PARTE II CARACTERIZAÇÃO DO GENE DA ESTERASE-3
CAPÍTULO 3 Caracterização da região codificante da esterase E3
CARACTERIZAÇÃO DA REGIÃO CODIFICANTE DA ESTERASE E3
Embora a região que contém as duas mutações conhecidas por conferir a resistências aos inseticidas OP já tenha sido caracterizada, o seqüenciamento de toda a região codificante da enzima E3 é muito importante para a caracterização do gene. Além de ser pioneira para esta espécie, a caracterização da seqüência completa do cDNA do ChαE7 possibilitará a comparação com os genes ortólogos já seqüenciados em outras espécies e poderá revelar novas mutações relacionadas com a resistência a inseticidas.
METODOLOGIA DETALHADA
Amostras de C. hominivorax
As amostras frescas de C. hominivorax no estágio larval foram coletadas em Caiapônia - GO e Doverlândia - GO, diretamente de feridas de animais, e mantidas até a fase adulta na criação do Laboratório de Genética Animal, como descrito por Infante e Azeredo-Espin (1995). Alguns indivíduos da criação foram obtidos na fase de pupa, sendo mantidos a –70° C até o momento da extração do RNA.
Síntese do cDNA
O RNA total foi extraído separadamente de 5 pupas e 15 adultos de C. hominivorax, utilizando Trizol (Invitrogen), descrito detalhadamente no Capítulo 1. A construção do cDNA foi realizada utilizando o kit “ImProm-IITM Reverse Transcription System” (Promega). A primeira etapa
consistiu em misturar 1µg de RNA total, 0,5µg de oligodT18VN (5’ - TTT TTT TTT TTT TTT TTT
VN – 3’) e água para um volume final de 5µL. O tubo foi colocado a 70° C por 5 minutos e imediatamente transferido para o gelo por mais 5 minutos. Em seguida, em outro tubo foi misturado 4µL do ‘ImProm-IITM 5X Reaction Buffer’, 2,4µL de MgCl2 25mM, 1µL de dNTP mix 10mM, 0,5µL de
“Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor” (40U/µL), 1µL de “ImProm-IITM Reverse Transcriptase”
e água até completar 15µL. Esse último volume foi misturado aos 5µL iniciais resultando em um volume de 20µL, o qual foi submetido a 25°C por 5 minutos, 42° C por 60 minutos e 70° C por 15
minutos, consecutivamente. Após a síntese da primeira fita de cDNA, este foi submetido a um tratamento com 1µL “RNAse H” (2U/µL) a 37° C por 30 minutos e, em seguida, 70° C por 15 minutos.
Amplificação
Para a amplificação dos fragmentos de cDNA foi utilizada a “Taq DNA Polimerase” e as condições iniciais de amplificação utilizadas em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b) e, a partir delas, padronizadas variando a temperatura de hibridização dos “primers”, concentrações de DNA molde e MgCl2, e concentração da enzima.
As reações de PCR foram realizadas para um volume final de 15µl utilizando o termociclador “Perkin Elmer GenAmp PCR System 9.600”. Os “primers” utilizados foram os seguintes: 7F1a, previamente construído para L. cuprina; 7R3a, específico para C. hominivorax; o “primer” direto degenerado 7F4a, construído com base nas seqüências de C. hominivorax obtidas com o par 7F1a/7R4; o “primer” direto degenerado E3F e o reverso 7R7, ambos construídos com base no alinhamento múltiplo das seqüências de L. cuprina, H. irritans, D. melanogaster e M. domestica; e o oligodT18VN (Tabela 2; Figura 12).
Tabela 2. “Primers” utilizados na amplificação da região codificante da E3 com suas respectivas
seqüências. Em vermelho, ‘primers’ construídos para C. hominivorax neste estudo.
