LIANA SOARES. Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado

Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado

Cuiabá – MT Março - 2012

LIANA SOARES

Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal

Área de Concentração: Produção Animal

Orientador: Profa. Dra. Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis

Co-Orientador: Prof. Dr. Joanis Tilemahos Zervoudakis

Cuiabá – MT Março – 2012

FICHA CATALOGRÁFICA

Catalogação na fonte: Maurício S.de Oliveira CRB/1-1860. S676v Soares, Liana Cristina de Moura.

Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado / Liana Cristina de Moura Soares. -- 2012.

66 f. ; 30 cm (incluem figuras e tabelas)

Orientadora: Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis. Co-orientador: Joanis Tilemahos Zervoudakis.

Dissertação (mestrado) -- Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação Ciência Animal, Cuiabá, 2012.

FOLHA DE APROVAÇÃO

Aluna: LIANA CRISTINA DE MOURA SOARES.

Título: Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado

Aprovado em:26/03/2021

Profª. Drª.: Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis (FAMEV/UFMT – Orientadora)

Prof. Dr.:Joanis Tilemahos Zervoudakis (FAMEV/UFMT – Co- Orientador)

Prof. Dr.: Luciano da Silva Cabral (FAMEV/UFMT – Membro)

Prof. Dr.: Marcílio Nichi

( Universidade de São Paulo – USP - MEMBRO)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal

DEDICATÓRIA

À Deus

Aos meus pais Luiz e Cecília Ao meu marido Rinaldo

AGRADECIMENTOS

A Deus por me proporcionar tudo de melhor, e me guiar pelos caminhos que ele designou melhor para mim.

Aos meus pais Luiz e Cecília e ao meu marido Rinaldo por todo apoio e confiança, por acreditarem e me ajudarem em mais uma etapa da minha vida.

A professora Luciana Keiko Hatamoto Zervoudakis pela confiança e paciência. A amiga Camila Pasa, por fazer parte desta conquista.

Aos Professores Joanis Tilemahos Zervoudakis e ao Professor Luciano as Silva Cabral pelo aprendizado, e pela atenção comigo.

Ao proprietário da Fazenda Kangayan Olímpio Riso de Brito por ceder os animais e toda estrutura para realização do experimento.A Tauna de Brito por auxiliar na coleta dos animais.

Aos colegas de mestrado Moacir, Leodil e aos estagiários Fabiana (Gaúcha), Paulo Henrique (PH) e Pedro (Japonês) por serem peças de extrema importância para a execução e conclusão deste trabalho.

A empresa Bioembryo em especial a Lívia, José Eduardo e Joyce pela execução da fecundação in vitro.

Ao PGCA pela oportunidade de realizar o mestrado, e a CAPES pela bolsa concedida.

A todos que de forma direta ou indireta contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho,

RESUMO

SOARES, L. Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado. 2012. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2012.65 p.

Objetivou-se avaliar os efeitos da vitamina E sobre a fertilidade do sêmen bovino. No primeiro trabalho (Adição de vitamina E no meio de criopreservação e avaliação da fertilidade do sêmen bovino) o objetivo foi avaliar a adição de vitamina E ao diluidor de sêmen criopreservado de bovinos, sobre a qualidade espermática, o nível de estresse oxidativo e desenvolvimento inicial de embriões produzidos “in vitro”. Foram utilizados 38 touros da raça Nelore com idade média de 36 meses e peso corporal médio de 490 kg. O ejaculado foi coletado pelo método de eletroejaculação. Em seguida, o sêmen foi submetido a exames imediatos: volume, aspecto e coloração do ejaculado, turbilhonamento, motilidade, vigor espermáticos e concentração espermática para posterior diluição. Foram coletadas alíquotas para as avaliações de: morfologia espermática (defeitos maiores, menores e totais), viabilidade espermática (coloração eosina-nigrosina), avaliação do estresse oxidativo (TBARS – espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico). Após as avaliações alíquotas do ejaculado foram diluídas em quatro tratamentos: Tratamento controle (TC) apenas diluidor lactose – gema (meio base); Tratamento 10 (T10) meio base com adição de 10 mMol/mL de vitamina E; Tratamento 30 (T30) meio base com adição de 30 mMol/mL de vitamina E; Tratamento 50 (T50) meio base com adição de 50 mMol/mL de vitamina E, de modo que a concentração final obtida fosse de 22,5 milhões de espermatozóides/ml. O sêmen foi resfriado a 5oC por 4 horas e então envasados em palhetas de 0,5 ml, congelados em vapor de nitrogênio por 15 minutos e conservados em nitrogênio líquido até o momento das análises. Posteriormente, as palhetas foram descongeladas em banho maria a 36°C por 30 segundos e analisadas para motilidade, vigor, viabilidade espermática, avaliação do estresse oxidativo e a fertilidade dos espermatozóides através da produção in-vitro de embriões (PIV). O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado e os dados analisados através da ANOVA e o efeito de tratamento foi comparado

através do SNK (Student-Newman-Keuls) com nível de significância de 10%. O vigor espermático não diferiu entre os valores médios observados nos tratamentos (p>10). O tratamento controle proporcionou menor perda de qualidade na motilidade progressiva retilínea após o descongelamento (13,31±2,34%) comparado aos demais grupos experimentais T10 (5,36±0,92%); T30 (8,15±1,80%) e T50 (10,10±1,57%). Na avaliação do estresse oxidativo dos espermatozóides os valores médios obtidos nos tratamentos T10 (50,91±7,22 ng/ml); T30 (65,88±2,58 ng/ml) e T50 (84,22±11,68 ng/ml), foram superiores aos resultados obtidos no tratamento controle TC (13,07±1,87ng/ml) (p≤0,0001). Na PIV o T50 proporcionou maior produção de embriões in vitro (39,85%±6,22%) que os outros tratamentos; T10 (27,26±6,63); T30 (25,88±5,69), entretanto sem diferenças estatísticas do grupo Controle (27,90±3,89). Pode-se concluir que a utilização de vitamina E no meio de criopreservação do sêmen bovino não preservou a qualidade da célula espermática criopreservada, não reduziu o estresse oxidativo nem melhorou a produção in vitro de embriões. No experimento 2 (Suplementação oral com vitamina E: integridade da membrana espermática e qualidade seminal em touros suplementados à pasto) objetivou-se avaliar a integridade da membrana e qualidade seminal de touros da raça Brangus suplementados com vitamina E e criados a pasto. Foram utilizados 11 touros Brangus com idade média de 120 meses e peso médio de 442,2 Kg distribuídos aleatoriamente em dois tratamentos: grupo controle (GC) e grupo suplementado com vitamina E (GS- 400 UI de vitamina E/dia) adicionados ao suplemento concentrado. Cada grupo foi mantido separado em piquetes formados por pastagem de Panicum maximum cv. Mombaça e receberam concentrado diariamente na quantidade de 4,5 kg/animal. A suplementação com vitamina E foi realizada por 60 dias. Durante o período experimental foram realizadas 4 coletas de sêmen sendo: uma antes do início da suplementação; uma com 30 outra com 60 dias de suplementação, e uma 15 dias após o término da suplementação. O sêmen foi coletado por eletroejaculação, em tubo graduado, aferiu-se o volume, cor e aspecto do ejaculado. Em seguida foram avaliados motilidade (MOT), vigor (VIG) e turbilhonamento espermático. Foram realizados testes para avaliar a morfologia espermática (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais), integridade da membrana espermática (teste hipoosmótico, HIPO) e da membrana acrossomal (coloração fast green rosa bengala, POPE) e para avaliar a viabilidade espermática (coloração eosina nigrosina, EOS) e reação de acrossoma (coloração Tripan Stain). O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado com medidas repetidas no tempo. Os dados

