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Resumo: O estudo dos tumores mamários da cadela é um exce- lente modelo para a investigação clínico-patológica, diagnóstica e prognóstica das neoplasias mamárias da espécie humana. O ob- jetivo deste estudo foi investigar a expressão imuno-histoquími- ca das citoqueratinas 5, 14 e 18 na caracterização da histogênese e do grau de malignidade de tumores mamários em cadelas em citologias por impressão, caracterizando um auxílio diagnóstico e um prognóstico mais precoce dos tumores mamários. Dessa forma foi testada a capacidade dos referidos anticorpos mono- clonais em discriminar as camadas epiteliais luminal e basal, e caracterizar o prognóstico destes animais. Os resultados presen- temente alcançados são de muito valor na rotina oncológica, além de determinantes para um diagnóstico precoce, pré-cirúrgico, das neoplasias mamárias em cadelas. Das citoqueratinas estudadas, a citoqueratina 18 apresentou resultados estatísticos significativos como marcador diagnóstico, uma vez que a sua expressão está relacionada com o diagnóstico de carcinoma. Outrossim, pode ser considerado marcador de mau prognóstico se considerarmos os carcinomas, os tumores de caráter mais maligno. A utiliza- ção deste anticorpo pode contribuir para um prognóstico tumoral mais criterioso, permitindo ir além da utilização de uma classifi- cação tumoral complexa e pouco conclusiva como única resposta na busca de uma melhor e maior sobrevida ao paciente portador de câncer mamário.
Abstract: The investigation of the mammary tumors in the bitch has showed to be an excellent model for the diagnostic, clinic pathologic, and prognostic search of mammary neoplasias in human beings. The goal of this research was the investigation of immunocytochemical capability of monoclonal antibodies (citokeratins 14 and 18) to characterize the histogenesis and the malignant degree of mammary tumors in the bitch. We also, tes- ted the capability of these monoclonal antibodies to discriminate between luminal and basal epithelial tissue, and to determine malignant through type I citokeratin expression. These results have a great value for oncology practice and, besides, are deter- minant for an early presurgical diagnosis of canine mammary ne- oplasias. The use of those antibodies as a panel of markers may contribute for a more accurate tumoral prognosis, allowing us to go farther than the use of a non definitive and complex tumoral classification as the sole answer in the search of a better and lon- ger life for the patient suffering mammary neoplasia.
Introdução
As neoplasias mamárias são os tumores mais comuns na cadela, sendo responsáveis por aproximadamente 52% de todas as neoplasias nesta espécie (MacEwen, 1990; Sørenmo, 1998). Também, a fêmea canina, é a que apresenta maior incidência de neoplasias mamá- rias dentre todos os mamíferos e, quando comparada à mulher, apresenta três vezes mais tumores (Brodey et al., 1983).
Os tumores mamários dos canídeos são modelos apropriados, e válidos, ao estudo da biologia do câncer (Schneider et al., 1970; Mottolese et al., 1994), assim como para testes de agentes terapêuticos, já que ani- mais de companhia têm tumores que do ponto de vista histopatológico e de comportamento biológico são si- milares aos descritos na espécie humana (MacEwen, 1990; Peleteiro, 1994). O estudo da patogenia e his- togênese destas neoplasias, envolvendo marcadores de receptores hormonais e de filamentos intermediários, é o que tem alcançado maior progresso nos últimos anos (Peleteiro, 1994).
O valor diagnóstico do exame citológico de tumo- res, tanto de lesões internos como externos, tem sido bem estabelecido na prática médica humana (Griffiths et al., 1984). Na maioria das vezes, o material colhido pode ser conseguido de forma rápida, fácil e barata, com pouco ou nenhum risco para o paciente. Freqüen- temente o material pode ser preparado, corado e inter- pretado com o cliente ainda no ambulatório. A inter- pretação dos achados citoscópicos é sempre de valor no estabelecimento do diagnóstico, identificação do processo (neoplasia ou hiperplasia reactiva), definição da terapia, ajuizamento do prognóstico e na determi- nação dos procedimentos diagnósticos subseqüentes (Cowell et al., 1999).
