AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DE NANOCOMPÓSITO DE Al3O2/5% ZrO2 RECOBERTO COM FOSFATO DE CÁLCIO PELO MÉTODO BIOMIMÉTICO APÓS
DIFERENTES TRATAMENTOS QUÍMICOS
D. Osiro1, K. H. Santos1, J. A. Ferreira1, H. Fukumasu1, E. M. J. A. Pallone1 1
Universidade de São Paulo/Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos; Av. Duque de Caxias Norte, 225, Pirassununga-SP, CEP 13635-900.
E-mail: deniosiro@hotmail.com
RESUMO: A formação de fosfatos de cálcio sobre nanocompósitos de Al3O2/ZrO2 tornam suas superfícies bioativas, sendo biomateriais promissores na substituição e restauração de tecidos ósseos. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar a citotoxicidade de nanocompósitos de Al3O2/ZrO2 (5%vol), sob diferentes tratamentos superficiais químicos, recobertos com fosfato de cálcio. Dessa forma,
nanocompósitos sinterizados (1500C/2h), tratados e não tratados quimicamente,
foram recobertos biomimeticamente e caracterizados por FTIR e MEV. A biocompatibilidade dos nanocompósitos recobertos foi avaliada por testes in vitro utilizando linhagem de células CHO, de acordo com a norma ISO10993-5. As células foram cultivadas durante 72 horas em contato direto com os nanocompósitos recobertos, a 37º C, sob atmosfera úmida com 5% de CO2. A boa viabilidade celular dos nanocompósitos recobertos foi comprovada pelo teste de MTT. Já a morfologia e proliferação celular na superfície desses nanocompósitos recobertos foram confirmadas por microscopia óptica e MEV.
Palavras-chave: Nanocompósito, Alumina, Zircônia, Citotoxicidade, Testes in vitro.
INTRODUÇÃO
Dentre os materiais bioativos utilizados, os fosfatos de cálcio são amplamente reconhecidos como biomateriais em potencial na substituição e restauração de tecidos ósseos devido à sua semelhança com a fase mineral dos ossos 1,2,3). A combinação de fosfatos de cálcio com nanocompósitos de Al3O2/ZrO2 tem como objetivo aumentar a resistência mecânica do biomaterial, tornando mais vantajoso a sua aplicação em próteses biocompatíveis e resistentes(1,2,3).
Na síntese de fosfatos de cálcio com diferentes fases, o método biomimético tem se destacado por apresentar vantagens como: baixo custo, temperatura de operação de 36,5oC e a possibilidade de recobrimento de diferentes superfícies.
Além disso, o processo biomimético é o único método que possibilita a obtenção de todos os fosfatos de interesse biológico (1,2,3).
O método biomimético foi introduzido por Abe e colaboradores(4) em 1990 e consiste da imersão do substrato em uma solução de concentração iônica e pH similar aos fluidos corpóreos, denominada Synthetic Body Fluid (SBF). O SBF inicialmente proposto foi de 1,5 vezes mais concentrado (SBF-1,5x), sendo realizada sua troca a cada 48 horas durante o tempo de 1 a 28 dias de recobrimento (4). Desde então, muitas variações na solução de SBF tem sido realizadas para acelerar o tempo de deposição e alterar a cristalinidade do recobrimento. Por exemplo, Barrere(5) propôs o uso de soluções de SBF 5,0x vezes mais concentrado (SBF-5,0x) para diminuir o tempo de deposição de semanas para dias ou horas (6). Ressalta-se que durante a deposição dos fosfatos de cálcio sobre a superfície do substrato, pode ocorrer a formação de fases precursoras metaestáveis. Isso ocorre devido à espontaneidade do processo e devido à influência do tempo de incubação, temperatura, agitação e concentração de íons presentes na solução de SBF(7,8).
