UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA
RAISA QUEIROZ CATUNDA
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS ADESIVOS ADPER™
SINGLE BOND 2, SINGLE BOND™UNIVERSAL E SILORANO
AUTOCONDICIONANTE EM CÉLULAS VERO EM CULTURA
RECIFE - PE 2014
RAISA QUEIROZ CATUNDA
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DOS ADESIVOS ADPER™
SINGLE BOND 2, SINGLE BOND™UNIVERSAL E SILORANO
AUTOCONDICIONANTE EM CÉLULAS VERO EM CULTURA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Odontologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Odontologia, com área de concentração em Clínica Integrada.
Orientador: Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez Co-orientador: Prof. Dr. Jeymesson Raphael Vieira
RECIFE - PE 2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado VICE-REITOR
Profª. Drª. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Francisco de Souza Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
VICE-DIRETORADO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Vânia Pinheiro Ramos
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Profª. Drª. Jurema Freire Lisboa de Castro
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA CORPO DOCENTE PERMANENTE
Profª. Drª. Alessandra Albuquerque T. Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof. Dr. Arnaldo de França Caldas Júnior Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida Profa. Drª. Flávia Maria de Moraes Ramos Perez
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão Profª. Drª. Jurema Freire Lisboa de Castro
Profª. Drª. Liriane Baratella Evêncio Prof. Dr. Luiz Alcino Monteiro Gueiros Profª. Drª. Maria Luiza dos Anjos Pontual
Prof. Dr. Paulo Sávio Angeiras Goes Profª. Drª. Renata Cimões Jovino Silveira Profª. Drª. Simone Guimarães Farias Gomes
Prof. Dr. Tibério César Uchôa Matheus
MEMBROS COLABORADORES Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva Profª Drª. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice
SECRETÁRIA DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Oziclere de Araújo Sena
Dedico esse trabalho a todos que venham de alguma maneira serem ajudados pelos resultados por ele obtido
AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a Deus, por me proporcionar a oportunidade de estar aqui neste mundo e ter a chance de aprender e compartilhar todo o conhecimento adquirido.
Ao meu orientador Danyel Perez e co-orientador Jeymesson Raphael Vieira por serem sempre presentes e terem me iluminado o caminho.
À Universidade Federal de Pernambuco pelo suporte da pesquisa e apoio necessário.
Aos meus pais, Vera e Rands, pela minha vida.
Aos meus queridos avós, pelo apoio em todas as etapas da minha vida, Nilton e
Teresinha, sem vocês eu não chegaria aqui!
Ao meu querido e muito especial Tio André, que sempre me incentiva e me ajuda em tudo que preciso, inclusive por ceder materiais fundamentais para esta pesquisa como fotopolimerizador, autoclave, materiais clínicos e, principalmente, apoio e amor.
Aos meus familiares Klinger e Cyntia Catunda, Marília Tavares pelo apoio. Aos meus melhores amigos que estiveram comigo em cada etapa, sejam dentro do mestrado como Yuri e Renata, como fora dele e dentro do meu coração: Gabriela
Varela, Raíssa Pardellas, Mariana Veloso, Nathália Mello, Júnior Chaves, Renata Sampaio, Clóvis Barbosa, Day, Diogo Gouveia, Jú, Flávia, Angélica e Bruno Casado,
que inclusive deu grande contribuição para esta pesquisa com seus dons criativos. Ao meu querido professor Marcos Japiassú, que mesmo de longe sempre me ajudou e me deu as devidas orientações por sua experiência na área.
À Isabel Porto, uma colega de profissão que foi fundamental para a organização da metodologia dessa pesquisa e esteve sempre muito disponível apesar da distância.
As professoras Eliete e Paloma por terem sido tão receptivas no Laboratório de Cultura de Células e as grandes amigas que fiz dentro dele: Erwelly, Mariana Barreto e
Você não pode ter o que você dá, se não der o que você tem (Alexander Maximilian Band)
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a citotoxicidade de três adesivos dentinários (Adper Single Bond 2 -SB, Sistema Adesivo Silorano-SAS e Single Bond Universal -SBU) em células Vero, após diferentes tempos de contato. Métodos: As células foram cultivadas a uma concentração de 2x105
células/ml por 24h e crescidas até formar uma monocamada subconfluente. As células Vero foram expostas a 25µl de extratos obtidos da imersão dos adesivos em meio de cultura (DMEM) por 24h, 48h e 72h, imediatamente após a polimerização. DMEM fresco foi utilizado como controle negativo e o metabolismo celular foi avaliado pelo método MTT [3-(4,5- Di-metiltiazol-2-il)-2,5- brometo difenil- tetrazolio)]. Os dados foram comparados estatisticamente através do teste ANOVA. Resultados: Os valores percentuais de viabilidade variaram de 94,2% em 72h (SBU) até 109,6% em 48h (SB). A média percentual de viabilidade após a exposição aos extrados de SB, SAS e SBU foram 103,2%, 100,63% e 97,43%, respectivamente. Não houve uma diferença significativa entre os grupos experimentais e o controle negativo (p= 0,342).
Conclusões: Todos os adesivos testados neste estudo apresentaram
nenhuma citotoxicidade à células Vero in vitro.
Palavras-chave: citotoxicidade. adesivos dentinários. células Vero. MTT.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate, in vitro, the potential cytotoxicity of three different dental adhesives (Adper Single Bond 2 -SB, Silorane System Adhesive Bond -SSAB and Single Bond Universal -SBU) on Vero cells after different contact times. Methods: The cells were cultured in a concentration of 2 x 105 cell/ml for 24h and grown to sub-confluent monolayers. Vero cells were
exposed to 25µl of extracts obtained from 24h, 48h and 72h immersion of adhesive samples in culture medium (DMEM), immediately after polymerization. Fresh DMEM was used as negative control. Cell metabolism was evaluated by the MTT assay [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide], and the data were compared statistically by ANOVA. Results: The values of cell viability ranged from 94,2% at 72h (SBU) to 109,6% at 48h (SB). The average percentage of viability after exposure to the extracts of SB, SSAB and SBU were 103,2%, 100,63% and 97,43% respectively. There was not a statistically significant difference (p= 0.342) between the experimental and negative control groups. Conclusions: All adhesives tested in this study presented low or no cytotoxicity to Vero cells in vitro.
