Verificação da possível associação do alelo mutante com resistência ao

VERIFICAÇÃO DA POSSÍVEL ASSOCIAÇÃO DO ALELO MUTANTE COM RESISTÊNCIA A INSETICIDA ORGANOFOSFORADOS

Uma vez que toda a região codificante do gene da E3 já havia sido caracterizada, incluindo as mutações relacionadas com a resistência a inseticidas OP, foi realizado um bioensaio que, embora ainda preliminar, teve o objetivo de verificar a associação da principal mutação (Gly137/Asp) com a resistência a inseticida OP em C. hominivorax.

METODOLOGIA DETALHADA

Amostras de C. hominivorax

As amostras de C. hominivorax no estágio larval foram coletadas em Estiva – MG em fevereiro de 2006, diretamente de feridas de animais infestados, e mantidas na criação do Laboratório de Genética Animal por diversas gerações, como descrito por Infante e Azeredo-Espin (1995). As larvas utilizadas na infestação artificial das feridas para realização do bioensaio pertenciam à geração F11 da população coletada em Estiva – MG. No primeiro dia após a eclosão (primeiro estágio larval = L1), estas larvas foram transferidas em meios contendo carne moída e sangue até o local onde o bioensaio foi realizado e utilizadas na infestação artificial ainda no mesmo dia.

Bioensaio com inseticida OP

O bioensaio foi realizado em setembro de 2006 na Fazenda da FMU (Faculdades Metropolitanas Unidas), localizada no município de Cabreúva – SP, que nos cedeu toda a infra- estrutura necessária, além dos animais utilizados no experimento e do suporte técnico veterinário pelo Dr. Gustavo Sabatini. O experimento foi aprovado pela Comissão de Ética e Experimentação Animal (CEEA) da FMU, protocolo número 001/pp/2007 – CEEA.

Vinte vacas da raça nelore foram utilizadas no experimento. Foram realizadas duas incisões em formato elíptico, com aproximadamente 5cm de extensão, em cada quarto traseiro (anca) do animal. Antes da incisão, foram aplicados 5mL de anestésico (cloridrato de lidocaína) nos locais onde seriam realizadas as incisões. As larvas de C. hominivorax de primeiro estágio (L1) foram

colocadas em cada incisão. As vacas foram liberadas para o pasto e, após 6 dias, recolhidas para a coleta das larvas (Figura 16).

Figura 16. Vista posterior de um bovino contendo as incisões laterais, conforme indicado pelas as setas. A incisão do lado direito apresentou infestação, enquanto que a da esquerda ocorreu a cicatrização.

Das 20 vacas que foram infestadas artificialmente, 10 apresentaram a infestação, sendo uma ferida por animal. Cada ferida foi tratada individualmente com a aplicação tópica local de um inseticida a base de dois compostos organofosforados, chlorfenvinphos (0,34%) e dichlorvos (0,51%). A aplicação foi realizada com tubo aerosol a uma distância de aproximadamente 10cm da lesão, por 5 segundos (que corresponde a 3mL do produto), de acordo com as recomendações do fabricante. Após a aplicação, as vacas foram liberadas do tronco de contenção e, após 20 minutos, foram presas novamente para a coleta das larvas.

Das 10 feridas, foi coletado um total de 338 larvas (L3). Destas, 295 estavam mortas, e 43 estavam vivas. As larvas que foram classificadas como vivas apresentaram movimentação normal após serem colocadas em uma placa de Petri. Todas as larvas foram fixadas em álcool absoluto e transferidas para o laboratório, onde, em seguida, foi realizada a extração do DNA genômico.

DNA genômico

A extração do DNA total dos indivíduos de C. hominivorax foi realizada como descrito por Azeredo-Espin (1993), descrita detalhadamente no Capítulo 1.