Por outro lado, muitos estudos foram realizados nos últimos anos empregando tratamentos químicos na superfície de materiais cerâmicos, a fim de melhorar a eficiência do processo de deposição dos fosfatos de cálcio pelo método biomimético(9). A utilização de um processo prévio de ativação da superfície visa assegurar uma união interfacial adequada entre o substrato e a camada de fosfato de cálcio formada (10), devendo influenciar na morfologia e a capacidade futura de osseointegração (11-13)
Os biomateriais desenvolvidos para serem aplicados em produtos na área da saúde devem ser primeiramente avaliados em testes de citotoxicidade in vitro quanto à sua bicompatibilidade em relação à presença de células de mamíferos. Somente após a confirmação de biocompatibilidade do biomaterial a partir dos testes in vitro, irá prosseguir a realização dos ensaios in vivo em animais para estudar reações adversa em tecidos moles e/ou ossos e sobre a toxicidade sistêmica(1,14). A
International Organization for Standardization (ISO 10993-5, 2009)(15) padroniza os testes de citotoxicidade in vitro de biomateriais, que baseiam-se em análises quantitativas e qualitativas do desenvolvimento de células em contato direto ou
indireto com o material avaliado. A quantificação das células pode ser realizada de forma direta (número de colônias formadas) ou indireta (por exemplo, a partir da determinação de componentes celulares ou de produto do metabolismo celular)(15,16). A avaliação qualitativa é normalmente feita por microscopia (microscópios ópticos e eletrônicos) analisando a morfologia e/ou a proliferação celular(15,16).
Portanto, neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do nanocompósito de Al3O2/ZrO2 (5% em volume), sob diferentes tratamentos químicos, recoberto com fosfato de cálcio pelo método biomimético.
MATERIAIS E MÉTODOS
Obtenção nanocompósito de Al2O3/ZrO2 biomimeticamente recoberto com fosfatos de cálcio
Os nanocompósitos foram obtidos utilizando pós-comerciais de Al2O3 (AKP-53, Sumitomo Chemical Co., Japão), 99,995% e tamanho médio de 0,2 µm, e ZrO2 monoclínica nanométrica (Nanostructured Materials Inc.), 99,900% e tamanho médio de 50 nm. Os nanocompósitos de matriz de Al3O2 com inclusões nanométricas de ZrO2(5% em volume) foram obtidas na forma de pastilhas com aproximadamente 10mm de diâmetro, calcinados a 400oC/1h, sinterizados a 1500oC/2h(17,18).
Para tornar a superfície do nanocompósito de Al3O2/ZrO2 mais eficiente na deposição de fosfatos de cálcio, suas superfícies foram tratadas quimicamente, durante 4 dias a 90C nas seguintes soluções: H3PO4 5mol/L, HNO3 5 mol/L, NaOH 15 mol/L e somente água(9).
Após o tratamento químico superficial, o recobrimento biomimético dos nanocompósitos ocorreu por imersão em solução de SBF-5,0x, a 36,5C, por 14 dias, segundo o método sugerido por Barrere(5). Em seguida, os nanocompósitos foram lavados com água destilada e secos em dessecador à temperatura ambiente por 72 horas.
A presença e caracterização dos fosfatos de cálcio depositados sobre a superfície dos nanocompósitos foi confirmada por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Análise da viabilidade celular dos nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 biomimeticamente recobertos com fosfatos de cálcio
A biocompatibilidade dos nanocompósitos recobertos foram então testados in
vitro de acordo com a norma ISO 10993-5(15) para biomateriais, utilizando linhagem
de células de ovário de hamster chinês (CHO).
Pedaços de látex e papel de filtro com diâmetro aproximado de 10 mm, semelhante as dimensões dos nanocompósitos recobertos, foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. As amostras de biocerâmicas foram esterilizados em autoclaves e os controles positivos (látex) e negativos (papel filtro) por exposição na luz ultravioleta por 24 horas.
Os testes de citotoxicidade foram realizados em placas para cultura de células com 24 poços estéreis. Os nanocompósitos recobertos foram testados em triplicatas e, após serem colocados nos poços da placa de cultura, foi depositada sobre eles 0,5 mL de solução de 104 células/mL. Em seguida, as células CHO foram cultivadas em estufa por 72 horas a 37º C, sob atmosfera úmida de 5% de CO2.