Assim, o estudo citopatológico do tumor tem um grande valor como apoio diagnóstico, pois, feito rapi-
A imuno-expressão das citoqueratinas como marcadores diagnósticos e prognósticos nas neoplasias mamárias caninas
Cytokeratin immunoexpression as diagnostic and prognostic markers in canine mammary neoplasias
Debora Aparecida Pires de Campos Zuccari 1*, Marcilia Viana Pavam 2, José Antônio Cordeiro3, Aureo Evangelista Santana1
1 FCAV - UNESP, Campus de Jaboticabal, Rodovia Carlos Tonanni, s/nº - Jaboticabal (SP), Brasil
2 UNIRP - São José do Rio Preto (SP), Brasil
3 FAMERP - São José do Rio Preto (SP), Brasil
* Correspondência: debora.zuccari@terra.com.br. Endereço actual:
UNIRP - Centro Universitário de Rio Preto – São José do Rio Preto (SP), Brasil
damente e no próprio consultório, possibilita ao clínico a adoção de condutas terapêuticas mais precoces, segu- ras e, na maioria das vezes, individualizadas (Wallgren et al., 1976; Wilson e Ehrmann, 1978). Para a lesão maligna, a aspiração do nódulo mamário e o diagnós- tico citopatológico permitem ao clínico descobrir a do- ença precocemente e estabelecer um plano de terapia mais seguro e urgente, até mesmo a definição de um tratamento mais radical como uma mastectomia (Ei- senberg et al., 1986).
A detecção de filamentos intermediários, que com- põem o citoesqueleto das células epiteliais, é uma das maneiras mais importantes de caracterizar a histogêne- se tumoral e de classificar tumores de origem desco-
nhecida. Os filamentos intermediários constituem uma família de proteínas relacionadas. Esta família inclui as citoqueratinas, a vimentina, a desmina e o neuro- filamento revelando uma distribuição tecidual restrita (Arai et al., 1994).
As queratinas estão presentes na maior parte das cé- lulas epiteliais sendo, assim, marcadores muito sensí- veis à detecção de células malignas de origem epitelial.
Na anátomo-fisiologia da glândula mamária da cadela, pode-se observar que os alvéolos da glândula mamária são compostos por epitélios basal e luminal. O epitélio basal forma uma camada descontínua entre a membra- na basal e o epitélio luminal, o qual forra o lume dos ductos e alvéolos (Griffiths et al., 1984). Essa dispo- sição topográfica é de extrema importância no estudo dos tumores mamários havendo uma relação direta da distribuição dos componentes celulares com o prognós- tico da lesão. As células epiteliais luminais expressam as queratinas 7, 8, 18 e 19 e as células epiteliais basais expressam queratinas 5 e 14 (Warburton et al., 1989).
Arai et al. (1994) observaram que a expressão de filamentos intermediários nas células epiteliais ma- márias pode ser mantida ou modificada quando essas células sofrem transformação neoplásica. Tais células passariam a ter a capacidade de síntese de uma deter- minada citoqueratina de peso molecular 57 kilodalton, conhecida como citoqueratina tipo I (anticorpo mono- clonal 24) e considerada como o marcador molecular da transformação maligna das células epiteliais mamá- rias.
Assim, o presente trabalho foi planejado e executado com o objectivo de contribuir para o aprimoramento da técnica de imunomarcagem aplicada à citologia por impressão dos tumores mamários em cadelas e, ao mesmo tempo, definir a histogênese tumoral e a possí- vel transformação maligna das células, auxiliando no estabelecimento de melhor conduta clínica, bem como no auxílio diagnóstico e do prognóstico precoce da ne- oplasia mamária em cadelas.
Materiais e métodos
No presente protocolo experimental foram utilizadas trinta e uma cadelas, portadoras de neoplasias mamá- rias, atendidas no Hospital Veterinário “Governador Laudo Natel”, da FCAV/UNESP - Câmpus de Jaboti- cabal, no período de Janeiro a Dezembro de 2000.
As preparações citoscópicas foram submetidas a acção de anticorpos dirigidos contra três diferentes marcadores para a avaliação e classificação das neopla- sias mamárias: a citoqueratina 18 (The Binding Site, PH504) como marcador de células epiteliais luminais, a citoqueratina 14 (The Binding Site PH503) como marcador de células epiteliais basais (mioepiteliais) e a citoqueratina tipo I (The Binding Site CK50) como marcador de transformação maligna da célula epite- lial.
