PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE FABIANA DURANTE DE MEDEIROS
ESTUDO DO EFEITO NEUROPROTETOR DA BERBERINA E EMULSÃO DE BERBERINA SOBRE COMPORTAMENTO TIPO-AUTISTA: ESTUDO
PRÉ-CLÍNICO.
Tubarão 2019
FABIANA DURANTE DE MEDEIROS
ESTUDO DO EFEITO NEUROPROTETOR DA BERBERINA E EMULSÃO DE BERBERINA SOBRE O COMPORTAMENTO TIPO-AUTISTA: ESTUDO
PRÉ-CLÍNICO.
LINHA DE PESQUISA: NEUROCIÊNCIAS
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Luiz Alberto kanis, Dr.
Coorientadora: Profa. Jucélia Jeremias Fortunato, Dra.
Tubarão 2019
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por guiar meus passos, por me sustentar com seu amor nos momentos mais difícieis, sendo minha fortaleza.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Luiz Alberto Kanis, pelo desafio, pela confiança, pelas ideias, pelo seu comprometimento e competência.
À minha co-orientadora, Profa. Dra. Jucélia Jeremias Fortunato, pela dedicação, pela confiança, pela competência, pelo exemplo de pessoa e profissional, pelas horas que achei que não conseguiria e você me mostrou que tudo é possível, me tornei uma pessoa muito melhor.
A vocês dois, Professor Luiz e Professora Jucélia minha eterna gratidão. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde (PPGCS/UNISUL), pelo apoio.
Aos colegas do PPGCS, turma dezembro de 2014, pelo convívio.
Aos meus colegas e parceiros de experimentos por toda a colaboração e dedicação, sem vocês nada seria possível. Principalmente ao grupo de pesquisa NEUROIMET – núcleo autismo, vocês foram fundamentais para a realização deste sonho.
À Naiana da Rosa e Ana Olívia Martins Laurentino pela grande parceria. À UNA da Saúde – UNISUL, pelos momentos de descontração e pela força. Às minhas AMIGAS-IRMÃS pela amizade, que são como pegadas na alma, que são eternas.
À minha amiga Carolina Barbosa pelas horas que passamos exercitando o corpo e a mente.
À minha família, por todo apoio dado ao longo da minha vida, em especial meus pais, pelo amor e pela dedicação. Mãe agora vamos relaxar!
Ao meu filho amado, pelo companheirismo durante toda essa trajetória. Dedico esta tese para você, Eduardo de Medeiros Peretti, você me ensinou a ser mais corajosa.
“Não é o crítico que importa; nem aquele que aponta onde foi que o homem tropeçou ou como o autor das façanhas poderia ter feito melhor. O crédito pertence ao homem que está por inteiro na arena da vida, cujo rosto está manchado de poeira, suor e sangue; que luta bravamente; que erra, que decepciona, porque não há esforço sem erros e decepções; mas que, na verdade, se empenha em seus feitos; que conhece o entusiasmo, as grandes paixões; que se entrega a uma causa digna; que, na melhor das hipóteses, conhece no final o triunfo da grande conquista e que, na pior, se fracassar, ao menos fracassa ousando grandemente”.
Trecho do discurso “Cidadania em uma República” (ou “O Homem na Arena”), proferido na Sorbonne por Theodore Roosevelt, em 23 de abril de 1910. Citado por Brené Brown no livro “A coragem de ser imperfeito”, 2016.
RESUMO
Introdução: Alterações comportamentais como déficits de interação social, padrões restritivos e repetitivos de comportamento; alterações de aprendizagem e memória ocorrem em resposta a ativação imune materna (AIM), caracterizadas como comportamento de indivíduos com Transtorno do Espectro Autista (TEA). Novas alternativas terapêuticas têm sido sugeridas para melhorar os sintomas desse transtorno, entre elas, a berberina (BBR) tem apresentado resultados positivos no tratamento de doenças neurológicas e psiquiátricas.
Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito neuroprotetor da BBR sobre respostas comportamentais, bioquímicas e permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE) de ratos expostos ao LPS em período pré-natal.
Métodos: Ratos Wistar fêmeas prenhes receberam injeção intraperitoneal (ip) de LPS submetendo a prole de machos ao modelo animal de autismo (grupo experimental) e o grupo salina recebeu injeção ip de soro fisiológico. As fêmeas iniciaram tratamento com BBR 1 h após a aplicação do LPS, 9,5 dia gestacional até o PND21, dia do desmame. Foram realizados na prole testes comportamentais e de memória no PND 45 e PND 60; avaliação da BHE no PND 22 e PND 60, análises bioquímicas em PND 60, estrutura hipocampo; análise do leite no PND 10 e da concentração plasmática das matrizes e da prole no PND 10.
Resultados: a AIM provocada pela administração de LPS, causou na prole adulta alterações comportamentais condizentes com o TEA, como redução no comportamento social recíproco; redução na memória aversiva. A BBR apresentou reversão do comportamento tipo-autista e exerceu efeito neuroprotetor, aumentou o comportamento social recíproco; aumentou a memória aversiva.
Conclusão: A administração preventiva de BBR (100 mg/Kg) na matriz 1 hora após a AIM proporcionou efeitos na prevenção do comportamento tipo-autista na prole. A BBR apresentou reversão do comportamento e exerceu efeito neuroprotetor, especificamente, aumento no comportamento social recíproco e aumento da memória aversiva.
ABSTRACT
Introduction: Behavioral changes such as social interaction deficits, restrictive and repetitive patterns of behavior; changes in learning and memory occur in response to maternal immune activation (MIA), characterized as behavior of individuals with Autistic Spectrum Disorder (ASD). New therapeutic alternatives have been suggested to improve the symptoms of this disorder, among them, berberine (BBR) has presented positive results in the treatment of neurological and psychiatric diseases.
Objective: The objective of this study was to evaluate the neuroprotective effect of BBR on behavioral, biochemical and blood-brain barrier (BBB) responses of rats exposed to LPS in the prenatal period.
Methods: Pregnant female Wistar rats received intraperitoneal (ip) injection of LPS by submitting male offspring to the animal model of autism (experimental group) and the saline group received ip injection of saline solution. Females started treatment with BBR 1 h after LPS application, 9.5 gestational day until PND21, day of weaning. Behavioral and memory tests were carried out in PND 45 and PND 60; evaluation of BBB in PND 22 and PND 60, biochemical analysis in PND 60, hippocampal structure; analysis of milk in PND 10 and the plasma concentration of dams and offspring in the PND 10.
Results: MIA caused by the administration of LPS caused in adult offspring behavioral changes consistent with ASD, as a reduction in reciprocal social behavior; reduction in aversive memory. BBR presented a reversal of autistic-type behavior and exerted neuroprotective effect, increased reciprocal social behavior; increased aversive memory.
Conclusion: Preventive administration of BBR (100 mg / kg) in the matrix 1 hour after MAI provided effects in preventing autistic type behavior in offspring. The BBR presented a behavior reversal and had a neuroprotective effect, specifically, an increase in reciprocal social behavior and increase in aversive memory.