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ºC = grau centígrado μm = micrômetro 3-D = três dimensões
Bis-GMA = bisfenil A glicidil metacrilato cm = centímetro
DMEM = Meio Eagle Modificado por Dulbeco DMSO = dimetilsufóxido h = hora HEMA = 2 hidroxietilmetacrilato Kg = quilograma mm = milímetro MTT = 3-(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazólio PBS = solução salina tamponada com fosfato rpm = rotações por minuto
s = segundo
SB = Single-Bond 2 SBF = Soro bovino fetal
SBU = Single Bond Universal SE Plus SSAB/SAS = Sistema Adesivo Silorano TEGDMA = trietilenoglicol dimetacrilato UDMA = uretano dimetacrilato
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 21 2. REVISAO DA LITERATURA 24 2.1 Sistemas Adesivos 25 2.2 Células Vero 27
2.3 Testes citotoxicidade celular 28
3. OBJETIVOS 34 3.1 Objetivo geral 35 3.2 Objetivos específicos 35 4. METODOLOGIA DETALHADA 36 4.1 Cultura celular 37 4.2 Grupos experimentais 37
4.3 Preparação das amostras 38
4.4 Preparação dos extratos 39
4.5 Teste de citotoxicidade 39
4.6 Análise estatística 41
5. Capítulo 42
REFERÊNCIAS 62
ANEXO 69
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1. INTRODUÇÃO
Os sistemas adesivos dentários, como biomateriais, devem preencher o requisito de biocompatibilidade, que pode ser definida como a capacidade de um material exercer suas funções específicas quando aplicado em tecidos vivos de determinado hospedeiro, sem, contudo, causar danos ou prejuízo ao mesmo (COSTA et al., 2000; HUANG et al., 2002).
A citotoxicidade define o potencial toxicológico de um material ou seu extrato sobre cultura de células (SZEP et al., 2002; CAO et al., 2005). A interação dos materiais e seus componentes com as células, em nível molecular, é responsável por grande parte das alterações imunológicas e da genotoxicidade registradas (KLEINSASSER et al., 2004), além de reações teciduais como inflamação e necrose (ACCORINTE et al., 2005). Portanto, os testes de citotoxicidade são um pré-requisito para a avaliação de biocompatibilidade dos materiais (DEMIRCI et al., 2005).
A citotoxicidade dos materiais odontológicos pode ser realizada por análises quantitativas ou qualitativas. Na análise quantitativa se conta o número de células após proliferação ou inibição celular, o número de colônias formadas, a dosagem de seus componentes, como proteínas e mitocôndrias, ou pela proliferação ou inibição do material genético. A análise qualitativa avalia as células microscopicamente, observando as alterações morfológicas, como vacuolização citoplasmática e lise de suas membranas (ISO, 2009). Um teste de citotoxicidade bem aceito é o que utiliza o ensaio de Metiltiazol tetrazólio (MTT) ou sal de tetrazolium (SZEP et al., 2002; VAJRABHAYA et al., 2003; CAO et al., 2005; DEMIRCI et al., 2005), que após a redução por desidrogenases mitocondriais de células, formam os cristais de formazan insolúveis em água, solúveis somente em solventes orgânicos como o Dimetil Sulfóxido (DMSO). Quando o DMSO é adicionado, os sais de formazan são solubilizados permitindo a leitura por espectrofotometria em função desta solubilização (HENSTEN-PETTERSEN, 1988).
A avaliação da citotoxicidade de adesivos dentários é indispensável uma vez que estes, frequentemente, estão em contato com a dentina vital, ou em casos de acidentes com tecido epitelial ou conjuntivo (DEMIRCI et al., 2005).
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Embora amplamente utilizados na prática odontológica sem relatos importantes de efeitos adversos sobre o tecido pulpar (COSTA,HEBLING,HANKS, 2000; SZEP et al., 2002), os sistemas adesivos possuem diversas gerações e seus componentes isolados provaram ser citotóxicos sobre várias células (HUANG; CHANG, 2002; ANNUNZIATA et al., 2006; MANTELLINI et al., 2006). Por outro lado, muitas substâncias lançadas no mercado mostram muitos graus de atividade citotóxica in vitro, que nem sempre podem ser observadas in vivo (GEURTSEN, 1998). A resposta celular varia conforme o material testado (ABOU HASHIEH et al., 1998; HUANG;CHANG, 2002) e metodologia utilizada, demonstrando a necessidade de testar cada um deles.
Os adesivos dentários considerados como padrão ouro na odontologia são os de condicionamento ácido total ou 5ª geração. Os adesivos autocondicionantes são aqueles que dispensam o passo do condicionamento ácido total, seja por obter um primer autocondicionante (6ª geração), seja por ter um adesivo autocondicionante de frasco único (7ª geração). (MILIA, et al., 2012).
Pouco é conhecido sobre a citotoxicidade destes novos sistemas adesivos, especialmente o adesivo Single Bond Universal (GROBLER et al., 2004; ANNUNZIATA et al., 2006; MONTES et al., 2011; BIELAWSKA et al., 2012; SCHMALZ et al, 2013). Portanto, é necessária avaliação do grau de dano à celula causado por esses agentes de nova geração. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta de células Vero em cultura à três diferentes adesivos dentais, em diferentes tempos de exposição, através do ensaio de Metiltiazol Tetrazólio (MTT).
24
R
EVISÃO DE
L
ITERATURA
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Sistemas adesivos dentários
A rápida evolução da Odontologia proporciona grande avanço na produção de materiais de uso rotineiro, principalmente aqueles que buscam melhorar a estética, função e durabilidade dos procedimentos restauradores, como por exemplo os adesivos dentários.
A base para restaurações adesivas ocorreu em 1955, quando Buonocore propôs que ácidos poderiam ser utilizados na superfície do esmalte, formando microporosidades, promovendo uma superfície mais receptiva à penetração e imbricamento mecânico das resinas hidrófobas de baixa viscosidade (SWIFT et al., 1997).
Um ano mais tarde, a união com a dentina foi tentada pelos pesquisadores, utilizando-se, após condicionamento ácido, uma resina adesiva à base de ácido glicerofosfórico dimetacrilato que possuía afinidade química com a estrutura dental. As superfícies dos dentes eram condicionadas com uma solução de ácido clorídrico a 7% por 1 minuto, logo em seguida aplicava-se o material adesivo. Os resultados mostraram maiores valores de resistência à tração para os dentes tratados com o ácido, em comparação com aqueles não tratados. A partir desse ensaio foi sugerido que poderia ocorrer uma adesão devido à possibilidade de combinação química entre um dos constituintes da resina e a matriz orgânica da dentina, hipótese descartada em observações subsequentes (BUONOCORE, 1956).
Atualmente, duas estratégias são aceitas para a obtenção da interação física entre resina e dentina (KANCA, 1992; TAY, 1996; TAY, 2000; VAN MEERBEEK, 2003). A primeira denominada de condicionamento ácido total, baseia-se na remoção completa da smear layer e, conseqüentemente, desmineralização da dentina subjacente. Pela previsibilidade dos resultados obtidos, é considerada padrão ouro nos testes de adesão. Estes sistemas podem ser utilizados em três passos, em que o condicionamento é realizado através da aplicação de ácido fosfórico de 30 a 40% durante 15 segundos. Segue-se com a remoção do ácido e seus subprodutos através de abundante
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lavagem com água produzindo uma diminuição da energia superficial da dentina, em seguida, a aplicação do primer e do adesivo. O sistema de condicionamento ácido total também pode ser feito pela técnica de dois passos, que inclui o condicionamento total e aplicação do adesivo e primer em frasco único (MILIA et al., 2012). A segunda estratégia de hibridização utiliza monômeros ácidos, denominados de primers autocondicionantes ou adesivos autocondicionantes, que desmineralizam parcial ou totalmente a smear layer e a dentina subjacente incorporando-as e usando-as como substrato para união (CARVALHO, 1997; VAN MEERBEEK, 2003).
