FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DO INSTITUTO DE BIOLOGIA – UNICAMP
Título em inglês: Isolation and characterization of esterase gene related with OP insecticide
resistance in Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae).
Palavras-chave em inglês: Insecticide resistance; Esterases; Organophosphorus compounds;
Screwworm.
Área de concentração: Genética Animal e Evolução. Titulação: Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Banca examinadora: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, Antônio Thadeu Medeiros de Barros,
Gonçalo Amarante Pereira.
Carvalho, Renato Assis de
C253i Isolamento e caracterização do gene da esterase
relacionado à resistência a inseticidas organofosforados na mosca praga da pecuária Cochliomyia hominivorax
(Diptera: Calliphoridae) / Renato Assis de Carvalho. – Campinas, SP: [s.n.], 2007.
Orientadora: Ana Maria Lima de Azeredo-Espin.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
1. Resistência a inseticidas. 2. Esterases. 3. Compostos organofosforados. 4. Bicheira. I. Azeredo-Espin, Ana Maria Lima de. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
“The insecticide resistance is probably the best proof of the effectiveness of natural selection yet obtained.”
DEDICATÓRIA
“Não há escola que se iguale com um lar decente, nem professores que se igualem a pais honestos e virtuosos.” Mahatma Gandhi Aos meus pais, Antônio José e Arlinda, que sempre me apoiaram em todos os momentos da minha vida e contribuíram com todo suor e dedicação à minha formação como aprendiz e ser humano. E a toda minha família, pelo apoio e pela confiança que sempre depositaram em mim.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, quero agradecer enormemente à professora e orientadora Ana Maria, por ter me dado oportunidade de ingressar na carreira científica. Quando aluno de graduação, ainda imaturo, sem ter conhecimentos do que era um laboratório de pesquisa, ela me acolheu e me deu a oportunidade de realizar a iniciação científica. Isso foi apenas o começo da longa trajetória que cursei no laboratório, e que ainda não acabou. Além disso, agradecer também pela experiência de participar como monitor da disciplina de Genética Fisiológica e Molecular, o que contribuiu muito para minha formação.
Não menos importante na minha formação no laboratório, quero agradecer a Tati, que tanto se empenhou em me ajudar e me inserir no árduo caminho da carreira científica, cobrando leitura de artigos, revisão de relatórios e afins. Através da sua ‘orientação de bancada’, foi ela quem mais contribuiu para meu amadurecimento profissional e para o despertar de uma visão crítica.
Quero agradecer a todo pessoal do Laboratório de Genética Animal, por ter estado sempre comigo em todos os momentos da execução deste projeto. À Rosângela, pela dedicação e comprometimento com toda a parte operacional do laboratório, desde os estoques de reagentes até os ‘toques’ no momento de fazer um gel ou uma digestão. À Alessandra, que recentemente também tem contribuído nos bastidores do laboratório. À Mariana, pelas viagens de coletas e por ter respondido tantas dúvidas minhas, tanto sobre processos evolutivos quanto sobre os documentos necessários para qualificação, banca e por aí vai. À Norma, pelas discussões a respeito da resistência aos inseticidas. À Karina, que por algum tempo se sentou na minha frente e tanto me ajudou em diversos temas científicos. Ao Johnny, Palocci, Pablo e Túlio (in EUA) pelas discussões científicas e também, não menos importantes, das mesas de bar. Ao conterrâneo Mário Paniago, que me acompanhou na fase final do projeto e cedeu o seu laboratório e diversos materiais para que o objetivo fosse atingido. À Pri, a Bárbara e a Aline que sempre estiveram ao meu lado, brincando de microssatélites (brincadeira!). À Salete, que tanto me ajudou com a criação dessas larvas exigentes. Aos demais, que estão ou já estiveram em nosso laboratório: Ana Cláudia, Ana Carolina, Mari Loira, Jaú, Joan, Lú, Pedro, Lissiene.
Agradeço também os professores que participaram da minha formação na graduação em Ciências Biológicas e na pós-graduação em Genética e Biologia Molecular. Em especial, o professor Louis Bernard Klaczko, que me ajudou nas análises estatísticas referentes ao bioensaio realizado
veterinários Gustavo e Guilherme Sabatini, que foram fundamentais na realização do bioensaio no campo.
Agradeço aos membros da pré-banca Prof. Dr. Michel Georges Albert Vincentz e Profa. Dra. Márcia Cristina Mendes, pelas sugestões para a melhoria da tese. E também aos membros da banca Dr. Antônio Thadeu Medeiros de Barros, Prof. Dr. Gonçalo Amarante Pereira, Prof. Dr. José Eduardo Bracco.
Agradeço aos amigos que encontrei aqui na turma BIO 01D da Unicamp, que fizeram de Campinas um lugar mais agradável pra se viver e que fizeram parte de tantos momentos da minha vida. E principalmente, aos que enfrentaram 1.000 km pra conhecer minha terra natal e minha família: Frango, Egito, Mineiro, Zapa, Pedro, Johnny, Fred, Júlia, Bel e Amanda. Quero agradecer também toda a galera que já morou comigo (agora na sétima moradia!) e que fez dos fins de semana um Barão Geraldo mais alegre: Juliano, Pitchula, Leonardo, Paulo, Yuzo, Madruga, Júlio César, Daniel Nay, Gustavinho e Coutinho. Em especial, agradeço a Ilezi e família, que me acolheu em Campinas desde o primeiro ano da faculdade e foi minha segunda mãe por todo esse período longe de casa.
Agradeço à Natália e sua família, pelo amor e companheirismo que vem me proporcionando nesses últimos meses de luta, e pela paciência e compreensão dos abandonos em fins de semana e feriados pra eu conseguir terminar essa tese.
Agradeço aos meus amigos lá do Goiás, que estavam sempre presentes nos momentos de descanso e diversão lá na terra querida, e principalmente aos que vieram me prestigiar na minha formatura, conhecendo um pouquinho do mundo em que eu vivia: Jamar Jr., Ramon, Flávio, Fernando, Rilmo, Pedro Rafael, Gustavo, Aloísio e Léo. E aos amigos goianos aqui de Campinas, Fleury, Alexandre (Baby), Mamão e Toneto, que estavam sempre dispostos a tomar umas e cantar uma moda caipira.
Agradeço à toda minha família, por ter me apoiado em todas as decisões que eu tomei e por ter confiado em mim nessa aventura em busca do conhecimento. Aos meus irmãos Júnior, Adriana, Andreia e Angela por botarem fé no irmão caçula e sempre desejarem o melhor pra mim. Aos meus pais, Antônio José e Arlinda, pelo exemplo a ser seguido e pelo esforço em sempre dar a melhor educação aos filhos, seja em casa ou nas melhores escolas. Aos tios e primos e avós, pelo incentivo dado em todos os momentos.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro durante a iniciação científica, e pelo auxílio durante o mestrado, com bolsa e apoio financeiro para participação em congressos científicos. E pelo auxílio a projetos de pesquisa da Profa. Dra. Ana Maria Lima de Azeredo-Espin, que garantiram a execução deste trabalho.
ÍNDICE FICHA CATALOGRÁFICA...ii BANCA EXAMINADORA...iii DEDICATÓRIA...v AGRADECIMENTOS...vi ÍNDICE...ix
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS...xii
ABREVIAÇÃO E TERMOS EM INGLÊS...xiii
RESUMO...xv
ABSTRACT...xvi
ORGANIZAÇÃO DA TESE...xvii
PARTE I – INTRODUÇÃO GERAL... ...1
1.1 A MOSCA DA BICHEIRA E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA...1
1.2 DISTRIBUIÇÃO DA COCHLIOMYIA HOMINIVORAX...4
1.3 RESISTÊNCIA A INSETICIDAS...6
OBJETIVOS...11
PARTE II - CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA ESTERASE-3...12
CAPÍTULO 1 - Caracterização das mutações Gly137/Asp e Trp251/Ser ...12
METODOLOGIA DETALHADA...12
Amostras de C. hominivorax...12
DNA genômico...12
Síntese do cDNA...13
Amplificação por PCR...14
Seqüenciamento dos fragmentos obtidos...15
Análise das seqüências...16
RESULTADOS E DISCUSSÃO...17
Amplificação...17
CAPÍTULO 2 - Método de identificação da mutação Gly137/Asp...25
METODOLOGIA DETALHADA...25
Amostras de C. hominivorax...25
DNA genômico...25
Amplificação...25
Identificação dos indivíduos mutantes por PCR-RFLP...26
RESULTADOS E DISCUSSÃO...27
Identificação dos mutantes por PCR-RFLP...27
CAPÍTULO 3 - Caracterização da região codificante da esterase E3...38
METODOLOGIA DETALHADA. ...38
Amostras de C. hominivorax...38
Síntese do cDNA...38
Amplificação...39
Seqüenciamento...41
Análise das seqüências...41
RESULTADOS E DISCUSSÃO...42
Amplificação do cDNA...42
Análise das seqüências...43
CAPÍTULO 4 - Verificação da possível associação do alelo mutante com resistência ao inseticida organofosforado: uma abordagem preliminar...50
METODOLOGIA DETALHADA...50
Amostras de C. hominivorax...50
Bioensaio com inseticida OP...50
DNA genômico...51
Identificação dos genótipos por PCR-RFLP...52
Análise das freqüências dos genótipos...52
RESULTADOS E DISCUSSÃO...52
CONCLUSÕES GERAIS...55
Resistência e valor adaptativo...55
Resistência monogênica X poligênica...58
ÍNDICE DE FIGURAS E TABELAS FIGURAS
Figura 1. Fêmea adulta de C. hominivorax e bolsa escrotal de um bovino recém castrado contendo larvas e massa de ovos de C. hominivorax (Pág. 5).
Figura 2. Ciclo de vida da Cochliomyia hominivorax (Pág. 6).
Figura 3. Distribuição geográfica histórica e atual da C. hominivorax (Pág. 8).
Figura 4. À esquerda, estrutura química do diazinon (dietil OP), e à direita, o malation (dimetil OP), com os grupos etil e metil em destaque (Pág. 12).
Figura 5. Filogenia simplificada da ordem Diptera (Pág. 12).
Figura 6. Esquema do cDNA de Lucilia cuprina, mostrando a posição das mutações e dos introns (Pág. 18). Figura 7. Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos de amplificação em C. hominivorax e
L. cuprina com os pares de “primers” 7F1a/7R2 e 7F1a/7R4 (Pág. 22).
Figura 8. Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos de amplificação em L. cuprina e
C. hominivorax com o par de “primers” 7F1a/7R3a (Pág. 22).
Figura 9. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos dos alelos ChαE7 de C. hominivorax encontrados e
de um indivíduo heterozigoto, juntamente com parte da seqüência do LcαE7 de L. cuprina (Pág. 25).
Figura 10. Esquema da reação de digestão com a enzima Tsp45I dos produtos de PCR amplificados com os “primers” 7F1a/7R3a (Pág. 29).
Figura 11. Análise eletroforética em gel de agarose da reação de digestão com a endonuclease Tsp45I dos produtos amplificados em C. hominivorax com o par de “primers” 7F1a/7R3a (Pág. 30).
Figura 12. Esquema do cDNA de L. cuprina, mostrando a posição das mutações Gly137/Asp (em verde) e Trp251/Leu (em amarelo) (Pág. 43).
Figura 13. Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos da amplificação em cDNA e DNA genômico de C. hominivorax com os pares de “primers” 7F1a/7R3a, E3F/7R3a; e 7F4a/7R7 (Pág. 46).
Figura 14. Alinhamento das seqüências nucleotídicas da E3 de L. cuprina e C. hominivorax (Pág. 48).
Figura 15. Alinhamento das seqüências preditas de aminoácidos da E3 de C. hominivorax, L. cuprina,
M. domestica, H. irritans e D. melanogaster (Pág. 51).
Figura 16. Vista posterior do bovino contendo as incisões laterais (Pág. 54). TABELAS
Tabela 1. “Primers” utilizados na amplificação do fragmento contendo as mutações (Pág. 17). Tabela 2. “Primers” utilizados na amplificação da região codificante da E3 (Pág. 42).
ABREVIAÇÕES E TERMOS EM INGLÊS
ABIEC Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carne. AChE Acetilcolinesterase
Asp Ácido aspártico
Asp/Asp Indivíduo homozigoto com os dois alelos portando o códon do ácido aspártico Asp/Gly Indivíduo heterozigoto com um alelo portando o códon do ácido aspártico e o
outro alelo portando o códon glicina.
CBMEG Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética cDNA DNA complementar
CEEA Comissão de Ética e Experimentação Animal CICB Centro das Indústrias de Curtumes do Brasil DDT Inseticida diclorodifeniltricloroetano
DEPC Água tratada com dietil pirocarbonato DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTP Qualquer um dos quatro possíveis desoxirribonucleotídeos trifosfatos DTT 1, 4-Dithiothreitol
E3 Carboxilesterase-3
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FMU Faculdades Metropolitanas Unidas
Genbank Banco de dados de seqüências do NIH (National Institutes of Health)
Gly Glicina
Gly/Gly Indivíduo homozigoto com os dois alelos portando o códon da glicina Gly137/Asp Substituição de glicina por ácido aspártico na posição 137 da cadeia de aminoácidos
Gly/His Substituição de glicina por histidina na posição 137 da cadeia de aminoácidos
IAEA International Atomic Energy Agency
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IEL Instituto Euvaldo Lodi
INPI Instituto Nacional da Propriedade Industrial KCl Cloreto de potássio Leu Leucina MgCl2 Cloreto de magnésio OP Inseticida organofosforado pb Pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction
PCR-RFLP Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism ‘Primer’ Oligonucleotídeo iniciador
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RT-PCR Reverse transcriptase – Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodecyl sulfate
Ser Serina
SIT Sterile Insect Technique Taq Thermus aquaticus TE Tampão Tris – EDTA Trp Triptofano
Trp251/Leu Substituição do Triptofano por Leucina na posição 251 da cadeia de aminoácidos
Trp251/Ser Substituição do Triptofano por Serina na posição 251 da cadeia de aminoácidos
US$ Dólar americano
RESUMO
A pecuária bovina tem significativa importância no contexto sócio-econômico para o país, sendo responsável pela produção anual de mais de 2 milhões de toneladas de carne, uma das principais fontes de proteína animal da dieta do consumidor brasileiro. A alta produtividade deve estar sempre acompanhada de um controle sanitário eficiente desses animais. Os prejuízos econômicos provocados por ecto e endoparasitas estão entre os principais fatores limitantes da produção animal. Dentre os ectoparasitas de maior importância na pecuária nacional e considerada uma das principais pragas, está a Cochliomyia hominivorax (Coquerel), conhecida no Brasil como a mosca da bicheira. Os prejuízos causados pelas infestações dessa espécie vêm através da redução da qualidade do couro e da produção de leite, na perda de peso e fertilidade do hospedeiro, e mortalidade dos animais infestados. No Brasil, o seu controle tem sido realizado principalmente através da aplicação de inseticidas organofosforados (OP). Porém, o uso indevido e/ou prolongado desses agentes químicos pode provocar a seleção de indivíduos resistentes. Com a recém introdução de outros princípios ativos, como os piretróides, nas formulações dos inseticidas para controle da C. hominivorax, associada ao fato de que a espécie L. cuprina (Calliphoridae), causadora de miíases em ovelhas, adquiriu resistência ao inseticida OP em menos de 10 anos de uso de tal inseticida, torna-se evidente a importância da investigação da resistência a inseticidas OP em C. hominivorax. Através da amplificação heteróloga com ‘primers’ previamente construídos para L. cuprina, e com ‘primers’ construídos especificamente para C. hominivorax, o gene da esterase E3 foi amplificado e seqüenciado nesta espécie. Foram identificadas as mesmas mutações (Gly137/Asp e Trp251/Ser) responsáveis por conferir resistência a inseticidas organofosforados em L. cuprina e Musca domestica. Além da caracterização dessas mutações, foi desenvolvido um método rápido e eficiente para identificação da principal mutação relacionada com resistência a OP. Toda a região codificante da carboxilesterase E3 foi amplificada e seqüenciada em C. hominivorax, permitindo sua caracterização nesta espécie. Através da realização de um bioensaio utilizando inseticidas organofosforados, a principal mutação (Gly137/Asp) foi associada com a resistência a tal classe de inseticidas em C. hominivorax. A caracterização deste gene nas populações naturais da mosca da bicheira permitirá a realização de uma análise da freqüência de indivíduos resistentes nas diferentes regiões do Brasil, o que possibilitará o uso mais apropriado e eficiente dos agentes químicos nas propriedades com atividade pecuária, contribuindo para uma maior produtividade animal e menor dano ambiental.