“Primer” Seqüência (5’ – 3’)
E3F 5’ - ATG AAT TTC AAI GTY AGY YWI ITG GAG - 3’
7F1a 5’ - AGC TAA ATC CCG AAA CTA AAC - 3’
7R3a 5’ - ATC CTT ATC ATT ATT TTC ACC C - 3’
7F4a 5’- CTG TKG ARC CNT ATC AGA C - 3’
7R7 5’ - TTG GTT ACA CTC TAA AAT AAA TC - 3’
OligodT18VN 5’ - TTT TTT TTT TTT TTT TTT VN - 3’
As condições de amplificação para os diferentes pares de “primers” foram as mesmas, com exceção da temperatura de hibridização, que variou entre 50° e 52°C. As concentrações finais
200µM de cada dNTP, 1.8mM de MgCl2,1µM de cada ‘primer’ e 1µL de amostra de DNA
preparadas como descrito anteriormente. Estas reações foram submetidas a uma etapa inicial de desnaturação a 96°C por 3 minutos (1 ciclo), seguida de 35 ciclos de 95°C por 1minuto, 52°C por 1 minuto e 72° C por 2 minutos. Um passo prolongado de extensão de 72° C por 10 minutos foi adicionado após o último ciclo.
Figura 12. Esquema do cDNA de L. cuprina, mostrando a posição das mutações Gly137/Asp (em verde) e Trp251/Leu (em amarelo). I, II, III, IV e V representam as posições dos introns em L. cuprina (Newcomb
et al., 1997b). Em vermelho estão os “primers” construídos para a amplificação do fragmento em C. hominivorax neste estudo.
Com o intuito de verificar a integridade do cDNA e a ausência de DNA genômico, o par de “primers” 7F1a/7R3a foi utilizado na reação de amplificação, uma vez que o fragmento genômico amplificado por esse par é maior devido à presença do intron III (63pb).
Foi realizada a tentativa de amplificação do cDNA completo do gene da esterase utilizando o “primer” direto degenerado E3F juntamente com o oligodT18VN. Esse novo “primer” direto foi
utilizado também juntamente com o “primer” reverso 7R3a, cuja eficiência já era conhecida, na amplificação da porção 5’ do cDNA.
Para amplificar a porção 3’ do cDNA, três combinações de ‘”primers” foram utilizadas. Uma delas utilizou o “primer” direto de eficiência já conhecida 7F1a juntamente com o oligodT18VN em um
termociclador “Mastercycler gradient” (Eppendorf), com variação na temperatura de hibridização dos “primers” de 29.9° C a 49,8° C. As outras combinações envolveram a utilização dos “primers” direto 7F1a e 7F4a com o “primer” reverso 7R7, que se hibridiza na extremidade 3’ do gene. Este último “primer” reverso (7R7) foi construído com base no alinhamento das seqüências da porção 3’ dos genes da E3 de L. cuprina, M. domestica e H. irritans. A partir do alinhamento dessas 3 seqüências,
foi observada uma região conservada na região do “stop codon”. Baseado nesta região conservada entre essas três espécies, foi sintetizado o “primer” 7R7 utilizando apenas a seqüência de L. cuprina. Seqüenciamento
Para a realização do seqüenciamento, os fragmentos resultantes da amplificação foram clonados em vetores plasmidiais. A clonagem foi realizada ligando os fragmentos da PCR já purificados pelo “QIAquick PCR Purification kit” (QIAGEN) em vetores utilizando o kit e “pGEM-T Easy Vector System I” (Promega), de acordo com as especificações do fabricante, os quais foram usados para transformar células competentes de E. coli por meio de choque químico. As células foram plaqueadas em meio LB sólido acrescido de ampicilina (50µg/mL) e X-Gal (0,8mg por placa) para posterior identificação das colônias recombinantes. Para a realização do seqüenciamento, o DNA plasmidial foi então isolado através de minipreparação por lise alcalina, como descrito por Sambrook et al.(1989). Para verificação da presença e tamanho do inserto foi realizada digestão do plasmídeo com a endonuclease EcoR I.