Os sistemas autocondicionantes são compostos por monômeros hidrófilos ácidos, água, hidroxietilmetacrilato (HEMA) e dimetacrilatos bifuncionais. Um aumento na concentração de monômeros ácidos é necessário para dissolver a smear layer e condicionar a dentina subjacente; a água é utilizada como meio de ionização destes componentes resinosos ácidos. O HEMA é acrescentado como um solvente, pois alguns dos monômeros ácidos não são solúveis em água diretamente (TAY et al., 2002).
O Sistema Adesivo Silorano (3M ESPE, MN, EUA) foi especialmente desenvolvido para proporcionar uma adesão resistente e durável à Filtek P90, resina composta para dente posterior de baixa contração de polimerização, e, segundo o fabricante, oferece uma excelente base para a integridade marginal das restaurações (3M ESPE, 2012).
O adesivo do Sistema Silorano é baseado em uma composição química com metacrilatos. Como componente principal, ele contém um monômero hidrófobo bifuncional®, a fim de unir-se à resina hidrófoba Silorano. Outros componentes incluem monômeros ácidos que iniciam a polimerização catiônica de abertura dos anéis da Resina Filtek P90, oferecendo, portanto, uma união química a ela. O sistema fotoiniciador é baseado na molécula de canforoquinona (3M ESPE, 2012).
Existem sistemas ainda mais modernos, que dizem não importar o tipo de substrato ou o método de aplicação, como o Single Bond Universal. Segundo o fabricante, ele apresenta a VMS Technology®. Esta tecnologia permite a aplicação do adesivo tanto em dentina úmida quanto seca. A sua química possibilita a reidratação das fibras colágenas e a formação de uma camada híbrida mesmo com a dentina ressecada (3M ESPE, 2012).
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Os principais fatores de agressão ao tecido pulpar após a restauração apontados por Hanks (1991) foram a liberação de componentes oriundos dos materiais restauradores ou forradores em contato direto ou indireto com a polpa e a presença de microrganismos viáveis nas margens das restaurações. Ainda, de acordo com KIM et al. (2014), a dentina tem um papel fundamental em influenciar a difusão de substâncias tóxicas, que podem ser liberadas pelos materiais de proteção ou adesão, para a polpa através dos túbulos dentinários. A preocupação em relação à citotoxicidade destes sistemas depende da composição química e tem correlação com as quantidades de Hidroxietilmetacrilato (HEMA) e Trietilenoglicol-dimetacrilato (TEGMA) (ÖZEN et al., 2005; GROBLER et al. 2008; KOULAOUZIDOU et al., 2008). As resinas nos sistemas adesivos são de interesse de muitos autores (BOUILLAGUET et al., 1996; TANG et al., 1999; GEURTSEN et al., 1999; DEMIRCI et al., 2008). Diversos estudos in vitro indicaram que os monômeros como bisfenol glicidil metacrilato (Bis-GMA) e uretano dimetacrilato (UDMA), são altamente citotóxicos a fibroblastos, e o HEMA e TEGDMA são moderadamente citotóxicos (BOUILLAGUET et al., 1996; GEURTSEN et al., 1998; CHEN et al., 2003).
2.2 Células Vero
As células Vero são originárias do rim de macacos verde da África ou macaco do velho mundo (Cercopithecus aethiops). Elas são homólogas às células do corpo humano e facilmente cultivadas (WANG et al., 2010). De acordo com a British Standard (6920-2.5:2000), as células Vero saudáveis possuem forma triangular, e tendem a arredondar quando contaminada, fazendo com que sua avaliação qualitativa também seja possível. A citotoxicidade dos agentes químicos, tais como pentaclorofenol e ácido perfluoroctanóico, em relação a células Vero foi avaliado usando os parâmetros bioquímicos e morfológicos (HAZEN et al., 2005; FREIRE et al., 2008). Avaliações in vitro das células de mamíferos, incluindo células Vero, como ecotoxicologia e toxicologia ambiental são atualmente utilizados para fornecer informações para a avaliação de riscos de novos produtos químicos ou amostras ambientais (CASTILLO et al., 2001; HUANG et al., 2008).
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Hazen et al. (2005) ainda descreveram este tipo celular como uma ferramenta útil para estudar os efeitos celulares induzidos por produtos químicos que estão atualmente presentes no mercado.
Dentre as diversas pesquisas existentes utilizando esse tipo celular, o estudo de Silva et al. (2012) verificou a citotoxicidade através do MTT de nanopartículas sólidas lipídicas em células Vero. Ainda utilizando as mesmas células, Katsuo et al. (2007) encontraram que as células Vero foram as mais resistêntes dentre seis linhagens célulares testadas (HeLa: carcinoma humano; MDCK: rim de cão Madin-Darby; XC: sarcoma de ratos; CHO: ovário de hamster chinês; Neuro-2A: neuroblastoma de rato e L929: fibroblastos de ratos) para estudos de citotoxicidade, eliminando viéses como sensibilidade celular dentro dos testes.
Kumar et al. (2009) ao avaliarem a padronização e validação das células Vero para ensaios de estimação de potenciais do serum de antitoxina diftérica, puderam concluir que as células Vero são uma ótima alternativa para estudos in vitro.
Em relação a materiais odontológicos, os cimentos endodônticos foram avaliados quanto a sua citotoxicidade, utilizando esse tipo celular por Senne et al (2009), um cimento à base de óxido de zinco e eugenol (Endofill) e outros dois cimentos à base de resina epóxica (Sealer 26 e AH Plus), obtendo resultados de média citotoxicidade para os três cimentos.
Tukay et al. (2010) avaliaram a citotoxicidade de materiais de cimentação de prótese em células Vero, MA-104 e células primárias de polpa dental humana. Os resultados dos dois cimentos testados (Viscogel e Molloplast ) mostraram que a citotoxicidade dependeu do material testado e do tipo celular utilizado, o Molloplast apresentou 20% de citotoxicidade nas células pulpares e não citotoxico às células MA-104, o Viscogel não foi citotoxico as células pulpares, porém apresentou 10% de citotoxicidade aos MA-104 e 35% às células Vero.
2.3 Testes de citotoxicidade celular
Os testes de citotoxicidade in vitro apresentam um grande número de métodos e materiais, e portanto devem seguir as normas da International
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Standard Organization 10993-5 (2009), que padronizam esses testes e selecionam o método mais apropriado para cada material. Três categorias são listadas: o teste que utiliza extratos, o teste onde há o contato direto do material com as células utilizadas e o teste onde o contato é indireto, por meio da difusão em ágar ou filtros Millipore. A escolha do teste a ser utilizado vai depender da natureza da amostra a ser avaliada. Esta escolha vai determinar então, os detalhes dos preparos das amostras, o preparo das culturas de células e o método pelo qual as células serão expostas às amostras.