Imediatamente após a exérese cirúrgica do tumor,
45%
16% 10%
10%
10%
6%
3%
TCM TCB
Carcinoma túbulo-alveolar Carcinoma alveolar Carcinoma lobular Carcinoma ductal Carcinoma esquirroso
Figura 1 - Diagnóstico histopatológico de neoplasias mamárias em cade- las atendidas junto ao HV-FCAV/ Unesp, no período de janeiro a dezem- bro de 2000. Jaboticabal (SP), 2001. TCB – Tumor Complexo Benigno;
TCM – Tumor Complexo Maligno.
Figura 2 – Fotomicrografia de preparações imunocitoquímicas demons- trando a marcação das citoqueratinas nas citologias dos carcinomas com- plexos malignos em cadelas. A. Citoqueratina 5 (60X); B. Células fusi- formes marcadas por Citoqueratina 5 (60X); C. Citoqueratina 18 (40X);
D. Citoqueratina 14 (40X). Jaboticabal (SP), 2001.
A B
C D
foram feitas as impressões para os procedimentos imu- nocitoquímicos e foram colhidos fragmentos do tumor para a realização da técnica histológica. Os fragmentos de tecido colhidos durante a exérese da massa tumoral foram fixados em formol a 10%, desidratados, diafani- zados e embebidos em parafina e os blocos, submetidos a cortes de 5 µm de espessura, montados entre lâmina e lamela e corados pela Hematoxilina e Eosina (HE) para diagnóstico histopatológico.
O procedimento para imunomarcação das prepara- ções citoscópicas e também dos cortes de tecido ini- ciou-se com a Recuperação Antigênica. Foi prepara- da uma solução de ácido cítrico (pH = 6,0) e esta foi aquecida por cinco minutos em microondas (700 w).
As preparações citoscópicas foram mergulhadas nesta solução por 25 minutos, em panela a vapor (80 oC).
Após as lâminas retornarem a temperatura ambien- te, foi realizado o Bloqueio da Peroxidase Endógena, para o que as preparações citoscópicas foram lavadas três vezes em água destilada e, em seguida, colocadas em solução de Metanol com Peróxido de Hidrogênio a 3%, durante 20 a 30 minutos. Em seguida, as prepa- rações foram incubadas em câmara húmida por duas horas (temperatura ambiente) ou durante a noite à 4 oC, com o anticorpo primário, sendo que as diluições dos anticorpos foram feitas em soro fetal bovino (BSA), seguindo a especificação de cada anticorpo.
Após a incubação, as preparações foram submetidas a três lavagens sucessivas de PBS de cinco minutos
A B
C D
Figura 3 – Fotomicrografia de preparações imuno-histoquímicas de- monstrando a marcação das citoqueratinas na histopatologia dos carci- nomas complexos malignos em cadelas. A e B. Citoqueratina 14 (40X) Marcação da dupla camada epitelial; C. Citoqueratina 18 (40X) Marca- ção de células estromais e luminais D. Citoqueratina 5 (40X) Marcação das células mioepiteliais. Jaboticabal (SP), 2001.
Tabela 1 - Diagnóstico, perfil imunocitoquímico e prognóstico de tumores mamários de cadelas (Diagnóstico: TCB – Tumor Comple- xo Benigno; TCM – Tumor Complexo Maligno. Marcadores: X. Inconclusivo, -. Negativo, +. FOCAL, ++. ATÉ 25%, +++. 25-50%, ++++. MAIS DE 50%). Jaboticabal, 2001.