As reações de seqüenciamento foram submetidas a uma etapa inicial de desnaturação a 96° C por 1 minuto e meio (1 ciclo), seguida de 35 ciclos de 96° C por 12 segundos, 50° C por 6 segundos e 60° C por 4 minutos. A etapa de purificação da reação foi realizada adicionando-se 80µL de etanol 80% em cada tubo, seguido por um período de incubação de 15 minutos. Em seguida, centrifugou-se por 30 minutos e o sobrenadante foi descartado. Foram adicionados 150µL de etanol 70% e centrifugou-se mais uma vez por 10 minutos, descartando o sobrenadante em seguida. O precipitado de DNA foi então ressuspenso em 3µL TE para a realização do seqüenciamento.
As reações de seqüenciamento foram então purificadas e submetidas ao seqüenciamento automático. Em seguida, foram analisadas no sistema ABI 3.700 (Applied Biosystems).
Análise das seqüências
As seqüências foram verificadas inicialmente através do programa Chromas 2.21 (Technelsium Pty Ltd) e, então, submetidas a buscas por similaridades em bancos de seqüências (GenBank) utilizando o aplicativo BLASTN (Altschul et al., 1997). As análises comparativas entre as seqüências foram realizadas com base nos alinhamentos múltiplos obtidos com o auxílio do
de nucleotídeos foram traduzidas em seqüências de aminoácidos pelo programa “Biological Sequence Alignment Editor” (Hall, 1999), visando à detecção de substituição de aminoácidos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Amplificação do cDNA
Na tentativa de obter a seqüência codificante completa da esterase E3, foi realizada a extração de RNA total de indivíduos frescos de C. hominivorax na fase de pupa e adulta para a posterior síntese do cDNA. A extração do RNA foi realizada com eficiência, apresentando as seguintes concentrações: 37,8µg/µL a partir das moscas adultas e 14,7µg/µL a partir das pupas. A partir do RNA total extraído, foram sintetizadas as primeiras fitas de cDNA utilizando como oligonucleotídeo iniciador o oligodT18VN, que se hibridiza com a cauda poliA dos RNAm e sintetiza a
fita complementar.
Algumas combinações de “primers” foram utilizadas na amplificação do cDNA da esterase E3 para posterior seqüenciamento. O par de “primers” 7F1a/7R3a, utilizado na amplificação em DNA genômico do fragmento (536 pb) com as mutações Gly137/Asp e Trp251/Ser, foi utilizado como controle positivo, amplificando um fragmento de aproximadamente 480 pb (Figura 13A) devido à ausência do intron III no cDNA.
A tentativa de amplificação da região codificante completa da esterase em apenas uma reação utilizando o “primer” direto degenerado E3F, que se hibridiza na extremidade 5’ do gene, juntamente com o oligodT18VN, não amplificou nenhum fragmento.
O par de “primers” E3F/7R3a foi utilizado na amplificação da porção 5’ do cDNA, resultando em um fragmento de aproximadamente 840pb (Figura 13B), o que era esperado de acordo com as seqüências de L. cuprina e M. domestica (Newcomb et al., 1997b; Claudianos et al., 1999). Essa região, que compreende aproximadamente metade da região codificante do gene da esterase (1.700pb), inclui as duas mutações (Gly137/Asp e Trp251/Ser) que possivelmente estão associadas com a resistência a inseticidas OP em C. hominivorax.
Para a amplificação da porção 3’ do cDNA da E3, três combinações de “primers” foram utilizadas. Uma vez que a temperatura de hibridização do ‘primer’ oligodT18VN é extremamente
baixa, por possuir baixíssimo conteúdo de G + C (Innis et al., 1990), a reação de amplificação utilizando o par 7F1a/oligodT18VN foi realizada com gradiente de temperatura de hibridização
A segunda tentativa de amplificação da porção 3’ do cDNA utilizou o par 7F1a/7R7. O fragmento esperado era de aproximadamente 1.350pb. Mas nenhum fragmento foi visualizado no gel de agarose. Dessa forma, o produto dessa reação de PCR foi usado como DNA molde para uma reação seguinte, que utilizou o par 7F4a/7R7 (reação denominada “Semi-Nested PCR”). Essa reação resultou em um fragmento de aproximadamente 750pb (Figura 13C), o que era esperado de acordo com as seqüências de L. cuprina e M. domestica (Newcomb et al., 1997b; Claudianos et al., 1999). Dessa forma, toda a região codificante do gene da esterase E3 foi amplificada, possibilitando o posterior seqüenciamento e caracterização da mesma.