foram analisados através da ANOVA e do teste SNK com um nível de significância de 10%. Foi encontrado efeito da interação coleta x tratamento na avaliação da reação acrossomal (TRIPAN) (P<0,10). Foram encontrados efeito da coleta para (CONSISTÊNCIA) (p≤0,0001); volume do ejaculado (p=0,0442); vigor espermático (p=0,0263); defeitos maiores (p=0,0515) ; defeitos totais (p=0,0703), teste hiposmótico (p=0,0131) e integridade acrossomal (POPE) (p=0,0006). Não foram encontradas diferenças (p>0,10) para as demais variáveis: motilidade, concentração turbilhonamento, defeitos menores e circunferência escrotal. Com os resultados obtidos nas condições experimentais do presente trabalho, conclui-se que a suplementação oral com vitamina E de 400UI/dia não alterou a qualidade seminal nem a integridade da membrana espermática da célula espermática.

ABSTRACT

SOARES, L. Vitamin E and quality of fresh and cryopreserved bull semen. 2012. Dissertation (mestrado em Ciências Animal), Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, 2012.p.

The objective was to evaluate the effects of vitamin E on fertility of bulls. In the first study (Addition of vitamin E in the extender of cryopreservation and evaluation of the bovine semen fertility) the objective was to evaluate the addition of vitamin E to the extender cryopreserved bovine semen on the sperm quality, the level of oxidative stress and early development produced embryos "in vitro". We used 38 Nelore bulls with an average age of 36 months and mean body weight of 490 kg. The ejaculate was collected by electroejaculation method. Then the semen was immediately subjected to tests: volume, appearance and color ejaculate, whirling, motility, sperm vigor and sperm concentration for subsequent dilution. Aliquots were collected for assessments: morphology (major defects, minor and total), sperm viability (eosin-nigrosin staining), assessment of oxidative stress (TBARS - thiobarbituric acid reactive species). After the assessment of semen aliquots were diluted into four treatments: control treatment (CT) only lactose - gem (basic extender); Treatment 10 (T10) base extender with the addition of 10 mmol/mL of vitamin E; Treatment 30 (T30) basal extender with added 30 mmol/mL of vitamin E; 50 treatment (T50) using the base extender with the addition of 50 mmol/mL of vitamin E, so that the final concentration was 22.5 million spermatozoa / mL. The semen was cooled to 5 °C for 4 hours and then loaded into 0.5ml straws, frozen in nitrogen vapor for 15 minutes and stored in liquid nitrogen until the analysis. Straws were thawed in a water bath at 36 °C for 30 seconds and analyzed for motility, vigor, sperm viability, assessment of oxidative stress and fertility of the sperm through in vitro embryo production (FIV). The experiment was conducted in experimental completely randomized design and data analyzed using ANOVA and the effect of treatment was compared by the SNK (Student-Newman-Keuls) with a significance level of 10%. The spermatic did not differ between the mean values observed in the treatments (p>10). The control treatment resulted in less loss of quality in straight

progressive motility after thawing (13.31 ± 2.34%) compared to other experimental groups T10 (5.36 ± 0.92%), T30 (8.15 ± 1,80%) and T50 (10.10 ± 1.57%). In the evaluation of oxidative stress sperm average values in the treatment T10 (50.91 ± 7.22ng / ml), T30 (65.88 ± 2.58 ng/ml) and T50 (84.22 ± 11.68 ng/ml) were superior to results obtained in the control treatment TC (13.07 ± 1.87 ng/ml) (p ≤ 0.0001). In PIV T50 produced higher in vitro embryos (39.85% ± 6.22%) than other treatments, T10 (27.26% ± 6.63), T30 (25.88% ± 5.69), however no significant differences from the control group (27.90% ± 3.89). Concluded that the use of vitamin E in the extender of cryopreservation of bovine semen did not preserve the quality of semen cryopreserved cell, did not reduce oxidative stress or improved in vitro production of embryos. In experiment 2 (Oral supplementation with vitamin E: sperm membrane integrity and semen quality in supplemented bulls to grazing) aimed to evaluate membrane integrity and sperm quality in Brangus bulls supplemented with vitamin E and raised on pasture. Were used 11 Brangus bulls were used with mean age of 120 months and mean weight of 442.2 kg, randomly distributed into two treatments: control group (CG) and vitamin E-supplemented group (GS-400 IU vitamin E / day) added to supplement concentrated. Each group was kept in a separate paddock of Panicum maximum cv. And concentrated Mombaça received daily in the amount of 4.5 kg/animal. Supplementation with vitamin E was performed for 60 days. During experimental period were performed four semen collections: one before the start of supplementation, another one with 30 and 60 days of supplementation, and 15 days after the end of supplementation. Semen was collected by electroejaculation in graduated tube, has measured volume, color and ejaculate appearance. They were then evaluated motility (MOT), vigor (VIG) and turbulence sperm. Tests were conducted to evaluate the sperm morphology (major defects, minor defects and total defects), sperm membrane integrity (hypoosmotic test, HIPO) and acrosomal membrane (fast green rose bengal staining, POPE) and to evaluate sperm viability (eosin nigrosin staining, EOS) and acrosome reaction (Stain Trypan staining). The experiment was conducted in completely randomized design with repeated measures. Data were analyzed by ANOVA and SNK test with a significance level of 10%. Found a significant interaction between treatment x collection in assessing the acrosome reaction (trypan) (P <0.10). Were found to effect the collection (Consistency) (p ≤ 0.0001), volume (VOLUME) (p = 0.0442); force (FORCE) (p = 0.0263), larger defects (p = 0.0515) ; total defects (p = 0.0703), hypoosmotic test (HIPO) (p = 0.0131) and acrosomal integrity (POPE) (p = 0.0006). There were no significant differences (p>

0.10) for the other variables: motility, concentration, turbulence, minor defects and scrotal circumference. With the results obtained in the experimental conditions of this study, we conclude that oral supplementation with vitamin E, 400UI/dia vitamin E did not alter the quality of semen or sperm membrane integrity of sperm cells.

