EFEITO DE DIFERENTES MEIOS DE CULTURA NA REGENERAÇÃO IN VITRO DO MELOEIRO (Cucumis melo L.) GAÚCHO E HALES BEST IMPERIAL

IN VITRO DO MELOEIRO (Cucumis melo L.) ‘GAÚCHO’ E

‘HALES BEST IMPERIAL’

JONNY EVERSON SCHERWINSKI PEREIRA

IDEMIR CITADIN

JOSÉ ANTÔNIO PETERS

RESUMO - O presente trabalho foi desenvolvido no

Laboratório de Cultura de Tecidos da Universidade Fe-deral de Pelotas, Pelotas, RS, com objetivo de identifi-car um meio adequado para regeneração in vitro do me-loeiro. Segmentos cotiledonares de meloeiro (Cucumis

melo L.), cultivares ‘Gaúcho’ e ‘Hales Best Imperial’,

fo-ram cultivados em três diferentes meios de cultura: o meio M1, contendo os sais do meio MS, acrescido de

2,2 g/l de CaCl2 .2 H2O, 30 g/l de sacarose e os

regula-dores de crescimento benzilaminopurina (BAP) e o áci-do abscíssico (ABA) a 0,84 mg/l e 0,26 mg/l, respecti-vamente; o meio M2, contendo os sais de MS, adicio-nado de 20 g/l de sacarose, assim como o BAP e o áci-do naftalenoacético (ANA) a 0,5 mg/l e 0,1 mg/l, res-pectivamente, e o meio M3, contendo os sais de MS, acrescido de 30 g/l de sacarose e o hormônio BAP à

concentração de 1 mg/l. O pH foi ajustado a 5,8±0,1

antes da autoclavagem dos meios. Cada tratamento foi repetido cinco vezes e cada repetição constou de 6 ex-plantes, mantidos em sala de cultura por seis semanas, sob fotoperíodo de 16 horas, luminância de 3000 lux e

temperatura de 25º±2ºC. Foram utilizados frascos com

capacidade de 250 ml, contendo 30 ml de meio de cul-tura. Avaliaram-se a percentagem de explantes regene-rados, o número médio de brotações por explante, o ta-manho médio de brotações por explante, o número mé-dio de gemas por explante e o aspecto geral dos ex-plantes regenerados. Concluiu-se que o meio M1 é si-gnificativamente superior aos meios M2 e M3 para as variáveis avaliadas, exceto para o aspecto geral dos explantes. Não foram observadas diferenças significati-vas entre as cultivares quanto às variáveis avaliadas.

TERMOS PARA INDEXAÇÃO: Meloeiro, Cucumis melo, regeneração, meio de cultura.

EFFECTS OF DIFFERENTS CULTURE MEDIUM IN THE IN VITRO

REGENERATION OF MELON (Cucumis melo L.) ‘GAUCHO’ AND

‘HALES BEST IMPERIAL’

ABSTRACT - The present work was developed at the

Tissue Culture Laboratory in the Universidade Federal de Pelotas, Pelotas-RS, aiming to identify an appropriate medium for melon regeneration. Segments of melon cotyledons, cultivars ‘Gaúcho’ and ‘Hales Best Imperial’, with 2 to 3 day-old seedling grown in vitro were cut longitudinally into halves and were cultivated in the three different types of medium: Medium M1 containing MS salts, suplemented with 2.2

g/l of CaCl2 .2 H2O, sucrose 30 g/l and the growth

regulators BAP and ABA at 0.84 mg/l and 0.26 mg/l respectively; the medium M2 containing MS salts, suplemented with 20 g/l sucrose, and growth regulators NAA and BAP at 0.1 mg/l and 0.5 mg/l respectively and the medium M3 containing MS salts, suplemented with

sucrose 30 g/l and growth regulator BAP at 1 mg/l. The pH was adjusted to 5.8 before autoclaving the medium. Each treatment was repeated five times, and each replication contained six explants. All the material was kept in a growth room for six weeks, under photoperiod of 16h at 3000 lux and temperature

of 25±2ºC. 250 ml flasks with 30 ml of the culture

media were used. It was evaluated the percentage of explants regenerated, mean number and size of the shoots for explants, mean number of the buds for explants and the general aspect of explants. It was concluded that the medium M1 is significantly superior than medium M2 and M3 for each variable evaluated, except for the general aspect of explants. It was not observed significant diferences between the two cultivars studied.