Diagnóstico CK14 CK18 CK5 Prognóstico
1 TCB X + ++ BOM
2 CARCINOMA ALVEOLAR +++ ++ +++ RUIM
3 TCM X +++ X BOM
4 TCB X X +++ RUIM
5 TCM - - X BOM
6 TCB ++ ++++ ++ BOM
7 TCM ++ ++++ ++ BOM
8 TCM ++++ ++++ ++++ RUIM
9 TCM ++++ ++++ ++++ RUIM
10 TCM +++ ++ +++ BOM
11 TCM ++ +++ ++ BOM
12 TCM ++++ ++++ ++++ BOM
13 CARCINOMA TUBULAR - - - BOM
14 CARCINOMA ALVEOLAR ++ ++ ++ RUIM
15 TCM - +++ +++ BOM
16 TCM X +++ +++ RUIM
17 TCM ++ ++ ++ BOM
18 TCM ++++ ++++ ++++ BOM
19 TCM X ++++ ++++ BOM
20 CARCINOMA ALVEOLAR ++++ X ++++ BOM
21 TCB ++++ ++++ ++++ BOM
22 CARCINOMA ESQUIRROSO + ++++ + BOM
23 TCM +++ +++ ++++ BOM
24 TCB + X + BOM
25 CARCINOMA TÚBULO- ALVEOLAR ++++ +++ + RUIM
26 CARCINOMA DUCTAL +++ +++ +++ RUIM
27 CARCINOMA TÚBULO-ALVEOLAR X X X BOM
28 CARCINOMA DUCTAL +++ - ++ BOM
29 CARCINOMA LOBULAR ++++ ++++ ++++ RUIM
30 CARCINOMA LOBULAR ++++ ++++ ++++ RUIM
31 CARCINOMA LOBULAR ++++ ++++ ++++ RUIM
cada e em seguida foi utilizado o Kit LSAB Peroxida- se (Dako, Dinamarca). Primeiramente, as preparações citoscópicas foram incubadas em câmara húmida por 15 minutos (temperatura ambiente), com a solução A (biotina anti-mouse e anti-goat) e após três lavagens sucessivas de PBS de cinco minutos cada, foram in- cubadas em câmara húmida por 15 minutos, também a temperatura ambiente, com a Solução B (Estreptavi- dina-Peroxidase) e logo em seguida foram submetidas a três lavagens sucessivas de PBS, de cinco minutos cada.
Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em so- lução de cromogênio DAB (diaminobenzidina - Dako, Dinamarca) por aproximadamente oito minutos ou até a visualização macroscópica da cor marrom-dourada, foram lavadas em água corrente durante cinco minu- tos e em seguida lavadas em água destilada. Para o contraste nuclear, foi utilizado hematoxilina de Mayer com hidróxido de amônia a 0,1%, durante um a dois minutos e em seguida as lâminas foram montadas com meio de Entellan (Merck).
Em todos os testes imunocitoquímicos a bateria de lâminas possuía sempre um controlo positivo e nega- tivo para o anticorpo testado. Como controlo negativo o anticorpo primário foi substituído por PBS. Para o controlo positivo utilizou-se um carcinoma mamário com expressão positiva conhecida para os marcadores utilizados.
Os animais, independentemente dos procedimentos pós-cirúrgicos recomendados, foram acompanhados
até dezoito meses após a cirurgia para avaliação da ocorrência de recidiva e/ou metástase da neoplasia ma- mária.
Para descrever a intensidade e a percentagem de cé- lulas marcadas utilizou-se do sistema de cruzes (- Ne- gativo; + focal (expressão em 10% das células); ++ até 25%; +++ 25-50%; ++++ mais de 50%).
Os resultados obtidos no presente estudo foram ana- lisados dentro do contexto do diagnóstico tumoral e do prognóstico do paciente. O método de predição esco- lhido foi o da Regressão Logística Nominal, quando considerado só o diagnóstico, e aquele da Regressão Logística Binária, quando considerados o diagnóstico e o prognóstico.
O prognóstico foi avaliado com base nas caracterís- ticas macroscópicas do tumor (dimensões, localização, presença de áreas de ulceração e necrose), tempo de evolução, recidiva, presença de metástase (Classifica- ção TNM) (Gilbertson et al., 1983) e ainda em relação à resposta pós-operatória e óbito. No caso dos animais que vieram a óbito, em decorrência de outras causas, foram considerados apenas os aspectos pré-operatórios do tumor e do paciente.