Identificação dos genótipos por PCR-RFLP

Foi realizada a genotipagem de 30 indivíduos da geração parental (F10) das larvas utilizadas no bioensaio com o intuito de verificar a presença das 3 classes genotípicas (Asp/Asp, Asp/Gly e Gly/Gly) e analisar a freqüência desses genótipos nessa população. Das 43 larvas sobreviventes coletadas das feridas do bioensaio, 41 foram genotipadas para a presença da mutação Gly137/Asp. E das 295 larvas mortas, foi analisada uma amostra de 40 indivíduos.

A amplificação do fragmento contendo a mutação Gly137/Asp e a reação de digestão com a endonuclease Tsp45I estão descritas detalhadamente no Capítulo 3. A reação de digestão acontece a uma temperatura de 65° C por 60 minutos, e a visualização das bandas é feita através de eletroforese em gel de agarose (2%) corado com brometo de etídeo e, em seguida, visualizadas em transiluminador UV.

Análise da freqüência dos genótipos

Foi realizada uma comparação da taxa de sobrevivência ao bioensaio com inseticida entre as diferentes classes genotípicas: Asp/Asp, Asp/Gly e Gly/Gly. A significância dos dados foi obtida através do teste exato de Fisher, ao testar a hipótese nula, na qual as linhas e colunas são independentes (Sokal and Rohlf, 1995), obtido no seguinte endereço eletrônico: http:///www.physics.csbsju.edu.

Além desta análise, foi realizada também uma comparação das freqüências dos genótipos entre a geração parental (F10) e as larvas que sobreviveram ao bioensaio. A significância dos dados foi obtida através do teste do χ2 _{(Sokal and Rohlf, 1995).}

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Bioensaio

O bioensaio com os inseticidas OPs, embora tenha sido uma abordagem preliminar, foi realizado com o intuito de verificar a associação da mutação Gly137/Asp com a resistência a esta classe de inseticida, analisando as diferentes taxas de sobrevivência entre as 3 classes genotípicas: Asp/Asp, Asp/Gly e Gly/Gly. O objetivo inicial era genotipar todos os indivíduos sobreviventes para a posição 137 da esterase E3, a fim de identificar a possível mutação. No entanto, não foi possível obter de todos os 43 indivíduos sobreviventes, DNA com qualidade suficiente para realização da

amplificação do fragmento por PCR. Sendo assim, foram genotipadas 41 das 43 larvas que sobreviveram ao bioensaio.

Das 295 larvas que foram coletadas mortas, estas pertenciam a 9 feridas diferentes. Uma vez que era inviável genotipar todas as larvas devido ao tempo e ao custo do material utilizado nesse processo, uma amostragem dessa população foi analisada. Foram coletadas ao acaso 40 larvas desse grupo, representando todas as feridas, e em seguidas, genotipadas.

Análises das freqüências dos genótipos

Ao fazer uma comparação na taxa de sobrevivência entre as diferentes classes genotípicas pelo teste exato de Fisher, foi verificado que houve uma diferença significativa de sobrevivência entre as diferentes classes (Tabela 3). Assumindo independência da sobrevivência e dos genótipos, a probabilidade de obter os resultados deste experimento seria de 0,7% (p= 0,007). Baseado neste resultado, foi rejeitada a hipótese nula da independência e concluiu-se que a diferença na sobrevivência está relacionada com o genótipo do indivíduo. Dessa forma, foi realizada uma outra análise com o objetivo de investigar qual genótipo estava sendo favorecido em um ambiente cuja pressão de seleção consistia na aplicação de inseticida.

Tabela 3. Comparação da taxa de sobrevivência entre os diferentes genótipos.

Genótipo Sobreviventes Mortas TOTAL

Asp/Asp 28 19 47

Asp/Gly 8 20 28

Gly/Gly 5 1 6

TOTAL 41 40 81

Uma vez que não foi analisada a freqüência dos genótipos dessa população antes da aplicação do inseticida, foi realizada uma comparação entre a freqüência dos genótipos da geração parental e das larvas sobreviventes (Tabela 4). Através dos resultados dessa comparação (χ2_{= 9,35;}

p= 0,009), nós rejeitamos a hipótese nula de que as freqüências dos genótipos são independentes do ambiente com inseticida. Isso sugere uma associação entre a mutação Gly137/Asp e a resistência ao inseticida.

