crescimento de duas linhagens de células de inseto (Spodoptera frugiperda e Lymantria díspar em meio IPL-10 livre de SFB (Vaughn e Fan 1997).

Ainda segundo Ikonomou e col. (2003), as células de insetos acumulam lactato em baixos níveis, diferentemente das células de mamíferos, e, conforme discutido por Mendonça e col. (1999), este metabólito pode ser produzido em condições limitantes de oxigênio. Em algumas situações, contudo, o lactato pode ser consumido, sendo possivelmente um substrato alternativo para o suprimento de carbono ao metabolismo celular, proporcionando a produção de piruvato, através da enzima lactato desidrogenase, formando ácido α-cetoglutarato, composto resultante do ciclo TCA (Figura 3.2).

Um outro metabólito importante em cultura celular, por seu efeito tóxico e inibidor de crescimento é o amônio (NH4+). O amônio é o principal subproduto do metabolismo da

glutamina. Entretanto, quando a glicose torna-se escassa no meio de cultura, as células podem utilizar a glutamina para a produção de energia (Mendonça e col., 1999).

Dentre os componentes importantes ao metabolismo de células de insetos, destacam-se também os citados por Mitsuhashi (1989), as proteínas hidrolisadas como a lactoalbumina hidrolisada (LH), freqüentemente adicionadas no meio, e o hidrolisado de leveduras (yeastolate), que podem promover o crescimento. Os hidrolisados protéicos podem ser provenientes de tecidos animais, proteínas do leite, bactérias, leveduras e de

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proteínas vegetais, e são uma fonte econômica de peptídeos pequenos e de aminoácidos livres e estáveis, lipídios, vitaminas e outros componentes de baixa massa molar.

O yeastolate e o extrato de levedura são obtidos por autólise em processos similares, contudo o yeastolate sofre ainda um processo de filtração para a remoção de proteínas com alta massa molar, encontrando-se disponível comercialmente em uma forma padronizada. A atuação destes compostos na promoção do crescimento das células não é bem conhecida, entretanto, sua utilização está associada a resultados favoráveis do ponto de vista de crescimento celular, possivelmente em virtude da presença de vitaminas, peptídeos, carboidratos, aminoácidos e substâncias bioativas (Mendonça e col., 2007).

Drews e col. (1995), observaram um aumento no crescimento da linhagem Sf9 quando a concentração de extrato de levedura passou de 4 para 8 g/L, indicando que componentes presentes neste composto, promovem o crescimento celular. Entretanto, o aumento da concentração de extrato de levedura para 16 g/L ocasionou inibição do crescimento, associado possivelmente ao aumento excessivo da osmolalidade.

As vitaminas apresentam-se também como composto de fundamental importância no cultivo de células animais. As vitaminas são utilizadas para a realização do metabolismo celular como um todo. As células de Drosophila cultivadas in vitro necessitam das principais vitaminas do complexo B, como a maioria das células animais. Esta necessidade é geralmente suprida com a adição de extrato de levedura (cerca de 1 a 2 g/L). Na ausência deste composto, uma mistura suplementar de vitaminas é geralmente adicionada (Echalier, 1997). A vitamina E (tocoferol) é considerada um agente anti-oxidante, devendo ser adicionada aos meios de cultivo celulares (Maiorella e col., 1988). Segundo Mohan e col. (2003), o acetato de alfa tocoferol (0,05 % em volume) resultou na redução de 80 % da apoptose ocasionada por exposição das células Sf9 a raios UVB.

Os lipídios também são considerados essenciais no crescimento celular, como constituintes de membranas, destacando-se colesterol e fosfolipídios (Mitsuhashi, 1989). Segundo Echalier (1997), a ausência de lipídios como ácido linoléico, lecitinas, colesterol, etanolamina e fosfatidilcolina resulta na queda de eficiência da multiplicação das células de Drosophila. O soro sangüíneo num percentual que pode variar entre 5 e 20 %, em volume no meio de cultivo, provém às células a concentração adequada de lipídios. Entretanto, nas últimas décadas o uso do soro no meio de cultivo tornou-se cada vez mais restrito, e com

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isso surgiu a necessidade do emprego de outro componente que realizasse a dispersão do lipídio adequadamente no meio de cultivo, uma vez que a maior limitação para a administração deste suplemento no meio é a baixa solubilidade em soluções hidrofílicas. Para contornar esta limitação pode-se emulsificar os lipídios com agentes tensoativos não citotóxicos, como o Pluronic F68, conforme proposto por Maiorella e col. (1998), e empregá-los como suplementos ao meio de cultura. Variados tipos de emulsão lipídicas estão disponíveis comercialmente como a formulada pela Invitrogen, cuja à formulação é mostrada na Tabela 3.2.

Tabela 3.2. Composição da emulsão lipídica empregada no cultivo de células de inseto.

Componentes Concentração (mg/L)

Pluronic F68 100

Álcool etílico 100

Colesterol 220

Tween 80 2,2

(DL) acetato de alfa tocoferol 70

Ácido esteárico 10 Ácido mirístico 10 Ácido oléico 10 Ácido linoléico 10 Ácido linolênico 10 Ácido palmítico 10 Ácido palmitoléico 10 Ácido araquidônico 2

A emulsão descrita na Tabela 3.2 apresenta composição projetada para reduzir ou substituir o soro em meios de cultura para uma variedade de aplicações, incluindo crescimento e manutenção de células CHO, hibridomas, células de inseto, além da produção de anticorpos monoclonais através de hibridomas e a expressão viral em células de inseto (Verma e col., 1998).

O soro sanguíneo, freqüentemente adicionado a meios de cultura, é rico em lipídios e muitos outros componentes. No cultivo de células de insetos, o soro de vertebrados mais

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freqüentemente empregado é o SFB, conforme citado anteriormente. A Tabela 3.3 apresenta os principais componentes do soro.

Tabela 3.3. Principais componentes do soro fetal bovino (Freshney, 1992).

Componentes Concentração média por litro

Na+ _{137 meq}

K+ _{11 meq}

Fe2+_{, Zn}2+_{, Cu}+2_{, Mn}+2_{, Co}+2 _{µg a ng}

Ca+2 _{136 mg}

Compostos fosfatados inorgânicos 100 mg

Glicose 1250 mg Nitrogênio (uréia) 160 mg Proteína total 38 g Albumina 23 g Fibronectina 35 mg Creatinina 31 mg Hemoglobina 113 mg Insulina 0,4 µg

TSH (hormônio estimulante da tiróide) 1,2 µg

FSH (hormônio estimulante folicular) 9,5 µg

Hormônio de crescimento bovino 39 µg

Prolactina 17 µg Colesterol 310 µg Testosterona 0,4 µg Progesterona 80 ng Prostaglandina E 6 µg Prostaglandina F 12 µg Vitamina A 90 µg Vitamina E 1 mg Endotoxinas 0,35 µg

Destacam-se entre suas principais funções o estímulo ao crescimento e às atividades metabólicas, através de hormônios, fatores de crescimento, proteínas para o transporte de