Figura 13. (A) Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos da amplificação em cDNA (coluna 1) e DNA genômico (coluna 2) de C. hominivorax com o par de “primers” 7F1a/7R3a.; (B) Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos da amplificação em cDNA de C. hominivorax com o par de “primers” E3F/7R3a; (C) Análise eletroforética em gel de agarose dos produtos da amplificação em cDNA de C. hominivorax com o par de “primers” 7F4a/7R7. ‘L’ - 1 Kb plus DNA Ladder (Invitrogen), com os tamanhos em pares de base (pb) de alguns fragmentos.
Análise das seqüências
A reação de amplificação da porção 5’ do cDNA utilizando o “primer” degenerado E3F, construído com base no alinhamento das seqüências de L. cuprina, M. domestica, H. irritans e D. melanogaster, juntamente com o “primer” reverso 7R3a, construído especificamente para C. hominivorax, amplificou um fragmento de 831pb, o qual inclui a posição dos aminoácidos (137 e 251) relacionados com resistência aos OP. A região codificante amplificada corresponde às posições 1-831 (Figura 14) da seqüência nucleotídica do LcαE7 em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b). De acordo com o gene da esterase já caracterizado em L. cuprina e M. domestica, na seqüência genômica dessa região amplificada em C. hominivorax estão incluídos 3 introns, sendo que apenas o intron III já foi caracterizado para esta espécie, possuindo 63pb (Carvalho et al., 2006).
Como descrito, a mutação na posição 251, resultando na mudança do aminoácido triptofano (Trp) para serina (Ser), encontrada em alguns alelos selvagens (Gly137) está relacionada com baixo nível de resistência aos dietil OP e grande resistência a uma pequena classe de inseticidas organofosforados (dimetil OP) em L. cuprina (Smyth et al., 2000) e M. domestica (Taskin et al., 2004). No entanto, as duas mutações (137 e 251) nunca foram encontradas juntas no mesmo alelo, devido à pequena distância para que haja recombinação e também devido ao fato de que a resistência ao dimetil OP, como o malation, requer a manutenção da atividade carboxilesterase, enquanto que a mutação Gly137/Asp impede esta atividade (Campbell et al., 1998). No entanto, a resistência aos 2 tipos de OP pode ser adquirida através da duplicação do gene da esterase, cada um possuindo uma das mutações (Newcomb et al., 2005).
A substituição do Trp251 foi encontrada em indivíduos de L. cuprina coletados na Austrália antes do início da utilização de inseticidas OP naquela região (Hartley et al., 2006). Uma vez que ainda não foi documentado nenhum custo ao valor adaptativo associado a essa mutação, acredita- se que as populações de L. cuprina estavam pré-adaptadas a tal classe de inseticida (malathion). Heidari et al. (2005) mostraram que a substituição do Trp251 pode também estar relacionada com resistência a inseticidas piretróides. Baseado nestes resultados, embora os piretróides ainda sejam pouco utilizados no controle da C. hominivorax, pode haver uma pré-adaptação a essa classe de inseticida, podendo contribuir para uma rápida aquisição da resistência a tal classe.