LISTAS
Lista de abreviaturas
ADDM Autism and Developmental Disabilities Monitoring AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
AIM Ativação Imune Materna Akt Proteína Akt
AMA Associação de Amigos dos Autistas
AMPA Alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico
AMPK Adenosina monofosfato ativada – proteína cinase ativada
APA Associação Americana de Psiquiatria (do inglês, American Psychiatric Association
APAE Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
ATP Adenosina trifosfato (do inglês, adenosine triphosphate)
Bax Proteína Bax – pró-apoptótica (do inglês, apoptosis regulator Bax) BBR Berberina (do inglês, berberis)
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
BHE Barreira hematoencefálica Ca2+ Cálcio
CAT Catalase
CDC Controle e prevenção de doenças (do inglês, Disease Control and Prevention)
CD14 Do inglês, cluster of differentiation 14 CEUA Comissão de ética no uso de animais CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal COX Cicloxigenase
DA Doença de Alzheimer DG Giro dentado
DG Dia gestacional
DNA Ácido desoxirribonucleico (do inglês, deoxyribonucleic acid) DNPH Dinitrofenilhidrazina
DSM Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (do inglês, Diagnostic and Statiscal Manual)
EM Esclerose múltipla EO Estresse oxidativo EPM Erro padrão da média
EROs Espécies reativas de oxigênio
ERK Do inglês, Extracellular Signal-regulated Kinase ETC Cadeia de transporte de elétrons
EUA Estados Unidos da América
FADH2 Flavina adenina dinucleotideo reduzida
FCEE Fundação Catarinense de Educação Especial FDA Do inglês, Food and Drug Administration GABA Ácido gama-aminobutírico
GHS Glutationa reduzida GPx Glutationa peroxidase GTP Guanosina trifosfato
HIF-1α Fator de hipóxia induzida-1α IFN-γ Interferon-γ
IL Interleucina
i-NOS Óxido Nítrico-Sintase Induzível ip Intraperitoneal
I/R Isquemia/reperfusão
IRAK Quinase associada a IL-1R K+ Potássio
LBP Proteína ligadora de LPS (do inglês, lipopolysaccharide binding protein)
LPS Lipopolissacarídeo
LTP Potenciação de longo prazo MAO-β Monoamina oxidase-β MCD Memória de curta duração MDA Malondialdeído
ME Metabolismo Energético MIA Morte indolor assistida
MK-801 Dizocilpina (do inglês, dizolcilpine) MLD Memória de longa duração
MT Memória de trabalho
MyD88 Do inglês, Myeloid differentiation primary response 88 NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
NF-kβ Fator de Transcrição Nuclear Kappa β (do inglês, nuclear factor – kappa beta)
ON Óxido nítrico (do inglês, nitric oxid) PDN Dia pós-natal
pH Potencial Hidrogeniônico RNAm Ácido ribonucleico mensageiro SOD Superóxido dismutase
SN Sistema Nervoso
SNC Sistema Nervoso Central
TAK1 Do inflês, Transforming growth factor beta-activated kinase 1
TBARS Substâncias reativas ao ácido barbitúrico (do inglês, Thiobarbituric acid reactive substances)
TCA Ácido tricarboxílico (do inglês, tricarboxylic acid) TEA Transtorno do Espectro Autista
TID TJ
Transtorno Invasivo do Desenvolvimento
Junções intercelulares (do inglês, intercellular junctions)
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa (do inglês, Tumor Necrosis Factor - Alpha) TLR Do inglês, toll-like receptor
TRAF Do inglês, receptor associated factor
Lista de quadros
Quadro 1 - Variáveis de estudo ... 57
Lista de figuras
Figura 1 – Histórico do Transtorno do Espectro Autista. ... 22 Figura 2 – Estrutura química da BBR. ... 34
Figura 3 – Farmacocinética da BBR. ... 38 Figura 4 – Síntese da etapa de delineamento do estudo – fase pré-natal –
administração BBr nas matrizes prenhes – via indireta ... 47 Figura 5 – Síntese da etapa do delineamento do estudo – fase pós-natal – administração BBR nas matrizes durante o aleitamento – via indireta.
Realização dos testes comportamentais e análises bioquímicas. ... 48 Figura 6 – Síntese da etapa do delineamento do estudo – coleta de leite e
de sangue – administração BBR nas matrizes durante o aleitamento – via
indireta. ... 49 Figura 7 – Distribuição dos objetos no campo aberto ... 52 Figura 8 – Efeito da BBR sobre o número (8A) e tempo (8B) de episódios
de grooming de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, em PND 45. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via,
seguido pelo teste post hoc Tukey ... 60 Figura 9– Efeito da BBR sobre o número (9A) e tempo (9B) de episódios de grooming de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND 60.
Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via,
seguido pelo teste post hoc Tukey ... 61 Figura 10 – Efeito da BBR sobre episódios de rearing de ratos Wistar
expostos ao LPS prenatalmente, PND 45. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey ... Figura 11 – Efeito da BBR sobre episódios de rearing de ratos Wistar
expostos ao LPS prenatalmente, PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey ...
62 Figura 12 – Efeito da BBR sobre o número crossing de ratos Wistar
expostos ao LPS prenatalmente, PND 45. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey ...
63 Figura 13 – Efeito da BBR sobre o número crossing de ratos Wistar
expostos ao LPS prenatalmente, PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey ...
63 Figura 14 A e B – Efeito da BBR sobre o índice de reconhecimento de
objetos (MCD) de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND45 e PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey ...
Figura 15 A e B – Efeito da BBR sobre o índice de reconhecimento de objetos (MLD) de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND45 e PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma
via, seguido pelo teste post hoc Tukey ... 65 Figura 16 – Efeito da BBR na Interação Social – Cheirar de ratos Wistar
expostos ao LPS prenatalmente, PND45 e PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey. A comparações entre grupos foram analisadas utilizando-se o teste Mann-Whitney e Kolmogorov-Smirnov. Os símbolos *p<0,05 indicam
significância estatística em comparação com 45 e 60 dias do mesmo grupo; ** p<0,05 significância do teste no mesmo grupo; #p<0,05 indica
significância estatística quando comparados com o grupo LPS/SAL ... 66 Figura 17 – Efeito da Berberina na Interação Social – Seguir de ratos
Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND45 e PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=07-10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey. A comparações entre grupos os foram analisadas utilizando-se o teste Mann-Whitney. Os símbolos *p<0,05 indicam
significância estatística em comparação com 45 e 60dias do mesmo grupo; #p<0,05 indica significância estatística quando comparados com o grupo
LPS/SAL ... 67 Figura 18 – Efeito da BBR na Esquiva Inibitória de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND 45. Valores expressos em média ± EPM (n=10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey. A comparações entre grupos os foram analisadas utilizando-se o teste Mann-Whitney. Os símbolos *p<0,05 indicam significância estatística em comparação com o treino e teste do mesmo grupo; ** p<0,05 significância do teste no mesmo grupo; #p<0,05 indica significância estatística quando comparados com o
grupo LPS/SAL ... 68 Figura 19 – Efeito da BBR na Esquiva Inibitória de ratos Wistar expostos ao LPS prenatalmente, PND 60. Valores expressos em média ± EPM (n=10); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey. A comparações entre grupos os foram analisadas utilizando-se o teste Mann-Whitney. Os símbolos *p<0,05 indicam significância estatística em comparação com o treino e teste do mesmo grupo; ** p<0,05 significância do teste no mesmo grupo; #p<0,05 indica significância estatística quando comparados com o
grupo LPS/SAL ... 68 Figura 20 – Avaliação dos níveis de TBARS no hipocampo de ratos Wistar adultos tratados com BBR (n=5) e seus respectivos controles. Os dados foram apresentados como média ± EPM e analisados por ANOVA de uma via, seguido de teste post hoc Tukey ...
69
Figura 21 – Avaliação dos níveis de Carbonil no hipocampo de ratos Wistar adultos tratados com BBR (n=5) e seus respectivos controles. Os dados
foram apresentados como média ± EPM e analisados por ANOVA de uma via, seguido de teste post hoc Tukey ...