ABSTRACT
The cattle breeding is very important to the social-economic context of Brazil. It is responsible for annual production of more than 2 million ton of meat, one of the essential sources of animal protein on Brazilian diet. The large productivity should be always accomplished by an efficient sanitary control of the animals. The economic losses caused by internal and external parasites are the main limiting factors of meat production. Cochliomyia hominivorax (Calliphoridae) is one of the most important myiasis-causing flies and it is responsible for severe economic losses, mainly by reducing the quality of leather and the production of milk and meat. In Brazil, C. hominivorax has been controlled by applying insecticides, particularly organophosphate (OP)-based compounds. However, the improper and continuous use of these chemicals can lead to the selection of OP-resistant strains. Changes in a specific carboxylesterase (E3) activity have been associated with OP resistance in Lucilia cuprina, one important myiasis-causing fly in sheep in Australia and also a member of the Calliphoridae family. The recent introduction of other insecticides for C. hominivorax control, associated with the development of OP resistance in L. cuprina in less than ten years, shows the importance of resistance investigation in C. hominivorax. Based on foregoing studies, the same mutations responsible for conferring OP resistance in L. cuprina and Musca domestica (Muscidae) were identified in C. hominivorax. Besides characterization of these mutations, a rapid and efficient method for identifying the major mutation related to OP resistance (Gly137/Asp) was developed. Moreover, the entire codifying region of carboxylesterase E3 was amplified and sequenced, allowing its characterization in this species. Using a bioassay, the major mutation (Gly137/Asp) was associated with OP resistance in C. hominivorax. The characterization of this gene in natural populations can be an important tool for surveying resistance to insecticides in different regions of Brazil. This will provide information for the selection and for the implementation of more effective pest management programs.
ORGANIZAÇÃO DA TESE
Esta tese está organizada em duas partes. A primeira parte constitui uma introdução geral, contendo uma revisão bibliográfica sobre aspectos biológicos e distribuição geográfica da mosca da bicheira, Cochliomyia hominivorax. Além disso, apresenta os principais mecanismos de resistência a inseticidas.
A segunda parte está dividida em quatro capítulos e abrange a caracterização do gene da esterase E3 em C. hominivorax, e a associação deste com a resistência. Desta forma, o primeiro capítulo descreve a caracterização, em C. hominivorax, das mutações responsáveis por conferir resistência a inseticidas organofosforados em outras espécies. Já o segundo capítulo descreve o desenvolvimento de um método molecular rápido e eficiente de identificar a principal mutação relacionada com a resistência, o qual foi tema de um pedido de depósito de patente de invenção junto ao INPI. Os resultados destes dois capítulos foram publicados em um artigo científico no periódico ‘Veterinary Parasitology’ vol. 140: 344-351 (2006), intitulado: “A survey of mutations in the Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae) esterase E3 gene associated with organophosphate resistance and the molecular identification of mutant alleles”. Carvalho, R. A., Torres, T. T., Azeredo-Espin, A. M. L.
O terceiro capítulo compreende todo o processo de amplificação e seqüenciamento do cDNA da carboxilesterase E3 em C. hominivorax. Utilizando alguns ‘primers’ previamente construídos para L. cuprina, e outros ‘primers’ construídos especificamente para a realização deste trabalho, toda a região codificante da E3 foi caracterizada, permitindo a comparação desta com as demais seqüências de esterases já depositadas no banco de dados. Um artigo científico referente a esse capítulo está em fase de preparação.
O quarto capítulo descreve um teste preliminar para verificar a associação da mutação Gly137/Asp com a resistência a OP em C. hominivorax. O bioensaio foi realizado em parceria com a FMU (Faculdades Metropolitanas Unidas), que disponibilizou toda a infra-estrutura e apoio veterinário. Apesar de algumas questões a serem consideradas, o bioensaio indicou a associação da mutação com a resistência a OP na espécie C. hominivorax.
Após a apresentação dos capítulos, há as conclusões gerais do projeto e uma discussão a respeito das implicações dos resultados encontrados em programas de controle da espécie. Além disso, são apresentadas algumas perspectivas relacionadas com a genética de resistência nessa espécie praga da pecuária.
PARTE I - INTRODUÇÃO GERAL
1.1 A MOSCA DA BICHEIRA E SUA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
O Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, com aproximadamente 207 milhões de cabeças (IBGE, 2005). A pecuária bovina tem significativa importância no contexto sócio-econômico para o país, sendo responsável pela produção anual de mais de 2 milhões de toneladas de carne por ano, uma das principais fontes de proteína animal da dieta do consumidor brasileiro. Em 2006, as receitas com exportação de carne bovina atingiram mais de U$ 3,7 bilhões (ABIEC, 2006). Esses números podem ser ainda maiores, uma vez que a tendência do crescimento da população mundial é um importante fator do aumento da demanda futura de carne.
O aumento da produtividade deve estar associado a um controle sanitário dos animais, reduzindo os custos e aumentando a qualidade da carne produzida. Os prejuízos econômicos provocados por ecto e endoparasitas estão entre os principais fatores limitantes da produção animal, afetando a produção de carne e leite, e a qualidade do couro produzido. Dentre os ectoparasitas, as moscas causadoras de miíases estão entre as pragas de maior importância para a pecuária mundial (Hall and Wall, 1995). Dentre os principais desafios do controle destas pragas por meio de inseticidas estão a necessidade de limitar os resíduos químicos na carne, no leite e no ambiente, e retardar o desenvolvimento da resistência por parte dos insetos (Nolan and Schnitzerling, 1986).
As infestações de larvas de dípteros no homem e nos animais despertaram a atenção de vários cronistas e missionários na América Latina, desde o início da colonização. Já no século XVI encontramos várias referências à presença de larvas no corpo do homem ou dos animais (Guimarães et al., 1983). O termo miíase (do grego myia = mosca) foi definido como a “infestação de seres humanos e vertebrados vivos por larvas de dípteros que, pelo menos por algum período de tempo, se alimentam dos tecidos vivos ou mortos do hospedeiro, de suas substâncias corporais líquidas ou do alimento por ele ingerido” (Zumpt, 1965).
Existem dois grupos principais de espécies causadoras de miíases: os parasitas obrigatórios ou primários, que se desenvolvem em hospedeiros vivos, e os parasitas facultativos ou secundários, que podem se alimentar de tecidos necrosados ou materiais em decomposição (Zumpt, 1965). Dentre as moscas causadoras de miíases, destacam-se as pertencentes às famílias Oestridae, Calliphoridae e Sarcophagidae (Hall and Wall, 1995), incluindo espécies de grande importância sanitária e econômica, por infestarem o homem, promoverem a disseminação mecânica de
Dentro da família Calliphoridae, duas espécies destacam-se por serem parasitas obrigatórios: a Chrysomya bezziana, sendo a principal mosca causadora de miíase primária no Velho Mundo, e a Cochliomyia hominivorax (Figura 1), considerada uma das mais importantes moscas causadoras de miíases na região Neotropical. Ainda na família Calliphoridae, a Lucilia cuprina, classificada como um parasita facultativo, é a grande responsável pela incidência de miíases em ovelhas na Austrália, causando diversos prejuízos à produção pecuária local (Levot, 1995).
Figura 1. Fêmea adulta de C. hominivorax e bolsa escrotal de um bovino recém castrado contendo larvas e massa de ovos de C. hominivorax.
A Cochliomyia hominivorax (Coquerel), da família Calliphoridae, conhecida no Brasil como mosca da bicheira, é considerada uma das mais importantes pragas da pecuária nacional. Seu ciclo de vida compreende aproximadamente 21 dias. A fêmea fecundada deposita seus ovos, em média 200, em feridas pré-existentes ou em orifícios do corpo, como olhos, ouvidos e narinas. Até mesmo feridas resultantes da picada de um carrapato são suficientes para atrair as fêmeas para a oviposição. Metabólitos bacterianos, resultantes do processamento do tecido animal por outras larvas, podem aumentar a atratividade das feridas como sítios de oviposição (Hammack et al., 1987; Chaudhury et al., 2002). Após 12 horas, as larvas emergem e passam a se alimentar dos tecidos vivos do hospedeiro por aproximadamente 7 dias até atingir o terceiro instar, quando caem no solo e se transformam em pupas. O período de pupa dura, em média, 6 dias, sendo seguido pela emergência dos adultos. Com cerca de 8 dias, as fêmeas já estão prontas para serem fecundadas e realizar a ovoposição, fechando o ciclo de vida da espécie (Figura 2).
Figura 2. Ciclo de vida da Cochliomyia hominivorax.
Embora as miíases sejam conhecidas desde tempos muito antigos, no começo do terceiro milênio elas ainda persistem como um problema não resolvido para a produção animal. Os prejuízos econômicos causados por esta espécie provêem da redução na produção de leite, na perda de peso, na redução na qualidade do couro devido às cicatrizes provocadas e na mortalidade dos indivíduos infestados, principalmente de bezerros recém-nascidos (Sereno et al., 1996).