LISTA DE ABREVIATURAS

ATP adenosina tri fosfato

CAT Catalase

ºC Graus Celsius

Cu+ íon cuproso

Fe+ Íon ferroso

ROS espécies reativas de oxigênio

GPx glutationa peroxidase

GRD glutationa redutase

GSH glutationa reduzida

G6PD glicose-6-fosfato desidrogenase

H2O molécula de água

H2O2 peróxido de hidrogênio

Kg Quilograma

LOO- Peroxil

NADPH nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato reduzida

O2 molécula de oxigênio

O2- ânion superóxido

OH- radical hidroxila

Prx Peroxiredoxinas

SOD superóxido dismutase

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. _{Principais tipos de reações radicalares}

_...

22 Figura 2. Formação de radicais livres na cadeia de transporte de elétrons

mitocondrial

...

23 Figura 3. _{Etapas da lipoperoxidação e ação antioxidante do α-tocoferol}

_...

27

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Páginas

Tabela 1. Média e Erro padrão das características físicas do sêmen fresco de bovinos da raça Nelore em pastejo

...

40

Tabela 2. _{Composição do meio diluente Lactose – Gema}

_...

41

Tabela 3. Médias, erro padrão das médias e nível de significância (P) para as características físicas do sêmen pós

congelamento/descongelamento de bovinos da raça Nelore±36 meses de idade criopreservado com vitamina E

...

43

Tabela 4. Médias,erros padrões e níveis de significância (P) da produção in vitro de embriões utilizando o sêmen bovinos da raça Nelore criopreservado em meio suplementado com vitamina E

...

45

Capítulo 2

Páginas Tabela 1. Composição químico-bromatológica do suplemento

concentrado e da forragem utilizada na alimentação dos animais experimentais com base na matéria natural

...

53

Tabela 2. Média ± erro padrão da média das variáveis: circunferência escrotal (CE), consistência (CONS), volume (VOL), vigor espermático (VIG), % de defeitos maiores (DEFMA), % de defeitos totais (DEFTOT) das amostras seminais de touros Brangus não suplementados (Coleta 1) ou suplementados com vitamina E (Coleta 2 e 3) e após 15 dias da suplementação (Coleta 4)

...

56

Tabela 3. Média ± erro padrão da média das variáveis: circunferência escrotal (CE), consistência (CONS), volume (VOL), motilidade espermática (MOT), vigor espermático (VIG), turbilhonamento (TURB), concentração do ejaculado(CONC), % de defeitos menores (DEFME), % de defeitos maiores (DEFMA), % de defeitos totais (DEFTOT) das amostras seminais de touros Brangus não suplementados (GC) ou suplementados com vitamina E (GE)

...

58

Tabela 4. Média ± erro padrão da média das variáveis espermatozóides vivos com acrossoma intacto (TR1–1), espermatozóides vivos com reação acrossômica (TRI–2), espermatozóides mortos com acrossoma intacto (TRI 3), espermatozóides mortos com reação acrossômal (TRI-4) do sêmen fresco e de touros Brangus por coleta

...

59

Tabela 5. Consumo estimado diário de vitamina E na forragem (Mombaça), no concentrado, no mombaça + concentrado (situação do grupo controle, GC) e no mombaça + concentrado + suplementação (grupo suplementado com vitamina E, GE) dos animais experimentais

...

60

SUMÁRIO

Páginas

1.Introdução

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18

2. Revisão Bibliográfica

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19

2.1 Uso de sêmen bovino criopreservado na produção animal

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19

2.2. Estresse oxidativo

...

20

2.3 Danos provocados nos espermatozóides durante processo de congelamento e descongelamento

...

21

2.4 Antioxidantes

...

25

2.5 Vitamina E

...

25

2.6 Suplementação oral com vitamina E

...

28

2.7 Referência Bibliográfica

...

30

3. Capítulo 1 – Vitamina E e qualidade do sêmen bovino fresco e criopreservado

...

35 3.1 Introdução

...

38 3.2 material e métodos

...

39 3.3 Resultados e discussões

...

43 3.4 Conclusão

...

45 3.5 Referências

...

47

4. Capítulo 2 – Suplemetação oral com vitamina E: integridade da membrana espermática e qualidade seminal em touros suplementados à pasto

...

48

4.1 Introdução

...

51

4.2 Material e métodos

...

52

4.3 Resultados e discussões

...

55

4.4 Referências

...

62

1. INTRODUÇÃO

Os termos espécies reativas oxidantes e espécies reativas do metabolismo do oxigênio (ROS Reactive Oxygen Species) são usados no meio científico para identificar os intermediários químicos reativos oriundos do metabolismo do oxigênio, entre eles: o radical superóxido (O

2

-), radical hidroxila (OH-) e peróxido de hidrogênio (H 2O2) (HALLIWELL et al., 1992).

Os espermatozóides são capazes de gerar e degradar os ROS, sendo um processo fisiológico normal, porém, quando há um desbalanço entre a produção e inativação dos ROS, tem-se o estresse oxidativo (HALLIWEL, 1991).

Os espermatozóides possuem uma membrana plasmática com grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados e seu citoplasma possui baixas concentrações de enzimas antioxidantes. Contudo, o plasma seminal, que é rico em antioxidantes, oferece proteção ao espermatozóide, compensando a baixa quantidade de enzimas antioxidantes (AITKEN, 1994).

Para prevenir e reduzir os efeitos causados pelo estresse oxidativo, o organismo possui mecanismos de defesa. A vitamina E desempenha papel importante, participando da estrutura ou como co-fator de enzimas antioxidantes. A vitamina E tem como função a manutenção da integridade e da funcionalidade dos sistemas reprodutivo, muscular, circulatório, nervoso e imune. Ela também esta relacionada a reações normais de fosforilação (ATP), proteção das vitaminas A e C contra oxidação, metabolismo de aminoácidos sulfurosos, metabolismo da vitamina B12 e vitamina D no fígado e rins (KOURY e DONANGELO, 2003).

Na espécie bovina encontram-se poucos estudos sobre o efeito benéfico da vitamina E sobre as características reprodutivas em machos.

Os trabalhos foram realizados com o objetivo de verificar se a vitamina E atua na proteção da célula espermática , integridade de membrana, promovendo a melhora da mesma como motilidade, vigor, turbilhonamento, viabilidade espermática, concentração, redução da peroxidação lipídica (estresse oxidativo), redução dos defeitos maiores, menores e totais, aumento na fertilidade de reprodutores bovinos machos avaliados através da produção de embriões in vitro.

2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Uso de sêmen bovino criopreservado na produção animal

A pecuária brasileira é uma atividade de grande importância para a economia do país por se destacar pelo seu elevado potencial e possibilidade de crescimento.