INDEX TERMS: Melon, Cucumis melo, regeneration, culture medium

1. Engenheiro Agrônomo, M.Sc. em Fruticultura de Clima Temperado, FAEM/UFPEL, Caixa Postal 354, 96.010-900, Pelotas-RS. e-mail: jscherwi@ufpel.tche.br

2. Engenheiro Agrônomo, Pós-graduando em Fruticultura de Clima Temperado da FAEM/UFPEL, Pelotas- RS. 3. Engenheiro Agrônomo, Dr., Professor Titular, Departamento de Botânica da FAEM/UFPEL, Pelotas-RS.

INTRODUÇÃO

O meloeiro é, economicamente, uma das princi-pais espécies da família das cucurbitáceas. Entretanto, sérios problemas ocorrem durante sua produção e co-mercialização, causados pela ocorrência de diferentes doenças na cultura (Jarl, Bokelmann e Hass, 1995) e, principalmente, pelas acentuadas perdas após a colhei-ta, devido ao rápido amadurecimento dos frutos (Bo-browski et al., 1997). Os últimos avanços no campo da engenharia genética têm possibilitado a obtenção de plantas geneticamente modificadas, apresentando uma maturação retardada dos frutos após a colheita (Ayub e Pech, 1997). Porém, para a aplicação de técnicas de melhoramento da espécie na área da biotecnologia, é de fundamental importância que se obtenham métodos eficientes de regeneração de plantas, através da cultura de tecidos. As descrições na literatura, citando os méto-dos de regeneração aplicaméto-dos ao meloeiro, são poucas e a regeneração de plantas através de cotilédones (Blackmon e Reynolds, 1982; Roustan, Latche e Fallot, 1992; Pereira e Pech, 1997), hipocótilos (Molina e Nuez, 1995b), folhas (Moreno et al., 1985; Kathal, Bhatnagar e Bhojwani, 1988; Molina e Nuez, 1995a) e protoplastos (Jarl, Bokelmann e Hass, 1995) tem sido bastante utilizada. Porém, esses estudos revelam uma grande variação nas respostas morfogenéticas, devido à influência de fatores genéticos, fisiológicos e de condi-ções do meio de cultura, embora a relativa importância de cada fator não seja, ainda, plenamente conhecida (Molina e Nuez, 1995b).

O tipo de explante também parece ser de grande importância neste processo. Em um estudo comparativo de regeneração a partir de explantes de cotilédones, folhas e hipocótilos, Molina e Nuez (1995b) observaram a mais alta freqüência de regenera-ção quando utilizaram explantes foliares e cotiledona-res. Dirks e Van Buggenum (1989) afirmam que a re-generação a partir de explantes cotiledonares é mais rápida que partindo-se de explantes foliares.

Assim sendo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a regeneração “in vitro” de explantes cotiledonares de melão (Cucumis melo L.), cultivares Gaúcho e Hales Best Imperial em diferentes meios de cultura.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Botânica da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel, UFPel, Pelo-tas-RS. Para o estudo da regeneração, utilizaram-se ex-plantes cotiledonares oriundos de sementes maduras de melão (Cucumis melo L.), cultivares Gaúcho e Hales Best Imperial. Após serem separadas de seu tegumento, as sementes foram desinfestadas através de imersão

por 10 minutos em cloreto de mercúrio (0,6 %) e por 20 minutos em hipoclorito de sódio (1%), seguida de três lavagens em água destilada e esterilizada, antes de serem colocadas para germinarem, sob condições assépticas, em meio de germinação. Esse meio foi formado pelos sais e vitaminas de MS (Murashige e Skoog, 1962), acrescido de 20 g/l de sacarose e de 7 g/l de ágar. Após 3 dias nesse meio, as sementes germinadas apresentavam uma raiz de aproximada-mente 1 cm. Cada cotilédone foi então cortado transversalmente em 6 (seis) explantes (5x5mm) e colocados em meios de regeneração assim constituí-dos: M1, formado pelos sais e vitaminas do meio

MS, acrescido de 2,2 g/l de CaCl2 .2 H2O, sacarose a

30 g/l e os reguladores de crescimento BAP e ABA a 0,84 e 0,26 mg/l, respectivamente; M2, formado pelos sais e vitaminas do meio MS, adicionado de 20 g/l de sacarose, assim como os hormônios ANA e BAP a 0,1 e 0,5 mg/l, respectivamente, e o meio M3, formado pelos sais e vitaminas do meio MS, acrescido de 30 g/l de sacarose e o hormônio BAP à concentração de 1 mg/l.