69
Figura 22 – Avaliação dos níveis de CAT no hipocampo de ratos Wistar adultos tratados com BBR (n=5) e seus respectivos controles. Os dados foram apresentados como média ± EPM e analisados por ANOVA de uma via, seguido de teste post hoc Tukey ... 70 Figura 23 – Avaliação dos níveis de SOD no hipocampo de ratos Wistar
adultos tratados com BBR (n=5) e seus respectivos controles. Os dados foram apresentados como média ± EPM e analisados por ANOVA de uma via, seguido de teste post hoc Tukey ... 70 Figura 24 – Efeito da BBR sobre a atividade de complexos da cadeia
respiratória mitocondrial e creatina quinase em hipocampo de ratos Wistar submetidos ao LPS prenatalmente. Valores expressos em média ± EPM (n=5); ANOVA de uma via, seguido pelo teste post hoc Tukey. Os símbolos *p<0,05 indicam significância estatística em comparação com o salina; #p<0,05 indica significância estatística quando comparados os grupos
SAL+BBR X LPS+BBR ... 72 Figura 25 – Efeito da BBR sobre a integridade da BHE em hipocampo de
ratos Wistar jovens e adultos submetidos ao LPS prenatalmente. Valores expressos em média ± EPM (n=3-5); ANOVA de uma via, seguido pelo
teste post hoc Tukey ... 73 Figura 26 – Dosagens de concentrações plasmática e do leite das ratas
lactantes e a concentração plasmática dos ratos lactentes. Valores expressos em média ± EPM (n=3-5); ANOVA de uma via, seguido pelo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA (TEA) ... 21
1.1.1 Histórico ... 21
1.1.2 Epidemiologia ... 22
1.1.3 Fisiopatologia ... 23
1.1.3.1 Ativação Imune Materna ... 24
1.1.3.2 Lipopolissacarídeo (LPS) ... 25
1.1.3.3 Neuroinflamação ... 26
1.1.3.4 Barreira Hematoencefálica (BHE) ... 28
1.1.3.5 Estresse Oxidativo ... 29
1.1.3.6 Metabolismo Energético ... 31
1.2 MEMÓRIA ... 33
1.3 BERBERINA (BBR) ... 35
1.3.1 Atividades biológicas da BBR ... 36
1.3.2 Absorção, distribuição e excreção da BBR ... 38
1.4 MODELO ANIMAL DA DOENÇA ... 39
2. OBJETIVOS ... 41
2.1 OBJETIVO GERAL ... 41
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 41
2.2.1 Etapa 1 – Análises comportamentais: ... 41
2.2.2 Etapa 2 – Análises bioquímicas: ... 41
2.2.3 Etapa 3 – Análise da permeabilidade da BHE ... 42
2.2.4 Etapa 4 – Análise da distribuição da BBR no plasma e leite ... 42
3. MÉTODOS ... 43
3.2 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS ... 43
3.2.1 Emulsão de BBR ... 43
3.3 ANIMAIS ... 43
3.3.1 Animais experimentais ... 44
3.3.2 Acasalamento ... 44
3.3.3 Modelo animal de autismo ... 44
3.3.4 Padronização da ninhada ... 45 3.4 DELINEAMENTO DO ESTUDO ... 46 3.5 ENSAIOS/TESTES/TÉCNICAS ... 50 3.5.1 Testes comportamentais ... 50 3.5.1.1 Comportamento estereotipado ... 50 3.5.1.2 Reconhecimento social ... 50
3.5.1.3 Teste de habituação de campo aberto (Open Field) ... 51
3.5.1.4 Reconhecimento de objetos ... 51
3.5.1.5 Esquiva inibitória ... 52
3.5.2 Análises bioquímicas ... 53
3.5.2.1 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ... 53
3.5.2.2 Medida do dano oxidativo em proteínas ... 53
3.5.2.3 Atividade de superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) ... 54
3.5.2.4 Dosagem de proteínas ... 55
3.5.2.5 Metabolismo energético ... 55
3.5.3 Análise da permeabilidade da BHE ... 56
3.5.4 Análise da distribuição da BBR no plasma e leite ... 56
3.5.4.1 Etapa 1 ... 56
3.5.4.2 Preparo da amostra ... 57
3.6 VARIÁVEIS DE ESTUDO ... 57
3.8 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 59
4. RESULTADOS ... 60
4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS ... 60
4.1.1 Teste de Habituação ao campo aberto - Comportamento Estereotipado . 60 4.1.1.1 Grooming ... 60
4.1.1.2 Rearing ... 62
4.1.1.3 Crossing ... 63
4.1.2 Teste de memória de reconhecimento de objetos ... 64
4.1.3 Interação Social Recíproca ... 65
4.1.4 Esquiva Inibitória... 67
4.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 69
4.2.1 Efeitos da administração da BBR sobre a peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas no hipocampo de ratos adultos após tratamento com BBR. ... 69
4.2.2 Níveis das enzimas antioxidantes SOD e CAT no hipocampo de ratos adultos após tratamento com BBR ... 70
4.3 ANÁLISE DA PERMEABILIDADE DA BHE ... 72
5. DISCUSSÃO ... 75
5.1 ANÁLISES COMPORTAMENTAIS ... 75
5.2 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 78
5.3 ANÁLISE DA PERMEABILIDADE DA BHE ... 81
5.4 ANÁLISE DA DISTRIBUIÇÃO DA BBR NO PLASMA E LEITE ... 83
6. CONCLUSÃO ... 86
6.1 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 86
REFERÊNCIAS ... 87
ANEXO ... 116
ANEXO A- Parecer Aprovação do Comitê de Ética ... 116
1. INTRODUÇÃO
O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um distúrbio do desenvolvimento definido por critérios de diagnóstico que incluem déficits de comunicação e interação social e padrões restritos e repetitivos de comportamento, interesses ou atividades1.
Os indivíduos com TEA apresentam uma série de deficiências e gravidade, limitações funcionais que podem se desenvolver ao longo do tempo e variam entre as pessoas com TEA, o que representa um importante problema de saúde pública 2,3. Os sintomas são tipicamente aparentes antes da idade de 3 anos. A natureza complexa dessas disfunções, juntamente com a falta de marcadores biológicos para o diagnóstico e mudanças nas definições clínicas ao longo do tempo, produz desafios no monitoramento da sua prevalência4.
A etiologia do TEA ainda é imprecisa, incluem fatores etiológicos como malformações congênitas, prematuridade e baixo peso ao nascer5. Estudos têm implicado outras causas capazes de provocar alterações no sistema nervoso central (SNC) em desenvolvimento, as predisposições genéticas e fatores ambientais6-9 que tendem a influenciar o curso de alterações nos circuitos neurais, podendo desencadear o transtorno10-12.
Em uma revisão sistemática, estudos apontaram que as crianças com diagnóstico de TEA apresentam alterações no SNC que leva à redução da qualidade de vida através de percepções, estados emocionais e de comportamento anormais13. Estudos clínicos e pré-clínicos têm apoiado o papel da neuroinflamação em curso em diferentes regiões do encéfalo na etiologia desta doença13.
Outra causa para o TEA, além da inflamação, é o estresse oxidativo (EO) que se origina de um desequilíbrio entre as espécies reativas de oxigênio (EROs) e a capacidade antioxidante, resultando em danos às macromoléculas14. O encéfalo é suscetível ao dano oxidativo devido à sua composição e utilização de oxigênio14. O agravo neuronal tem sido sugerido com estresse oxidativo crônico e disfunção mitocondrial em crianças com TEA14.
A neuroinflamação, o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial exercem um papel substancial na patogênese do TEA, acredita-se que inibir a produção de mediadores inflamatórios pode ser uma estratégia terapêutica potencial15. Atualmente
a Risperidona e o aripiprazol são drogas que tem aprovação da Food and Drug Administration (FDA) para tratar sintomas associados de irritabilidade e agitação em crianças com TEA, mas nenhum outro medicamento tem indicação de uso específico nessa população16. Devido ao tratamento limitado e os efeitos adversos de alguns fármacos, como os anti-inflamatórios, existe a busca por agentes alternativos15.
A BBR é um alcaloide, isoquinolina, com efeitos terapêuticos, atividades farmacológicas e biológicas para doenças metabólicas, infecção microbiana e doenças inflamatórias15,17,18. Ela atravessa a BHE podendo suprimir a neuroinflamação19, eliminar radicais livres e atenuar o estresse oxidativo e o dano mitocondrial20. Embora tenha sido demonstrado que a BBR exerce fator de neuroproteção em vários modelos de doenças do SNC, os efeitos terapêuticos da BBR sobre o TEA não foram investigados.
Portanto, duas hipóteses para este estudo são consideradas. A primeira, que a atividade anti-inflamatória da BBR reduza o efeito do LPS diretamente na matriz e consequentemente minimize os danos neurais causados pela AIM na prole, melhorando a resposta comportamental e memória. A segunda, que a BBR administrada durante a gestação poderia agir diretamente na prole através da passagem placentária e do aleitamento materno.