De acordo com Freshney (1990), os testes com culturas celulares podem ser divididos em duas classes: resposta em curto prazo onde inclui alteração na permeabilidade da membrana e alteração de uma via metabólica; e sobrevivência em longo prazo que inclui auto-renovação e transformações malignas. Os ensaios em curto prazo medem a proporção de células viáveis após serem submetidas a situações traumáticas. A maioria destes testes tem como base no rompimento da integridade da membrana, visualizando pela incorporação de um corante vital ao qual a célula é normalmente impermeável ou na liberação de um isótopo radioativo. Já os testes a longo prazo, determinam a capacidade metabólica ou proliferativa das células após uma determinada influência tóxica.
A utilização de células em cultura é preferida pela homogeneidade das amostras e à facilidade de uma padronização, uma vez que é possível o controle de fatores tais como: pH, temperatura, pressão osmótica, tensão de CO2 e de O2. Segundo William (2008), os métodos de cultura celular in vitro
tem diversas vantagens quando comparados com testes in vivo; eles são mais repoduzíveis, mais rápidos e mais fáceis de serem realizados. Porém, algumas desvantagens devem ser consideradas para este método de estudo, entre elas a necessidade de se trabalhar em ambiente estéril e asséptico, o que exige certa prática por parte do pesquisador, e ainda, o custo de um experimento feito em cultura de células é maior do que o mesmo feito em animais (FRESHNEY, 1990). De acordo com Zhu et al. (1999), fibroblastos de ratos (L-929) e células Vero (célula epitelial de rim de macaco) tem sido amplamente utilizada nestes tipos de estudo (FREIRE et al., 2008; SENNE et al., 2008; LIAO et al., 2009).
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O teste de MTT é um indicador de atividades celulares chamadas "redox" atribuídas às enzimas mitocondriais das células. Alguns autores descreveram que o retículo endoplasmático e componentes do citosol e da membrana plasmática podem bioreduzir o MTT (BERNAS; DOBRUCKI, 2002), mas a quantidade dos cristais de formazan formados serve como uma estimativa do número de mitocôndrias, que significa o número de células vivas na amostra.
As citotoxicidades de agentes de união polimerizáveis como Scotchbond 1 (3M Espe), Prime and Bond NT (Dentsply DeTrey), Xeno III (Dentsply DeTrey), e Clearfil Protect Bond (Kuraray) foram comparadas em fibroblastos de ratos por Grobler et al. (2008). In vitro, todos os adesivos foram considerados citotóxicos através do MTT, sendo o Xeno III o mais citotóxico. Aparentemente a citotoxicidade depende da composição dos materiais testados e a parte mais citotóxica do Clearfil Protect Bond foi o primer, que contém uma molécula antibacteriana de piridina.
No trabalho de Zhang et al. (2008), a biocompatibilidade de 3 tipos de agentes de união de dentina (Xeno III – XO, Adper Prompt –AP e Single Bond 2 -SB) foi comparada e avaliada através da cultura celular in vitro, utilizando o MTT. Os resultados mostraram que todos os três tipos de adesivos dentinários apresentaram citotoxicidade aos fibroblastos de polpa humana em diferentes graus. As citotoxicidades do XO e AP foram menores do que a do SB (p<0,05). Os resultados da cultura celular indicaram que adesivos que utilizavam o sistema de condicionamento ácido total causam maiores irritações do que adesivos autocondicionantes.
A citotoxicidade de seis adesivos dentais (Admira Bond, Clearfil Liner Bond 2V, ED Primer II, Fuji Bond LC, Gluma Comfort Bond, e NanoBond) foi avaliada por Koulaouzidoua et al. (2009) através do MTT em fibroblastos de pulmão humano (MRC5). As amostras de adesivo foram fotopolimerizadas e colocadas em meio de cultura por 24h. Este extrato foi então colocado em contato com as células em cultura. Para os extratos expostos ao NanoBond, Fuji Bond LC, Clearfil Liner Bond 2V, ED Primer II, Admira Bond e Gluma Comfort Bond, as taxas de viabilidade foram 98%, 80%, 72%, 41%, 19% e 7%, respectivamente.
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Ahari et al. (2010) compararam a citotoxicidade do adesivo ortodôntico Transbond XT convencional e o modificado, que possui em sua formulação nanopartículas de dióxido de titânio, em fibroblastos gengivais humanos e fibroblastos de rato (L929). Utilizando o MTT, a viabilidade celular foi avaliada e obtiveram os seguintes resultados: ambos foram citotóxicos, sendo o convencional mais citotóxico do que o modificado. Os adesivos estudados mostraram citotoxicidade similar nas células L929.
Cavalcanti et al. (2011) compararam adesivos autocondicionantes (Clearfill Protect Bond primer -CP e Clearfill Protect Bond resin –CB), de condicionamento ácido total (Single Bond 2 –SB), e o cimento de hidróxido de cálcio em fibroblastos de polpa humana através do MTT, conseguiram chegar a resultados que mostraram que o SB reduziu bruscamente a viabilidade celular (0.09x103±0.06) quando comparado ao grupo controle [3.9x103(±0.75)].
Enquanto o cimento de hidróxido de cálcio, conhecido por seu uso em contato de direto com a polpa, chegou a valores superiores de viabilidade do que o controle (4.31x103±0.87). O adesivo CB (2.37x103±0.72 foi significantemente
menos tóxico do que o CP e o SB. Os autores chegaram a conclusão que o CP e o SB liberam substâncias que reduzem a viabilidade celular em fibroblastos humanos em cultura, sendo o capeamento pulpar direto com essas substâncias não recomendado.
Sengün et al. (2011) avaliaram a citotoxicidade de quatro adesivos dentários, três de sétima geração (G-bond, Quadrant University-1-Bond Adper Prompt self-etch) e um de sexta geração (Clearfil DC Bond System), em células de polpa humana dentro de câmara pulpar artificial através do MTT. Obtiveram resultados contrastantes de acordo com a espessura da barreira dentinária utilizada. Sendo os melhores resultados do Clearfil DC Bond System e Quadrant University-1-Bond, pois apresentaram-se semelhantes ao grupo controle e os piores resultados foram dos outros dois testados, levando a uma conclusão de que é recomendado que se use uma camada protetora do complexo dentina-polpa antes que se aplique o sistema adesivo, visto que a espessura dentinária situada abaixo do preparo não tem como ser mensurada clinicamente.
Chai et al. (2011) testaram através do MTT a diferença entre resistência de união e biocompatibilidade do adesivo Adper Single Bond 2, com acréscimo
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de um monômero catiônico (cloreto de metacriloxietil cetil - DMAE-CB), que possui atividade antibacteriana. Os resultados encontrados indicaram que a adição do DMAE-CB ao adesivo convencional Single Bond 2 não alterou suas propriedades referêntes a resistência e nem causou danos as células (L929), quando utilizado em concentração inferior a 2 µg/ mL. Os autores sugerem a incorporação do antimicrobiano ao adesivo, pois não interfere na sua resistência de união ou biocompatibilidade, desde que utilizado de maneira correta.