Tabela 4. Comparação da freqüência dos genótipos entre a geração parental e as larvas sobreviventes. Genótipo Parental (sem inseticida) Sobreviventes ao inseticida TOTAL Asp/Asp 10 28 38 Asp/Gly 9 8 17 Gly/Gly 11 5 16 TOTAL 30 41 71

No entanto, é necessário que se façam algumas ressalvas com relação ao bioensaio, uma vez que este foi um teste preliminar e apresentou algumas particularidades. A primeira delas foi a não identificação da freqüência dos genótipos na população das feridas em um momento anterior à aplicação do inseticida. Com isso, houve a necessidade de realizar a comparação da freqüência dos genótipos das larvas sobreviventes com a da geração parental. Isso pode incorrer em um certo erro, uma vez que a população que foi levada do laboratório, altamente endocruzada, pode ter sofrido a atuação da seleção natural antes da aplicação do inseticida. Além disso, pode ter ocorrido infestação natural de moscas da região, uma vez que não houve vistoria destas feridas nos dias de realização do experimento.

Outra questão a ser considerada neste bioensaio é de que as vacas, após a aplicação do inseticida, foram liberadas no curral e recolhidas novamente após alguns minutos. Nesse momento entre a aplicação do inseticida e da coleta das larvas, pode ter ocorrido uma evasão das larvas das feridas devido à presença do inseticida. Uma vez que o organofosforado atua inibindo a acetilcolinesterase provocando um excesso de acetilcolina na transmissão sináptica, as larvas podem ficar injuriadas e cair da ferida. Desta maneira, pode haver um desvio nas freqüências dos genótipos das larvas coletadas. Sendo assim, é importante a realização de novos bioensaios com algumas novas condições, como a genotipagem dos indivíduos antes da aplicação do inseticida e cobertura da ferida após a aplicação do inseticida impedindo a evasão de larvas, para que concretize a associação da mutação Gly137/Asp com a resistência aos inseticidas OP.

Apesar de ter sido um teste preliminar e com algumas ressalvas já apontadas, o bioensaio realizado com o inseticida OP em C. hominivorax sugere uma associação da mutação Gly137/Asp com a resistência nesta espécie, associação esta que já foi confirmada bioquimicamente na espécie L. cuprina (Newcomb et al., 1997a), e encontrada em linhagens resistentes a OP de M. domestica

(Claudianos et al., 1999). Uma evidência de que tal mecanismo de resistência possa ter evoluído em C. hominivorax é o fato de que as mesmas mutações de aminoácidos foram independentemente selecionadas nos genes ortólogos de L. cuprina, L. sericata e M. domestica.

A utilização desse método de identificação de indivíduos de C. hominivorax mutantes será de grande importância no estudo e manejo da resistência a inseticidas, permitindo uma estimativa da freqüência gênica nas populações naturais de C. hominivorax. Esse monitoramento proverá importantes informações para os pecuaristas e empresas especializadas na fabricação de inseticidas, quanto ao princípio ativo apropriado para determinada região e para a implementação de programas mais efetivos de controle dessa praga que causa significativos prejuízos à pecuária nacional.

CONCLUSÕES GERAIS

Resistência e valor adaptativo

Diversas questões tornam a investigação sobre os mecanismos da resistência genética a inseticidas atrativa como modelo de evolução molecular, como a velocidade do surgimento da resistência, o envolvimento de genes principais (“major genes”) e a identificação das mutações neles inseridas que conferem tal mecanismo (Newcomb et al., 2005). Embora muito importante, várias dúvidas ainda persistem em relação à origem da mutação que confere a resistência. Não se sabe ao certo se ocorrem múltiplas origens de um mecanismo genético em particular ou se a resistência se dispersa entre as populações a partir de um único evento mutacional. A dificuldade em esclarecer a origem é que a resposta dessa questão depende de vários parâmetros pouco elucidados como as taxas relativas de mutação para a resistência, os custos relativos do genótipo resistente e aspectos da dinâmica populacional da espécie em estudo, particularmente em relação ao fluxo gênico (Roush and Daly, 1990).