O aprendizado e a memória são propriedades básicas do SNC. Aprendemos a caminhar, realizar atos-motores simples e complexos e dependemos da aprendizagem e lembranças de como realizamos essas atividades. As alterações neurológicas apresentadas por indivíduos com TEA causam déficit em seu desenvolvimento, prejudicando sua aprendizagem motora e social, dificultando seu desenvolvimento no ambiente que está inserido.
O desenvolvimento global desses pacientes é importante para que os mesmos possam aprender e memorizar seus movimentos e ações facilitando a realização das terapias, principalmente a fisioterapia, pois um dos fatores que tornam os pacientes graves é o comprometimento cognitivo e a interação social, dificultando a realização de atividades neurofuncionais.
Assim, torna-se importante o tratamento medicamentoso buscando suprimir os sinais e sintomas do TEA. Considerando o potencial anti-inflamatório e antioxidante da BBR, este estudo propõe investigar o efeito neuroprotetor desta sobre a aprendizagem e memória no modelo de comportamento tipo-autista induzido por lipopolissacarídeo (LPS) em ratos.
1.1 TRANSTORNO DO ESPECTRO AUTISTA (TEA)
1.1.1 Histórico
O termo “autismo” foi utilizado pela primeira vez pelo psiquiatra suíço Bleuler, em 1911, para definir crianças que apresentavam características diferentes das crianças “neurotípicas”, como perda de contato com a realidade, gerando assim inabilidade para comunicar-se com o outro21-23. Somente em 1943 o autismo foi conceituado pela primeira vez por Leo Kanner, a partir da observação de um grupo de 11 crianças que apresentavam características como anormalidades na fala, movimentos repetitivos e esterotipados, isolamento social, alterações comportamentais diferentes de doenças já conhecidas que apareciam antes dos três anos de idade24,25. Kanner considerava que o autismo era supostamente raro e poderia ser confundido com esquizofrenia ou outras doenças que sugerissem debilidade mental24.
Hans Asperger, em 1944, descreveu um grupo de crianças com alterações similares as do autismo que apresentavam dificuldades na interação social26. Mesmo com os estudos feitos após as definições de Kanner, somente em 1980 o autismo foi descrito pela primeira vez, na terceira edição do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-III) revisado em 1989, da Associação Americana de Psiquiatria (APA – do inglês, American Psychiatric Association), sendo classificado como um Transtorno Invasivo do Desenvolvimento (TID), diferenciando-se da esquizofrenia que tem presente alucinações como característica comum, o autismo não apresenta esta característica27-32.
No ano de 1994, com a nova atualização do DSM, DSM-IV32, o diagnóstico de TID utilizou um sistema multi-categórico, que incluia o Transtorno Autista, Transtorno de Asperger, Transtorno Invasivo do Desenvolvimento sem outra especificação, Transtorno Desintegrativo da Infância e Transtorno de Rett33,34. Com a atualização do DSM e com a Classificação Estatística de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde - décima Revisão35, o autista poderia atingir níveis severos no desempenho de atividades como restrição em mostrar, pegar ou utilizar objetos, redução do contato visual, atividades repetitivas e comportamentos estereotipados, movimentação ou torção de mãos e dedos, agitação corporal ou dificuldade/ausência de fala36,37.
A quinta edição do DSM (DSM-5) apresentada em 2013, veio substituir o sistema de multi-categórico do DSM-IV com uma única dimensão de diagnóstico: Transtorno do Espectro Autista (TEA)1. O TEA, a partir desta data, passou a ser definido como um distúrbio neurocomportamental complexo, caracterizado por vários graus de deficiência incluindo interação social, agilidade de pensamento, mudanças peculiares de linguagem e/ou percepção atrasada, prejuízo na comunicação verbal e não verbal e inabilidade em responder a certos estímulos apresentando um comportamento restrito e repetitivo1,38. O DSM-5 admite que um indivíduo deve apresentar sintomas desde o início da infância, mesmo que esses sintomas não sejam reconhecidos mais tarde39.
Figura 1 – Histórico do Transtorno do Espectro Autista1,25,31
1.1.2 Epidemiologia
A prevalência do TEA tem aumentado consideravelmente nos últimos anos40.
Conforme estudos realizados nos Estados Unidos pelo Centro de Controle de Prevenção de Doenças (Center for Disease Control and Prevention – CDC)3 e Autism and Developmental Disabilities Monitoring (ADDM)3, nos anos de 2011 e 2012, os casos de TEA subiram para 1 em cada 68 crianças com idade média de 8 anos representando um aumento de 23% comparados ao período de 2006-20083,41.
Nos Estados Unidos, a prevalência estimada mostrou que 2% das crianças entre 6 e 17 anos apresentam sintomas de TEA, ou seja, 1 a cada 50 crianças americanas40,42. Em 2014, o Departamento de Saúde e Serviços Humanos e o CDC
realizaram nova pesquisa e tiveram como prevalência estimada 1 em cada 45 crianças43. No Brasil, em 2010, estimava-se cerca de 500 mil pessoas com autismo44. Em Santa Catarina, segundo base de dados da Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais (APAE), da Associação de Amigos dos Autistas (AMA) e da Fundação Catarinense de Educação Especial (FCEE) a prevalência encontrada é de 1,31 casos para 10 mil habitantes45,46.
Estudo realizado por Beck, Fortunato e Iser em 2018 (no prelo), teve como objetivo caracterizar os casos relatados de TEA e estimar a prevalência no Sul do Brasil, foram relatados 1254 casos deste transtorno, com prevalência estimada em 3,85/10.000 habitantes, sendo 3,31/10.000 no estado do Rio Grande do Sul, 3,94/10.000 em Santa Catarina e 4,32/10.000 no Paraná.
Algumas preocupações sobre o aparente aumento na prevalência de diagnóstico de TEA levou pesquisadores a cogitar a possibilidade da "Epidemia de Autismo"47. Um dos fatores que foram associados a este aumento pode estar relacionado à maior sensibilização da população para o transtorno, desencadeando maior frequência de encaminhamentos de crianças com comportamento anormal, além de critérios mais amplos de diagnóstico e averiguação mais completa de casos em estudos epidemiológicos dentre outros fatores47-49.
1.1.3 Fisiopatologia
TEA é um distúrbio do desenvolvimento neurológico de etiologia desconhecida e complexa50,51. Diversas linhas de pesquisa têm demonstrado ser consensual que a interação entre fatores genéticos e ambientais seja apontada como condição que requer atenção50,52, pois pode influenciar no desenvolvimento de alterações no circuito neural50,53.
No âmbito de desenvolvimento neurobiológico, imunológico e neuroimune existe uma vulnerabilidade associada às alterações decorrentes de fatores ambientais54-56. Tais alterações podem ser variáveis dependendo de alguns fatores como a natureza do acometimento, a época e a duração. Os acometimentos podem ocorrer em qualquer fase do neurodesenvolvimento50.
Estudos em humanos57,58 e animais59,60 têm apoiado o papel da neuroinflamação na etiologia do TEA sendo que no SNC há um aumento da resposta inflamatória capaz de ativar as células microgliais que conduz à liberação de citocinas
pró-inflamatórias, incluindo as citocinas IL-1β, IL-6 e TNF-α. Por sua vez, as citocinas pró-inflamatórias agravam e propagam a neuroinflamação, degenerando neurônios saudáveis e prejudicando as funções do SNC. Portanto, a microglia ativada pode desempenhar um papel-chave nos processos neuroinflamatórios contribuindo para a patogênese de distúrbios neuropsiquiátricos61.
Estudos pos-mortem revelam que o número de células microgliais e sua ativação em pacientes com TEA é maior do que em indivíduos saudáveis62. A neuroinflamação pode ser a origem dos sintomas do TEA e a desregulação da micróglia mediada pela resposta inflamatória pode contribuir para a fisiopatologia62.