Utilizaram-se frascos de 250 ml com 30 ml de meio de cultura. Para a solidificação dos meios, foi

uti-lizado ágar a 7g/l e o pH foi ajustado para 5,8±0,1 antes

da autoclavagem dos mesmos por 15 minutos a 121ºC, sob 1,5 atm de pressão. Em cada frasco, colocaram-se 6 (seis) explantes e as observações foram realizadas em intervalos de 5 (cinco) dias. As condições de cultivo fornecidas foram: fotoperíodo de 16 horas, luminância

de 3000 lux e temperatura de 25±2ºC.

Foram avaliados a percentagem de regenera-ção dos explantes, o número e tamanho das brota-ções formadas, o número de gemas e o aspecto geral das brotações regeneradas, após 42 dias de cultivo. Esta última variável foi avaliada, em função do des-envolvimento dos explantes através da atribuição de notas de 0 (zero) a 3 (três), em que a nota ‘0’ cor-respondeu a brotações pouco desenvolvidas de colo-ração amarelada, ‘1’ a brotações pouco desenvolvi-das de coloração verde, ‘2’ a brotações verde, medi-anamente desenvolvidas e ‘3’ a brotações verde- escu-ras bem desenvolvidas.

O delineamento experimental utilizado foi o in-teiramente casualizado, constando de 5 (cinco) repeti-ções por tratamento. A comparação entre médias foi re-alizada pelo teste de Duncan. Os dados do número de brotações e número de gemas foram transformados

se-gundo

x

+

1

seno e os dados de avaliação (notas) segundo a trans-formação logarítmica. Os dados de tamanho das brota-ções não foram transformados. Utilizou-se nas análises o SANEST (Zonta e Machado, 1984).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O tipo de meio de cultura utilizado influenciou a percentagem de explantes regenerados. Foi constatada a superioridade do meio M1 em relação aos meios M2 e M3, para ambas as cultivares, sendo que para o meio M3 foi verificada uma baixa percentagem de regenera-ção dos explantes, inviabilizando sua utilizaregenera-ção para a regeneração dessas cultivares (Figura1). Não foram ob-servadas diferenças significativas entre as cultivares. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por Pe-reira e Pech (1997), que obtiveram a mais alta freqüên-cia de regeneração dos explantes (74%), com a utiliza-ção do meio de cultura M1.

Para alguns autores (Bobrowski et al., 1997; Pe-reira e Pech, 1997), o aumento na concentração de cál-cio no meio de cultura é um importante fator para a obtenção de uma boa freqüência de regeneração no meloeiro. Segundo Läuchli e Epstein (1970) e Griffings e Ray (1979), além desse íon estar envolvido em im-portantes processos celulares, como a formação e a ex-tensão da parede celular, o cálcio tem sido descrito como sendo essencial para a manutenção da seletivida-de e integridaseletivida-de da membrana plasmática.

Observou-se, em todos os tratamentos, a forma-ção de calo (acima de 90%) na superfície cortada dos cotilédones, após duas semanas de cultivo. Dois tipos de calo foram produzidos: um tipo compacto, organo-gênico e esverdeado e outro do tipo branco friável.

Resultados semelhantes foram verificados por Roustan, Latche e Fallot (1992) e Ficadenti e Rotino (1995), que também observaram que a regeneração foi acompanhada, freqüentemente, por uma forte calogêne-se dos explantes. Embora calogêne-sendo uma regeneração dire-ta, esses autores citam que isso ocorreu, provavelmente, pelos diferentes tipos e concentrações de reguladores de crescimento utilizados.

Após seis semanas de permanência nos meios de cultura, foi verificado, para ambas as cultivares, um maior número de brotações e gemas formadas por ex-plante, quando estas desenvolveram-se em meio M1, em relação aos meios M2 e M3 (Figuras 2 e 3). Essas variáveis não diferiram significativamente entre as cul-tivares. Lucchesini e Vitagliano (1993), trabalhando com Prunus cerasifera, citam que o aumento nas con-centrações de cálcio no meio de cultura promoveu um aumento no número e tamanho das brotações.

a _a b b c c 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 GAÚCHO IMPERIAL Cultivar % de Explantes Regenerados M1 M3 M2

FIGURA 1 - Percentagem de explantes regenerados nas cultivares de meloeiro, Gaúcho e Hales Best Imperial, em

diferentes meios de cultura. Médias com a mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de proba-bilidade. UFPel, Pelotas, RS. 1998.