O seqüenciamento de toda a região codificante da esterase E3 em C. hominivorax permitiu a caracterização da mesma, possibilitando a identificação de mutações já associadas à resistência a inseticidas organofosforados em outras espécies de dípteros. Essas mutações foram encontradas nas mesmas posições (Gly137 e Trp251) descritas para Lucilia sericata e L. cuprina (Calliphoridae) e M. domestica (Muscidae; Hartley et al., 2006; Claudianos et al., 1999). A mutação Gly137/Asp foi

encontrada em todas estas espécies, incluindo a C. hominivorax. Já o Trp251 foi substituído pela Leu251 em L. cuprina, e pela Ser251 em L. sericata, M. domestica e C. hominivorax.

Essas descobertas são consistentes com os resultados de Heidari et al. (2005), que analisaram uma série de mutantes in vitro através de mutações sítio-dirigidas nas posições 137 e 251 da esterase E3 de L. cuprina. Na posição 137, nenhum outro aminoácido apresentou níveis equivalentes de atividade OP hidrolase como o do ácido aspártico (Asp). Já na posição 251, a substituição do triptofano (Trp) por leucina (Leu), serina (Ser), glicina (Gly), treonina (Thr) ou alanina (Ala) conferiu atividade OP hidrolase à enzima. O fato de dietil e dimetil OPs selecionarem independentemente mutações idênticas de aminoácidos em membros ortólogos de uma grande família de genes constitui evidência para uma evolução convergente bioquimicamente precisa e sugere que as opções genéticas para a resistência metabólica mediada por esterases são muito restritas (Claudianos et al., 1999).

Hartley et al. (2006) analisaram seqüências de parte do gene da esterase E3 (153pb) de indivíduos de L. cuprina coletados antes do início da utilização de inseticidas OP. Nenhum dos indivíduos apresentou a mutação Gly137/Asp. No entanto, 4 de 21 indivíduos analisados revelaram a substituição do resíduo Trp251 (2 por Ser, e 2 por Thr), o que pode explicar a rápida aquisição da resistência a OP detectada nesta espécie na Austrália após a aplicação destes compostos. Embora o diazinon (dietil OP) tenha sido o mais usado no controle da L. cuprina, a mutação do Trp251 (resistência ao malathion) também confere alguma resistência aos dietil OP. Desta forma, foi verificado que as populações de L. cuprina estavam pré-adaptadas com mutações conferindo níveis relativamente baixos de resistência ao diazinon, e que os alelos estão agora sendo selecionados para uma forma mais efetiva de resistência. Tal descoberta não é puramente de interesse acadêmico. Caso a resistência genética seja anterior à introdução de um inseticida, então a freqüência da resistência após a introdução de um princípio ativo pode ser muito maior do que o esperado. Se tais polimorfismos estão presentes em alta freqüência antes do uso do inseticida, então eles são provavelmente polimorfismos balanceados, ou seja, a seleção contra e a favor é igual, e o polimorfismo é mantido (ffrench-Constant, 2007).

É interessante ressaltar que algumas mutações relacionadas com resistência a inseticidas podem ocasionar uma redução no valor adaptativo dos indivíduos em um ambiente sem inseticida. Dessa forma, parece estar claro que as mutações que conferem resistência ao malation (Trp251) retêm bastante da atividade carboxilesterase vista nas formas suscetíveis, degradando substratos

carboxilésteres, enquanto que a mutação Gly137/Asp abole esta atividade. Além disso, está bem evidenciado um custo no valor adaptativo associado à mutação Gly137/Asp em L. cuprina (Mckenzie et al., 1982; Mckenzie, 1993; Mckenzie and O’Farrel, 1993; Davies et al., 1996; Clarke et al., 2000), mas nenhum custo foi documentado para as mutações associadas com a resistência ao malation.