Os marcadores de neuroinflamação são evidências para uma disfunção imunológica no encéfalo de pacientes com TEA63. Fatores de risco, como contato com substâncias químicas - medicação, tabaco, poluição do ar e do solo, contaminação de alimentos64,65, infecções virais, bacterianas e doenças auto-imunes maternas estão associadas com o desenvolvimento da neuroinflamação que ocorre no transtorno66. A exposição pré-natal a anticorpos maternos ou alterações imunitárias maternas, podem afetar o desenvolvimento fetal66,67.
1.1.3.1 Ativação Imune Materna
A ativação imune materna (AIM) é considerada a principal causa não genética do TEA68,69. A associação entre a infecção materna e distúrbios do desenvolvimento data de 1964, quando houve a pandemia de rubéola e as crianças nascidas de mães infectadas desenvolveram características do TEA67. A incidência do TEA aumentou de menos de 1% da população não exposta a cerca de 13 e 20%, respectivamente68,69. Essa combinação sugere o importante papel etiológico da ativação imune materna69. As infecções, incluindo a influenza, citomegalovírus, varicela, sarampo e rubéola, foram associadas como fator de risco para o TEA, levando a entender que não é o agente patogênico em particular que causa a doença, mas a ativação generalizada do sistema imune materno66,68-73.
Estudos com modelo animal têm sido bastante utilizados para pesquisar a AIM e doenças do neurodesenvolvimento que envolvem mudanças comportamentais69,74. Dentre os modelos animais de comportamento-autista há o modelo de infecção pré-natal que propõe mimetizar uma infecção bacteriana a partir da administração intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea de LPS em roedores75.
A resposta imunológica fetal para a ativação imune materna, induzida pelo LPS, é a produção de uma “tempestade de citocinas”, através da ativação da micróglia e assim causando a neuroinflamação76. A interferência no desenvolvimento do sistema nervoso no início do período gestacional (entre o nono e décimo dia gestacional de roedores) compromete o processo de organogênese, especificamente a formação da placa neuronal77,78.
Neste sentido, a literatura aponta algumas relações entre agentes infecciosos e problemas neurológicos nos neonatos refletidos em seu desenvolvimento pós-natal, como por exemplo, as infecções por bactérias gram-negativas associadas ao TEA79.
1.1.3.2 Lipopolissacarídeo (LPS)
O LPS é uma molécula80, um glicolipídio estruturamente único81, uma endotoxina originária da parede celular, membrana externa, de bactérias Gram-negativas, por exemplo, a bactéria Escherichia coli80,82,83 e um potente gatilho de resposta inflamatória in vitro e in vivo. Injeção intraperitoneal ou intravenosa de altas doses de LPS em animais induz a produção sistêmica de citocinas inflamatórias, que por sua vez, leva a danos nos tecidos e letalidade83.
Os componentes do LPS de muitas bactérias são tóxicos84. O LPS consiste num lipídio complexo, denominado lipídio A que está ligado a um polissacarídeo constituído de um núcleo e de uma série terminal de unidades repetidas82,84. Os humanos são expostos constantemente com LPS em pequenas doses, levando a alterações da composição do trato gastrointestinal que acabam por promover uma alteração na barreira das mucosas, aumentando a permeabilidade intestinal e levando ao aumento do LPS circulante85. Portanto, problemas intestinais comumente aumentam a permeabilidade do LPS para o sangue85.
A molécula do LPS é composta por três partes: lipídio A, núcleo de polissacarídeos (“core”) e repetições do antígeno O80,84. O lipídio A representa o componente hidrofóbico do LPS que se localiza no folheto externo da membrana externa, enquanto os polissacarídeos centrais e as repetições do antígeno O são exibidos na superfície das células bacterianas84. O lipídio A é conhecido por ser responsável pelos efeitos tóxicos das infecções por bactérias Gram-negativas84. O antígeno O varia entre as espécies de bactérias Gram-negativas tanto em composição como em comprimento, enquanto o core e o lipídio A são mais conservados entre as
diferentes espécies destas bactérias80. O domínio lipídio A é o componente bioativo e tóxico da endotoxina reconhecido durante a infecção humana80.
O LPS sistêmico através do seu mecanismo de ação, ativa primeiro as células endoteliais para liberar citocinas pró-inflamatórias86. Visto que o LPS entra em contato com o organismo do animal, inicia-se uma série de respostas no organismo infectado. Esta endotoxina pode atuar em macrófagos, monócitos, neutrófilos, plaquetas sanguíneas e células endoteliais87.
Já no plasma, o LPS liga-se a uma proteína de fase aguda do hospedeiro, proteína ligadora de LPS (lipopolysaccharide binding protein – LBP), produzida no fígado do animal, formando um complexo chamado de LPS:LBP. O complexo transfere o LPS para a proteína de membrana periférica CD14 na superfície dos macrófagos, iniciando a ativação celular88-90. Com o novo complexo formado, chamado de LPS:CD14, há ativação da sinalização do receptor semelhante ao Toll (ou toll-like receptor, TLR)-4, ao qual é complexada à proteína MD-2, iniciando um sinal transmembranar para o núcleo. Dentro do macrófago ocorre uma série de reações em cascata, incluindo a atuação de MyD88, IRAK, TRAF6, TAK-1, quinase IkB, AP-1, dentre outras, até a ativação do fator nuclear de transcrição NF-kβ (envolvido na plasticidade, desenvolvimento e neurodegeneração em neurônios e células da glia), que ativa os genes que codificam as proteínas envolvidas na defesa contra a infecção, que são as citocinas pró-inflamatórias (IL1β, IL6, TNFα)89,91-93. Diversas regiões do cérebro expressam receptores para citocinas tanto na glia quanto nos neurônios94. No SNC as citocinas podem modular neurotransmissores centrais como dopamina, serotonina, noradrenalina, ácido gamaaminobutírico (GABA), acetilcolina, neuropeptídeos, dentre outros95.
Entre as citocinas pró-inflamatórias ativadas e liberadas após o contato com o LPS, destacam-se a interleucina 1 beta (IL-1β), a inteleucina 6 (IL-6) e o TNF-α, além de algumas outras92.
1.1.3.3 Neuroinflamação
Os processos neuroinflamatórios ativos são encontrados por todo o SNC96 e
tipicamente desencadeados como uma resposta protetora após lesão, infecção ou doença97. No entanto, a inflamação aumentada ou crônica pode exercer efeitos
prejudiciais sobre células neuronais, provocando danos adicionais, mantendo ainda mais o ciclo inflamatório e a doença98.
A neuroinflamação, em geral, é caracterizada pela atividade de células da micróglia e astrócitos, ativação da enzima de óxido nítrico-sintase induzível (i-NOS) e o aumento da expressão e/ou liberação de citocinas e quimiocinas13,99. A micróglia e os astrócitos são células gliais que influenciam na formação e função das sinapses100. A partir da fase inicial do desenvolvimento os neurônios e as células gliais estão intimamente associados e o conjunto de circuitos neuronais necessitam de extensa sinalização neurônio-glia100,101.
As células microgliais são macrófagos residentes do SNC que formam o sistema imunitário e são reguladas por vários fatores solúveis e associados a membranas, incluindo citocinas, quimiocinas (fatores neurotróficos, fatores do complemento e neurotransmissores)102. Elas detectam os primeiros sinais de invasão por patógeno ou danos nos tecidos. Depois de sua conversão de um tipo de célula em repouso para uma forma ativada, eles removem sinapses danificadas103,104.
As células da micróglia, tal como os astrócitos, também são importantes na eliminação estrutural das sinapses no SNC em desenvolvimento. No entanto, a poda sináptica particularmente envolve processos microgliais fagocíticos que, durante as primeiras semanas após o nascimento, pode envolver elementos pré e pós-sinápticos103,105.