C.hominivorax ATG AAT TTC AAG GTT AGT CAG GTG GAG AAA TTA AAA TGG AAA ATT AAA TGT TTT GAA AAT AAA TTT CTA AAT TAT [ 75]
Lc(U56636) ... ... ... ..C ... ... TT. A.. ... ... ... ... ... ..G ... ... ..C A.. ... ... ..G ... T.. ..C ... [ 75]
C.hominivorax CGT TTG AGT ACA AAT GAA ACG GCT GTG GCT GAA ACA GAA TAT GGC AAA GTG AAA GGT ATT AAA CGT TTA ACA GTT [ 150]
Lc(U56636) ... ..A .C. ..C ... ... ... .TG ..A ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C G.. ... ... ... ..T ..G [ 150]
C.hominivorax TAT GAT GAT TCA TAT TAT AGT TTT GAG GGT ATA CCA TAC GCC CAA CCC CCC TTG GGT GAA TTG AGA TTT AAG GCA [ 225]
Lc(U56636) ..C ... ... ..C ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ..G ..A G.. ... ..G C.. ... ... ..A ... [ 225]
C.hominivorax CCC CAG CGA CCA ACA CCT TGG GAT GGT GTA CGT GAT TGT TGC AAT AAC AAA GAT AAA TCA GTG CAA GTT GAT TTT [ 300]
Lc(U56636) ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ..G ... ... ... ... ... C.T ... ... ..G ... ... ... ... ... ... [ 300]
C.hominivorax ATA ACG GGT AAA ACA TGT GGT TCA GAG GAT TGT TTA TAC TTG AGC GTC TAT ACG AAT AAT CTG GCT CCA GAA ACT [ 375]
Lc(U56636) ... ... ..C ... GTG ... ..C ... ... ... ... C.. ... C.A ..T ... ... ... ... ... ..A AA. ..C ... ... [ 375]
C.hominivorax AAA CGT CCA GTT TTG GTA TAC ATT CAT GGT GGT GAC TTT GTT ATA GGA GAA AAT CAT CGT GAA TAT TAT GGA CCT [ 450]
Lc(U56636) ... ... ..C ... ..A ... ... ..A ... ... ... .GT ... A.. ..C ..T ... ... ... ... ..T ATG ... ..T ... [ 450]
C.hominivorax GAT TAT TTT ATT AAA AAA GAT GTT GTA TTA ATT ACC ATA CAA TAT CGT TTG GGA GTT CTT GGT TTC TTG AGC TTA [ 525]
Lc(U56636) ... ... ..C ... ... ..G ... ..G ..G ..G ... .A. ... ... ... ... ... ... .C. ..A ... ..T C.A ..T ... [ 525]
C.hominivorax AAT TCT GAA GAG CTC AAT GTA CCC GGT AAT GCT GGC CTT AAG GAT CAA GTT ATG GCT TTA CGT TGG ATT AAA AAT [ 600]
Lc(U56636) ... ..A ... ..C ..T ... ..G ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... [ 600]
C.hominivorax AAT TGT GCC AAT TTC GGT GGT AAT CCT GAT AAC ATC ACT GTC TTT GGT GAG AGT GCT GGT GGA GCC TCT GCC CAT [ 675]
Lc(U56636) ... ..C ... ..C ..T ... ..C ... ..C ... ..T ..T ..A ... ... ... ..A ... ..C ... .CT ... ... A.. ..C [ 675]
C.hominivorax TAC ATG ATG TTA ACT GAA CAA ACA CGT GGT CTC TTC CAT CGT GGC ATT TTA ATG TCT GGC AAT GCT GTA TGT CCT [ 750]
Lc(U56636) ... ... ... ... ..C ... ... ..T ..C ... ..T ... ... ... ..T ..A C.. ... ..G ..T ... ... A.T ... ..A [ 750]
C.hominivorax TGG GCC ATT AGT CAA AAT CAA CAT CGT GCT TAT GCT ATA GCT AAA CTG AAT GGA TAT AAG GGT GAA AAT AAT GAT [ 825]
Lc(U56636) ... ..T .A. .CC ... TG. ... ... ... ..C .TC A.C T.. ..C ... T.. GCC ..C ... ... ... ..G G.. ... ... [ 825]
C.hominivorax AAG GAT GTT TTG GAA TTC TTA ATG AAA GCT AAA GCT CAT GAT TTA ATC AAA TTG GAA GAC AAA GTT TTA ACA CCC [ 900]