O aumento na produtividade pode ser atingido com o uso de biotécnicas que melhorem o sistema de produção com a inseminação artificial em tempo fixo como exemplo, buscando maior produção por área e assim minimizando os custos de produção. A utilização de biotécnicas aplicadas à reprodução permite mazimizar o uso de genética superior, permitindo o aumento na produtividade (CELEGNHINI, 2005).

A inseminação artificial em bovinos é uma biotecnologia reprodutiva que serve como uma ferramenta para o melhoramento genético dos rebanhos e possui custos mais acessíveis. Entretanto para sua realização é necessário o uso de sêmen congelado (CELEGNHINI, 2005). Anteriormente ao desenvolvimento das técnicas de congelação/descongelação dos espermatozóides, a inseminação artificial era realizada com sêmen fresco (THACKER e ALMQUIST, 1953). A longevidade espermática era em média ao redor de 48 horas, logo este representava um dos principais entraves para a difusão da técnica de inseminação artificial (THACKER e ALMQUIST, 1953).

Tal panorama só fora mudado a partir de meados do século XXI com o advento dos agentes crioprotetores, que são moléculas capazes de garantir a sobrevivência espermática após o processamento sob baixas temperaturas, viabilizando a estocagem de material genético por longo período de tempo (HOLT, 2000).

A observação de que os espermatozóides, especialmente de bovinos, representavam células passíveis de congelação e que poderiam ser estocados por longos períodos de tempo foi uma das descobertas para o grande sucesso nos programas de inseminação artificial (HOLT, 2000).

O sucesso da criopreservação de sêmen aumenta as vantagens da inseminação artificial, pois o armazenamento por longo prazo facilita o transporte à distância, permite a quarentena do sêmen, a utilização de germoplasma superior (mesmo depois da morte do touro); permite a distribuição da genética de diferentes touros para o comércio mundial, atua no controle de doenças passíveis de transmissão através do sêmen, além de ser uma biotecnologia fundamental para a obtenção de animais com maior potencial

de produção e reprodução (otimizando o sêmen dos animais melhoradores através da diluição do ejaculado) (VERBERCKMOES et al., 2005; BARUSELLI et al., 2004).

No Brasil, apenas 9% das fêmeas em idade reprodutiva são inseminadas. O total de doses de sêmen utilizadas no ano de 2011 foi de 11.906.763 doses, tendo assim uma evolução de 13,69% de utilização de doses quando comparada ao ano de 2009 (ASBIA, 2011).

2.2 Danos provocados nos espermatozóides durante processo de congelamento e descongelamento

Embora a criopreservação tenha se tornado um procedimento de rotina na indústria bovina da inseminação artificial, admite-se que a maioria dos protocolos utilizados baseiam-se em observações empíricas resultando em um número considerável de espermatozóides que falham em sobreviver ao processamento (NAGY et al., 2004). A queda na viabilidade espermática imposta pela congelação/descongelação é responsável pela redução significativa do potencial de fertilização das amostras congeladas com a maioria das técnicas vigentes (WATSON, 2000).

O processo de criopreservação é responsável pelo decréscimo de 50% a 60% na viabilidade dos espermatozóides, cerca de 85% dos espermatozóides bovinos presentes em uma amostra seminal sofrem algum tipo de injúria durante o processo de congelação/descongelação (CHAVEIRO et al., 2006).

Mudanças na estrutura e na integridade da membrana plasmática parecem ser um importante componente associado com a redução da fertilidade dos espermatozóides pós-descongelamento. Mudanças na conformação da membrana, que podem ser ocasionadas pela criopreservação, resultam em arranjos anormais dos fosfolipídeos e proteínas, permitindo rápida passagem de moléculas que atravessam a membrana citoplasmática (HOLT, 2000).

De acordo com Bailey et al. (2000), após a criopreservação, os espermatozóides sobreviventes possuem mais cálcio intracelular que antes do processo, o que reflete em danos acometidos à membrana no mecanismo de permeabilidade seletiva. Na refrigeração lenta à mudança de temperatura determina estresse sobre a membrana, sendo provável que este processo seja devido à mudança de fase dos lipídeos da bicamada e alteração do estado funcional da membrana (WATSON, 1995). As mudanças inerentes a refrigeração de qualquer célula são aumentadas pelo choque frio

presumindo-se que com uma redução rápida na temperatura, a reorganização das membranas é mais difícil, com um aumento na permeabilidade, prejudicando a manutenção do metabolismo e o gradiente iônico (AMANN e PICKET, 1987).

Se os períodos de resfriamento e equilíbrio forem controlados, os espermatozóides, ao invés de sofrerem choque térmico sofrerão modificações graduais na membrana plasmática e de fluxos iônicos, que conferem às células maior resistência durante o congelamento (HOLT, 2000).

Adicionalmente, os fosfolipídios do diluidor do sêmen interagem com os lipídios da membrana plasmática dos espermatozóides conferindo-lhes maior resistência ao choque térmico e auxiliando na preservação da integridade celular durante a preservação do sêmen (WATSON, 1995).

Os eventos físicos que ocorrem nas células dependem da velocidade de congelamento, pois quando as células são congeladas rapidamente, não há perda de água, promovendo com isso a formação de cristais de gelo intracelular, causando conseqüentemente lesões nas estruturas celulares, fato este que compromete a função celular. No entanto, quando o processo de congelamento é muito lento, ocorre congelamento da água extracelular com conseqüente concentração de soluto, deixando as células momentaneamente em meio hipertônico, fazendo com que percam água rapidamente. Esse efeito induz o aumento na concentração de soluto intracelular, promovendo morte celular por desidratação. Logo, os principais danos celulares ocorridos durante a criopreservação são causados pela cristalização e desidratação (WATSON, 1995).

Além das lesões sofridas pela membrana plasmática durante o congelamento, também ocorrem danos durante o processo de reaquecimento da célula apos o descongelamento, uma vez que a membrana e submetida a rearranjos estruturais envolvendo lipídios e proteínas, e a passagem rápida para o interior da célula pode causar o rompimento das membranas (HOLT, 2000).

2.3 Estresse Oxidativo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) é um termo que abrange todas as formas reativas do oxigênio, incluindo radicais e não-radicais, que participam da iniciação e progressão das reações em cadeia envolvendo a formação de espécies radicalares. A reatividade destes compostos com biomoléculas é variável, sendo alguns estáveis e

pouco reativos, como por ex. o radical superóxido, e outros altamente reativos, apresentando velocidade de reação próxima à constante de colisão com moléculas-alvo (radical hidroxila, HO•). Embora ROS seja associada à oxidação, algumas são agentes redutores em meio biológico, mas também contribuem para reações em cadeia que convergem para dano em biomoléculas (HALLIWEL e GUTTERIDGE, 1999). Os principais tipos de reações que envolvem radicais livres estão sumarizados na Figura 1.