Os astrócitos são capazes de fazer contato com vários neurônios e também podem fazer várias sinápses, possuem muitos receptores e canais de íons presentes nos neurônios, permitindo-lhes assim perceber e responder os sinais neuronais100,106,107. A geração e expansão de astrócitos está praticamente concluída antes do nascimento, mas a elaboração e maturação de seus processos sinápticos persiste durante o período ativo de sinaptogênese no período pós-natal100,101. Isto sugere que os astrócitos estão em uma posição crucial para comunicar-se ativamente com os neurônios durante a sinaptogênese e, assim, coordenar o desenvolvimento de circuitos neuronais100.
Os astrócitos também atuam na liberação de substâncias para regular o metabolismo, fornecimento de energia (incluindo o fluxo sanguíneo para o SNC) e inflamação, e substâncias para regular a transmissão sináptica, incluindo neurotransmissores e neuromoduladores, isto é, gliotransmissores, que desempenham um papel ativo na fisiologia sináptica100,103,108,109.
As interações fisiológicas de astrócitos e micróglia com sinapses são cruciais para a formação e funcionamento da rede sináptica, e apontam que a sua perda ou perturbação funcional pode contribuir para patogênese e progressão do TEA103 levando a alterações das citocinas que são mediadoras no comportamento neuropatológico do transtorno110.
Além disso, as evidências de inflamação no tecido nervoso em pacientes com TEA é comprovada através de biomarcadores de inflamação no líquor e no sangue desses indivíduos57,58,13. Os biomarcadores específicos incluem: ativação de micróglia e de astrócitos85,13;citocinas pró-inflamatórias96,13, fator de transcrição nuclear Kappa β (NF-kβ) e a via clássica do Sistema Complemento111,13.
As citocinas apresentam um impacto direto sobre as atividades dos neurônios e estão envolvidas no neurodesenvolvimento tanto no período pré como no pós-natal, incluindo as funções neurológicas de ordem superior como cognição e memória.112-114 Sendo assim, a perturbação da homeostase de citocinas pode ser responsável por uma variedade de consequências neurológicas relevantes para o TEA112.
A neuroinflamação no TEA pode causar danos ao encéfalo através do aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias e crescimento neuronal anormal115. Sugere-se que o estresse oxidativo pode ser contribuinte e a principal causa de lesões e inflamação no SN115.
1.1.3.4 Barreira Hematoencefálica (BHE)
A BHE é um termo usado para descrever uma série de propriedades microvasculares do SNC que regulam fortemente o movimento de células, moléculas, e íons entre o sangue e o SN116. É uma interface dinâmica entre o suprimento de sangue periférico e o parênquima cerebral, controlando o transporte de material, de e para o encéfalo117. Esta barreira é crucial para fornecer um ambiente apropriado permitindo a função neural adequada, a homeostase, bem como proteger o SNC de lesões e doenças117-119. O fornecimento de nutrientes ao SNC, realizado pela BHE, em condições normais, permite que as células inflamatórias respondam a alterações no ambiente local120.
O desenvolvimento da BHE é um processo de múltiplos passos que começa com a angiogênese encefálica quando os vasos preexistentes brotam no neuroectoderme embrionário e dão origem a novos vasos, sendo ainda muito
primitivos e fenestrados121. Estes brotos iniciais exibem muitas propriedades da BHE, incluindo expressão de proteínas de junções intercelulares (TJ) e transportadores de nutrientes. Eles também contêm um grande número de vesículas transcitóticas e apresentam alta expressão de moléculas de adesão de leucócitos121. Durante o período embrionário tardio e pós-natal inicial ocorre a diferenciação da BHE, onde os capilares encefálicos, quando em contato com o tecido neuronal, diferenciam-se e amadurecem gradualmente e expressam as características intrínsecas da barreira122.
É essencial que a BHE esteja intacta para construir e manter um microambiente que permita que os circuitos neuronais funcionem corretamente, suas principais propriedades incluem o tráfico de leucócitos, seja para vigilância imunológica e respostas efetoras a infecções cerebrais, ou após danos nos tecidos cerebrais, quando os detritos devem ser limpos por macrófagos121. A degradação da BHE, no entanto, leva ao aumento do extravasamento de células imunes e fluxo de moléculas mal reguladas e íons através da BHE quando os TJs são interrompidos, os processos de transporte são deficientes ou ambos, os mecanismos pelos quais ocorre a degradação de BHE e as consequências de uma barreira comprometida são múltiplas121.
Mudanças sutis na BHE em estágios iniciais poderiam torná-la mais vulnerável à inflamação sistêmica do que o normal e, em particular, pode predispor a ruptura123. O desafio sistêmico com LPS, é amplamente utilizado para modelos de inflamação sistêmica, quando administrado in vivo, o efeito do LPS na função BHE é variável123. Uma revisão117 mostrou que existem poucos estudos examinando diretamente as propriedades da BHE no TEA, mas recentemente, pesquisadores apontaram para aumento da permeabilidade e alterações na função da BHE. A evidência para a ruptura na BHE que está presente no TEA tem como base marcadores celulares endoteliais, marcadores moleculares de permeabilidade da BHE, citocinas pró-inflamatórias que estão aumentados117.
O aumento da permeabilidade da BHE parece ser um fator comum no TEA, levando ao aumento da infiltração de material periférico no encéfalo, culminando em neuroinflamação e estresse oxidativo117.
A neuroinflamação pode causar danos ao SN através do aumento da liberação de citocinas pró-inflamatórias e crescimento neuronal anormal115,124-126. O estresse oxidativo é geralmente a principal causa de danos no SNC, e desempenha um papel crucial em muitos distúrbios do neurodesenvolvimento, portanto, está associado à fisiopatologia de muitas doenças neuropsiquiátricas e neurodegenerativas incluindo a doença de Alzheimer127, doença de Parkinson128, esquizofrenia129e TEA115.
O estresse oxidativo deriva de um desequilíbrio entre espécies reativas de oxigênio (EROs) e capacidade antioxidante, o que resulta em dano da macromolécula130. EROs são moléculas instáveis e agressivas, que têm a tendência de dar seu elétron desemparelhado a outras moléculas celulares ou arrancar elétrons de outras moléculas para alcançar a estabilidade131. Elas podem causar dano oxidativo a proteínas, lipídios e DNA, se não forem eliminadas115,130. O órgão mais suscetível ao dano oxidativo é o encéfalo, devido à sua composição e utilização de glicose e oxigênio130, desta maneira ele se expõe aos radicais livres, e quando comparado ao restante dos tecidos do corpo, ele é mais sensível por possuir uma menor defesa antioxidante130. Agravo neuronal foi sugerido em crianças com TEA com estresse oxidativo crônico e disfunção mitocondrial130.
No momento em que não há estresse oxidativo existe um equilíbrio entre a produção de EROs e a capacidade antioxidante das células132. Quando ocorre produção exacerbada de EROs, ou seja, quando há desequilíbrio devido à depleção de antioxidantes e/ou aumento da formação de agentes pró-oxidantes além da capacidade das defesas antioxidantes existe a promoção da lesão133-135.
As EROs possuem fontes celulares e uma das principais fontes é a cadeia transportadora de elétrons mitocondrial que têm como seus principais componentes o superóxido (O2-) que sofre dismutação que forma o peróxido de hidrogênio (H2O2) e funciona como fonte geradora desses agentes tóxicos136. Existem sistemas de defesa enzimáticos antioxidantes protetores, que atuam antes que ocorra a lesão causada pela ação dos radicais livres ou espécies não-radicais, por meio da ação da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa reduzida (GHS), glutationa peroxidade (GPx)137,138. Em processos patológicos, a relação entre os agentes pró-oxidantes e antipró-oxidantes podem estar desequilibrada e, consequentemente, agir na disfunção e morte celular139,140.
Presente em quase todas as células, a SOD é considerada a primeira linha de defesa contra as EROs e catalisa a conversão do O2- em H2O2 e O2141. Quando em
presença a uma infecção, o SNC é capaz de ordenar uma resposta inflamatória baseada em ativação microglial, invasão local de células imunológicas circulantes e produção de EROs141. Nesta circunstância, aparecem os biomarcadores, utilizados a fim de avaliar o balanço redox para análise dos danos causados pelo estresse oxidativo em uma infecção e com a finalidade de avaliar a deficiência das defesas antioxidantes142. O estresse oxidativo tem como biomarcadores os compostos carbonílicos e sulfidrílicos que mensuram o dano nas proteínas; as espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) que avaliam os danos em componentes celulares e estruturas lipídicas; as atividades das enzimas antioxidantes como a SOD, a CAT e a GPx, GHS e métodos fluorescentes como o diclorodihidrofluoresceínadiacetato142.