Após 72 horas de crescimento celular, as pastilhas dos nanocompósitos recobertos e dos controles positivos e negativos foram retirados da placa de cultura. As células cultivadas nos poços foram então quantificadas para determinar a viabilidade celular. A quantificação das células foi realizada pela adição de 10L de solução de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) 5mg/mL em cada poço e incubação de duas horas, a 37C, em estufa com 5% de CO2. Após esse período, o meio de cultura foi removido e os cristais roxo de formazal foram solubilizados com solução de álcool isopropílico com HCl 0,04mol/L. A absorbância da solução nos poços foi medida em um espectrofotômetro em 570nm. A viabilidade celular foi feita considerando o controle positivo (papel de filtro) como 100% de células viáveis.
O desenvolvimento celular foi monitorado em intervalos de 24h por microscopia óptica. Após 72 horas de crescimento, os nanocompósitos retirados dos poços de cultura tiveram a superfície de fosfato de cálcio avaliada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) para determinar a morfologia e a proliferação celular.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Caracterização do nanocompósito de Al2O3/ZrO2 biomimeticamente recoberto com fosfatos de cálcio
A Figura 1 mostra imagens de MEV da superfície da camada de fosfato de cálcio depositada sobre o nanocompósito de Al2O3/ZrO2, tratado e não tratado quimicamente, após 14 dias de recobrimento biomimético. Nessas imagens é possível observar a formação dos núcleos de fosfatos que cresceram de forma espontânea em todas as condições de tratamento superficial que os nanocompósitos foram submetidos.
Já a figura 2 mostra os espectros de absorção e segunda derivada de FTIR da superfície de fosfato depositado sobre os nanocompósitos. A partir desses espectros, é possível observar principalmente a contribuição dos modos vibracionais resultantes dos grupos funcionais dos fosfatos de cálcio formados e dos grupos funcionais das superfícies do nanocompósitos de Al2O3/ZrO2. As bandas observadas em 877 cm-1, ~647 cm-1 e ~590 cm-1 podem ser atribuídas às vibrações de estiramento Al-O. Já as bandas de absorção observadas em 621 cm-1, 475 cm-1 e 445 cm-1 podem ser atribuídas às vibrações Zr-O(19,20).
Figura 1. MEV da superfície de fosfato de cálcio depositado, após 14 dias de recobrimento biomimético, sobre os nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 tratados e não
tratados quimicamente. 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 503 528 595 647 851 1128 1033 916 892 Tratamento com H3PO4 cm-1 448 467 cm-1
Tratamento com HNO3
877 527 cm-1 cm-1 449 505 649 920 590 611 467
Tratamento com NaOH
921 877 449 503 527 590 647 467 611 Sem tratamento 448 468 505 528 565 598 646 687 736 853 895 916 983 1126 1033
Figura 2. Espectros de FTIR de absorbância e segunda derivada da superfície de fosfatos de cálcio, após 14 dias de recobrimento biomimético, sobre nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 tratados e não tratados quimicamente.
A intensidade das bandas no espectro de FTIR foi ajustada igualando a intensidade da banda entre 400 e 500 cm-1, que é atribuída as vibrações Zr-O. A segunda derivada foi ajustada igualando para todas as amostras a banda em 445 cm-1, também atribuída a vibração Zr-O. A partir da normalização dos espectros foi possível observar uma grande semelhança entre os nanocompósitos sobmetidos a
diferentes tratamentos químicos quanto a composição química. A diferença nas amostras foi na quantificação do fosfato de cálcio formado.
As bandas de absorção observadas na região de 980 a 1150 cm-1 são características do grupo PO4-3 do fosfato de cálcio formado sobre a superfície do nanocompósito. Já a intensidade dessas bandas de absorção mostra que os nanocompósitos sem tratamento químico e tratados quimicamente com H3PO4 apresentaram maior deposição de fosfato de cálcio(21-23). Essa amostras, devido à maior deposição de fosfato de cálcio, apresentaram uma menor intensidade dos sinais atribuídos à Al-O e à Zr-O (entre 500 e 620cm-1).
Viabilidade celular dos nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 biomimeticamente recobertos com fosfatos de cálcio
As células CHO, cultivadas por 72 horas em contato direto com os nanocompósitos recobertos, tiveram um crescimento celular expressivo em toda a superfície do poço, inclusive nas bordas das biocerâmicas, como mostra a figura 3. Na análise visual não foi possível observar diferenças significativas da proliferação de células nos diferentes nanocompósitos recobertos, o que sugere uma toxicidade reduzida em todas as condições estudadas.
