Adição de vitamina E no meio de criopreservação e avaliação da fertilidade do sêmen bovino
Resumo – O trabalho foi realizado para avaliar os efeitos da suplementação com vitamina E no meio de congelamento de sêmen bovino, quanto a qualidade espermática, nível de estresse oxidativo e desenvolvimento inicial de embriões produzidos em laboratório. Foram utilizados 38 touros da raça Nelore com idade média de 36 meses e peso vivo médio de 490 kg. O ejaculado foi obtido dos animais por meio de eletroejaculação, e o sêmen submetidos a quatro concentrações de vitamina E : TC- meio lactose–gema (controle); T10- controle + 10 mMOL/mL de vitamina E; T30- controle + 30 mMOL/mL de vitamina E; T50- controle + 50 mMOL/mL vitamina E. As palhetas foram congeladas com uma concentração de 45 milhões de espermatozóides por palheta. Após a coleta, os ejaculados foram submetidos a exames imediatos: volume, aspecto e coloração do ejaculado, turbilhonamento, motilidade e vigor espermáticos. Outras avaliações foram realizadas posteriormente em laboratório: patologias espermáticas (defeitos maiores, defeitos menores defeitos totais), viabilidade espermática, avaliação do estresse oxidativo (TBARS – espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico). Posteriormente as palhetas foram descongeladas a 36°C por 30 segundos, e avaliadas para motilidade, vigor, viabilidade espermática, avaliação do estresse oxidativo e a fertilidade dos espermatozóides através da produção in-vitro de embriões (PIV). O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado e os dados analisados através da ANOVA e o teste SNK (Student-Newman-Keuls) com nível de significância de 10%. O vigor espermático não diferiu entre os tratamentos (P>0,10). O tratamento controle proporcionou menor queda na motilidade retilínea progressiva pós descongelamento (13,31±2,34%) comparado aos demais grupos experimentais T10 (5,36±0,92%), T30 (8,15±1,80%) e T50 (27,90±3,89%). Na avaliação do estresse oxidativo dos espermatozóides os valores médios obtidos nos tratamentos T10, T30 e T50 (50,91±7,22; 65,88±2,58; 84,22±11,68 ng/mL respectivamente) foram superiores ao apresentado no tratamento controle TC (13,07±1,87ng/mL). Já na PIV o tratamento com 50 mMol de vitamina E e o tratamento Controle proporcionaram maior produção T50( 39,85% ±6,22%) e TC(27,90±3,89%) quando comparado aos demais. Pode-se concluir que a utilização de antioxidantes no
diluidor de sêmen bovino para o processo de criopreservação não influenciou na proteção da membrana plasmática dos espermatozóides contra a peroxidação lipídica, nem a produção in vitro de embriões.
Palavras Chaves: embriões, espermatozóide, estresse oxidativo, espécies reativas de oxigênio.
Abstract
Addition of vitamin E cryopreservation extender and evaluate fertility of bovine semen
Abstract - The study was conducted to evaluate the effects of supplementation with vitamin E in the cryopreservation extender of bovine semen, sperm quality, level of oxidative stress and early development of embryos produced in the laboratory. Were used 38 Nelore bulls with an average age of 36 months and average live weight of 490 kg. The ejaculate was obtained from sheep by electroejaculation and semen were submitted to four vitamin E concentration: TC-half yolk lactose (control), T10-control + 10 mmol / mL of vitamin E; T30 control + 30 mmol / mL of vitamin E; T50 control + 50 mmol / mL vitamin E. The straws were frozen at a concentration of 45 million sperm per straw. After collection, the ejaculates were immediately subjected to tests: volume, appearance and color of the ejaculate, spermatic motility. Other evaluations were performed later in the laboratory: sperm pathologies (major, minor and total defects), sperm morphology (eosin-nigrosins), assessment of oxidative stress (TBARS - thiobarbituric acid reactive species). Thereafter the straws were thawed at 36 ° C for 30 seconds, and evaluated for motility, vigor, sperm viability (eosin-nigrosins), assessment of oxidative stress and the fertility of the sperm through in-vitro production of embryos (IVP). The experiment was completely randomized and analyzed by ANOVA and SNK (Student-Newman-Keuls) with a significance level of 10%. The spermatic did not differ between treatments (P> 0.10). The control treatment resulted in a smaller decrease in progressive motility after thawing (13.31 ± 2.34%) compared to other experimental groups T10 (5.36 ± 0.92%), T30 (8.15 ± 1.80%) and T50 (27.90 ± 3.89%). In evaluating the oxidative stress of spermatozoa the mean values obtained in treatments T10, T30 and T50 (50.91 ± 7.22, 65.88 ± 2.58, 84.22 ± 11.68 ng / mL, respectively) were higher than filed in the control treatment TC (13.07 ± 1.87 ng / mL). In the PIV treatment with
50 mmol of vitamin E and the control treatment showed greater production T50 (39.85% ± 6.22%) and TControl (27.90 ± 3.89%) when compared to others. It can be concluded that the use of antioxidants in bovine semen extender for the cryopreservation process had no effect on protection against sperm plasma membrane lipid peroxidation, or in vitro production of embryos.