Ainda em relação a testes envolvendo MTT, quanto ao uso do adesivo em solução ou na sua forma polimerizada, Bielawska et al. (2012) avaliaram três adesivos, dois de sétima geração (Heliobond e Xeno V) e um de quinta geração (Adper Single Bond 2), de forma diluida e polimerizados, encontrando-se uma diferença significativa entre a forma diluida e a forma polimerizada, sendo a primeira mais citotóxica. Diferença pequena de citotoxicidade foi encontrada entre os adesivos testados, porém a situação que mais se assemelha ao uso clínico é, de fato, a polimerizada, visto que os adesivos testados necessitam da fotopolimerização antes de seu uso, seja em dentina ou em esmalte.
Yilmaz et al. (2012) também utilizaram o MTT para a avaliação da citotoxicidade de cimentos endodônticos (Tubli-Seal, Tubli-Seal EWT, Pulp Canal Sealer, Pulp Canal Sealer EWT, Endomthasoe N e Apexit plus) em células L929. Após a leitura da densidade óptica, os autores puderam concluir que os cimentos Apexit Plus, Tubli-Seal e Tubli-Seal EWT não apresentaram citotoxidade em nenhuma das diluições. Os outros cimentos apresentaram algum grau de citotoxicidade nas diluições de ¼ e ½. Os cimentos Pulp Canal Sealer EWT e Endomthasoe N foram os que exibiram a citotoxicidade considerada mais potente na diluição de ½, comparado aos demais cimentos.
Os adesivos possuem solventes com a função de eliminar excesso de água remanescente e melhorar a difusão de monômeros através da matriz de colágeno exposta (PASHLEY et al., 2003). Portanto, os solventes também tem sido avaliados na literatura. Piva et al. (2013) avaliaram a citotoxicidade de sete tipos de solventes em fibroblastos de ratos em tempos de 24h e 1 ano. Os resultados obtidos indicaram que os solventes testados para 24h não apresentaram citotoxicidade de acordo com o método usado para avaliação
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(MTT), porém o tetraidrofurano foi o que obteve mais altos resultados de viabilidade celular e maior permanência, sendo sugerido como um bom solvente a ser incorporado nos novos adesivos e o monômero difosfato foi considerado como mais citotóxico.
Em pesquisa da citotoxicidade de quatro adesivos dentários (Adper Single Bond 2, SE, Multi Purpose e Easy Bond) com barreira de dentina de espessura de 200μm e 500μm num tempo de exposição de 24h, Schmaltz et al. (2013) utilizaram o MTT e encontraram resultados contrastantes: o Single Bond apresentou os piores resultados de viabilidade nas duas espessuras (71,17% a 200μm e 64,60% a 500μm), o Easy Bond, que é um adesivo autocondicionante, mostrou um certo grau de possível proliferação celular (103,37% a 200μm e 110,39% a 500μm). Esse resultado mostra que nem todos adesivos podem ser considerados como citotóxicos e que a espessura de dentina remanescente também exerce influência na viabilidade celular.
Kim et al. (2014) avaliaram a citotoxicidade de seis adesivos autocondicionantes (Optibond All-In-One, Adper Easy Bond, Clearfil S3 Bond, G-Bond, Bond force e Futurabond DC) em células L-929, com barreira dentinária ou artificial, através do MTT, e obtiveram resultados considerados como tóxicos, sejam com presença de barreira dentinária ou com a barreira de poliuretano.
O MTT também foi utilizado por Chen et al. (2014) para avaliar a citotoxicidade de cimentos Portland que contem radiopacificantes como o óxido de bismuto. Osteoblastos de ratos foram utilizados para o teste in vitro e os resultados utilizando o MTT indicaram que o radiopacificador melhora a qualidade de radiopacidade do cimento e mostra viabilidade celular semelhante ao grupo controle.
33
34
3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral
O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a citotoxicidade dos adesivos dentários Adper™ Single Bond 2, Single Bond™ Universal e Sistema Adesivo Silorano em células Vero.
3.2 Objetivos específicos
1. Avaliar comparativamente a citotoxicidade dos adesivos dentários Adper™ Single Bond 2, Single Bond™ Universal e Sistema Adesivo Silorano após 24h, 48h e 72h de contato em células Vero em cultura.
2. Avaliar se cada um dos adesivos dentários utilizados, Adper™ Single Bond 2, Single Bond™ Universal e Sistema Adesivo Silorano, alteraram a viabilidade celular ao longo dos três intervalos de tempo (24h, 48h e 72h) que ficaram em contato com as células em cultura.
3. Avaliar a viabilidade celular comparativamente entre todos os sistemas adesivos estudados e tempos de exposição testados.
35
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4. METODOLOGIA DETALHADA
4.1 Cultura celular
A linhagem de células Vero (CCL-81, Rio de Janeiro, Brasil) foi obtida do Laboratório de Cultura de Células do Departamento de Histologia e Embriologia (UFPE). Elas foram mantidas a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. O monitoramento do crescimento celular foi feito utilizando um
microscópio invertido. O meio de cultura utilizado foi Eagle Modificado por Dulbeco (DMEM - Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) complementado com 10% de SFB e 1% de solução antibiótica-antimicótica (10.000 unidades de penicillina, 10 mg de estreptomicina em 0.9% de cloreto de sódio; Sigma). As culturas tiveram seus meios trocados até a formação de uma monocamada de células. As células foram lavadas com tampão fosfato-salino (PBS), tripsinizadas, centrifugadas por 10 min à 1.200 rmp, então contadas na câmara de Neubauer após a diluição em azul de Tripan (10µl de cells em 90µl do azul de tripan). As células na concentração de 2x105 cels/ ml de DMEM por poço
foram distribuidas em placas de 96 poços (Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha) e incubadas por 24h a 37°C em 5% de CO2 e 95% de ar para estabilização.
4.2 Grupos experimentais
Os grupos experimentais foram divididos como segue:
Grupo Controle negativo (CN): Meio de cultura DMEM;
Grupo 1: Adesivo AdperTM Single Bond 2 (24h); Grupo 2: Adesivo AdperTM Single Bond 2 (48h); Grupo 3: Adesivo AdperTM Single Bond 2 (72h); Grupo 4: Adesivo Silorano Autocondicionante (24h);
Grupo 5: Adesivo Silorano Autocondicionante (48h);
Grupo 6: Adesivo Silorano Autocondicionante (72h);
37
Grupo 8: Single Bond™ Universal (48h);
Grupo 9: Single Bond™ Universal (48h).
Foram 9 amostras por grupo, totalizando 90 amostras. 4.3 Preparação das amostras
Todas as amostras foram preparadas em conformidade com a International Organization For Standardization (10993-12), parte 12: Preparação de amostras e materiais de referência, 2012.
As amostras de todos os sistemas foram obtidas pelo gotejamento do adesivo em uma matriz cilíndrica (5 mm de diâmetro x 2 mm de altura) feita com elástico ortodôntico sobre uma tira de poliéster e fotopolimerizadas por 20s com uma fonte de luz halógena de 500mW/cm2(Gnatus, São Paulo, Brasil).
A fonte de luz foi calibrada com um radiômetro (Demetron, CT, EUA) a cada cinco amostras. Para evitar a contaminação, os discos foram preparados na câmera de fluxo lâminar (Veco, São Paulo, Brasil). Imediatamente após a presa, as amostras foram removidas da matriz (Figura 1). A espessura e diâmetro das amostras foi medida em duas áreas utilizando um espessímetro digital de precisão de 0,01mm. Todos os espécimens foram expostos a luz ultravioleta por 45 minutos para evitar contaminação microbiana. Todos os espécimens foram preparados pelo mesmo operador.