As reações de eliminação de radicais livres (Equações 1 a 6, FIGURA 1) não são favorecidas em condições fisiológicas normais, devido às suas baixas concentrações. Assim, a principal forma de eliminação destas espécies e, portanto, da interrupção de reações em cadeias propagadas por elas depende da ação de compostos denominados antioxidantes (AUGUSTO et al., 1995).

Figura 1 – Principais tipos de reações radicalares. FONTE: Cerqueira et.al.(2007).

O próprio O2 no estado fundamental é um radical, uma vez que contém 2 elétrons desemparelhados no último orbital molecular. Todavia, o oxigênio reage lentamente com compostos que não possuam elétrons desemparelhados, ou seja, não reage com a maioria dos componentes celulares. Entretanto, a reação de O2 com íons de metais de transição e radicais livres resulta em uma variedade de ROS, que podem efetivamente iniciar reações em cadeia e atacar biomoléculas (HALLIWEL e GUTTERIDGE, 1999). Estima-se que cerca de 0,1% do O2 utilizado durante a

respiração mitocondrial forma ROS, devido ao escape dos elétrons dos complexos que compõem a cadeia respiratória (Figura 2).

Figura 2 - Formação de radicais livres na cadeia de transporte de elétrons mitocondrial. FONTE: Cerqueira et.al.(2007).

Além da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, ROS também são produzidas endogenamente por vários sistemas enzimáticos e células do sistema imune, além de serem formadas a partir da exposição à radiação ionizante (DJORDJEVIC, 2004).

Embora certo nível de ROS esteja envolvido na regulação de processos fisiológicos, o excesso na produção destes compostos leva à superestimulação de algumas vias intracelulares, o que geralmente está associado ao aparecimento de diversas doenças. Além disso, a própria natureza reativa destas espécies leva a modificações em biomoléculas, provocando alterações em suas estruturas e funções. Entre as alterações mais drásticas encontram-se alterações na ribose e bases nitrogenadas do DNA (ácido desoxirribonucléico); ligações cruzadas entre bases nitrogenadas, DNA e proteínas e proteína- proteína; formação de adutos; peroxidação de PUFAs (ácidos graxos poliinsaturados) que compõem membranas plasmáticas e lipoproteínas e nitração e nitrosilação de proteínas (GUTTERIDGE, 1995).

Em vista dos prejuízos provenientes do excesso de ROS, as células dispõem de uma variedade de mecanismos de defesa contra os danos causados por estas espécies: as defesas antioxidantes. Para o funcionamento celular normal, deve haver uma compensação entre a formação de ROS e os níveis de defesas antioxidantes, que

mantêm a célula em estado geral reduzido. Se as defesas antioxidantes tornam-se insuficientes frente à excessiva produção de ROS, ocorre o chamado estresse oxidativo (DROGE, 2003).

Halliwell e Gutteridge (1992) definiram antioxidante como alguma substância presente em concentrações baixas, comparadas às concentrações do substrato oxidante, que previne significativamente ou atrasa a oxidação de substratos susceptíveis. Os principais mecanismos de ação de compostos antioxidantes incluem captadores de radicais e supressores de estados excitados; sistemas catalíticos que neutralizam ou eliminam ROS e a ligação de íons metálicos a proteínas, o que os torna indisponíveis para a produção de espécies oxidantes.

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) ocorre fisiologicamente durante o metabolismo celular, sendo oriundo da fosforilação oxidativa que ocorre nas mitocôndrias a principal fonte intracelular de ROS, onde cerca de 2% do oxigênio (O2) é consumido completamente reduzido, gerando O2-. O estresse oxidativo tem sido considerado responsável por diferentes tipos de injúrias, incluindo a peroxidação lipídica de membranas, a oxidação de aminoácidos e ácidos nucléicos, apoptose e necrose (HALLIWELL et al., 1992).

Os danos celulares causados nos espermatozóides são resultado de um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) e sua eliminação por antioxidantes. Normalmente nas gônadas e no fluido seminal são mantidos níveis adequados dos antioxidantes: superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa (GSH) peroxidase e redutase, que são responsáveis por manter o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, sendo o desequilíbrio entre estes é denominado de estresse oxidativo. O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica que causa danos as membranas espermáticas alterando sua funcionalidade, causando disfunção espermática, diminuição da mobilidade e fertilidade (SIKKA, 1996).

Os principais produtores de radicais livres no sêmen são os leucócitos e os espermatozóides. A produção de ROS é um dos principais mecanismos pelo qual os neutrófilos destroem patógenos, sendo uma possível fonte geradora de estresse oxidativo no sêmen. A produção de ROS por espermatozóides parece estar associada com a retenção do citoplasma residual na peça intermediária (gota proximal) após a espermiação, sendo o aparecimento de gota proximal nos espermatozóides é observada quando estes animais são submetidos ao estresse térmico. A razão pela qual as células com um excesso de citoplasma residual apresentam altas taxas de produção de ROS está

relacionada com a presença de outra enzima citoplasmática, a glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD). Esta enzima mantém os níveis de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH), que por sua vez, é uma fonte de elétrons estimulando a produção de ROS (BARTH e OKO, 1989).

2.4 Antioxidantes

Antioxidante pode ser definido como qualquer substância que quando presente em baixa concentração, comparada àquela do substrato oxidável, e que retarda ou previne significativamente a oxidação daquele substrato (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1984).

Para proteger-se do efeito letal da formação excessiva de ROS, a célula possui um sistema de defesa antioxidante enzimático e um não enzimático. O sistema enzimático é composto pelas enzimas superóxido dismutase (SOD - remove o radical superóxido, convertendo-o em peróxido de hidrogênio); catalase (CAT – destrói o peróxido de hidrogênio, convertendo-o em água e oxigênio), peroxiredoxinas (Prx), glutationa (GSH), glutationa redutase (GR) e glutationa peroxidase (GPx – mais importante na remoção de peróxidos na célula). Fazem parte do sistema não enzimático um grande número de compostos de baixo peso molecular, incluindo as vitaminas C e E, diferentes compostos de selênio, ubiquinonas (coenzima Q), ácido úrico e ácido lipóico (NORDBERG e ARNÉR, 2001). Esse sistema pode atuar em duas linhas: como removedor, varredor do agente antes que ele cause lesão (glutationa redutase, superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase e vitamina E) ou como reparador da lesão ocorrida (ácido ascórbico, GR e GPx) (FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Com exceção da vitamina E (α-tocoferol), que é um antioxidante estrutural de membrana, a maior parte dos agentes antioxidantes encontra-se no meio intracelular (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).

2.5 Vitamina E

Vitamina E é um termo nutricional que se refere a um grupo de tocoferóis e tocotrienóis com atividade antioxidante. Apenas oito moléculas naturais possuem atividade antioxidante: quatro tocoferóis (α, β, γ, δ) e quatro tocotrienóis (α, β, γ, δ), (BRIGELIUS-FLOHÉ e TRABER, 1999; HALLIWELL e GUTTERIDGE ,1999). O

α-tocoferol é a forma mais abundante na natureza e a que possuí maior atividade biológica (BRIGELIUS-FLOHÉ e TRABER, 1999).