3.1 Introdução
A redução na fertilidade, associada à inseminação artificial (IA) com sêmen criopreservado, vem sendo atribuída aos processos ocorridos durante a congelação do sêmen, onde cerca de 10 a 50% dos espermatozóides de um ejaculado não resistem a este processo e morrem (WATSON, 2000).
Em condições naturais de acasalamento, os sistemas de defesa antioxidantes dos espermatozóides e do plasma seminal são eficientes no controle dos efeitos danosos das espécies reativas de oxigênio (ROS) sobre a fertilidade do sêmen. Quando o sêmen é manipulado para uso na inseminação artificial, ele é exposto ao oxigênio, e vários passos do seu processamento podem levar à produção de ROS, bem como à redução das defesas antioxidantes. A lavagem e a diluição, por exemplo, podem retirar ou reduzir a proteção antioxidante fornecida pelo plasma seminal. Todos esses fatores podem contribuir para aumentar os danos oxidativos ao espermatozóide do sêmen manipulado (BALL e VO, 2001).
O sêmen de boa qualidade é um dos fatores de fundamental importância para o sucesso da inseminação artificial, por isso seu processamento deve preservá-lo ao máximo (WATSON, 2000). Os procedimentos de congelação/descongelação do sêmen causam danos celulares devido à mudança na temperatura, formação de cristais de gelo, injúrias oxidativas, alterações na membrana do espermatozóide, lesões no DNA, estresse osmótico, além da toxicidade dos crioprotetores, diminuindo assim o número de espermatozóides viáveis por dose (BALL e VO, 2001).
Diversos estudos têm demonstrado que o processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e que a adição de antioxidantes aos meios de congelação e refrigeração de sêmen ajuda a proteger o espermatozóide contra o dano induzido pelos radicais livres sobre sua motilidade, viabilidade, produção de energia e integridade do DNA, bem como a interromper a reação em cadeia da peroxidação dos lipídeos das membranas espermáticas, em diversas espécies de animais (HOLT, 2000).
A vitamina E ou tocoferol é considerada um componente primário do sistema antioxidante do espematozóide e é um dos principais protetores de membrana contra ROS (SURAI et al.,1998).
O tocoferol encontra-se presente na dupla camada lipídica de membranas celulares. Sendo que a cadeia lateral do tocoferol mistura-se com os ácidos graxos de cadeia longa com o núcleo cromado na superfície da membrana celular (BOOTH E
MCDONALD,1992, citados por BORGES, 2003). Neste local, o tocoferol atua como antioxidante para proteger a membrana celular dos efeitos nocivos dos radicais livres (BORGES, 2003).
O Tocoferol é comprovadamente um eficiente inibidor da peroxidação de lipídios in vivo, agindo como doadores de H+ para o radical peroxila, interrompendo a reação radicalar em cadeia. Cada molécula de tocoferol pode reagir com até dois radicais peroxila e, nesse caso, o tocoferol e irreversivelmente desativado (BARREIROS et al., 2006).
No presente trabalho avaliou se a suplementação com vitamina E dos meios de criopreservação reduz os danos espermáticos e o estresse oxidativo provocados pelos processos de congelamento e descongelamento e aumenta a produção in vitro de embriões.
3.2 Material e Métodos
Os animais experimentais eram mantidos na fazenda Kangayan localizada em Denise- MT, a 145 Km a noroeste de Cuiabá.
As análises laboratoriais foram feitas no Laboratório de Reprodução Animal (LABRA) da Universidade Federal de Mato Grosso em Cuiabá.
As análises de Produção in vitro de embriões (PIV) com sêmen dos diferentes tratamentos, para avaliação da produção clivagem e eclosão, foram feitas no laboratório BIOEMBRYO, localizado em Cuiabá – MT.
Foram utilizados 38 touros da raça Nelore, com boa condição corporal (escore 3, na escala de 1-5), peso vivo médio de 490 Kg, idade média de 36 meses, avaliados e aprovados para reprodução por meio de exame andrológico de acordo com os padrões de qualidade de sêmen in natura preconizados pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal – CBRA (1998) (Tabela 1).