Em termos quantitativos, os números que envolvem a produção de couro no Brasil são bastante expressivos, chegando em 2005, a mais de 38 milhões de peças de couros bovinos, cerca de 10% do mercado mundial (IBGE, 2005). Mas, mesmo diante de indicadores que atestam a importância do setor de peles, couros e derivados, é de razoável consenso que existem entraves relevantes à ampliação da sua eficiência e competitividade no país. No caso do couro bovino, o Brasil deixa de ganhar cerca de US$ 900 milhões anuais, em virtude da baixa qualidade do couro produzido e dos descompassos entre a oferta nacional e a demanda pelo produto (CICB, 2001). Salienta-se que 85% dos couros produzidos no Brasil apresentam defeitos e, desse montante, 60% ocorrem dentro das propriedades rurais e 40% no transporte da propriedade para o curtume. Dos 60% dos defeitos do couro dentro da propriedade rural, 40% provém de danos causados por
ectoparasitoses, como a bicheira, 10% devido à marcação a fogo dos animais e 10% decorrente de marcas de arame farpado, galhos e espinhos (IEL, 2000).
Embora ainda não tenha sido estabelecida uma estimativa de custo para o controle dessa praga no Brasil, há um custo teórico que pode ser calculado a partir de estudos realizados na região do Caribe (Rawlings, 1985). A estimativa de perda anual com monitoramento e tratamento variou de US$ 4,82 a US$ 10,71 por animal. Extrapolando esses dados para o Brasil, com um rebanho de aproximadamente 200 milhões de cabeças de gado, estima-se que o custo médio anual para a pecuária nacional seja de aproximadamente US$ 1,5 bilhão (Torres, 2006).
1.2 DISTRIBUIÇÃO DA Cochliomyia hominivorax
Originalmente, a distribuição geográfica da mosca da bicheira se estendia do sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina e Uruguai (Hall and Wall, 1995). No entanto, já na década de 1930 esta praga foi responsabilizada por causar um enorme impacto econômico na produção pecuária dos Estados Unidos, o que despertou o interesse da comunidade científica em desenvolver medidas de controle e erradicação desta praga. Alguns pesquisadores concluíram que reduzir ou eliminar a população de insetos seria uma solução melhor do que tratar topicamente os animais após estes serem infestados pelas larvas, motivando iniciativas envolvendo a esterilização de machos e a implementação de um programa de erradicação através da liberação de insetos estéreis (IAEA, 1998; Bowman, 2006).
A técnica do inseto estéril SIT (“Sterile Insect Technique”) foi idealizada por E. F. Knipling, em 1937. Sua idéia inicial era de que a liberação no campo de um grande número de machos estéreis durante várias gerações sucessivas poderia levar a uma supressão na densidade populacional da mosca da bicheira (Knipling, 1955). Essa técnica consiste na criação em massa de indivíduos da espécie em questão, na esterilização sexual destes, normalmente com radiação gama, e conseqüente liberação dos indivíduos estéreis em determinada região, onde os machos estéreis irão competir com os machos selvagens pelo acasalamento. As fêmeas selvagens que se acasalam com os machos estéreis realizam a postura dos ovos normalmente e o embrião inicia o desenvolvimento, mas morre antes da eclosão (Baumhover, 2002).
Em 1958 foi iniciado o programa de erradicação de C. hominivorax nos Estados Unidos, sendo declarado livre de casos de infestação em 1966. Depois disso, foram estabelecidos outros programas de erradicação através do SIT, como no México (erradicação declarada em 1991), Belize
e Guatemala (1994), El Salvador (1995), Honduras (1986), Nicarágua (1999), Costa Rica (2000) e Panamá (2001). Neste último está sendo mantida uma barreira permanente através da liberação de insetos estéreis na divisa com a Colômbia para impedir a recolonização por moscas advindas da América do Sul (Torres, 2006).
A distribuição atual de C. hominivorax compreende uma parte da região do Caribe (Cuba, República Dominicana, Haiti, Jamaica, Trinidad e Tobago) e toda a América do Sul, com exceção do Chile (Figura 3).
Figura 3. Distribuição geográfica histórica e atual da C. hominivorax.
A erradicação por esterilização também foi utilizada com sucesso na Líbia, após a verificação da presença de C. hominivorax em 1988. O temor de que esta mosca se dispersasse e causasse conseqüências desastrosas para a produção animal e vida selvagem do continente africano levou a importação de moscas estéreis do México (Bowman, 2006; Reichard, 2002). De dezembro de 1990 a outubro de 1991, mais de 1,2 bilhões de moscas estéreis foram liberadas. Em 1992, a Líbia foi declarada livre desta espécie (Kouba, 2004). O custo de erradicação da C. hominivorax nessa região foi aproximadamente US$ 100 milhões, o que comprova o alto custo envolvido neste tipo de operação (FAO, 1993).
Atual Distribuição da C. hominivorax
Apesar do sucesso na erradicação nestes locais, o uso da técnica de insetos estéreis apresenta algumas limitações, como a ausência de dados concretos a respeito do problema, ausência de fundos financeiros suficientes, e número limitado de centros que poderiam liderar este processo (IAEA, 1998). Sendo assim, a principal forma de controle de C. hominivorax em sua atual distribuição geográfica é realizada através da aplicação de inseticidas, principalmente da classe dos organofosforados (OP). No entanto, há muitos obstáculos relacionados ao uso dessas drogas devido aos riscos de gerar efeitos tóxicos para animais, selecionar parasitas resistentes, deixar resíduos na carne e no leite, e de contaminar o ambiente.
1.3 RESISTÊNCIA A INSETICIDAS
Até a década de 1940, a pesquisa na área de resistência a inseticidas estava relativamente restrita a poucos entomologistas dos órgãos governamentais relacionados à agricultura, cujo foco era simplesmente documentar os casos de resistência no campo e, em seguida, prover explicações baseadas nos conhecimentos de genética e fisiologia da época. O primeiro artigo científico relatando a resistência a inseticidas foi publicado em 1914 por Melander, descrevendo experimentos preliminares que confirmaram observações de que uma praga comum em maçã podia sobreviver ao tratamento com inseticida em algumas áreas (Ceccati, 2004).
Alguns cientistas da época propuseram que o aumento da habilidade de alguns insetos sobreviverem a certos tratamentos inseticidas fosse devido a fatores ambientais, como temperatura e umidade, ou à falha na aplicação de inseticida. Melander (1914) contestou estas interpretações e criou uma hipótese na qual a resistência resultava de uma adaptação fisiológica de alguns indivíduos em uma população de insetos que podia ser passada geneticamente para a próxima geração, o que foi confirmado em estudos posteriores.
A partir da década de 40, dois eventos contribuíram para elevar o interesse das pesquisas na área de resistência. Um deles foi a descoberta e difusão do uso do DDT (diclorodifeniltricloroetano) e de outros inseticidas orgânicos sintéticos, o que resultou numa explosão de casos de resistência, com concomitante aumento no número de cientistas especializados e engajados no assunto. O outro evento foi a publicação de um livro pelo biólogo evolucionista Theodosius Dobzhansky, no qual ele citou a resistência a inseticidas como ‘provavelmente a maior prova já obtida da eficiência da seleção natural’ (Dobzhansky, 1937). Isso promoveu uma importante ponte entre o mundo da entomologia na agricultura e os laboratórios de
biologia, uma vez que os fatores que governam a origem e a propagação das mutações associadas à resistência são de importância acadêmica e aplicada (ffrench-Constant et al., 2004).
A resistência é um dos principais fatores limitantes ao uso de inseticidas para controle de insetos pragas. Ela é conferida por um número limitado de mecanismos em todos os insetos já analisados. Esses mecanismos envolvem predominantemente a alteração da sensibilidade do sítio alvo para que não seja suscetível à ação do inseticida ou a desintoxicação metabólica do inseticida antes de atingir o sítio alvo (Hemingway, 2000). Sozinhos ou em combinação, esses mecanismos conferem resistência, algumas vezes em níveis extremamente elevados, a todas as classes de inseticidas disponíveis (Hemingway et al., 2004).
A análise molecular em diferentes organismos tem mostrado o limitado número de substituições de aminoácidos que pode ser tolerado em importantes receptores e enzimas. Os três principais grupos de enzimas envolvidas no processo de desintoxicação metabólica são: glutationa-S-transferases (GST), monooxigenases P-450 e carboxilesterases (Hemingway and Karunaratne, 1998).