As mudanças ocorridas nas atividades de enzimas antioxidantes como a SOD, CAT e GPx, aliada a uma interação entre fatores genéticos, ambientais e fatores imunológicos poderiam estar envolvidas na síntese do TEA, sendo o EO o mecanismo de ligação entre tais fatores131,143,144.
Muitos estudos têm relatado que os produtos de peroxidação lipídica são muito mais elevados em pacientes com o transtorno em comparação com controles saudáveis131,143,144. A peroxidação lipídica é uma reação em cadeia entre ácidos graxos poliinsaturados e EROs, e produz peróxidos lipídicos e polímeros de hidrocarbonetos, que são altamente tóxicos para a célula144.
O malondialdeído (MDA) é um produto final da peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados e ésteres relacionados e é, portanto, usado como marcador de peroxidação lipídica. O EO no TEA está associado ao aumento dos níveis plasmáticos de MDA e outros biomarcadores de peroxidação lipídica144. Além disso, a diminuição dos níveis de antioxidantes e agentes de desintoxicação em amostras a partir de crianças com TEA foi avaliado145-148.
1.1.3.6 Metabolismo Energético
O SNC possui uma intensa atividade metabólica, sua conectividade funcional é complexa, e suas reservas energéticas são extremamente pequenas em relação a sua demanda149. Tem um elevado custo energético, e requer o uso eficiente de glicose, principal substrato energético para esse sistema149,150. O uso da glicose no SNC varia conforme a etapa do seu desenvolvimento, o estado nutricional do indivíduo e o destino de sua cadeia de átomos de carbono151. O tecido nervoso é extremamente
vulnerável à falta de energia, e assim suscetível a danos em situações de metabolismo energético (ME) reduzido, portanto sistemas de células nervosas dependem de um fornecimento contínuo de energia151.
As mitocôndrias são essenciais para a vida das células, elas produzem a maior parte da energia necessária para o funcionamento do organismo através do trifosfato de adenosina (ATP) pela fosforilação oxidativa152. No SNC a fosforilação oxidativa fornece mais de 95% do ATP sintetizado, juntamente com a glicose que entra no ciclo do ácido cítrico sob a forma de acetilcolina, que é então oxidada completamente a dióxido de carbono (CO2)153-155.
As mitocôndrias têm duas membranas (externa e interna), um espaço intermembranar, e uma matriz interna. A membrana interna mitocondrial contém a cadeia de transporte de elétrons (ETC), a maquinaria molecular para produção de energia152,156. Cinco complexos de proteínas formam o ETC, destes cinco complexos, três (I, III, e IV) ativam a bomba de prótons (H+) através da membrana interna, gerando um gradiente de H+ necessário para a síntese de ATP no complexo V (ATP sintase)152,156. O núcleo da célula codifica outras proteínas mitocondriais (mais de 1.000), que realizam a mediação de processos como a regulação da homeostase de íons, as respostas ao estresse, a sobrevivência da célula, e transdução de sinal152,156.
Fornecimentos de energia neuronais são completamente dependentes da fosforilação oxidativa mitocondrial152. Os neurônios têm capacidade limitada para obter energia através da glicólise quando a fosforilação oxidativa está comprometida152,157, o que os torna particularmente vulneráveis à disfunção mitocondrial152.
As mitocôndrias abrigam os grandes sistemas enzimáticos utilizados para completar a oxidação de açúcares, gorduras e proteínas para a produção de energia utilizável na forma de ATP158. Na matriz mitocondrial ocorre o ciclo do ácido cítrico, também conhecido como ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) ou o ciclo de Krebs, que consiste de uma sequência de reações onde, em cada volta do ciclo são formadas três moléculas de nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (NADH), uma de flavina e adenina dinucleotídeo reduzido (FADH2), duas de CO2 e uma de guanosina trifosfato (GTP)158-160. A NADH (complexo I) e a FADH2 (complexo II) formados são carreadores de elétrons para a cadeia respiratória. A cadeia respiratória é formada por uma série de complexos protéicos, onde ocorre a transferência de elétrons concomitante com o bombeamento de prótons da matriz para o lado citosílico da
membrana mitocondrial interna. O gradiente de prótons é usado como força-motriz para impulsionar a síntese de ATP158-160.
Além disso, as mitocôndrias têm papel emergente na neuroplasticidade152. Tem sido demonstrado várias vias de sinalização importantes que estimulam a biogênese mitocondrial e metabolismo energético, enquanto que regulamenta simultaneamente a neuroplasticidade161. Essas organelas são distribuídas por todo o comprimento do axônio pré-sináptico e terminais, além de estarem associadas com as espinhas dendríticas152,162,163. As mitocôndrias também participam do metabolismo de EROs, sinalização de cálcio e apoptoses152,156.
A redução do metabolismo energético pode levar a diminuição na síntese de ATP, comprometer a síntese de neurotransmissores, captação de glutamato pelos astrócitos e neurônios e induzir apoptose152,156. Portanto, a deficiência do metabolismo energético parece estar implicada na patogênese de uma série de transtornos psiquiátricos152,156 e doenças neurológicas152.
A disfunção mitocondrial no TEA é mais comum do que o esperado164. Percentagens substanciais de pacientes com TEA exibem marcadores periféricos de disfunção do metabolismo energético mitocondrial, tais como aumento de creatina quinase, lactato, piruvato e os níveis de alanina no sangue, urina, e/ou líquor, e deficiência de carnitina no soro165-167. Por consequência sugere-se que os mecanismos de neuroinflamação e apoptose que confirmam a etiologia do transtorno podem ser utilizados como parâmetros de biomarcadores152.
1.2 MEMÓRIA
Memória é a aquisição, a formação, a conservação e a evocação de informações168,169. É o processo de retenção e reconstrução do conhecimento aprendido170. Há muitas classificações para as memórias, considerando sua função, seu conteúdo e seu tempo de duração. Se for considerado o tempo que as memórias duram, pode-se dizer que algumas duram somente alguns segundos, enquanto outras duram horas, dias, meses ou anos171. Neste aspecto, as memórias podem ser classificadas como memórias de trabalho (MT), de curta duração (MCD) ou de longa duração (MLD)172. Há também outra classificação onde define-se dois sistemas de memória distintas: (i) memória declarativa (explícita) de fatos e acontecimentos, para as pessoas, lugares e objetos, dividida em episódica (memória para eventos) e
memória semântica (memória para fatos)170; e (ii) memória não declarativa (implícita), memória de habilidades motoras e perceptivas que engloba condicionamento clássico simples, a aprendizagem não associativa, priming, e memória processual170,173. Esses sistemas de memória dependem de mecanismos idênticos associados ao reforço da transmissão sináptica, que envolvem mudanças morfológicas na sinapse e ultrapassa o tempo de estabilização da memória174.
A formação da memória, apesar de ser resultado de uma infinidade de processos interativos, ocorre na forma de eventos moleculares ao nível de uma conexão sináptica individual, o que é denominado plasticidade sináptica175,176. Estas mudanças sinápticas integram-se através de múltiplas conexões sinápticas que envolvem redes neuronais maiores, e finalmente estão expressos em nível comportamental175,176. Mudanças micro-anatômicas que fazem parte da formação da memória não são exclusivamente relacionadas com neurônios e suas partes, mas envolvem as células não neuronais, incluindo os astrócitos176,177.