Resultados
Como observado na Figura 1, os tumores complexos malignos ocorreram com maior freqüência e totaliza- ram 45% dos casos. Os tumores complexos benignos representaram apenas 16% e foram a representação das neoplasias benignas neste grupo. Os carcinomas alveolares, túbulo-alveolares e lobulares foram diag- nosticados em 10% dos casos, cada um. Os carcinomas ductais foram diagnosticados em dois casos (6%) e os carcinomas esquirrosos em apenas um (3%).
As citoqueratinas demonstraram excelente expres- são nas preparações imunocitoquímicas (Figura 2) e também nas imunohistoquímicas. Nas preparações de imunocitoquímica observou-se a marcação tanto dos grupos celulares como nas células fusiformes soltas no esfregaço. Em concordância com a literatura con- sultada, a marcação das citoqueratinas caracterizou-se como citoplasmática.
Nos cortes de tecido (Figura 3), observou-se a mar- cação da citoqueratina 14 nas camadas epiteliais lu- minal e basal. Já a citoqueratina 18 marcou as células epiteliais luminais e também as células estromais dos tumores. Ainda nos cortes, houve grande expressão da citoqueratina 5 apenas nas células mioepiteliais.
Conforme observado na Tabela 1, a marcação foi simbolizada com cruzes e os esfregaços inconclusivos aparecem como “X”.
Cinco cadelas vieram a óbito em decorrência de ou- tras causas como ICC descompensada, complicações anestésicas pós-cirúrgicas, atropelamento, causas estas sem qualquer ligação com a neoplasia mamária. Nestes casos o prognóstico foi avaliado em relação às caracte- rísticas macroscópicas da lesão, presença de metástase
Figura 5 - Diagnóstico em relação à evolução clinica de cadelas porta- doras de tumores mamários atendidas no HV- câmpus de Jaboticabal no período de janeiro a dezembro de 2000. Jaboticabal, 2001.
16%
26% 58%
Bom Prognóstico Mau Prognóstico Óbito por outra causa
Figura 4 - Evolução clinica das cadelas portadoras de tumores mamários atendidas junto ao HV – câmpus de Jaboticabal de janeiro a dezembro de 2000. Jaboticabal, 2001.
0 2 4 6 8 10 12 14
TCB TCM Carcinoma
Tipo Tumoral
nº de casos
Mau Prognóstico Bom Prognóstico
e/ou recidiva (Classificação TNM) para confrontação com o diagnóstico tumoral (Figura 4). As caracterís- ticas macroscópicas das lesões de maior importância foram o tamanho tumoral e a presença de ulcerações, além do crescimento rápido destes tumores. O princi- pal sítio de metástases foi, sem dúvida, pulmonar e as recidivas ocorreram em 30% dos casos.
Quando confrontados o diagnóstico tumoral com o mau prognóstico observamos que nos tumores comple- xos benignos, apenas em um caso (20%) houve discor- dância do diagnóstico com relação à evolução do caso.
No caso dos tumores complexos malignos, dentre 14 cadelas apenas 3 (21,5%) confirmaram um mau prog- nóstico. Mas no caso dos carcinomas, de 12 casos, sete (58%) confirmaram o pior prognóstico (Figura 5).
Quanto aos resultados estatísticos, inicialmente, fo- ram avaliados, por meio de regressão logística nomi- nal, os anticorpos em relação ao diagnóstico, conside- rando-se como evento referencial o carcinoma, o mais maligno dos tumores.
Das citoqueratinas estudadas, obtivemos uma as- sociação positiva significativa para a citoqueratina 18 (valor p=0,027) quando comparado o carcinoma com os tumores complexos malignos. Isso significa que a citoqueratina 18 pode ser utilizada como um marcador para carcinomas em cadelas. Essa citoqueratina não tem valor preditivo significante quando da confron- tação do carcinoma com um diagnóstico benigno. A citoqueratina 14 não demonstrou relação significativa com o diagnóstico tumoral, tal como a citoqueratina 5 que, por apresentar forte correlação com as outras duas, mesmo quando avaliada sozinha, não é um bom marcador nem a nível diagnóstico, nem tampouco prognóstico. Sendo assim, este marcador não pode ser considerado um marcador de expressão nas neoplasias malignas mamárias. O diagnóstico não foi significativo para a formação de prognóstico.