Lc(U56636) ... ... ... ... ... ..T C.T ... ... ..C ..G C.A ..G ... ... ..A ... C.T ..G ..A ... ... ... ..T .TA [ 900]
C.hominivorax GAA GAA CAT GTG AAT AAA GTG ATG TTT GCT TTT GGC CCC ACT GTG GAA CCT TAT CAG ACT GCT GAC TGT GTT TTA [ 975]
Lc(U56636) ... ..G .G. ACA ... ..G ..C ... ... C.. ... ..T ... ... ..T ..G ..A ... ... ..C ... ..T ... ..C ... [ 975]
C.hominivorax CCT AAA CAT CCT AGA GAA ATG GTG AAG ACT GCT TGG GGT AAT TCT ATA CCC ACA ATG ATG GGT AAT ACT TCG TAC [1050]
C.hominivorax GAG GGA TTA CTG TTT ACA CCG ATT GTT AAA CAA ATG CCG GCA CTT TTG AAA GAG TTG GAA ACT TGT GCC AAT TTT [1125]
Lc(U56636) ... ..T C.. T.T ..C ..T T.A ... C.. ..G ... ... ..T ATG ... G.T ..G ..A ... ... ... ... .T. ... ... [1125]
C.hominivorax GTT CCT ACT GAA TTA GCC GAT TCC GAA CGC AGT TCT GCT GAA ACC TTG GAA TTG GGT GCC AAA ATT AAA AAA GCC [1200]
Lc(U56636) ..G ..A .G. ... ..G ..T ... G.T ... ... .CC G.C C.A ..G ... ... ... A.. ... ..T ... ... ... ..G ..T [1200]
C.hominivorax CAT GTT ACA GGA GAA ACA CCA ACT AAT GAT AAC TTT TTG GAT CTT TGC TCA CAC TTT TAC TTC TGG TTC CCC ATG [1275]
Lc(U56636) ... ... ... ... ... ... ... ..A GC. ... ..T ... A.. ... ... ... ..T ... A.C ..T ... ... ... ... ... [1275]
C.hominivorax CAT CGT CTA CTC CAA ATA CGT TTC AAA CAT ACA TCT GGA ACT CCT GTC TAT TTA TAT CGT TTT GAT TTT GAT TCT [1350]
Lc(U56636) ... ... T.G T.G ... T.. ... ... ..T ..C ..C ..C ..T ..A ..C ... ..C ..G ... ..C ..C ..C ... ... ..G [1350]
C.hominivorax GAA GAA ATA ATT AAT CCT TAT CGT ATT ATG CGT CAT GGC CGT GGC GTT AAG GGT GTA AGT CAT GCT GAT GAA TTA [1425]
Lc(U56636) ... ..T C.T ... ... ..C ... ... ... ... ... AG. ..A ... ..T ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... [1425]
C.hominivorax ACA TAC CTT TTC TGG AAT GCA TTA GCC AAA CGT TTG CCT AAA GAA TCC CGA GAA TAC AAG ACA ATT GAA CGT ATG [1500]
Lc(U56636) ..C ..T T.C ... ... ... CA. ..G ... ... ... A.. ... ... ... ..G ..T ... ... ..A ... ... ... ... ... [1500]
C.hominivorax GTG GGT ATA TGG ACT CAG TTT GCT ACT ACC GGT AAT CCC TAT AGC AAT GAA ATT GAT GGC CTG GAA AAT ATT ATT [1575]
Lc(U56636) ACT ... ... ... .TA ..A ... ..C ..C ..T ... ... ..T ... ... ... ... ... ..A ..T A.. ... ... G.. TCC [1575]
C.hominivorax TGG GAC CCT ATC AAG AAA TCT GAT GAA GTC TAT AAA TGT TTA AAT ATA AGT GAT GAA TTG AAG ATT ATC GAT GTG [1650]
Lc(U56636) ... ..T ..A ..T ... ... ..C ..C ... ..A ..C ..G ... ..G ... ..T ... ..C ... ... ..A ..G ..T ... ... [1650]
C.hominivorax CCT GAA ATG GAA AAA ATT AAA CAA TGG GAA TCA CTG TAT GAA AAA CGC AAA GAT TTA TTT TAG [1713]
Lc(U56636) ... ... ... ..T ..G ... ... ... ... ... ..G A.. .T. ... ... .AT .G. ... ... ... ... [1713]
Figura 14. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos consenso de C. hominivorax obtida nesse estudo e de L. cuprina (U56636 – GenBank). Em destaque, estão os códons responsáveis por conferir resistência a inseticidas OP em L. cuprina e M. domestica.