Os efeitos pleiotrópicos negativos causados pelas mutações podem ser reduzidos pela seleção natural por duas maneiras. A primeira delas é a substituição do alelo, na qual uma mutação com menor efeito pleiotrópico deletério substitui a mutação anterior e atinge a fixação. A segunda delas envolve a seleção de um ou mais genes que modificam ou compensam a redução do valor adaptativo (Guilemaud et al., 1998), que foi o caso encontrado em L. cuprina, na qual a introdução do alelo resistente no genoma dessa espécie resulta em uma alteração no desenvolvimento.

Os genes modificadores do valor adaptativo podem oferecer uma vantagem somente na presença do alelo resistente. Assim, a seleção para estes genes deve ser bem fraca até os alelos resistentes atingirem alta freqüência. Na maioria dos casos, o inseticida é substituído quando a resistência aparece. No entanto, o diazinon (dietil OP) continuou a ser usado no tratamento contra L. cuprina apesar da detecção resistência. Então, o alelo resistente foi mantido em altíssima freqüência pelo uso continuo do diazinon por mais de 10 anos após a primeira detecção da resistência (Mckenzie et al., 1982).

De forma semelhante ao que aconteceu em L. cuprina, não podemos descartar a possibilidade da existência da redução do valor adaptativo relativo nos indivíduos mutantes em C. hominivorax. E da mesma forma, é possível também que um gene amenizador deste efeito tenha sido selecionado em C. hominivorax, uma vez que a utilização dos inseticidas OP para o controle dessa praga no Brasil está ocorrendo há muitos anos. A caracterização do gene da esterase E3 e a verificação da associação da mutação Gly137/Asp com a resistência a um inseticida OP nesta espécie possibilitará estudos futuros envolvendo a investigação de redução do valor adaptativo provocado pelos alelos mutantes.

Dois métodos têm sido usados para medir as desvantagens adaptativas que resultam da resistência. Uma delas é medir os componentes do valor adaptativo, como fecundidade, tempo de desenvolvimento, fertilidade e competitividade no acasalamento para cada genótipo. O outro método é seguir as mudanças nas freqüências genotípicas em uma população por um certo número de gerações. Este último é preferível devido a maior facilidade em relação ao primeiro, e pelo fato de

A evolução da resistência aos inseticidas organofosforados em L. cuprina indica que a adaptação e a biologia do desenvolvimento estão intimamente ligadas, ao mostrar que as mudanças que respondem a um agente seletivo podem ter efeitos pleiotrópicos influenciando o desenvolvimento e o fenótipo do indivíduo. No caso da L. cuprina, e possivelmente da C. hominivorax, há a possibilidade das enzimas carboxilesterases participarem nas interações entre as células na diferenciação das cerdas (Lauder, 1993).

Uma estratégia de manejo da resistência freqüentemente adotada consiste em alternar inseticidas com diferentes princípios ativos e, conseqüentemente, diferentes modos de ação. Essa estratégia é baseada no pressuposto de que a freqüência da resistência de cada composto decline rapidamente na ausência do mesmo, devido à diluição da resistência por imigração de indivíduos suscetíveis (fluxo gênico) ou devido à seleção natural contra os indivíduos que possuem o alelo resistente (Georghiou, 1983). No entanto, a menos que o fluxo de suscetíveis seja unidirecional, o que é improvável, a permanente ausência de resistência dependeria da seleção natural contra os indivíduos que possuem o alelo que confere resistência (RR = homozigoto para o alelo resistente, ou RS = heterozigoto). Para tanto, os genótipos resistentes devem possuir alguma desvantagem na ausência de inseticidas. Sendo assim, é importante determinar se tal desvantagem seletiva é suficiente para se tornar relevante nas questões práticas de manejo da resistência, visando retardar ou minimizar a evolução da mesma (Roush and Mckenzie, 1987).