Discussão
A citologia por impressão é sem dúvida uma técnica fácil, barata, simples e não necessita de instrumental sofisticado para sua confecção (Cowell, 1999). Sob as presentes condições, nas preparações citológicas por impressão de lesões neoplásicas, retiradas durante exé- rese da massa tumoral ou por ocasião do exame post mortem do paciente, o sangue e os fluídos tissulares foram primeiramente removidos da superfície da lesão da qual a impressão foi feita, enxugando-a com mate- rial absorvente. De acordo com a literatura consultada (Cowell, 1999), o excesso de sangue e de fluídos pode inibir a aderência das células do tecido à lâmina. No presente trabalho, as preparações da citologia por im- pressão se mostraram ricas, mesmo na presença de cé- lulas sangüíneas que em nada atrapalharam a qualidade das preparações.
A citologia complementada com a técnica de imuno- citoquímica demonstrou ser eficiente para o estudo dos
marcadores diagnósticos e prognósticos. Considerando o resultado inconclusivo uma possibilidade no proce- dimento citológico, uma vez que impressões repetidas podem resultar em uma ou outra impressão negativa, isto leva a técnica a ser considerada uma técnica de bai- xa sensibilidade. Neste trabalho, para cada animal fo- ram confeccionadas 10 lâminas e a impressão repetida do mesmo fragmento tumoral na lâmina resultou, algu- mas vezes, em esfregaços negativos. Tal fato invalidou estatisticamente a análise dos componentes principais e justifica a ocorrência de resultados inconclusivos em um ou mais marcadores estudados, por terem sido pro- cessados seqüencialmente.
A padronização da técnica de imunocitoquímica para tumores mamários caninos foi necessária já que os anticorpos comerciais foram desenvolvidos contra antígenos humanos limitando seu uso em patologia ve- terinária. Foram testados os reagentes de três laborató- rios e em apenas um deles (The Binding Site) obteve-se expressão positiva para os anticorpos estudados.
O estudo da expressão das citoqueratinas no tecido demonstrou que houve forte correlação entre as cito- queratinas estudadas. Isso significa que a expressão foi muito semelhante para as três citoqueratinas em cada caso estudado. O fato de o estudo ter sido feito em preparações citoscópicas, em que as células epiteliais perdem seu arranjo, apresentando-se em grupos ou mesmo soltas no esfregaço, dificultou a determinação da histogênese epitelial, o que não ocorreu nos cortes de tecido, quando as citoqueratinas demonstraram sua marcação específica.
Outrossim, a citoqueratina 18 que deveria marcar epitélio luminal demonstrou essa intensa marcação definindo o diagnóstico de carcinoma. Como espera- do, quando há forte densidade de marcação com a ci- toqueratina 18 o provável diagnóstico é aquele de um carcinoma.
Já a citoqueratina 5 que deveria marcar a transforma- ção maligna do tumor demonstrou, nos cortes de teci- do, expressão positiva apenas nas células mioepiteliais ou epiteliais luminais. O anticorpo contra a citoquera- tina tipo I foi descrito e desenvolvido por Arai et al.
(1994) e a forma comercial encontrada é muito similar em peso molecular ao marcador de células mioepite- liais, justificando sua marcação neste tipo celular.
Os resultados deste trabalho demonstram ainda que a utilização como um painel de marcadores, desses anticorpos que mostraram resultados estatisticamen- te significativos, pode contribuir para um prognóstico tumoral mais criterioso, deixando-se de lado a classi- ficação tumoral complexa e inconclusiva, como única resposta na busca de uma melhor e maior sobrevida ao paciente com câncer. Além disso, o pequeno número de pesquisas em medicina veterinária, buscando novos marcadores prognósticos e preditivos para a neoplasia mamária mostra um imenso campo de pesquisa a ser desenvolvido.
Os resultados obtidos neste trabalho, nas condições
metodológicas empregadas, permitem-nos concluir que a imunocitoquímica demonstrou sua importância como auxílio diagnóstico e prognóstico precoce dos tu- mores mamários em cadelas. Das citoqueratinas estu- dadas a citoqueratina 18 demonstrou ser um marcador diagnóstico para carcinomas mamários em cadelas e conseqüentemente um marcador para um prognóstico ruim.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (Proces- so nº 98/15634-3).
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