Figura 1 – Discos: (A) matriz sobre a tira de poliéster; (B): disco de adesivo polimerizado; (C): após a remoção da matriz, dentro de um tubo Falcon.
C
B
38
4.4 Preparação dos extratos
Os extrados de adesivo (meio condicionado) foram preparados pela imersão das amostras (discos de adesivo) em DMEM e filtrados (Filtro para seringa 0.22µm – TPP, Darmstadt, Alemanha) após os tempos de exposição de 24h, 48h e 72h (Figura 2), para eliminar partículas sólidas e microrganismos). A área superficial dos discos foi 0,5cm2/mL, que está dentro das especificações
recomendadas pela ISO (2012), que recomenda uma média entre 0,5-6cm2/ml.
Figura 2 – Discos de adesivos imersos em DMEM.
4.5 Teste de citotoxicidade
A avaliação da atividade citotóxica foi realizada através do método colorimétrico de brometo (MTT) (GERAN et al., 1972; MOSMANN et al., 1983). Em placas de 96 poços (TPP, Darmstadt, Alemanha) na concentração celular de 2×105 céls/mL por poço, as células Vero foram cultivadas por 24h (Figura 3).
O meio de cultura foi então substituido pelos extratos do adesivo em volumes iguais (25 µl), utilizando o próprio meio de cultura como controle negativo. Após a incubação por 24h, 25µl (5mg/mL) de solução de MTT foi adicionada a cada poço e as placas foram incubadas por 3 horas. O MTT foi então removido e 25µl de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço para dissolver os cristais de formazan. De acordo com a ISO (2009), um declínio no número de células vivas resulta em um declínio na atividade metabólica da amostra. Este declínio é diretamente proporcional a quantidade de formazan azul-violeta formado, monitorado pela densidade óptica (DO) em 570nm no espectrofotômetro (Bio-Rad, São Paulo, Brasil) (Figura 4). Para calcular a
39
redução da viabilidade comparando com o controle negativo, a seguinte equação foi utilizada:
O DO570e é a média da densidade óptica medida em 100% das amostras
testadas e DO570cn é a média do valor de densidade óptica medido no controle
negativo. Quanto mais baixa a Viab.%, maior potencial citotóxico o item testado terá.
A viabilidade celular foi então classificada da seguinte forma (AHRARI et al., 2010):
1. Valores maiores que 90%: material não é considerado citotóxico;
2. Entre 60-90 %: Baixa citotoxicidade;
3. Entre 30-59%: citotoxicidade moderada;
4. Menor que 30%: severamente citotóxico.
Figura 3 – Placa de 96 poços, contendo células e DMEM. 𝑉𝑖𝑎𝑏. % = 100𝑥 𝐃𝐎570e
40
Figura 5 – Espectrofotômetro (Bio-Rad)
Figura 6 – Esquema das etapas de cultivo celular, montagem de placa e teste de citotoxicidade
4.6 Análise Estatística
Os dados foram comparados utilizando o teste F (ANOVA) para dois fatores de interação (tempo e adesivo testato; adesivo testado e controle negativo) e margem de erro utilizada foi de 5%.
41
42
5. Capítulo:
CITOTOXICITY EVALUATION OF THREE DENTAL ADHESIVES ON VERO CELLS IN VITRO
43
44
1. Introduction
As biomaterials, dental adhesive systems must satisfy the requirement of biocompatibility, which can be defined as the ability of materials to perform their specific functions when applied on a living tissue of a particular host, without causing damage or injury [1,2].
The assessment of cytotoxicity is a prerequisite for the biocompatibility evaluation of the materials [3] By definition, the cytotoxicity of an agent means toxicological risks by a material or its extract in cell culture [4,5]. The interaction of the materials and components with the cells at the molecular level is responsible for many of the immune alterations and genotoxicity registered [6], as well as tissue reactions such as inflammation and necrosis [7].
The use of cell cultures is indicated, since this method is easier to controll, eliminating the factors related to the subject reaction [8,9,10]. In vitro assessments of mammal cells, including Vero cells, as ecotoxicology and environmental toxicology are currently used to provide information for risk assessment of new chemicals or environmental samples [11,12].
To assess the cytotoxicity of dental materials, quantitative or qualitative analyzes can be used. The quantitative analysis measures the number of cells after cell proliferation or inhibition and the number of colonies, such as proteins and mitochondria, or the inhibition of proliferation or genetic material. Qualitative analysis evaluates the cells microscopically observing morphological changes such as cytoplasmic vacuolization and lysis of their membranes [13]. The methyl thiazol tetrazolium assay (MTT) or tetrazolium salt are cytotoxicity tests in which, after reduction by mitochondrial dehydrogenases of cells, form the insoluble formazan crystals in water, soluble only in organic solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO). When added DMSO in culture medium, formazan salts are solubilized and can be detected spectrophotometrically [14].
The assessment of cytotoxicity of dental adhesives is indispensable because of the close contact with vital dentin and pulp tissue, and in case of accidents involving other surrounding tissues such as epithelium or connective tissue of the oral mucosa [3]. Although widely used in clinical dentistry practice without reports of significant adverse effects on pulp tissue [2,4], the individual
45
components of adhesive systems proved to be cytotoxic to various cells [1,16,17]. Many of the substances released show diverse degrees of cytotoxic activity in vitro, which may not always reflect in vivo conditions [18]. In addition, cellular response varies according to the methodology tested [1,19], demonstrating the need to test each one.
Dental adhesives considered as golden pattern in Dentistry are known as total-etching systems or 5th generation systems. Self-etching systems are the
ones that do not use a separated step for enamel/dentin etching, they have a self-etching primer/two bottle system (6th generation) or a self-etching
adhesive/one bottle system (7th generation) [20].
However little is known about cytotoxicity of these new adhesive systems, mainly Single Bond Universal [8,21,22,23,24]. Therefore, it is necessary to assess the degree of cellular damage caused by these new generation agents. The purpose of this study was to evaluate the response of cultured Vero cells to three different dentin adhesives on different times of exposure by observing cell metabolic activity using the methyltetrazolium (MTT) assay.
2. Material and Methods
2.1. Materials
Three commercial dental adhesives were evaluated using materials of similar compositions, with different clinical application procedures (total etching and self-etching systems). The dental adhesives tested in this study were Adper SingleBond 2 (3M ESPE, St. Paul, MN USA), Silorane System Adhesive Bond (3M ESPE) and Single Bond Universal (3M ESPE). Details of the tested materials are shown in Table 1.
46
Table 1 – Materials and their main components used in this study.