Os principais inseticidas utilizados para o controle da mosca da bicheira na pecuária nacional, conhecidos como matabicheiras, pertencem à classe dos organofosforados (OP). Esses inseticidas têm como sítio alvo a acetilcolinesterase (AChE), enzima que possui a função de hidrolisar o neurotransmissor acetilcolina. Uma vez inibida a AChE pelos inseticidas, ocorre a morte do inseto. Os OPs, em sua maioria, podem ser hidrolisados por enzimas carboxilesterases (Hemingway and Karunaratne, 1998).
Quanto à persistência no meio ambiente, os OPs são classificados como não persistentes ou ligeiramente residuais, sendo detectados no sítio de aplicação por até 12 semanas (Menzer, 1991). Seu relativo baixo custo e sua atuação no controle tanto de carrapatos quanto de miíases foram responsáveis pela disseminação do uso desse inseticida na pecuária nos últimos 30 anos (Tellam and Bowles, 1997). No entanto, após aproximadamente 8 anos de utilização desse agente químico na Austrália para controle da L. cuprina, espécie causadora de miíases em ovelhas, esta mosca desenvolveu um mecanismo de resistência a tal inseticida (Levot, 1995). O fenótipo resistente detectado foi um resultado direto da aquisição de uma habilidade de desintoxicação associada com um alelo do gene da esterase E3 (Hughes and Raftos, 1985; Russel et al., 1990; Parker et al., 1991).
A resistência a inseticidas OP já foi associada com mutações no seu sítio alvo, a AChE, em alguns insetos como Drosophila melanogaster (Mutero et al., 1994; Menozzi et al., 2004), Musca domestica (Walsh et al., 2001) e Bactrocera oleae (Vontas et al., 2002). No entanto, mudanças de aminoácidos na acetilcolinesterase podem alterar a eficiência desta enzima, provocando um custo associado para o inseto resistente na ausência do inseticida (Shi et al., 2004).
Mudanças na atividade de carboxilesterases desintoxicantes também têm sido associadas com resistência a inseticidas em diversas espécies (Wheelock et al., 2005). Em muitas espécies de artrópodes, a super produção de carboxilesterases (alteração quantitativa) foi documentada como uma resposta evolutiva à pressão de seleção por compostos OP e carbamatos. Neste tipo de resistência, as esterases atuam como um ligante de alta afinidade que seqüestram e, muito vagarosamente, hidrolisam OPs, prevenindo a inibição do sítio alvo acetilcolinesterase. A causa da síntese excessiva dessas enzimas pode ser devido à amplificação de genes no genoma (Mouches et al., 1986; Field and Devonshire, 1997; Karunaratne et al., 1998; Raymond et al., 1998; Field et al., 1999; Small and Hemingway, 2000; Vontas et al., 2000) ou à regulação positiva da transcrição, sem o evento da amplificação gênica (Villarino et al., 2003; Lee et al., 2000; Hawkes and Hemingway, 2002; Pruet et al., 2001).
Já as espécies Musca domestica (van Asperen and Oppenoorth, 1959), L. cuprina (Hughes and Raftos, 1985) e Chrysomya putoria (Towsend and Busvine, 1969) mostram uma diminuição da atividade carboxilesterase em linhagens resistentes a OPs. Isto tem sido explicado pela hipótese mutante ali-esterase (Oppenoorth and van Asperen, 1960; Bigley and Plapp, 1960). Esta hipótese propõe que uma mutação estrutural na carboxilesterase (alteração qualitativa) resulta numa reduzida habilidade de hidrolisar substratos carboxilésteres, como ésteres metil butirato e naftil acetato, mas uma aquisição na habilidade de hidrolisar substratos OPs (Claudianos et al., 1999).
Após a caracterização molecular da carboxilestersase E3 em L. cuprina, a hipótese ali-esterase foi confirmada para esta espécie (Newcomb et al., 1997a). Substituições de nucleotídeos resultaram em substituições de aminoácidos (Gly137/Asp e Trp251/Leu) no centro catalítico da esterase E3 conferindo resistência a OP nessa mosca (Newcomb et al., 1997b; Campbell et al., 1998). Os alelos mutantes conferiram dois diferentes padrões de resistência: a dietil OPs (ex: diazinon) e dimetil OPs (ex: malation), respectivamente (Figura 4).
Figura 4. À esquerda, estrutura química do diazinon (dietil OP), e à direita, o malation (dimetil OP), com os grupos etil e metil em destaque.
A substituição Gly137/Asp na E3 confere um largo espectro de resistência a OPs, excluindo o malathion (Campbell et al., 1998). Já a substituição do aminoácido triptofano na posição 251 por leucina ou serina (Trp251/Leu e Trp251/Ser) tem sido associada a um baixo nível de resistência aos dietil OPs e grande resistência a uma pequena classe de inseticidas organofosforados, os dimetil OPs (especialmente o malation), e pode estar relacionada com resistência cruzada a inseticidas piretróides (Heidari et al., 2005). Substituições de aminoácidos nestas mesmas posições foram encontradas também em linhagens de Musca domestica resistentes a OP (Claudianos et al., 1999; Taskin et al., 2004) e em alguns indivíduos de Lucilia sericata (Hartley et al., 2006), moscas pertencentes a diferentes famílias (Figura 5).
Figura 5. Filogenia simplificada da ordem Diptera, destacando as famílias das espécies cujas seqüências da E3 foram analisadas. Adaptado de McAlpine and Wood (1989).
O uso de inseticidas organofosforados para controle da C. hominivorax no Brasil tem sido realizado há décadas. Recentemente, tem ocorrido a introdução de outros princípios ativos, como os piretróides, nas formulações dos matabicheiras. Além disso, tem-se encontrado cada vez mais dificuldade em tratar as feridas de animais infestados com larvas da mosca da bicheira. Associando essas duas informações com o fato de que a espécie L. cuprina adquiriu resistência ao inseticida OP em menos de 10 anos (Levot, 1995), tornou-se clara a importância da investigação da resistência a inseticidas OP em C. hominivorax, praga que, como já mencionado anteriormente, causa enormes prejuízos à pecuária nacional.
Os estudos envolvidos na caracterização da resistência em L. cuprina (Newcomb et al., 1997a; Newcomb et al., 1997b; Campbell et al., 1997; Heidari et al., 2005; Newcomb et al., 2005, Hartley et al., 2006;), mosca também pertencente à família Calliphoridae, foram de grande importância para o desenvolvimento do trabalho em C. hominivorax. Alguns oligonucleotídeos (“primers”), previamente descritos para L. cuprina, foram utilizados para isolar e seqüenciar parte de um possível gene ortólogo em C. hominivorax, que codifica a E3, uma das enzimas responsável por conferir resistência a inseticidas organofosforados. A amplificação e seqüenciamento do gene em C. hominivorax permitiu investigar a presença das substituições nas posições Gly137 e Trp251, mutações responsáveis em conferir a resistência aos inseticidas OP em L. cuprina e M. domestica (Newcomb et al., 1997a; Claudianos et al., 1999).
Dessa forma, a caracterização deste gene nas populações naturais na mosca da bicheira e a verificação da associação das mutações encontradas com resistência a OP permitirão realizar uma análise da freqüência de indivíduos resistentes nas diferentes regiões do Brasil. A identificação de indivíduos resistentes possibilitará o uso mais apropriado dos agentes químicos nas propriedades com atividade pecuária. Alternativamente ao uso de organofosforados, o proprietário poderá fazer uso de outros inseticidas, associado a outras práticas de manejo e controle, como uma alternativa ao mecanismo de resistência das moscas, contribuindo para uma maior produtividade em sua propriedade.
OBJETIVOS
O objetivo geral do projeto foi caracterizar em Cochliomyia hominivorax o gene da esterase E3 e as mutações nele inseridas relacionadas com o intuito de investigar a presença de um mecanismo de resistência a inseticidas OP nesta mosca praga da pecuária. O conhecimento da seqüência nucleotídica possibilita verificar a presença de mutações já conhecidas por conferir resistência a essa classe de inseticidas. Além disso, foi verificada a associação da principal mutação encontrada com a ocorrência de resistência a inseticida OP nesta espécie.
PARTE II – CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA ESTERASE-3
Capítulo 1
CARACTERIZAÇÃO DAS MUTAÇÕES Gly137/Asp E Trp251/Ser
Este primeiro capítulo trata da caracterização das mutações no gene da esterase de C. hominivorax possivelmente associadas à resistência aos inseticidas OPs. Foi utilizado o conhecimento prévio da seqüência do gene da esterase da mosca causadora de miíase em ovelhas Lucilia cuprina, também pertencente à família Calliphoridae.