Um número de distúrbios cognitivos, incluindo doença de Alzheimer (DA), demência relacionada com a Síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), esclerose múltipla (EM), câncer e TEA112 estão associados com níveis elevados de citocinas no SNC sugerindo uma possível ligação entre moléculas pró-inflamatórias elevadas e disfunção da memória178,180,181. As citocinas interferem na resposta imune e são benéficas em níveis basais, mas podem produzir comportamentos de doença e prejudicar a cognição em níveis fisiopatológicos que alteram as conexões sinápticas que envolvem as redes neuronais175,178-180.
Durante uma resposta inflamatória, a micróglia e os astrócitos tornam-se ativados, resultando na liberação de citocinas, no SNC178. Estas citocinas pró-inflamatórias afetam diretamente a função neuronal, incluindo a potenciação de longo prazo (LTP), a liberação de glutamato, o tráfico de receptor de alfa-amino-3-hidroxi-metil-5-4-isoxazolpropiónico (AMPA) e a ativação das vias de sinalização celular178,182,183. Esses processos afetam a plasticidade sináptica e a neurotransmissão, evidenciando que as citocinas podem impactar nos processos neuronais pertinentes à cognição178,184.
O hipocampo é considerado uma região fundamental para a formação da memória176. Existe uma elevada densidade de receptores de citocinas no hipocampo, especialmente no giro dentado (DG)178, indicando que o hipocampo pode ser particularmente vulnerável durante a neuroinflamação178. De fato, usando modelos
animais, os pesquisadores têm observado que a administração de citocinas ou outros estímulos imunogênicos, incluindo o LPS, pode interromper o processo de aprendizagem e de memória dependente do hipocampo178,184-189.
Estudo mostra que existem déficits de memória declarativa e implícita em indivíduos com TEA190. Sugere-se que os dois sistemas de memória se apresentam mais prejudicados no TEA de baixo funcionamento, pois o TEA de alto funcionamento mostrou-se sem alteração nas muitas formas de memória não declarativa e declarativa quando foram testadas a memória para estímulos não sociais 170,190,191.
1.3 BERBERINA (BBR)
Berberina (Figura 2)192 é um alcaloide isoquinolínico, do tipo protoberberina, de sabor amargo e cor amarela. É utilizado há pelo menos 3.000 anos na medicina ayurvédica e chinesa e também se faz presente em várias fórmulas na medicina japonesa, indiana e coreana193-203. A BBR foi identificada nas raízes, rizomas e casca do caule de muitas plantas, como Hydrastis canadensis (goldenseal), Coptis chinensis (coptis ou fio de ouro), Berberis aquifolium (Uva Oregon), Berberis vulgaris (Bérberis) e Berberis aristata (árvore do açafrão)193-203. Historicamente, a BBR também tem sido utilizada como corante, devido à sua cor; tradiocionalmente seu uso é baseado nas suas propriedades antimicrobianas19,193-203. Além dessa propriedade, ela exerce outras atividades biológicas tais como antioxidante, antifúngica, antiviral, anti-inflamatória, anti-tumoral, antidiarreico, antidislipidemia e antidiabética19,193-203.
1.3.1 Atividades biológicas da BBR
Estudos preliminares sugerem que a BBR pode melhorar a qualidade de vida e diminuir as taxas de mortalidade em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva crônica198,204,205. Estudos clínicos e pré-clínicos tem mostrado que a BBR pode auxiliar na regulação da glicemia e na prevenção e tratamento da diabetes mellitus198,206-208. Também tem sido utilizada como tratamento para a hipercolesterolemia, devido sua capacidade de reduzir triglicerídeos, colesterol e níveis de lipoproteína de baixa densidade198,209-211.
Ainda, pesquisas indicam que a BBR é benéfica para tratamento do câncer212, obesidade, aterosclerose213, artrite reumatóide, doenças cerebrovasculares, febre, dores de cabeça, pressão arterial elevada, alterações do sistema imune, síndrome do intestino irritável, leucemia, leucopenia, doenças no fígado, osteoporose e doenças respiratórias214.
A BBR possui múltiplos efeitos neuroprotetores e melhora o desenvolvimento, a função e a sobrevivência dos neurônios, enquanto protege essas células encefálicas215. Além disso, há evidência de que a BBR possui ação neuroprotetora nas doenças neurodegenerativas216, incluindo Doença de Alzheimer216, doença de Parkinson217 e doença de Huntington218.
Esse composto bioativo tem apresentado efeitos neuroprotetores em vários modelos de lesão encefálica219-221. Em um modelo de lesão encefálica crônica, gerado pela administração de tricloreto de alumínio em ratos, a ingestão de doses da BBR quatro horas após a administração de alumínio evitou que os ratos apresentassem comprometimento na aprendizagem, memória e lesão neuronal no hipocampo216,219, assim como, inibiu a diminuição das atividades de CAT e SOD, o aumento da atividade da acetilcolinesterase, conteúdo de malondialdeído (MDA) e atividades da enzima monoamina oxidase-B (MAO-β), bem como a expressão de RNAm da MAO-β e de proteína216,219.
Em um estudo com modelo de oclusão da artéria cerebral média, a BBR produziu melhora no resultado neurológico e reduziu a isquemia/reperfusão (I/R) induzida por infarto encefálico, 48 h após a oclusão da artéria cerebral média. Atividade atribuída a inibição da geração de EROs, e posterior liberação dos fatores pró-apoptóticos de citocromo C e fatores indutores de apoptose em mitocôndrias219,220. A BBR mostrou efeitos anti-apoptóticos contra a isquemia,
diminuindo o fator de hipóxia induzida-α (HIF-1α), a caspase 9, caspase 3, e aumentando o inibidor de apoptose (Bcl-2)/promotor de apoptose (Bax)204 e pelo aumento da fósforo-ativação de Akt219,221-224.
Em modelo pré-clínico de doença neurodegenerativa induzida por Dizocilpina (MK-801), utilizando ratos neonatos, a administração de BBR, via intraperitoneal, demonstrou efeitos neuroprotetores em neurônios danificados. Os efeitos provavelmente se deram, através de bloqueio de transporte de K+ e diminuição do limiar do potencial de ação225, redução da produção do TNF-α, IL-1β, e prostaglandina E2 a partir da micróglia ativada17. Houve também, inibição da produção excessiva de glutamato219,226,227, redução da atividade da metaloproteinase de matriz-9228, diminuição da produção de óxido nítrico (ON) em células oligodendrogliais219,229, aumentando o heme oxigenase-1 de RNAm e a expressão de proteína230, e a atenuação da sobrecarga de cálcio (Ca2+) intracelular2019,231 são outros mecanismos propostos para efeitos neuroprotetores e anti-neuroinflamatórios da BBR.
A BBR teve seu consumo aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) o qual tem significativo efeito antioxidante232,233. Elimina a atividade de radicais livres, portanto é capaz de absorver e neutralizar os radicais livres, e eliminar o oxigênio reativo, ou decompor peróxidos. A BBR é capaz de aumentar a atividade de CAT, SOD e GPx e é capaz de aumentar o conteúdo de GSH provavelmente por estimulação do ciclo de g-glutamil e/ou regeneração de GSH enzimática a partir de glutationa oxidada232-235. É um potente inibidor da peroxidação lipídica e pode reduzir a geração de ON de uma forma dependente da concentração232. Desta forma, a sua capacidade de sequestrar radicais livres e reduzir a produção de ON leva a inibição da produção de ONOO- 232,236.
Estudo de Lu e colaboradores237, mostrou que a BBR diminui a ação do LPS ou interferon- γ (IFN-γ) induzido por i-NOS, COX-2, e a expressão de citocinas pró-inflamatórias; inibe a expressão de i-NOS e COX-2, e a ativação de ERK através da ativação da AMPK, mostrando que a BBR diminui distúrbios metabólicos por meio de múltiplas vias, incluindo a diminuição da expressão de mediadores inflamatórios. Além disso, a BBR também suprimiu IL-1B e TNF-α através da inibição da sinalização da via NF-kB237.
A BBR apresenta capacidade de atravessar a BHE, bem como sua pequena estrutura, que permite agir sobre uma série de alvos moleculares193,218. É um dos pilares da sua eficácia como um agente anti-inflamatório e antioxidante no SNC193,218.