A molécula de vitamina E é dividida em duas partes: um anel cromanol, também chamado de cabeça hidrofílica e uma cadeia ou cauda de hidrocarbonetos (hidrofóbica), que serve para ancorá-la na membrana lipídica. O grupo OH pertence ao anel cromanol que é o responsável por sua atividade antioxidante. Essa vitamina é conhecida como o principal antioxidante lipofílico que protege os ácidos graxos poliinsaturados dos tecidos contra a peroxidação, sendo um potente removedor de radicais peroxil (LOO˙) e provavelmente o mais importante inibidor da reação em cadeia da lipoperoxidação em animais (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).

O grupo hidroxila presente no grupo fenólico do anel cromanol rapidamente reage com o radical peroxil (LOO˙), transferindo para ele o seu átomo de Hidrogênio, convertendo-o em hidroperóxido de lipídio (–LOOH) (BRIGELIUS-FLOHÉ e TRABER, 1999; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; NORDBERG e ARNÉR, 2001) e um radical tocoferoxyl; um segundo radical peroxil se liga ao radical antioxidante para formar outro hidroperóxido (LOOH) que é um produto não radical. Para cada molécula de vitamina E oxidada, dois radicais peroxil são consumidos (LIEBLER, 1993) (Figura 3).

Figura 3 - Etapas da lipoperoxidação e ação antioxidante do α-tocoferol. (A) Iniciação: o grupo metileno de ácidos graxos poliinsaturados é atacado por radicais livres, havendo o rearranjo das duplas ligações na forma de dieno conjugado. Simultaneamente há formação de um radical alquila (R•) no carbono central. O radical alquila reage com O2 formando alquilperoxila (ROO•). Propagação: ROO• ataca outras moléculas de lipídios (não mostrado). Terminação: as reações em cadeia são interrompidas por interação entre os próprios radicais (não mostrado), ou (B) entre radicais e α-tocoferol, originando produtos não-radicalares e o radical tocoferila. O radical α-tocoferila é reduzido por ação do ácido ascórbico

Fonte: Cerqueira et.al. (2007).

No entanto, dependendo dos compostos presentes na reação, a vitamina E pode exercer efeito anti ou pró-oxidativo (BRIGELIUS-FLOHÉ e TRABER, 1999). Segundo HALLIWELL e GUTTERIDGE (1999) os tocoferóis podem reduzir Fe

3+ a Fe 2+ e Cu 2+ a Cu +

, que por sua vez exercem efeito pró-oxidativo. Além disso, o radical tocoferol oriundo da redução do radical peroxil pode abstrair hidrogênio dos ácidos graxos poliinsaturados, atuando então como um fraco promotor de lipoperoxidação. Esses fenômenos já foram observados em alguns sistemas in vitro. Para BOLLE et al. (2002) o uso da vitamina E como terapia antioxidante depende rigorosamente da dose ou da concentração in vitro da vitamina.

A vitamina E é um inibidor reconhecido da peroxidação de lipídeos em membranas biológicas e tem efeito de proteção na atividade metabólica e viabilidade celular de espermatozóides bovinos criopreservados (BECONI et al., 1993). Porém O’FLAYERT et al. (1997) não obtiveram modificações nos parâmetros de viabilidade espermática após o descongelamento de sêmen contendo vitamina E.

Os espermatozóides bovinos são pouco adaptados para metabolizar o tóxico peróxido de hidrogênio (H2O2), e o balanço entre a produção de ROS e a desintoxicação

dos mesmos, pode ser importante fator de sobrevivência e funcionalidade dos espermatozóides antes, durante e após sua criopreservação, exercendo influência direta sobre a fertilidade (BILODEAU et al., 2000).

Atualmente, o reduzido conhecimento da ação de oxidantes e antioxidantes encontrados no sêmen dos animais talvez seja responsável pelos ineficientes resultados obtidos após os procedimentos de criopreservação em algumas espécies e posterior utilização em técnicas de reprodução assistida, como IA e fertilização in vitro. Sabe-se, no entanto, que uma variedade de mecanismos de defesa denominados de antioxidantes estão envolvidos nos sistemas biológicos e que o equilíbrio entre os benefícios e os riscos de ROS e antioxidantes, in vivo e in vitro, parece ser necessário para o funcionamento reprodutivo normal.

2.6 Suplementação oral com vitamina E

A suplementação oral para touros com vitamina E é uma alternativa para evitar os danos peroxidativos na membrana espermática causados pelas ROS, mas ainda não se tem comprovado a eficácia dessa suplementação sobre a viabilidade espermática, uma vez que ainda são escassos os estudos sobre a ação da vitamina E suplementar na dieta animal e os resultados ainda são controversos no que diz respeito ao uso oral de vitamina E.

De acordo com Suleiman et al. (1996) a suplementação oral com vitamina E, em humanos reduziu significativamente a peroxidação lipídica (avaliada através das concentrações de malonaldeído) e aumentou a motilidade espermática, promovendo aumento da ocorrência de gravidez durante o estudo em 21%. A administração oral de vitamina E melhora a motilidade espermática (SULEIMAN et al.,1996 ).

Ten et al. (1997) suplementaram ratos com altas e baixas doses de vitamina E e de vitamina C (25mg de vitamina C e 60mg de vitamina E/kg de dieta e 10g de vitamina C e 600mg vitamina E/kg de dieta, respectivamente). Os autores não observaram efeito sobre a qualidade espermática, fertilidade ou taxa de concepção quando se forneceram baixas doses de vitamina (2 vezes o requerimento diário). Porém, altas doses de vitamina (20 vezes o requerimento diário) diminuíram a concentração espermática e aumentaram a porcentagem de espermatozóides com alterações morfológicas.

De acordo com Velasquez-Pereira (1998) touros alimentados com 14 mg de gossipol livre/Kg de peso corporal e suplementados com vitamina E tiveram um

aumento da porcentagem de espermatozóides normais, aumento no percentual de motilidade, diminuição de anormalidades de peça intermediaria, reduzindo os efeitos do gossipol sobre essas variáveis, devido a vitamina E reduzir os danos causados pelas ROS ou pelo efeito das enzimas envolvidas no sistema antioxidante do testículo.

Desta forma estudos foram realizados a fim de quantificar os efeitos de diferentes concentrações de vitamina E adicionada ao diluidor de criopreservação, avaliando as alterações a nível de qualidade seminal pós descongelamento, motilidade, vigor, estress oxidativo nas células espermáticas e taxa produção de embriões in vitro fecundados com o sêmen com vitamina E.

Os artigos da presente dissertação foram elaborados segundo as normas propostas pela Revista Brasileira de Reprodução Animal (RBRA).Revista Brasileira de Medicina Veterinária (QUALIS B2).