METODOLOGIA DETALHADA
Amostras de C. hominivorax
Neste estudo foram analisadas amostras de C. hominivorax provenientes de diferentes localidades do Brasil. As larvas foram coletadas diretamente das feridas de animais infestados e foram mantidas na criação no Laboratório de Genética Animal, como descrito por Infante e Azeredo-Espin (1995), até atingirem a fase de pupa para obtenção do DNA genômico e do RNA total. Amostras de L. cuprina provenientes de Botucatu-SP e mantidas a –70° C foram utilizadas como controle positivo. Uma vez que alguns oligonucleotídeos, ou simplesmente ‘primers’, utilizados na reação de PCR foram sintetizados inicialmente para esta espécie, a amplificação do lócus desejado dessa mosca foi de grande importância para evitar erros no diagnóstico da PCR.
DNA genômico
A extração do DNA total dos indivíduos de C. hominivorax e L. cuprina foi realizada como descrito por Azeredo-Espin (1993). Cada indivíduo foi colocado em um tubo de 1,5mL contendo 300µL de solução A (10mM Tris.Cl 2M, 60mM NaCl, 300mM sacarose, 10mM EDTA 0.5M). Após macerar o inseto, foi adicionado 300µL da solução B (300mM Tris.Cl 2M, 40mM SDS 10%, 20mM EDTA 0.5M, 1% DEPC) e o lisado foi incubado no gelo por 15 minutos. Ao lisado foi adicionado 600µL de fenol equilibrado em tampão Tris 2M pH 8.0 e incubado por 3 minutos e, então, centrifugado por 10 minutos a 5.000 rpm a 4°C. Retirou-se a camada superior e nela foi adicionado 300µL de fenol e 300µL de clorofórmio/álcool isopropílico (24:1) e incubado por 3 minutos.
Centrifugou-se por 5 minutos a 5.000 rpm, removeu-se a camada superior e nela foi adicionado 600µL de clorofórmio/álcool isopropílico (24:1). Após ser misturado em vortex, foi incubado no gelo por 3 minutos e centrifugado por mais 5 minutos a 5.000 rpm a 4° C e, em seguida, a camada superior foi transferida para um novo tubo. Foram adicionados 22µL de acetato de sódio 3M e 800µL de etanol absoluto gelado, os tubos foram invertidos suavemente e incubados a –20° C por 2 horas e, em seguida, centrifugados a 12.000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi redissolvido em 150µL de TE (1.0mM de Tris-HCl, pH 7.4 e 0.1mM de EDTA, pH 8.0). Foram adicionados 8µL de acetato de sódio 3M e 450µL de etanol gelado, os tubos foram invertidos suavemente e incubados a –70° C por 30 minutos, e centrifugados a 12.000 rpm por 30 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado redissolvido em 150µL de TE (1.0mM de Tris-HCl, pH 7.4 e 0,1mM de EDTA, pH 8.0).
Síntese do cDNA
O DNA complementar, ou cDNA, foi sintetizado a partir do RNA total extraído separadamente de pupas e adultos de C. hominivorax. Os tecidos frescos foram macerados em nitrogênio líquido em recipientes de porcelana estéreis e 100mg de cada tecido foram colocados em tubos de 1,5mL. Em cada um foi adicionado 1mL de Trizol (Invitrogen) e incubados por 5 minutos à temperatura ambiente. Foi adicionado 200µL de clorofórmio, misturado em vortex e incubado por 3 minutos à temperatura ambiente. Centrifugou-se por 12.000 rpm a 4° C. A camada superior foi removida e nela foram adicionados 500µL de isopropanol e incubado por 10 minutos à temperatura ambiente. Centrifugou-se por 10 minutos a 14.000 rpm a 4° C e o sobrenadante foi removido. Ao precipitado foi adicionado 1mL de etanol 75% e centrifugou-se a 9.000 rpm por 5 minutos a 4° C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 50µL de água DEPC quente. A quantificação do RNA total foi realizada no aparelho Gene Quant (Pharmacia Biotech), de acordo com as especificações do fabricante.
A construção da fita de cDNA foi realizada através da reação de RT-PCR (‘Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction’), com o kit ‘SuperScriptTM RT for RT-PCR’ (Invitrogen).
Adicionou-se em um tubo eppendorf 500 µg de oligo(dT), 5ηg de RNA, 10 mM de cada dNTP, e completou com água até atingir 12µL. Essa mistura foi aquecida a 65° C por 5 minutos e depois
0.1 M DTT, 1µL (40 unidades) de RNaseOUTTM e incubada a 37° C por 2 minutos. Foi então
adicionado 1µL (200 unidades) de SuperScriptTM RT e a reação foi incubada por 50 minutos a 37° C.
A reação foi finalizada elevando a temperatura a 70 oC por 15 minutos.
Amplificação por PCR
Os “primers” utilizados inicialmente (7F1, 7F1a, 7R2 e 7R4) foram desenvolvidos para a L. cuprina. Em seguida, para aumentar a eficiência da reação de amplificação, foi sintetizado um “primer” especificamente para C. hominivorax (Tabela 1). Para cada par de “primers”, foram realizadas séries de amplificações visando alcançar as melhores condições de amplificação.
Tabela 1. “Primers” utilizados na amplificação do fragmento contendo as mutações com suas
respectivas seqüências.
“Primer” Seqüência
7F1 5’ – GGA TGG TGT GCG TGA TTG TTG – 3’ 7F1a 5’ – AGC TAA ATC CCG AAA CTA AAC – 3’ 7R2 5’ – TCC CAA ACG ATA TTG TAT GTT – 3’ 7R4 5’ – CCG AGG ATG TTT GGG TAA GAC – 3’
7R3a 5’ - ATC CTT ATC ATT ATT TTC ACC C – 3’
Para as amplificações foram utilizadas as enzimas “Taq DNA Polimerase” (Invitrogen) e a “Platinum Taq DNA Polimerase” (Invitrogen) e as mesmas condições iniciais de amplificação utilizadas em L. cuprina e M. domestica (Newcomb et al., 1997b; Claudianos et al., 1999). A partir destas condições, as amplificações foram padronizadas para C. hominivorax variando a temperatura de hibridização dos “primers”, concentrações de DNA molde e MgCl2, e tipo e concentração da
enzima. As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 15µl utilizando o termociclador “Perkin Elmer GenAmp PCR System 9.600”. Na fase inicial foram utilizados 3 “primers”: 7F1 (direto), 7R2 (reverso) e 7R4 (reverso), que combinados, formaram 2 pares de “primers”. Além destas combinações, o “primer” direto 7F1a, foi utilizado juntamente com o “primer” reverso 7R4. Um novo “primer” reverso específico para C. hominivorax, 7R3a, foi sintetizado e utilizado nas amplificações (Figura 6).
Figura 6. Esquema do cDNA de Lucilia cuprina, mostrando a posição das mutações Gly137/Asp (em verde) e Trp251/Leu (em amarelo). I, II, III, IV e V representam as posições dos introns em L. cuprina, com os respectivos tamanhos: I - ~ 2kb, II – 280pb, III – 56pb, IV – 77pb, V - ~ 1.0kb (Newcomb et al., 1997b).
As melhores condições de amplificação obtidas utilizaram as seguintes concentrações finais: 20mM Tris-HCl (pH 8.4), 50mM KCl, 1U de enzima (“Taq DNA Polimerase”), 200µM de cada dNTP, 1,8mM de MgCl2,1µM de cada “primer” e 1µL de amostra de DNA preparadas como descrito
anteriormente. Estas reações foram submetidas a uma etapa inicial de desnaturação a 96° C por 3 minutos (1 ciclo), seguida de 35 ciclos de 95° C por 1minuto, 52° C por 1 minuto e 72° C por 2 minutos. Um passo prolongado de extensão de 72° C por 10 minutos foi adicionado após o último ciclo para garantir a extensão dos fragmentos cujos “primers” já estavam hibridizados. A temperatura de hibridização usada foi a originalmente descrita para a L. cuprina. Os produtos de PCR foram visualizados através de eletroforese em gel de agarose (1%) corado com brometo de etídeo e, em seguida, visualizadas em transiluminador UV.
Seqüenciamento dos fragmentos obtidos
A obtenção das seqüências dos fragmentos obtidos nas amplificações foi realizada de duas maneiras. Em uma delas foi realizado o seqüenciamento direto dos produtos de PCR, que foram purificados anteriormente utilizando filtros VM 0.05µm (Millipore), de acordo com as especificações do fabricante. Os produtos purificados foram então utilizados na reação de seqüenciamento com “Big DyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Kit”, versão 3.0 (ABI PrismTM , Perkin Elmer) com os
próprios ‘primers’ utilizados para a amplificação. As reações de seqüenciamento foram submetidas a uma etapa inicial de desnaturação a 96° C por 1 minuto e meio (1 ciclo), seguida de 35 ciclos de
reação foi realizada adicionando 80 µL de isopropanol 75% em cada tubo, seguido por um período de incubação de 15 minutos. Em seguida, centrifugou-se por 30 minutos e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 150µL de etanol 70% e centrifugou-se mais uma vez por 10 minutos, descartando, em seguida, o sobrenadante. O precipitado de DNA foi então ressuspenso em 3µLTE para a realização do seqüenciamento.