Figura 3. Microscopia óptica das células CHO, após 72 horas de cultivo em contato direto com os nanocompósitos de Al2O3/ZrO2 biomimeticamente recobertos com fosfato de cálcio, sob diferentes tratamentos superficiais químicos.
A figura 4 mostra imagens de MEV de células CHO, após 72 horas de cultivo, sobre a superfície dos fosfatos de cálcio formados sobre os nanocompósitos sob diferentes tratamentos químicos. Pode-se observar estruturas circulares das células CHO, com tamanhos entre aproximadamente 10 e 12 m, além da presença de pequenas esferas. Essas estruturas já foram relatadas por Porter et al.(24) em um estudo por MEV sobre as mudanças morfológicas das células CHO durante o seu ciclo de vida. Neste trabalho, Porter et al.(24) descreveu o ciclo de vida das células CHO em 4 etapas: G1, S, G2 e D. No primeiro estágio do ciclo de vida, denominada etapa inicial G1, ressaltou a morfologia arredondada da células CHO, com aproximadamente 12 m, cobertas com numerosos microvilosidades e outras esferas lisas (2-4 um), descritas como fragmentos de células lisadas durante a mitose. Na etapa intermediária G1, as células começam a aumentar de tamanho, perdendo sua forma esférica e adquirindo uma forma estendida, com pequenas bolas entremeadas com numerosas microvilosidades. Nas etapas seguintes, até atingir a confluência, as células perdem as microvilosidades e bolas e começam a apresentar um aspecto bastante estendido e assimétrico(24), como observado na microscopia óptica na figura 3.
Figura 4. MEV de células CHO, após 72 horas de cultivo, na superfície de fosfato de cálcio depositado sobre nanocompósitos de Al2O3/ZrO2.
Desta forma, pode-se presumir que, após 72 horas de crescimento, as células na superfície do poço de cultura (figura 3) estão próximas a etapa de confluência (final do estágio de crescimento), onde se observam células mais estendidas, com pouca presença de esferas e microvilosidades. Além disso, pode-se observar em todas as imagens de microscopia ótica (figura 3) pequenos fragmentos que se desprenderam da superfície do nanocompósito. Esses fragmentos não podem ser confundidos com estruturas celulares, visto que estavam presentes desde o início do cultivo. Por outro lado, na superfície de fosfatos de cálcio formada sobre os nanocompósitos foram observadas células arredondada, com a presença de pequenas estruturas circulares e microvilosidades (figura 4), características do estágio inicial do ciclo de vida da célula CHO. Esses resultados sugerem que as células tiveram um estágio de adaptação na superfície do nanocompósito, retardando o início da sua proliferação. Após superado essa etapa de adaptação, as células passaram a se desenvolver normalmente. A adaptação na superfície do nanocompósito recoberto pode ser comprovada pelas presenças de estruturas
Sem tratamento H3PO4
celulares, como a microvilosidades(24). Devido à mudança de condição de cultivo, com diferença na superfície de adesão, o tempo de adaptação das células é totalmente justificado e não representa toxicidade das amostras.
Os resultados do teste de MTT de viabilidade celular são mostrados no gráfico da figura 5. Os valores de viabilidade celular maiores que 90% demonstram a ótima biocompatibilidade e baixa citotoxicidade dos nanocompósitos recobertos e analisados. Esses resultados podem ser comparados também com ensaios de citotoxicidade citados na literatura, em que são observados bons resultados em amostras de fosfato de cálcio e nanocompósitos de Al2O3/ZrO2(1,3,25-27).
86 88 90 92 94 96 98 100 tratamento químico NaOH HNO3 H3PO4 tratamento
Período de 14 dias de incubação - SBF 5,0x
Perce ntu al d e via bilidad e ce lular (%) sem
Figura 5. Viabilidade celular (%), após 72 horas de cultivo em contato direto com os nanocompósitos de Al2O3/ZrO2, recobertos com fosfato de cálcio, sob diferentes tratamentos químicos e após 14 dias de recobrimento biomimético.