Dental Adhesive
Manufacturer # Batch Components
Adper Single Bond 2
3M ESPE #N421234 Ethyl alcohol, bisphenol a
diglycidyl ether dimethacrylate (bisgma), Silane treated silica (nanofiller), 2-hydroxyethyl
methacrylate (hema),
Copolymer of acrylic and itaconic acids, Glycerol
1,3-dimethacrylate, Water, Diurethane dimethacrylate (udma), Diphenyliodonium hexafluorophosphate, Ethyl 4-dimethyl aminobenzoate (edmab) Single Bond Universal 3M ESPE #494757 Methacryloyloxydecyl dihydrogen phosphate, phosphate monomer, dimethacrylate resins, hydroxyethyl methacrylate, methacrylate-modified
polyalkenoic acid copolymer, filler, ethanol, water, initiators, silane
Silorane System Adhesive Bond
3M ESPE #N383992 Substituted dimethacrylate,
Silane treated silica, Triethylene glycol dimethacrylate (tegdma), Phosphoric acid methacryloxy-hexylesters, 1,6-hexanediol
dl-47
camphorquinone According to Material Safety Data Sheet (2013)
2.2. Cell Culture
VERO cell line (CCL-81, Rio de Janeiro, Brazil) was obtained from Cell Culture Laboratory, Department of Histology and Embriology, Federal University of Pernambuco, Recife, Brazil. They were maintained at 37°C in a humidified 5% CO2 atmosphere. Growth monitoring cell was performed by using an
inverted microscope. The culture medium was Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (Cultilab Ltda, Campinas, SP, Brazil) and 1% antibiotic-antimycotic solution (10,000 units of penicillin, 10 mg of streptomycin in 0.9% sodium chloride; Sigma). Cultures were supplied with fresh medium every 3 days until an adequate number of cells were obtained. The cells were counted in a Neubauer chamber after 1:10 dilution in Trypan Blue Dye (10µL of cells in 90µL of Trypan Blue). The cells (2x105 cells/ mL of DMEM perwell) were
transferred to the culture plate (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) and incubated for 24h at 37°C in 5% CO2 and 95% air to stabilize the cells.
2.3 Experimental groups
The experimental groups were divided as follows:
Negative control group (NC): Meio de cultura DMEM;
Grup 1: AdperTM Single Bond 2 (24h); Grup 2: AdperTM Single Bond 2 (48h); Grup 3: AdperTM Single Bond 2 (72h);
Grup 4: Silorane System Adhesive Bond (24h);
Grup 5: Silorane System Adhesive Bond (48h);
Grup 6: Silorane System Adhesive Bond (72h);
Grup 7: Single Bond™ Universal (24h);
Grup 8: Single Bond™ Universal (48h);
Grup 9: Single Bond™ Universal (72h).
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2.4 Preparation of samples
All samples were made according to International Organization For Standardization (10993-12), part 12: Sample preparation and reference materials, 2012.
Samples of the systems were obtained by dripping adhesive on a cylindrical matrix of orthodontic elastics (5mm diameter x 2 mm height) placed on a strip of polyester and light-cured for 20 seconds with a halogen light source (Optilight Plus, Gnatus, São Paulo, Brazil) irradiation at 500 mW/cm2. The
halogen light source was calibrated with a radiometer (Demetron, Kerr Corp., CT, USA) every 5 samples made. To prevent contamination, the discs were prepared in a laminar flow cabinet (VECO, São Paulo, Brazil). Immediately after the prey, the samples were removed from the cylindrical matrix (Fig. 1). The sample thickness was measured in two areas using a digital caliper with an accuracy of 0.01 mm. All specimens were prepared by the same operator. The samples were exposed to ultraviolet light for 45 minutes to prevent bacterial contamination.
Figure 1 – (A) matrix of polytetrafluoroethylene placed on polyester strip; (B) Disc of the polymerized adhesive; C) Discs after removal of the matrix inside of a Falcon tube.
2.5 Extracts
C
B
49
Extracts were prepared by soaking samples of the polymerized adhesive in DMEM that was stored in Falcon tubes. The samples had a mean size of 0.5 cm², which is within the recommended range of 0.5–6.0 cm2/mL
suggested by the International Organization for Standardization (2012) [25], and the amount of growing medium required for each especimen was 1.414 ml. The samples of the adhesives remained in contact with DMEM for 24 h, 48h and 72h and then they were filtered (Syringe filter 0.22µm, TPP, Darmstadt, Germany) to eliminate solid particles..
2.6 Cytotoxicity assay
In 96-well culture plates (TPP, Darmstadt, Germany) 2×105 cells in
1mL of DMEM per well were cultured and grown to sub-confluent monolayers for 24h. The culture medium was then replaced with equal volumes (25µl) of adhesive extracts, using the culture medium itself as negative control. The evaluation of the cytotoxic activity was determined by the colorimetric method bromide [3 - {4,5-dimethylthiazol-2-yl} -2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (MTT) [26,27]. After 24 hours incubation, 25 µl (5 mg/ml) of MTT solution was added to each well and the plates were incubated for 3 hours. The MTT was then removed and 25µl per well dimethyl sulphoxide (DMSO) was added to each well to dissolve the formazan crystals. According to ISO 10993-12 [23], a decrease in number of living cells results in a decrease in the metabolic activity in the sample. This decrease directly correlates to the amount of blue-violet formazan formed, as monitored by the optical density (OD) at 570 nm. To calculate the reduction of viability compared to the negative control, this equation is used:
𝑉𝑖𝑎𝑏. % = 100 𝑥 𝐎𝐃570𝑒 𝐎𝐃 570𝑛𝑐
OD570e is the mean value of the measured optical density of the 100%
extracts of the test sample and OD570nc is the mean value of the measured
optical density of the negative control. The lower Viab.% value means higher the cytotoxic potential.
The cell viability was classified in non-cytotoxic (more than 90 per cent cell viability) slightly cytotoxic (60–90 per cent cell viability), moderately
50
cytotoxic (30–59 per cent cell viability) and severely cytotoxic (less than 30 per cent cell viability), according to Ahrari et al. [28].
2.7 Statistical analysis
Data were compared by ANOVA for two interactional factors (time of exposure and adhesives; adhesives and negative control group) and had a 5% margin of error.
3. Results
The results of cell viability (MTT assay) showed that all bonding agents had no cytotoxic effects (all values >90%) and the values of cell viability ranged from 94.2% (Group 9) to 109.6% (Group 2) (Fig. 2). The mean percentage of viability after exposure to the extracts of Single Bond (SB), Silorane System Adhesive Bond (SSAB) and Single Bond Universal (SBU) were 103.2%, 100.63% and 97.43%, respectively (Fig. 2). No statistically significant difference was observed (p=0.342) between the experimental and negative control groups.
Figure 2 - Effect of the dental adhesives on Vero cells after 24, 48 and 72 hours of exposure. Data are expressed as a percentage of the negative control cultures (p = 0.342).
24h 48h 72h Average
Adapter Single Bond 2 96,2 109,6 103,8 103,2
Silorane System Adhesive Bond 98,1 100,63 103,8 100,63
Single Bond Universal 101,9 96,2 94,2 97,43
85 90 95 100 105 110 115
Ce
ll
Vi
a
bi
li
ty
(%)
MTT Assay
51
Considering the average of viable cells in all tested materials the lowest score was observed after 24h (98.73%) of adhesive exposure to the culture medium (Fig. 3), although no statistically significant difference was observed (p=0.724).