Nº de Brotações por Explante

M3

FIGURA 2 Hales

Duncan, a 5% de probabilidade. UFPel, Pel tas, RS. 1998.

a a b b c c 0 2 4 6 8 10 12 GAÚCHO IMPERIAL Cultivar

Nº de Gemas por Explante

M1 M3 M2

FIGURA 3 - Número médio de gemas formadas nos explantes das cultivares de meloeiro, Gaúcho e Hales Best

Imperial, em diferentes meios de cultura. Médias com a mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. UFPel, Pelotas, RS. 1998.

Vários estudos demonstram que a combinação de determinados reguladores de crescimento estimulam a organogênese “in vitro”. Citocininas são normal-mente utilizadas por induzirem a formação de um grande número de brotos, estimulando a produção de parte aérea e altas taxas de multiplicação. Já as auxinas, apesar de não promoverem a proliferação de brotações, incrementam o crescimento da cultura, estando relacio-nadas com a regulação da organogênese, em conjunto com as citocininas (Hu e Wang, 1983; George e Sher-rington, 1984). Resultados obtidos por Roustan, Latche e Fallot (1992) indicam que ANA e BAP foram os mais efetivos reguladores de crescimento envolvidos na rege-neração, estimulado a formação de gemas e brotações. Ficcadenti e Rotino (1995) observaram que somente a presença de BAP em meio de cultura foi capaz de rege-nerar brotos e gemas; entretanto, esses mesmos autores observaram um aumento significativo no número de explantes produzindo brotações quando utilizaram a combinação de BAP e ABA nos meios de cultura para os diferentes genótipos testados. Pereira e Pech (1997) também obtiveram os melhores resultados com a adição de ABA no meio de cultura. Estudos preliminares reali-zados por esses autores demonstraram que a não adição deste regulador no meio promoveu uma forte

calogêne-se nos explantes, com a formação de calos do tipo bran-co friável, possivelmente devido à elevada bran-concentração de hormônios presentes nos cotilédones, especialmente giberelinas (Brenner, Stombauch, Birnberg, 1990), e concluíram que isso foi prejudicial à regeneração. De-vido a sua ação inibitória sobre muitos efeitos fisiológi-cos induzidos pelas giberelinas, o ABA pode reduzir a indução de calos, favorecendo assim a regeneração.

O comprimento das brotações foi influenciado pelo tipo de meio utilizado, sendo o meio M1 significativamente superior aos meios M2 e M3, para ambas as cultivares tes-tadas. Apesar de não haver diferenças significativas entre as cultivares, verifica-se que as brotações foram de maior tamanho na cultivar Hales Best Imperial (Figura 4).

Em relação ao aspecto das brotações regenera-das, observa-se na Figura 5, que não houve diferenças significativas entre os meios M1 e M3, dentro de cada cultivar testada, não tendo sido observadas também, diferenças significativas entre as cultivares. Contudo, é possível verificar o efeito benéfico dos meios M1 e M3 na obtenção de brotações de melhor qualidade. Esse re-sultado confirma a superioridade destes, principalmente o meio M1, na regeneração das cultivares testadas neste experimento.

Tamanho das Brotações (cm)

M1 M3 M2

FIGURA 4 - Tamanho médio de brotações formadas nos explantes das cultivares de meloeiro, Gaúcho e Hales

Best Imperial, em diferentes meios de cultura. Médias com a mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de probabilidade. UFPel, Pelotas, RS. 1998.

a a a a b b 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 GAÚCHO IMPERIAL Cultivar

Aspecto dos Explantes

M1 M3 M2

FIGURA 5 - Aspecto das brotações regeneradas nas cultivares de meloeiro, Gaúcho e Hales Best Imperial, em

di-ferentes meios de cultura. Médias com a mesma letra não diferem entre si, pelo teste de Duncan, a 5% de probabi-lidade. UFPel, Pelotas, RS, 1998.

CONCLUSÕES

a) O meio M1 mostrou-se o mais adequado para a regeneração do meloeiro, cultivares Gaúcho e Hales Best Imperial, incrementando positivamente a percen-tagem de explantes regenerados, o número médio das brotações e gemas formadas por explante, além de pro-porcionar um maior tamanho das mesmas.

b) O melhor aspecto no desenvolvimento das brotações é obtido com a utilização dos meios M1 e M3.

AGRADECIMENTOS

À Fundação Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pelo apoio fi-nanceiro, e ao Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Botânica da UFPel, onde este trabalho foi realizado.

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