Resistência monogênica X poligênica

A resistência a inseticidas pode ser conferida por diversos mecanismos tais como redução da penetração do inseticida, comportamento de fuga, insensibilidade do sítio alvo e desintoxicação do inseticida (Mckenzie and Batterham, 1994). Desta maneira, é importante lembrar que a resistência a inseticidas pode ser afetada por muitos genes, mas que a distribuição dos efeitos através dos locos não é uniforme.

Em alguns casos, um ou poucos genes podem contribuir para a maior parte da resistência. Nestes casos, uma vez que esse loco seja localizado e compreendido, torna-se possível elucidar os mecanismos da resistência e, conseqüentemente, retardar o processo de evolução da resistência (Groeters and Tabashnik, 2000). Devido às implicações diretas no controle da C. hominivorax no Brasil, torna-se de fundamental importância a investigação do mecanismo de resistência

monogênica (esterase E3) para esta espécie, mecanismo este que já foi caracterizado em populações de L. cuprina e M. domestica resistentes a OPs.

Enquanto a resistência poligênica tende a ser dependente da população ou linhagem, as respostas monogênicas envolvem mudanças de freqüências gênicas no mesmo loco em diferentes populações e alterações bioquímicas similares aos mesmos pesticidas são observadas em diferentes espécies (Plapp, 1986; Russel et al., 1990), como já foi verificado em C. hominivorax, L. sericata e L. cuprina (Calliphoridae) e M. domestica (Muscidae). Um fator importante a ser agregado à resistência monogênica é o fato dela ser mais provável de se dispersar do que a resistência poligênica. Se um indivíduo com resistência poligênica migra para uma população suscetível, é provável que os alelos resistentes se diluam caso a população não seja tratada com inseticida por algumas gerações. Já quando um indivíduo com resistência monogênica (especialmente não recessiva) migra para uma população suscetível, é mais provável de deixar alguns descendentes resistentes, mesmo após algumas gerações não tratadas (Roush and Mckenzie, 1987).

Baseado neste cenário, é de fundamental importância o entendimento dos mecanismos moleculares relacionados com a resistência a inseticidas e a elucidação dos processos evolutivos pelos quais a resistência é adquirida. Independente das estruturas químicas, dos seus modos de ação ou métodos de aplicação, é certo que os inseticidas utilizados atualmente, e os que estão em desenvolvimento, serão selecionados para resistência em populações de insetos, e que a resistência estará, em muitos dos casos, envolvida com sistemas metabólicos enzimáticos (Li et al., 2007). Desta maneira, é um desafio contínuo utilizar o conhecimento adquirido sobre mecanismos moleculares de resistência metabólica na elaboração e implementação de programas sustentáveis de controle.

Referências

ABIEC (2006). Associação Brasileira das Indústrias Exportadoras de Carne.

Altschul, S. F., Maden, T. L., Schäffer, A. A., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D. J. (1997). Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein data base search programs. Nucleic Acids Research. 25, 3389-3402.

Azeredo-Espin, A. M. L. (1993). Mitochondrial DNA variability in geographic populations of screwworm fly from Brazil. Int. Atomic Energy Agency, 327: 161-165.

Baumhover, A. H. (2002). A personal account of developing the sterile insect technique to eradicate the screwworm from Curacao, Florida and the Southeastern United States. Florida Entomology 85(4): 666-673.

Bigley, W. S., Plapp, F. W. Jr. (1960). Cholinesterase and ali-esterase in organophosphorus susceptible and resistant house flies. Annals of the Entomologic Society of America 53, 360-364.

Bowman, D. D. (2006). Successful and currently ongoing parasite eradication programs.