Tabela 1 – Média e Erro padrão das características físicas do sêmen fresco de bovinos da raça Nelore em pastejo
VARIÁVEIS MÉDIAS ± ERRO PADRÃO DA
MÉDIA Volume (mL) Aspecto 6,61±0,47 1,79±0,12 Motilidade (%) 78,68±2,08 Vigor (1-5) 3,05±0,09 Turbilhonamento (1-5) 3,08±0,10 Perímetro escrotal (cm) Defeitos maiores(%) Defeitos menores(%) Defeitos totais(%) TBARS ng/mL 33,67 ± 0,37 4,98±0,43 5,40±0,42 10,39±0,70 63,50±5,25 Aspecto: 0-aquoso/1-ralo/2-semi-denso/3-denso
Os animais experimentais eram mantidos em piquetes de Brachiaria brizantha cv. Marandu e recebiam sal mineral comercial ad libtum (níveis de garantia por Kg do sal mineral comercial consumido pelos animais experimentais: cálcio 130g, fósforo 60g, sódio 165g, enxofre 40g, manganês 550mg, zinco 5000mg, cobre 1200mg, cobalto 70mg).
Os animais eram vacinados e vermifugados (ivermectina 1%) contra endo e ectopsrasitas a cada seis meses.
Para obtenção do ejaculado, empregou-se o método de eletroestimulação, primeiramente os touros foram devidamente contidos em tronco apropriado, protegendo-os de possíveis lesões traumáticas. Para recepção dos ejaculados, foram utilizados tubos graduado protegido da luz solar.
Imediatamente após a coleta, o tubo coletor foi colocado em banho maria a 37°C, para a avaliação dos parâmetros macroscópicos (volume, aspecto) e microscópicos imediatos do sêmen (motilidade, vigor e turbilhonamento).
Foram realizadas as análises físicas do sêmen: volume (mL), aspecto (aquoso, ralo, semi-denso e denso), motilidade progressiva espermática (0-100%), vigor (0-5) e turbilhonamento (0-5).
Uma gota de sêmen de cada ejaculado foi colocado em uma lâmina previamente aquecida a 37°C em aumento microscópico 100X, onde foi avaliado o turbilhonamento nas bordas da gota. Posteriormente, colocou-se uma lamínula previamente aquecida a 37°C sobre uma gota de sêmen, e em um aumento de 100X foram avaliados motilidade espermática progressiva e vigor espermático (CBRA, 1998).
Os ejaculados que obtiveram motilidade inferior a 60%, vigor menor que 3 e porcentagem de defeitos totais maiores que 30% foram descartados. Também foram descartados animais com azospermia ou sêmen com presença de células inflamatórias.
Em tubos tipo eppendorf contendo 1 mL de solução formol-salina tamponada foram acondicionadas alíquotas de 10 µ L de sêmen para a análise morfológica dos espermatozóides por meio de preparação de câmara úmida corada com rosa bengala, com o auxílio da microscopia em aumento de 1000X. Foram contabilizadas 200 células por ejaculado, mensurados em percentagem os defeitos espermáticos e classificados em defeitos maiores, menores e totais (CBRA, 1998).
A viabilidade espermática foi avaliada através da coloração de eosina-nigrosina, utilizando-se a metodologia proposta por World Health Organization (WHO, 1992).
O estresse oxidativo (PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA) do plasma seminal foi mensurado através da determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). As determinações se basearam na alteração da coloração da amostra quando colocada para reagir com o ácido tiobarbitúrico a 1%, à temperatura entre 90 e 100°C (Ohkawa et al., 1979).
A vitamina E (Acetato de α-Tocopherol, Sigma) foi adicionada ao diluidor base (Tabela 2) após a preparação do mesmo. A composição dos meios diluentes nos diferentes tratamentos foram: TC (meio controle) – diluidor lactose gema; T10- diluidor lactose gema+10mMol vitamina E; T30- diluidor lactose gema+30mMol vitamina E e T50- diluidor lactose gema+50mMol vitamina E. Após a adição da vitamina E o diluente foi mantido a refrigeração 5°C por 12 horas.
Tabela 2- Composição do meio diluente Lactose - Gema REAGENTE Volume (mL) QTD. 1000,0 Lactose (g) 81,4 H2O estéril (QSP) 740,0 Glicerol (mL) 60,0 Gema (mL) 200,0 Tilosina (mL) 0,6 Gentamicina (mL) 4,0 Lincomicina (mL) 6,0
Após o exame físico uma alíquota de 10µL de sêmen in natura foi colocada em 1.990 mL de solução formol-salina tamponada para determinação da concentração espermática em câmara de Newbauer, calculou-se o número de doses e volume final de diluente a ser adicionado para que se obtivesse uma concentração final de 45 milhões de espermatozóides por mL.
O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,5 mL devidamente identificadas. As palhetas foram colocadas dentro de uma geladeira com temperatura interna de 5°C, durante 4 horas.
Após o resfriamento procedeu-se o congelamento do sêmen. As palhetas foram dispostas sobre uma grade 5 cm acima da lâmina de nitrogênio líquido, durante 15 minutos. Sequencialmente foram mergulhadas em nitrogênio líquido a -196°C para o congelamento final do sêmen, sendo em seguida colocadas na raque e transferidas para o botijão contendo nitrogênio líquido até o momento das análises.
As palhetas foram descongeladas em banho Maria a 37°C por 30 segundos, acondicionadas em tubos eppendorf e homogeinizadas para análise imediata da motilidade e vigor espermático, viabilidade espermática e estresse oxidativo (teste de TBARS- espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico).
Foram utilizados 3.200 oócitos provenientes de matadouros, estes foram submetidos ao processo de maturação in vitro, destes 2.400 oócitos maturados foram fertilizados com o sêmen congelado suplementado com vitamina E de acordo com o tratamento e, 800 oócitos foram fertilizados com o sêmen congelado não suplementado, logo foram 800 oócitos para controle, 800 oócitos para T10, 800 oócitos para T30 e 800 oócitos para T50. Os oócitos fertilizados foram submetidos ao cultivo (ABREU et al., 2004). A taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionário (produção e eclosão de embriões) foram os parâmetros utilizados para avaliar a fertilidade dos espermatozóides e foram aferidos no 3° e 5° dias de cultivo, respectivamente.
O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado e os dados analisados através da ANOVA e o efeito de tratamento comparado através do teste SNK (Student-Newman-Keuls) com nível de significância de 10%.
3. 3 Resultados e discussão
A adição de vitamina E ao diluente seminal nas concentrações de 10 mMol, 30 mMOL e 50 mMol, afetou significativamente a motilidade do sêmen descongelado, sendo o melhor resultado apresentado pelo controle, onde os espermatozóides foram congelados sem a adição de vitamina E (Tabela 3).
Tabela 3 – Médias, erro padrão das médias e nível de significância (P) para as características físicas do sêmen pós congelamento/descongelamento de bovinos da raça Nelore±36 meses de idade com vitamina E.
TRATAMENTOS
MOT (%) VIG (1-5) VIAB.(%) TBARS
(ng/mL) CONTROLE 13,31±2,34 A 2,00 ±0,13 68,95±3,88AB 13,07±1,87C T 10 5,36±0,92 B 1,81±0,15 73,91±3,72A 50,91±7,22B T 30 8,15±1,80 AB 1,76±0,14 54,29±4,20BC 65,88±2,58A T 50 10,10±1,57AB 2,05±0,12 46,41±5,49C 84,22±11,68A P 0,0135 0,1117 0,0001 0,0001
Legenda: MOT-Motilidade espermática; VIG-Vigor espermático; VIAB.- Viabilidade espermática; TBARS-peroxidação lipídica; TC (tratamento controle); T10 (tratamento com 10 mMol de vitamina E), T 30 ( tratamento com 30 mMol de vitamina E), T50 (tratamento com 50 mMol de vitamina E).
Estes resultados corroboram aos obtidos por Borges (2003), Upreti et al. (1997), e Penitente (2010), que não obtiveram melhora na motilidade progressiva com a adição de vitamina E ao diluente de sêmen bovino e ovino, respectivamente.
A adição de vitamina E ao diluente seminal nas concentrações de 10mMol, 30 mMol e 50 mMol não afetaram o vigor espermático do sêmen descongelado (Tabela 3), concordando com os resultados obtidos em ovinos por Upreti et. al. (1997) e Penitente (2010). Contudo, Borges (2003) encontrou melhora na manutenção do vigor espermático ao adicionar vitamina E, Equex e vitamina C ao diluente de sêmen bovino. Este resultado pode ter ocorrido devido a associação das duas vitaminas, pois a vitamina C permite o uso de baixas doses de vitamina E, a vitamina C regenera a vitamina E pela redução dos radicais tocoferil em um ciclo redox.
A adição de vitamina E ao diluente seminal na concentração de 10 mMol (T10) não alterou a viabilidade espermática quando comparada ao tratamento Controle (TABELA
3); contudo foi superior a encontrada no sêmen criopreservado com 30 mMol (T30) e 50
mMol (T50).