2.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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3. Capítulo 1

Adição de vitamina E no meio de criopreservação e avaliação da fertilidade do sêmen bovino

Resumo – O trabalho foi realizado para avaliar os efeitos da suplementação com vitamina E no meio de congelamento de sêmen bovino, quanto a qualidade espermática, nível de estresse oxidativo e desenvolvimento inicial de embriões produzidos em laboratório. Foram utilizados 38 touros da raça Nelore com idade média de 36 meses e peso vivo médio de 490 kg. O ejaculado foi obtido dos animais por meio de eletroejaculação, e o sêmen submetidos a quatro concentrações de vitamina E : TC- meio lactose–gema (controle); T10- controle + 10 mMOL/mL de vitamina E; T30- controle + 30 mMOL/mL de vitamina E; T50- controle + 50 mMOL/mL vitamina E. As palhetas foram congeladas com uma concentração de 45 milhões de espermatozóides por palheta. Após a coleta, os ejaculados foram submetidos a exames imediatos: volume, aspecto e coloração do ejaculado, turbilhonamento, motilidade e vigor espermáticos. Outras avaliações foram realizadas posteriormente em laboratório: patologias espermáticas (defeitos maiores, defeitos menores defeitos totais), viabilidade espermática, avaliação do estresse oxidativo (TBARS – espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico). Posteriormente as palhetas foram descongeladas a 36°C por 30 segundos, e avaliadas para motilidade, vigor, viabilidade espermática, avaliação do estresse oxidativo e a fertilidade dos espermatozóides através da produção in-vitro de embriões (PIV). O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado e os dados analisados através da ANOVA e o teste SNK (Student-Newman-Keuls) com nível de significância de 10%. O vigor espermático não diferiu entre os tratamentos (P>0,10). O tratamento controle proporcionou menor queda na motilidade retilínea progressiva pós descongelamento (13,31±2,34%) comparado aos demais grupos experimentais T10 (5,36±0,92%), T30 (8,15±1,80%) e T50 (27,90±3,89%). Na avaliação do estresse oxidativo dos espermatozóides os valores médios obtidos nos tratamentos T10, T30 e T50 (50,91±7,22; 65,88±2,58; 84,22±11,68 ng/mL respectivamente) foram superiores ao apresentado no tratamento controle TC (13,07±1,87ng/mL). Já na PIV o tratamento com 50 mMol de vitamina E e o tratamento Controle proporcionaram maior produção T50( 39,85% ±6,22%) e TC(27,90±3,89%) quando comparado aos demais. Pode-se concluir que a utilização de antioxidantes no

diluidor de sêmen bovino para o processo de criopreservação não influenciou na proteção da membrana plasmática dos espermatozóides contra a peroxidação lipídica, nem a produção in vitro de embriões.

Palavras Chaves: embriões, espermatozóide, estresse oxidativo, espécies reativas de oxigênio.

Abstract

Addition of vitamin E cryopreservation extender and evaluate fertility of bovine semen

Abstract - The study was conducted to evaluate the effects of supplementation with vitamin E in the cryopreservation extender of bovine semen, sperm quality, level of oxidative stress and early development of embryos produced in the laboratory. Were used 38 Nelore bulls with an average age of 36 months and average live weight of 490 kg. The ejaculate was obtained from sheep by electroejaculation and semen were submitted to four vitamin E concentration: TC-half yolk lactose (control), T10-control + 10 mmol / mL of vitamin E; T30 control + 30 mmol / mL of vitamin E; T50 control + 50 mmol / mL vitamin E. The straws were frozen at a concentration of 45 million sperm per straw. After collection, the ejaculates were immediately subjected to tests: volume, appearance and color of the ejaculate, spermatic motility. Other evaluations were performed later in the laboratory: sperm pathologies (major, minor and total defects), sperm morphology (eosin-nigrosins), assessment of oxidative stress (TBARS - thiobarbituric acid reactive species). Thereafter the straws were thawed at 36 ° C for 30 seconds, and evaluated for motility, vigor, sperm viability (eosin-nigrosins), assessment of oxidative stress and the fertility of the sperm through in-vitro production of embryos (IVP). The experiment was completely randomized and analyzed by ANOVA and SNK (Student-Newman-Keuls) with a significance level of 10%. The spermatic did not differ between treatments (P> 0.10). The control treatment resulted in a smaller decrease in progressive motility after thawing (13.31 ± 2.34%) compared to other experimental groups T10 (5.36 ± 0.92%), T30 (8.15 ± 1.80%) and T50 (27.90 ± 3.89%). In evaluating the oxidative stress of spermatozoa the mean values obtained in treatments T10, T30 and T50 (50.91 ± 7.22, 65.88 ± 2.58, 84.22 ± 11.68 ng / mL, respectively) were higher than filed in the control treatment TC (13.07 ± 1.87 ng / mL). In the PIV treatment with

50 mmol of vitamin E and the control treatment showed greater production T50 (39.85% ± 6.22%) and TControl (27.90 ± 3.89%) when compared to others. It can be concluded that the use of antioxidants in bovine semen extender for the cryopreservation process had no effect on protection against sperm plasma membrane lipid peroxidation, or in vitro production of embryos.

3.1 Introdução

A redução na fertilidade, associada à inseminação artificial (IA) com sêmen criopreservado, vem sendo atribuída aos processos ocorridos durante a congelação do sêmen, onde cerca de 10 a 50% dos espermatozóides de um ejaculado não resistem a este processo e morrem (WATSON, 2000).

Em condições naturais de acasalamento, os sistemas de defesa antioxidantes dos espermatozóides e do plasma seminal são eficientes no controle dos efeitos danosos das espécies reativas de oxigênio (ROS) sobre a fertilidade do sêmen. Quando o sêmen é manipulado para uso na inseminação artificial, ele é exposto ao oxigênio, e vários passos do seu processamento podem levar à produção de ROS, bem como à redução das defesas antioxidantes. A lavagem e a diluição, por exemplo, podem retirar ou reduzir a proteção antioxidante fornecida pelo plasma seminal. Todos esses fatores podem contribuir para aumentar os danos oxidativos ao espermatozóide do sêmen manipulado (BALL e VO, 2001).

O sêmen de boa qualidade é um dos fatores de fundamental importância para o sucesso da inseminação artificial, por isso seu processamento deve preservá-lo ao máximo (WATSON, 2000). Os procedimentos de congelação/descongelação do sêmen causam danos celulares devido à mudança na temperatura, formação de cristais de gelo, injúrias oxidativas, alterações na membrana do espermatozóide, lesões no DNA, estresse osmótico, além da toxicidade dos crioprotetores, diminuindo assim o número de espermatozóides viáveis por dose (BALL e VO, 2001).