CONCLUSÕES
De forma geral, observou-se que os nanocompósitos de Al2O3/ZrO2, independentemente do tratamento químico recebido, apresentaram um bom recobrimento biomimético aos 14 dias de incubação. Além disso, observou-se também que as diferentes condições de tratamento químico influenciaram na quantidade de fosfatos de cálcio formados sobre as superfícies dos nanocompósitos, ocorrendo maior formação sobre os nanocompósitos tratados com H3PO4.
Os testes de viabilidade celular foram bastante promissores, com valores acima de 90%. A análise morfológia e de proliferação celular das células nas superfícies de fosfato de cálcio também demonstram baixa toxicidade e boa biocompatibilidade das amostras.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP, pelo apoio financeiro, (Processo no 2014/11100-9) e à Embrapa Instrumentação Agropecuária, pela aquisição das imagens de MEV.
REFERÊNCIAS
1. BEN-NISSAN, B. Advances In Calcium Phosphate Biomaterials (Springer Series In Biomaterials Science And Engineering), Springer, 2014.
2. HENCH L.L. Bioceramics: From concept to clinic, Journal of the American Ceramic
Society, v.74, n.7, p.1487-1510, 1991.
3. Antoniac, I.V. Handbook of Bioceramics and Biocomposites, Springer, 2016.
4. ABE, Y.; KOKUBO, T.; YAMAMURO, T. Apatite coating on ceramics, metals and polymers utilizing a biological process, Journal of materials science: Materials in medicine, v. 1, p.233-238, 1990.
5. BARRERE F, VAN BLITTERSWIJK C.A., GROOT K and LAYROLLE P. Influence of Ionic Strength and Carbonate on the Ca-P Coating Formation from SBF×5 Solution, Biomaterials, v.23, n.29, p.1921-1930, 2002.
6. CHEN, D., JORDAN E, H., GELL, M., WEI, M. Apatite formation on alkaline-treated dense TiO2 coatings deposited using the solution precursor plasma spray process, Acta
Biomaterialia, v.4, n.3, p. 553-559, 2009.
7. JOHNSSON, M.S.A; NANCOLLAS, H. The role of brushite and octacalcium phosphate in apatite formation, Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, v.3, p.61-82, 1992.
8. KOKUBO, T. Development of bioactive materials based on surface chemistry, Journal of
the European Ceramic Society, v.29, n.7, p.1267-1274, 2009.
9. UCHIDA, M.; KIM, H. M.; KOKUBO, T.; NAWA, M.; ASANO, T.; TANAKA, K.; 10.NAKAMURA, T. Apatite-forming ability of a zirconia/alumina nanocomposite induced by chemical treatment, Journal of Biomedical Materials Research, v.60, p.277-282, 2002.
11. SIOSHANSI, P., TOBIN, E.J. Surface Treatment of Biomaterials by Ion Beam Process,
Surface and Coatings Technology, v.83, p.175-182, 1996.
12. PICONI, C.; MACCAURO, G. Zirconia as a ceramic biomaterial, Biomaterials, v.20, p.1-25, 1999.
13. KIM Y.H.; KOAK, J.Y.; CHANG, I.T.; WENNERBERG, A.; HEO, S.J. A histomorphometric analysis of the effects of various surface treatment methods on osseointegration, International Journal Oral and Maxillofacial Implants, v.18, n.3, p.349- 356, 20
14. PIZZOFERRATO, A.;CIAPETTI, G.; STEA, S.; CENNI, E. ARCIOLA, C.R.; GRANCHI, D.; SAVARINO, L. Cell culture methods for testing biocompatibility, Clinical Materials, v.15, p.173-190, 1994.
15. International Organization for Standardization. ISO 10993-5:2009. Biological evaluation of medical devices –Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. 2009.
16. ROGEROA, S.O.; LUGÃOA, A.B.; IKEDAB, T.I.; CRUZB, Á.S. Teste in vitro de Citotoxicidade: Estudo Comparativo entre Duas Metodologias, Materials Research, v.6, n.3, p.317-320, 2013.
17. GUIMARÃES, F.A.T.; SILVA, K.L.; TROMBINI, V.; PIERRI, J.J.; RODRIGUES, J.A., TOMASI, R.; PALLONE, E.M.J.A. Correlation between microstructure and mechanical properties of Al2O3/ZrO2 nanocomposites, Ceramics International, v.35, n.2, p.741-745,
2009.