Figure 3 - Average in percentage of three different exposure times (p=0.724)
4. Discussion
Oral cells can be exposed to polymers used in dentistry as the ones in dental adhesives, when they come in contact with gingival tissue, or indirectly when products are released from the polymers and migrate towards the pulpal or surrounding tissues [24]. In vivo studies provide the most authoritative results on biocompatibility. However, for ethical reasons, cytotoxicity evaluation of materials is mostly carried out on cell cultures [24,25,26]. The present study was conducted on Vero cells, according to ISO 10993- 5 (2009) recommendations [13]. These cell lines have well-defined culturing characteristics in experimental settings and have been previously used for this purpose [28,29].
Nowadays, two different bonding strategies are well accepted to obtain physical interaction between resin and dentine [30,31,32]. The first one is known as etch-and-rinse. It is based on the total removal of the smear layer and
Average 24h 98,73 48h 101,93 72h 100,06 97 98 99 100 101 102 103 C e ll V ia b ili ty ( % )
52
demineralization of the subjacent dentine, and is considered as golden standard for predictable adhesion to the tooth. With three steps adhesives (fourth generation), the etching is performed with phosphoric acid (30-40%) during 15 seconds. After the phosphoric acid removal, the primer and adhesive can be used. It can also be done by the two step technique (fifth generation), which involves using the phosphoric acid and then the adhesive and primer at once [20]. The second etching strategy (sixth and seventh generations) is based on using acid monomers, which are called self-etching primers or self-etching adhesives. They demineralize partially or completely the smear layer and subjacent dentine, incorporating and using them as a substratum for the adhesion [33,34].
The self-etching systems have acid hydrophilic monomers, HEMA (2-Hydroxyethyl- methacrylate) and dimethacrylate bifunctional. The increase in the concentration of acid monomers is needed to dissolve the smear layer and etch the subjacent dentine, and water is used as a mean of ionization of these acids resinous components. HEMA is added as a solvent, because some of the acidic monomers are not soluble in water directly [35].
The tested bonding agents can be classified, based on their adhesion strategy, into various generations and systems. Adapter Single Bond (fifth generation or three bottle system), Silorane System Adhesive Bond (sixth generation or two bottle system) and Single Bond Universal (seventh generation or one bottle system), which etch and prime simultaneously, because they have a high concentration of acidic resin monomers. The first two agents require the use of phosphoric acid or a primer containing methacrylate-based monomers as well. There are few in vitro studies that compare 5th generation adhesives with
new generations, and usually the comparison is made based on the etching technique. Most results showed that 6th and 7th generations are more cytotoxic
than 5th generation adhesives [21,22,23,24]. However, in the current study, no
cytotoxic effects were observed in the adhesives evaluated.
Any type of dental material needs to be qualified for clinical use, so firstly it should be tested for its effectiveness and biocompatibility. We have many different in vitro studies that can be used for this purpose. MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) is a well-known and accepted cytotoxicity assay [3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14]. Viable cells reduce the
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MTT tetrazolium salt to a blue and insoluble product formazan, which precipitates in the cytoplasm. The advantages of this assay are: accuracy, speed and no radioisotope needs to be used [9].
In this study we chose to test materials of the same manufacturer, with the intention of evaluating the possible cytotoxicity based on the different adhesives generations and systems. As the three chosen types are highly used in clinical practice worldwide, it is important that the evolution of materials and techniques are also reinforced by scientific tests. The extracts used in the present study were obtained by immersing the samples in the culture medium for either 24, 48h or 72 h, which is a sufficient period for 85% of the unreacted monomer to be released [35].
The current study showed all of the tested adhesives presented a very high percentage of viable cells (>90%) [30]. Exposure time mean (mean of all adhesives tested) showed a slightly increase in the cell viability from 24h (98.73%) to 48h (101.93%) and a slight decrease at 72h (100.06%). The individual mean of SB (103.2%) and SSAB (100.63) were above the negative control (100%). These results are important and reinforce that the adhesives tested were not cytotoxic in this assay. Although the components (HEMA, TEGDMA, phosphate monomer) might seem toxic after the initial monomer release [36,37], they did not interfere in cell growth, which may have led them to proliferate as they usually would in favorable conditions. Similar findings have been observed in previous studies using Easy Bond, with percentages of cell viability from 103.37% to 110.39%, depending on the methodology [38,39]. Cell viability over 100% observed in some experimental groups can be attributed to the accumulation of cell waste products and metabolites in the control negative cells, as the media had not been changed for the last 48h whilst our cells seemed almost 100% confluent at 24h. Thus, the programmed cell death took place to rescue some cells on the expense of others [38].
In this experiment, SB showed no citotoxicity, differing from previous studies [21,40], which found values that ranged from 64.56% to 82.33%. This can be explained as those authors used unpolymerized liquid form of adhesives directly on cells, decreasing the cell viability when compared with the current study. We followed ISO (2012) [25] recommendations for sample preparations, which considers as appropriate pieces of approximately 10 mm x 50 mm or 5
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mm x 25 mm to calculate and obtain a proper quantity of medium. This can also be explained as they used a different type of cell line, mouse fibroblasts cells (3T3) and bovine dental papilla-derived cells (SV3NeoB),
Although no statistically significant difference was found (p=0.342), Group 9, a new one-step self-etching adhesive, showed a slight decrease (94,2%) in Vero cells than the other fifth (103,8%) and sixth generation (103,8%) adhesives, similar to observed in previous studies that involved SB and self-etching adhesives [1,22,40,41]. In accordance with recent studies, although no cytotoxic effects have been observed, the result of SUB can be attributed to one of its components, the phosphate monomer. Amongst seven different solvents, it has been considered the most cytotoxic followed by HEMA, THF, acetone and ethanol [37].
Group 1 had 96.2% of cell viability, followed by Group 4 (98.1%) and Group 7 (101.9%). The average of all tested materials showed the lowest score after 24h (98.73%) of adhesive exposure to the culture medium. This can be explained because just 50-75% of the monomers polymerize, the rest remain as free radicals, mainly reactive oxygen species (ROS), which have the ability to diffuse constituting a biological risk to cells at immediate times of exposure [36,42,43].
Group 2 had 109.6% of cell viability, followed by Group 5 (100,63%) and Group 8 (96.2%), this can suggest a little cell growth in Group 2 and 5 and a slight decrease in Group 8 [34,40,42]. Group 3 and Group 6 showed the same percentage of cell viability (103.8%).
The differential viability/cell proliferation induced by the materials tested could be attributed to the different components, the interactions between them, the degree of resin polymerization and the type of cultured cell [44]. According to this study all adhesives showed no cytotoxicity at all, but further studies should be performed with dentin barrier or in vivo to find more accurate results, as in clinical use there are other variants that cannot be reproduced in vitro.
5. Conclusions
Based on the results, we reject the hypothesis hence all adhesives tested in this study presented no cytotoxicity to Vero cells in vitro at all times tested.
55
Conflict of interest statement
The authors declare no conflicts of interest.
Acknowledgements
We thank Mariana Barreto for the support and Dr. Paloma Lys Medeiros for Vero cells donation.
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