Diversos estudos têm demonstrado que o processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e que a adição de antioxidantes aos meios de congelação e refrigeração de sêmen ajuda a proteger o espermatozóide contra o dano induzido pelos radicais livres sobre sua motilidade, viabilidade, produção de energia e integridade do DNA, bem como a interromper a reação em cadeia da peroxidação dos lipídeos das membranas espermáticas, em diversas espécies de animais (HOLT, 2000).

A vitamina E ou tocoferol é considerada um componente primário do sistema antioxidante do espematozóide e é um dos principais protetores de membrana contra ROS (SURAI et al.,1998).

O tocoferol encontra-se presente na dupla camada lipídica de membranas celulares. Sendo que a cadeia lateral do tocoferol mistura-se com os ácidos graxos de cadeia longa com o núcleo cromado na superfície da membrana celular (BOOTH E

MCDONALD,1992, citados por BORGES, 2003). Neste local, o tocoferol atua como antioxidante para proteger a membrana celular dos efeitos nocivos dos radicais livres (BORGES, 2003).

O Tocoferol é comprovadamente um eficiente inibidor da peroxidação de lipídios in vivo, agindo como doadores de H+ para o radical peroxila, interrompendo a reação radicalar em cadeia. Cada molécula de tocoferol pode reagir com até dois radicais peroxila e, nesse caso, o tocoferol e irreversivelmente desativado (BARREIROS et al., 2006).

No presente trabalho avaliou se a suplementação com vitamina E dos meios de criopreservação reduz os danos espermáticos e o estresse oxidativo provocados pelos processos de congelamento e descongelamento e aumenta a produção in vitro de embriões.

3.2 Material e Métodos

Os animais experimentais eram mantidos na fazenda Kangayan localizada em Denise- MT, a 145 Km a noroeste de Cuiabá.

As análises laboratoriais foram feitas no Laboratório de Reprodução Animal (LABRA) da Universidade Federal de Mato Grosso em Cuiabá.

As análises de Produção in vitro de embriões (PIV) com sêmen dos diferentes tratamentos, para avaliação da produção clivagem e eclosão, foram feitas no laboratório BIOEMBRYO, localizado em Cuiabá – MT.

Foram utilizados 38 touros da raça Nelore, com boa condição corporal (escore 3, na escala de 1-5), peso vivo médio de 490 Kg, idade média de 36 meses, avaliados e aprovados para reprodução por meio de exame andrológico de acordo com os padrões de qualidade de sêmen in natura preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal – CBRA (1998) (Tabela 1).

Tabela 1 – Média e Erro padrão das características físicas do sêmen fresco de bovinos da raça Nelore em pastejo

VARIÁVEIS MÉDIAS ± ERRO PADRÃO DA

MÉDIA Volume (mL) Aspecto 6,61±0,47 1,79±0,12 Motilidade (%) 78,68±2,08 Vigor (1-5) 3,05±0,09 Turbilhonamento (1-5) 3,08±0,10 Perímetro escrotal (cm) Defeitos maiores(%) Defeitos menores(%) Defeitos totais(%) TBARS ng/mL 33,67 ± 0,37 4,98±0,43 5,40±0,42 10,39±0,70 63,50±5,25 Aspecto: 0-aquoso/1-ralo/2-semi-denso/3-denso

Os animais experimentais eram mantidos em piquetes de Brachiaria brizantha cv. Marandu e recebiam sal mineral comercial ad libtum (níveis de garantia por Kg do sal mineral comercial consumido pelos animais experimentais: cálcio 130g, fósforo 60g, sódio 165g, enxofre 40g, manganês 550mg, zinco 5000mg, cobre 1200mg, cobalto 70mg).

Os animais eram vacinados e vermifugados (ivermectina 1%) contra endo e ectopsrasitas a cada seis meses.

Para obtenção do ejaculado, empregou-se o método de eletroestimulação, primeiramente os touros foram devidamente contidos em tronco apropriado, protegendo-os de possíveis lesões traumáticas. Para recepção dos ejaculados, foram utilizados tubos graduado protegido da luz solar.

Imediatamente após a coleta, o tubo coletor foi colocado em banho maria a 37°C, para a avaliação dos parâmetros macroscópicos (volume, aspecto) e microscópicos imediatos do sêmen (motilidade, vigor e turbilhonamento).

Foram realizadas as análises físicas do sêmen: volume (mL), aspecto (aquoso, ralo, semi-denso e denso), motilidade progressiva espermática (0-100%), vigor (0-5) e turbilhonamento (0-5).

Uma gota de sêmen de cada ejaculado foi colocado em uma lâmina previamente aquecida a 37°C em aumento microscópico 100X, onde foi avaliado o turbilhonamento nas bordas da gota. Posteriormente, colocou-se uma lamínula previamente aquecida a 37°C sobre uma gota de sêmen, e em um aumento de 100X foram avaliados motilidade espermática progressiva e vigor espermático (CBRA, 1998).

Os ejaculados que obtiveram motilidade inferior a 60%, vigor menor que 3 e porcentagem de defeitos totais maiores que 30% foram descartados. Também foram descartados animais com azospermia ou sêmen com presença de células inflamatórias.

Em tubos tipo eppendorf contendo 1 mL de solução formol-salina tamponada foram acondicionadas alíquotas de 10 µ L de sêmen para a análise morfológica dos espermatozóides por meio de preparação de câmara úmida corada com rosa bengala, com o auxílio da microscopia em aumento de 1000X. Foram contabilizadas 200 células por ejaculado, mensurados em percentagem os defeitos espermáticos e classificados em defeitos maiores, menores e totais (CBRA, 1998).

A viabilidade espermática foi avaliada através da coloração de eosina-nigrosina, utilizando-se a metodologia proposta por World Health Organization (WHO, 1992).

O estresse oxidativo (PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA) do plasma seminal foi mensurado através da determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As determinações se basearam na alteração da coloração da amostra quando colocada para reagir com o ácido tiobarbitúrico a 1%, à temperatura entre 90 e 100°C (Ohkawa et al., 1979).

A vitamina E (Acetato de α-Tocopherol, Sigma) foi adicionada ao diluidor base (Tabela 2) após a preparação do mesmo. A composição dos meios diluentes nos diferentes tratamentos foram: TC (meio controle) – diluidor lactose gema; T10- diluidor lactose gema+10mMol vitamina E; T30- diluidor lactose gema+30mMol vitamina E e T50- diluidor lactose gema+50mMol vitamina E. Após a adição da vitamina E o diluente foi mantido a refrigeração 5°C por 12 horas.

Tabela 2- Composição do meio diluente Lactose - Gema REAGENTE Volume (mL) QTD. 1000,0 Lactose (g) 81,4 H2O estéril (QSP) 740,0 Glicerol (mL) 60,0 Gema (mL) 200,0 Tilosina (mL) 0,6 Gentamicina (mL) 4,0 Lincomicina (mL) 6,0