A outra estratégia de seqüenciamento envolveu a clonagem dos fragmentos resultantes da amplificação em vetores plasmidiais. A clonagem foi realizada ligando os fragmentos da PCR já purificados pelo “QIAquick PCR Purification kit” (QIAGEN) em vetores utilizando os kits “TA Cloning kit" (Invitrogen) e “pGEM-T Easy Vector System I” (Promega), de acordo com as especificações de cada fabricante, os quais foram usados para transformar células competentes de E. coli por meio de choque químico. As células foram plaqueadas em meio LB (Luria Bertani) sólido acrescido de ampicilina (50µg/mL) e 0,8mg de X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) por placa para posterior identificação das colônias recombinantes. Para a realização do seqüenciamento, o DNA plasmidial foi então isolado através de minipreparação por lise alcalina, como descrito por Sambrook et al. (1989). Para verificação da presença e tamanho do inserto, foi realizada digestão do plasmídeo com a endonuclease EcoR I.
As reações de seqüenciamento foram submetidas a uma etapa inicial de desnaturação a 96° C por 1 minuto e meio (1 ciclo), seguida de 35 ciclos de 96° C por 12 segundos, 50° C por 6 segundos e 60° C por 4 minutos. A etapa de purificação da reação foi realizada adicionando 80µL de etanol 80% em cada tubo, seguido por um período de incubação de 15 minutos. Em seguida, centrifugou-se por 30 minutos e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 150µL de etanol 70% e centrifugou-se mais uma vez por 10 minutos, descartando, em seguida, o sobrenadante. O precipitado de DNA foi então ressuspenso em 3µL TE para a realização do seqüenciamento.
Análise das seqüências
As reações foram analisadas no sistema de seqüenciamento automático ABI 3700 (Applied Biosystems) e as seqüências foram verificadas inicialmente pelo programa Chromas 2.21 (Technelsium Pty Ltd). Estas seqüências foram, então, submetidas a buscas por similaridades em bancos de seqüências (GenBank) utilizando o aplicativo BLASTN (Altschul et al., 1997). As análises comparativas entre as seqüências foram realizadas com base nos alinhamentos múltiplos obtidos com o auxílio do programa ClustalX (Thompson et al., 1997), possibilitando a verificação de
possíveis mutações responsáveis por conferir resistência. As seqüências de nucleotídeos foram traduzidas em seqüências de aminoácidos pelo programa “Biological Sequence Alignment Editor” (Hall, 1999), visando à detecção de substituição de aminoácidos. O aplicativo Nebcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) foi utilizado para identificar possíveis sítios de restrição nas seqüências obtidas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Amplificação
Nesta etapa foram utilizados quatro “primers” de L. cuprina e um específico para C. hominivorax (7R3a), sendo combinados formando cinco pares de “primers” (7F1/7R2, 7F1/7R4, 7F1a/7R2, 7F1a/7R4, 7F1a/7R3a). Apesar de haver outras seqüências de genes codificantes da esterase E3 em outros dípteros (Drosophila melanogaster, Musca domestica, Haematobia irritans) depositadas nos bancos de dados, os “primers” de L. cuprina foram escolhidos por esta espécie pertencer à mesma família da C. hominivorax (Figura 4). Sendo mais próximas filogeneticamente, há uma maior probabilidade das regiões serem mais conservadas, sendo amplificadas pelo mesmo conjunto de “primers”.
Inicialmente, apenas um “primer” direto (7F1) havia sido utilizado, com o qual não se obteve amplificação do fragmento de tamanho esperado. Com o par 7F1/7R2, era esperado amplificar uma região de aproximadamente 260pb, que em L. cuprina possui o sítio da mutação que confere resistência a inseticidas organofosforados (Newcomb et al., 1997a; Campbell et al., 1998). Já com o par 7F1/7R4, esperava-se amplificar uma região maior, com aproximadamente 750pb, que inclui a região menor.
Nessa fase inicial, com a utilização desses pares de ‘primers’ não se obteve sucesso nas amplificações, isto é, não foi obtida amplificação do fragmento em C. hominivorax. A tentativa de otimização da amplificação foi realizada testando diferentes temperaturas de hibridização a partir da temperatura originalmente descrita para L. cuprina, além de diferentes concentrações de MgCl2 e
enzima. A concentração de magnésio é muito importante para a reprodutibilidade de padrões em reações de amplificação. As concentrações testadas variaram entre 1,5 e 1,8mM, sendo que a última apresentou melhores resultados, uma vez que o magnésio atua como cofator da enzima polimerase. No entanto, concentrações muito altas não puderam ser usadas na tentativa de
também a temperatura de desnaturação de DNA molde e dos ‘primers’ e ainda provocar artefatos através da formação de dímeros de ‘”primers” (Innis and Gelfand, 1990).
Além da utilização da “Taq DNA Polimerase”, foi utilizada outra enzima, a “Platinum Taq DNA Polimerase”, que possui anticorpos específicos que inibem a atividade da polimerase em baixas temperaturas (Markoulatos et al., 2003). Sua atividade é restaurada após a desnaturação dos anticorpos. Esta nova enzima foi utilizada como uma alternativa à etapa de “Hot start” utilizada nos trabalhos originais com L. cuprina, que consistia em elevar a temperatura da reação até 95° C antes de adicionar a enzima “Taq DNA Polimerase”. Essa etapa diminui as amplificações inespecíficas, uma vez que não permite que os ‘”primers” se hibridizem em sítios inespecíficos antes da reação atingir a temperatura ideal para sua hibridização, aumentando a especificidade (DeGraves et al., 2003). No entanto, o uso desta enzima não apresentou diferenças significativas nas amplificações.
Além das tentativas de amplificação em DNA genômico, os mesmos “primers” também foram testados em cDNA. Juntamente com esses “primers”, foi utilizado um novo ”primer” direto, o 7F1a, que era utilizado nas reações de seqüenciamento em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b). Esse novo “primer” foi combinado com os reversos 7R2 e 7R4, resultando na amplificação de fragmentos com tamanho esperado de aproximadamente 150pb e 630pb, respectivamente (Figura 7A).
Com este resultado, foi verificado que o problema nas amplificações anteriores era devido à falta de especificidade do ‘primer’ direto 7F1. Mas, apesar de ocorrer a amplificação dos fragmentos de tamanho esperado, o produto da reação com o par 7F1a/7R2 era muito pequeno, o que dificultava o seqüenciamento, e a reação com o par 7F1a/7R4 apresentou fragmentos inespecíficos.
Após várias tentativas frustradas de eliminar todos os fragmentos inespecíficos dessa reação de PCR aumentando a temperatura de hibridização dos “primers”, foi realizada uma diminuição da temperatura de hibridização (50° C), fazendo com que aumentasse a intensidade da banda desejada, resultando em uma maior quantidade de produto de PCR disponível para o seqüenciamento. No entanto, esse procedimento também fez aumentar a intensidade das bandas inespecíficas. Os produtos de várias reações de PCR da mesma amostra foram então reunidos e submetidos à eletroforese em gel de agarose. Em seguida, o fragmento específico foi extraído e purificado do gel para o seqüenciamento direto (Figura 7B).
Figura 7. (A) Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos de amplificação em C. hominivorax com os pares de ‘primers’ 7F1a/7R2 (colunas 1 e 2) e 7F1a/7R4 (colunas 3 e 4). ‘L’ representa o padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen), com os tamanhos em pares de base (pb) de alguns fragmentos. (B) Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos de amplificação com o par de ‘primers’ 7F1a/7R4 em L. cuprina (coluna 1) e C. hominivorax (colunas 2 e 3). Os fragmentos que foram recortados e purificados do gel estão indicados com a seta. ‘L’-1 Kb DNA Ladder (Invitrogen).
Após o seqüenciamento desse fragmento amplificado pelo par 7F1a/7R4, foi sintetizado um “primer” reverso baseado na seqüência de C. hominivorax, com o intuito de tornar a amplificação específica. Esse novo “primer” reverso específico para esta espécie, denominado 7R3a, foi utilizado nas reações de amplificação juntamente com o “primer” direto 7F1a. A reação amplificou um fragmento específico de aproximadamente 530pb, o qual continha as duas mutações (Gly137/Asp e Trp251/Leu), possivelmente associadas à resistência a inseticidas OPs em C. hominivorax (Figura 8).