18. OJAIMI, C.L.; CHINELATTO, A.S.A; CHINELATTO, A.L; PALLONE, E.M.J.A.; SALEM, R.E.P. Microstructural Evolution of Alumina-Zirconia Nanocomposites, Materials Science
Forum (Online), v.805, p.621-626, 2014
19. SARKAR, D.; MOHAPATRA, D.; RAY, S.; BHATTACHARYYA, S.; ADAK, S.; MITRA, N. Nanostructured Al2O3-ZrO2 Composite synthesized by sol-gel technique: powder processing and microstructure, Journal of Materials Science, v.42, p.1847-1855, 2007. 20. VOL’KHIN, V.V.; ZHARNYL’SKAYA, A.L.; LEONT’EVA, G.V. Physicochemical Study of Composite Gel in the Al2O3–ZrO2 System, Russian Journal of Inorganic Chemistry, v. 55, n.5,
p 670–675, 2010.
21. BERZINA-CIMDINA, L.; BORODAJENKO, N. Research of Calcium Phosphates Using Fourier Transform Infrared Spectroscopy, Infrared Spectroscopy - Materials Science,
Engineering and Technology, p.123-149, 2012.
22. GADALETA, S.J.; PASCHALIS, E.P.; BETTS, F.; MENDELSOHN, R.; BOSKEY, A.L. Fourier Transform Infrared Spectroscopy of the Solution-Mediated Conversion of Amorphous Calcium Phosphate to Hydroxyapatite: New Correlations Between X-Ray Diffraction and Infrared Data, Calcified Tissue International, v.58, p.9-16, 1996.
23. KOUTSOPOULOS, S. Synthesis and characterization of hydroxyapatite crystals: A review study on the analytical methods. Journal Biomedical Materials Research, v.62, p.600-612, 2002.
24. PORTER, K.; PRESCOTT, D.; FRYE, J. Changes in surface morphology of chinese hamster ovary cells during the cell cycle, The Jounal of Cell Biology, v. 57, p.815-836, 1973. 25. WEBLER, G.D.; ZAPATA, M.J.M.; AGRA, L.C.; BARRETO, E.; SILVA, A.O.S.; HICKMANN, J.M.; FONSECA, E.J.S. Characterization and evaluation of cytotoxicity of biphasic calcium phosphate synthesized by a solid state reaction route, Current Applied
Physics v.14, p876-880, 2014.
26. BOSE, S.; TARAFDER, S. Calcium phosphate ceramic systems in growth factor and drug delivery for bone tissue engineering: A review, J Biomed Mater Res B Appl Biomater, v. 93, n.2, p. 297-303, 2010.
27- Thamaraiselvi, T. V.; Rajeswari, S. Biological Evaluation of Bioceramic Materials - A Review, Trends Biomater. Artif. Organs, v.18, n.1, p.9-17, 2004.
EVALUATION OF Al2O3/5% ZrO2 NANOCOMPOSITE CYTOTOXICITY COATED WITH CALCIUM PHOSPHATE BY BIOMIMETIC METHOD AFTER DIFFERENT
TREATMENT CHEMICALS ABSTRACT
Due to its bioinert nature, Al2O3/ZrO2 nanocomposites feature promising characteristics for biomaterial applications. To make its performance more suitable biological, biomimetic coating has been used to promote the deposition of phosphate phases onto its surface. In this way, the objective of the study was to evaluate the cytotoxicity of Al2O3/ZrO2 (5% vol) nanocomposites, under different chemical surface treatments, coated with calcium phosphate. Thus, sintered nanocomposites (1500oC/2h), under different chemical surface treatments, were biomimetic coated and characterized by FTIR and SEM. The biocompatibility of the coated nanocomposite was evaluated by in vitro tests using strain CHO cells, according to standard ISO10993-5. The cells were cultured for 72 hours directly on the coated
nanocomposite surface, at 37oC, under 5% humid atmosphere of CO2. The cell
viability of coated nanocomposite was confirmed by MTT assay. The cell morphology and proliferation tests were confirmed by optical microscopy and SEM.