Segundo Borges (2003) muitos trabalhos não obtiveram diferenças significativas na viabilidade espermática do sêmen criopreservado com antioxidantes, pois utilizaram baixas concentrações de vitamina E ou pelo fato que da mesma não estar associada a vitamina C, uma vez que a vitamina C causa regeneração do tocoferol pela redução dos radicais tocoferil em um ciclo redox. Neste trabalho, as concentrações de vitamina E utilizadas foram elevadas. Provavelmente o que pode ter ocorrido é que a vitamina E pode ter sido deletéria. Em geral a vitamina E atua principalmente no radical hidroxila, e se a ROS que está causando o dano for a O2- ou o H2O2 , o tratamento pode não fazer efeito (UPRETI et al.1997).
O Estresse oxidativo foi significativamente mais baixo para os tratamentos, controle, e 10mMol (T10) (Tabela 3) demonstrando que as maiores concentrações de vitamina E foram prejudiciais a célula espermática, uma vez que, possibilitaram o aumento da produção ROS. A vitamina E ou tocoferol é uma molécula lipossolúvel susceptível a peroxidação, é um importante removedor de radicais peroxil e, provavelmente, o mais importante inibidor da reação em cadeia da lipoperoxidação em animais (HALLIWRL e GUTTERIDGE, 1992). Entretanto, faz-se necessário destacar que os efeitos da vitamina E podem variar conforme a dose utilizada, pois de acordo com a quantidade de radicais hidroxilas a serem inativados, a vitamina E poderá ter o efeito antioxidante ou estimular a oxidação (CAO e CUTLER,1997).
A producão de embriões foi superior nos oócitos fecundados com sêmen não suplementado (T controle) e nos oócitos fecundados com sêmen suplementado com 50 mMol (T50) de vitamina E (TABELA 4). O estresse oxidativo tem sido apontado como um dos responsáveis pela baixa qualidade e produção de embriões in vitro, sendo a proteção do embrião contra a ROS, dependente, em parte, do “pool” de enzimas antioxidantes (HARVERY et al. 1995). O que pode ser explicado frente aos resultados obtidos, é que as menores concentrações de vitamina E utilizadas neste trabalho não favoreceram a produção de embriões in vitro, contradizendo os resultados obtidos por Arechiga et al. (1994) que observaram que embriões roedores, em estágio inicial de desenvolvimento, apresentaram maior viabilidade frente ao choque produzido pelo calor, quando a vitamina E estava presente em baixas concentrações.
Tabela 4 – Médias,erros padrões e níveis de significância (P) da produção in vitro de embriões utilizando o sêmen bovinos da raça Nelore criopreservado em meio suplementado com vitamina E.
TRATAMENTOS
CLIVAGEM (%) PRODUÇÃO (%) ECLOSÃO (%)
CONTROLE 59,77±3,62 27,90±3,89 AB 41,12±2,05
T 10 59,30±3,87 27,26± 6,63B 46,01±3,43
T 30 54,78±2,73 25, 88 ±5,69B 47,23±3,96
T 50 63,06±2,62 39,85 ±6,22A 43,13±3,66
P 0,3231 0, 0190 0, 4653
P – Nível de significância; Legenda: TC (tratamento controle); T10 (tratamento com 10 mMol de vitamina E), T 30 ( tratamento com 30 mMol de vitamina E), T50 (tratamento com 50 mMol de vitamina E).
Para eclosão e clivagem não houve diferença entre tratamentos (Tabela4), as médias foram calculadas baseadas na porcentagem de clivados por gota.
Ao comparar os efeitos da vitamina E, se faz necessário utilização de trabalho com outras espécies animais, pois experimentos empregando vitaminas no meio diluidor do sêmen usado para produção de embriões bovinos são escassos e, na maioria das vezes, são utilizadas em variadas combinações, com diferentes propósitos (BORGES, 2003).
Ao avaliar a clivagem em oócitos provenientes de abatedouro, com o intuito de avaliar a fertilidade dos espermatozóides, observa-se (Tabela 4) que a adição de vitamina E ao meio de criopreservação não alterou a taxa de clivagem quando comparado ao controle. Assim podemos supor que a adição de vitamina E nas concentrações utilizadas não protegeu o espermatozóide contra os danos causados pelos processos.
3.4 Conclusão
A suplementação do meio diluidor com vitamina E não interferiu na qualidade seminal pós-descongelamento, no estresse oxidativo, assim como na produção de embriões in-vitro.
3.5 REFERÊNCIAS
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