Figura 8. Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos de amplificação em L. cuprina (coluna 1) e
Análise das seqüências
A primeira seqüência obtida foi a partir do fragmento amplificado pelo par de ‘primers’ 7F1a/7R4, utilizando cDNA como molde. O fragmento, após ser recortado do gel, foi purificado e clonado em vetor plasmidial para a realização do seqüenciamento. A região codificante amplificada apresentou 630pb, correspondendo às posições 359-990 da seqüência nucleotídica do LcαE7 em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b). A partir dessa seqüência, foi construído um “primer” reverso específico para C. hominivorax, o 7R3a (Figura 6).
Juntamente com o “primer” direto 7F1a, esse novo “primer” reverso amplificou, em DNA genômico, um fragmento de aproximadamente 530pb. Uma vez que a amplificação foi específica, foi possível realizar o seqüenciamento direto do produto de PCR. Para o seqüenciamento direto foi utilizado o “primer” reverso 7R3a. A região codificante amplificada corresponde às posições 359-831 da seqüência nucleotídica do LcαE7 em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b), e inclui as posições dos aminoácidos (137 e 251) relacionadas à resistência a OPs (Figura 9). A região do intron inserida no fragmento amplificado compreende 63pb e sua posição (nt 511) corresponde exatamente à posição do intron III reportada para os genes ortólogos α7 em L. cuprina e M. domestica, que possuem 56pb e 62pb, respectivamente (Newcomb et al., 1997b; Claudianos et al., 1999).
Assim como nos genes LcαE7 (L. cuprina), DmαE7 (D. melanogaster) e MdαE7 (M. domestica), a região ortóloga em C. hominivorax (ChαE7) contém domínios que são altamente conservados entre as carboxil/colinesterases e contribuem para o mecanismo catalítico do sítio ativo. Um desses domínios, o “nucleophilic elbow” (VFGESAG, resíduos 214-220 em ChαE7), o qual contém um dos resíduos da tríade catalítica (S218, E351, H471; Cygler et al., 1993), é conservado entre todas carboxil/colinesterases.
As seqüências codificantes (536pb) dos alelos selvagens de C. hominivorax apresentaram alta similaridade (84,5%) nucleotídica com L. cuprina (U56636 - GenBank). Três possíveis genótipos (selvagem homozigoto, mutante homozigoto e heterozigoto) foram encontrados entre as seqüências de C. hominivorax analisadas. As seqüências codificantes de C. hominivorax apresentaram 97,9% de similaridade entre elas.
A seqüência de aminoácidos predita apresentou 88,5% de identidade com os resíduos equivalentes da E3 de L. cuprina. A comparação da seqüência da carboxilesterase E3 de L. cuprina com a estrutura terciária resolvida da acetilcolinesterase da arraia Torpedo californica, a única enzima da família das carboxil/colinesterases resolvidas até naquele momento, possibilitou inferir a
posição do sítio ativo da E3 (Sussman et al., 1991). Analisando os domínios conservados que contribuem para o mecanismo catalítico da enzima, a única substituição relevante para a função da enzima foi a Gly137/Asp.
O códon GGG nas posições 409-411 dos alelos considerados selvagens da seqüência nucleotídica de C. hominivorax traduz o aminoácido glicina (Gly137). A mutação desta Gly137 para o resíduo ácido aspártico (Asp137) foi observada em alguns alelos de C. hominivorax, os quais continham o códon GAC na região correspondente. Esta substituição de aminoácido, que está associada com resistência a OPs em L. cuprina e M. domestica, ocorreu em um dos resíduos conservados que constitui o domínio conhecido como “oxyanion hole” (G136, G137, A219) e é predito de estar inserido no centro catalítico das enzimas carboxil/colinesterases (Claudianos et al., 1999).
Os alelos que continham a Gly137 apresentaram uma outra mutação, a substituição do códon TGG, que traduz o Trp251, pelo códon TCG, que traduz o aminoácido serina (Ser251). Além dessas mutações, sete substituições de nucleotídeos e uma substituição de aminoácido foram observadas entre as seqüências de C. hominivorax (Figura 9).
Figura 9. Alinhamento das seqüências de nucleotídeos dos 3 tipos de alelos ChαE7 de C. hominivorax
encontrados e de um indivíduo heterozigoto (GenBank: DQ266357 ao DQ266360, respectivamente), juntamente com parte da seqüência do LcαE7 de L. cuprina (U56636). ‘wild’: genótipo selvagem (Gly137);
‘mut1’ e ‘mut2’: mutantes (Asp137); ‘het’: heterozigoto. R = A/G, S = C/G, W = A/T, Y = C/T. A posição do
intron III (<>3 na figura) foi determinada por comparação com a seqüência de cDNA de L. cuprina. Os códons
A mutagênese sítio dirigida da butyrylcolinesterase humana (BuChE) mostrou que uma mutação Gly/His no aminoácido correspondente à Gly137 da enzima de L. cuprina também confere a atividade OP hidrolase (Lockridge et al., 1997). Assim como na mutante BuChE humana, a substituição Gly/Asp na esterase E3 pode mudar a estrutura do centro catalítico, resultando na perda da atividade da carboxilesterase e aquisição da atividade OP hidrolase.
Além da mutação Gly137/Asp, a segunda mutação envolvida em resistência a OPs em L. cuprina foi identificada nas seqüências de C. hominivorax. Esta segunda mutação, conhecida como “malation resistente” (Smyth et al., 2000), confere uma resistência maior aos dimetil OPs, enquanto que a mutação Gly137/Asp, conhecida como “diazinon resistente”, é considerada um tipo geral de resistência aos OPs (Hughes et al., 1987; Price, 1991). O resíduo Trp251, predito de estar próximo aos resíduos catalíticos, foi substituído pela serina (Trp251/Ser) em C. hominivorax, enquanto que nas linhagens “malation resistentes” de L. cuprina ele foi substituído pela leucina (Trp251/Leu) (Smyth et al., 2000). No entanto, Taskin et al. (2004) encontraram a substituição Trp251/Ser nas linhagens “malation resistentes” de M. domestica, sugerindo que a substituição do grande resíduo hidrofóbico triptofano (Trp) por um resíduo menor tal como glicina (Gly), serina (Ser) ou leucina (Leu) pode aumentar a hidrólise de malation pelas α-esterases. Um estudo recente (Heidari et al., 2005) comprovou tal fato e sugeriu que a mutação do Trp251 pode também estar envolvida na resistência a piretróides (outro princípio ativo usado no controle da C. hominivorax) e pode ser a base da resistência cruzada entre OPs e piretróides.
Os alelos de C. hominivorax que continham a mutação Gly137/Asp não apresentaram a substituição Trp251/Ser, como em estudos prévios em L. cuprina, que indicaram uma forte associação negativa entre resistência ao diazinon (dietil OP) e ao malation (dimetil OP; Smyth et al., 2000). Isso parcialmente reflete o fato de que as duas mutações que conferem resistência estão somente 400pb de distância, o que reduz as chances de criar um duplo mutante por recombinação (Newcomb et al., 2005). No entanto, mesmo que um alelo contenha o Asp137 e Leu ou Ser251 juntos, é improvável que ele confira resistência a ambos OPs, porque a resistência ao malation pela E3 requer a manutenção da atividade carboxilesterase, enquanto que a mutação Gly137/Asp abole esta atividade (Campbell et al., 1998). Porém, há a possibilidade do desenvolvimento da dupla resistência através da duplicação gênica, como foi verificado em L. cuprina (Newcomb et al., 2005).
espécies de dípteros. Apesar dos inseticidas OPs serem usados há décadas no controle de C. hominivorax no Brasil, nenhuma caracterização molecular de uma possível resistência havia sido realizada. Dessa forma, essa recém descoberta levanta a questão de que há uma grande probabilidade de que os mesmos mecanismos de resistência a OP adquiridos por L. cuprina e M. domestica tenham evoluído em C. hominivorax.
Uma vez verificada a presença dessas mutações relacionadas com resistência a inseticidas OPs na esterase E3 de C. hominivorax, o estudo da genética de resistência nessa espécie continuou a ser realizado de forma a caracterizar toda a região codificante da esterase e verificar a associação da principal mutação (Gly137/Asp) com a resistência. Como forma de obter uma rápida identificação de indivíduos de C. hominivorax que apresentassem ou não a mutação Gly137/Asp, foi desenvolvido um diagnóstico molecular rápido e eficiente da presença/ausência dessa mutação, que será descrito no capítulo 2.