Uma vez que a primeira tentativa de amplificação da porção 3’ do cDNA da E3 com os pares de ‘primers’ 7F1a/7R7 e 7F4a/7R7 não resultou na amplificação de nenhum fragmento que pudesse ser visualizado em gel de agarose, foi realizada, então, a reação de PCR “Semi-nested”. Essa reação de amplificação resultou em um fragmento com 781pb, que corresponde às posições 940- 1721 (Figura 14) da seqüência nucleotídica do LcαE7 em L. cuprina (Newcomb et al., 1997b). Em L. cuprina e M. domestica, essa região contém os introns IV e V, os quais já foram caracterizados para estas espécies.
Analisando toda a região codificante da E3 em C. hominivorax, notamos que ela contém domínios que são altamente conservados entre as carboxil/colinesterases, os quais contribuem para o mecanismo catalítico do sítio ativo. Dentre eles, há o ‘nucleophilic elbow’ (VFGESAG, resíduos 214-220 em ChαE7 – Figura 15), que é conservado entre todas carboxil/colinesterases, e o domínio conhecido como “oxyanion hole” (G136, G137, A219), predito de estar inserido no centro catalítico das enzimas carboxil/colinesterases (Claudianos et al., 1999).
O cDNA da E3 de C. hominivorax possui os mesmos 1713pb da região codificante de L. cuprina (U56636 - GenBank), apresentando 83% de similaridade nucleotídica com a mesma. As 292 substituições de nucleotídeos encontradas entre a seqüência consenso de C. hominivorax e a de L. cuprina (U56636 - GenBank) resultam na alteração de 71 aminoácidos. Dessa maneira, as seqüências preditas de aminoácidos com 571 resíduos apresentaram 87,7% de identidade entre estas espécies. Cygler et al. (1993) descreveram 24 resíduos que são conservados dentre 29 carboxil/colinesterases. Na seqüência predita da E3 em C. hominivorax, todos se mostraram invariantes (Figura 15).
Figura 15. Alinhamento da seqüência predita de aminoácidos da E3 da seqüência consenso de
C. hominivorax obtida nesse estudo com as seqüências dos genes ortólogos de L. cuprina (Lc_U56636), M. domestica (Md_AF133341), H. irritans (Hi_ AF139082) e D. melanogaster (Dm_NM079537). Em
destaque, os aminoácidos que Cygler et al. (1993) descreveram como invariantes para 29 carboxil/colinesterases.
Analisando toda a região codificante da E3 em C. hominivorax, nota-se que a similaridade com a seqüência de L. cuprina é extremamente alta, o que era esperado, uma vez que estas espécies pertencem à mesma família (Calliphoridae). Uma grande similaridade também foi encontrada entre as seqüências preditas de aminoácidos da esterase E3 de M. domestica e L. cuprina, 87%. A associação das mesmas mutações (e nas mesmas posições) com a resistência a inseticidas OP em espécies de diferentes famílias como Muscidae (M. domestica) e Calliphoridae (L. cuprina) indica um alto grau de conservação dessas mutações. Uma vez que as mesmas mutações foram encontradas em C. hominivorax, essa grande conservação sugere fortemente que o mesmo mecanismo de resistência tenha sido selecionado nesta espécie.
Sendo assim, esta recém caracterização da região codificante da esterase E3 em C. hominivorax pode contribuir enormemente para a caracterização da resistência nessa espécie, auxiliando na utilização mais apropriada de inseticidas e contribuindo na implementação de programas efetivos de controle. Além de reduzir os custos da produtividade animal, a caracterização da resistência a inseticidas OP nesta espécie pode contribuir para a melhoria da qualidade da carne e do leite, uma vez que à medida que um inseticida vai se tornando ineficiente, a tendência é aumentar a quantidade da aplicação, gerando resíduos na carne e no leite.