Sequenciamento de genomas: princípios e métodos clássicos

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Sequenciamento de genomas:

princípios e métodos

clássicos

Cesar Martins (cmartins@ibb.unesp.br) Departamento de Morfologia

Instituto de Biociências , UNESP Universidade Estadual Paulista Botucatu, SP

Sequenciamento de DNA e de genomas:

Determinar a sequência de nucleotídeos ao longo da cadeia de DNA

...AGCAATTGTGAGTCCCTGACTTTTTGCTTA

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Estudo de genes

Diagnóstico forense e clínico Identificação de indivíduos Estudos comparativos

Evolução, Fisiologia, Ecologia, ... Conhecimento do genoma

Aplicações

Análise genômica 2013

Genomas sequenciados

Primeiro genoma sequenciado:Fago X174, 5.375 pb (9 genes) Sanger et al. 1977, Nature 265: 687-695

Primeiro eucarionte sequenciado:Saccharomyces cerevisae, 13 milhões pb Goffeau et al. 1996, Science 274: 546, 563-567

Primeiro animal sequenciado:Caenorhabditis elegans, 100 milhões pb C elegans Sequencing Consortium 1998, Science 282: 2012-2018

Primeira planta sequenciada:Arabidopsis thaliana, 157 milhões pb Arabidopsis Genome Initiative 2000, Nature 408: 796-815

Genoma humano: 3 bilhões pb

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Genomas sequenciados

1000 genomes available Source: NCBI, May 07/2013

Princípios e Métodos Clássicos

Método químico

Maxam & Gilbert 1977

Método dideoxi ou de terminalização

Sanger et al. 1977

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Arranjo dos nucleotídeos na molécula de ácido nucléico Nucleotídeo Nucleotídeo Nucleotídeo Ligação fosfodiéster Ligação fosfodiéster fosfato Base açúcar Análise genômica 2013 Análise genômica 2013

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Clivagem preferencial do DNA em nucleotídeos específicos

Dimetilfulfato

Piperidina

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Marcar os finais da dupla fita de DNA com 32_P

Desnaturar o DNA para separar as fitas

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Método dideoxi ou de terminalização

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Frederick Sanger Dois prêmios Nobel em Bioquímica

Sanger Institute, Cambridge, England

*Método dideoxi de sequenciamento *Sequenciamento Shotgun

Método dideoxi ou de terminalização

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13 Fita contínua Fita descontínua Primers Duplicação do DNA Análise genômica 2013 Duplicação do DNA

DNA polimerase requer adicionar próximo nucleotídeo

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Método dideoxi ou de terminalização Dideoxinucleotídeo Nucleotídeo sem grupo OH no carbono 3 do açucar Nucleotídeo normal Deoxinucleotídeo Análise genômica 2013

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** IMPORTANTE!!

primer ou um dos nucleotídeos marcados radioativamente! Seqüenciamento

manual

Seqüenciamento manual

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Seqüenciamento manual by C Martins (1999)

Gilbert X Sanger

Gilbert

Requer grande quantidade de DNA purificado e muitos passos de purificação;

Digestões enzimáticas; Produz curtas leituras;

Encontrou aplicação em footprinting Não requer clonagem;

Automatização não disponível.

Sanger

Requer clonagem do fragmento de interesse; Requer muito pouco DNA;

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Desenvolvimento de sequenciamento automatizado

1986:

Leroy E. Hood's laboratory at the California Institute of Technology announce the first semi-automated DNA sequencing machine.

1987:

Applied Biosystems markets first automated sequencing machine, the model ABI 370.

Seqüenciamento automático versão I

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Sequenciamento automático

Leroy Hood

18/ 03/ 12 08:17 Fluorescence detection in autom ated DNA sequence analysis

gina 1 de 1 http:/ / www.nature.com / nature/ journal/ v321/ n6071/ abs/ 321674a0.htm l

nature.com about npg news@nature.com naturejobs natureevents help site index

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Nature 321, 674 - 679 (12 June 1986); doi:10.1038/321674a0

Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis

LLOYD M. SMITH, JANE Z. SANDERS, ROBERT J. KAISER, PETER HUGHES, CHRIS DODD, CHARLES R. CONNELL*_{, CHERYL HEINER}*_, STEPHEN B. H. KENT & LEROY E. HOOD

Division of Biology, California Institute of Technology, Pasadena, California 91125, USA

*_{Applied Biosystems, Inc., Foster City, California 94404, USA}

We have developed a method for the partial automation of DNA sequence analysis. Fluorescence detection of the DNA fragments is accomplished by means of a fluorophore covalently attached to the oligonucleotide primer used in enzymatic DNA sequence analysis. A different coloured fluorophore is used for each of the reactions specific for the bases A, C, G and T. The reaction mixtures are combined and co-electrophoresed down a single polyacrylamide gel tube, the separated fluorescent bands of DNA are detected near the bottom of the tube, and the sequence information is acquired directly by computer.

References

1. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. Proc. natn. Acad. Sci. U.S.A.74, 5463 5467 (1977). | ChemPort |

2. Smith, A. J. H. Meth. Enzym.65, 560 580 (1980). | Article | PubMed | ChemPort |

3. Maxam, A. M. & Gilbert, W. Meth. Enzym.65, 499 559 (1980). | Article | PubMed | ChemPort |

4. Smith, L. M., Fung, S., Hunkapiller, M. W., Hunkapiller, T. J. & Hood, L. E. Nucleic Acids Res.13, 2399 2412

(1985). | PubMed | ISI | ChemPort |

5. Smith, L. M., Kaiser, R. J., Sanders, J. Z. & Hood, L. E. Meth. Enzym. (in the press).

6. Atkinson, T. & Smith, M. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (ed. Gait, M. J.) 35 81 (IRL, Oxford, 1984).

7. Forster, A. C., McInnes, J. L., Skingle, D. C. & Symons, R. H. Nucleic Acids Res.13, 745 761

(1985). | PubMed | ISI | ChemPort |

8. Chuvpilo, S. A. & Kravchenko, V. V. Sov. J. bioorg. Chem.9, 1694 1697 (1983).

9. Rosenthal, A., Schwertner, S., Hahn, V. & Hunger, H. Nucleic Acids Res.13, 1173 1184 (1985). | PubMed | ISI | ChemPort |

1986 Nature Publishing Group Privacy Policy

Seqüenciamento automático versão II

A C GT: dideoxi nucleotídeos marcados

com compostos fluorescentes DNA

Primer

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19

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Cromatograma Seqüenciamento automático versão II

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Seqüenciamento automático versão III (capilar)

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http://www.wellcome.ac.uk/Education-resources/Teaching-and-education/Animations/DNA/WTDV026689.htm

Seq capilar por Sanger

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Sequenciamento de genomas inteiros

Sequenciamento total de genomas

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Desvendando a complexidade dos genomas Mapa físico da seqüência nucleotídica

HGP Celera

Sequenciamento clássico por

-Vantagens

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Análise genômica 2013

08-11 de Julho de 2013

Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP