PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
CENTRO UNIVERSITÁRIO DE ANÁPOLIS
Estudo comparativo entre métodos de diagnóstico da
Leishmaniose Visceral em cães procedentes de Araguaína –
Tocantins.
Celina Fernandes Sales
Goiânia – GO
2010
ii
Celina Fernandes Sales
Estudo comparativo entre métodos de diagnóstico da
Leishmaniose Visceral em cães procedentes de Araguaína –
Tocantins.
.
Goiânia – GO
2010
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento em Tecnologia Farmacêutica, oferecido numa associação entre a Pontifícia Universidade Católica de Goiás, a Universidade Estadual de Goiás e o Centro Universitário de Anápolis, para obtenção do título de mestre.
Orientadora: Dra. Dulcinéa Maria Barbosa Campos
v
Dedicatória
Dedicatória
Dedicatória
Dedicatória
À minha família,
À minha família,
À minha família,
À minha família,
Aos meus pais
Aos meus pais
Aos meus pais
Aos meus pais (Socorro e Salim), meus exemplos valiosos de
honestidade, profissionalismo e sabedoria.
Aos meus irmãos, cunhadas e sobrinhos
meus irmãos, cunhadas e sobrinhos
meus irmãos, cunhadas e sobrinhos
meus irmãos, cunhadas e sobrinhos pela inspiração de minhas investidas.
Ao meu esposo Osvaldo
Osvaldo
Osvaldo
Osvaldo pelo amor e carinho. Obrigada pelo incentivo
e compreensão em meus momentos de ausência e limites de intolerância.
A minha vózinha Débora
Débora
Débora
Débora, pelo exemplo
de vida e perseverança (in memorian).
vi AGRADECIME0TOS
Agradeço, incondicionalmente:
A Deus, pela sua infinita bondade, e esperança nos momentos mais difíceis da minha caminhada...
À Profª. Drª. Dulcinéa Maria Barbosa Campos, exemplo de seriedade e competência. Minha gratidão por sua orientação.
Ao Prof. Dr. Heitor Franco de Andrade Junior, por todo apoio, atenção, disponibilidade e colaboração nesse trabalho. Seu profissionalismo, competência, dedicação, simplicidade, mas acima de tudo, seus valores humanos, tornam-no um exemplo a ser seguido.
À Profª. Drª. Luciana Regina Meirelles Eckman por todo apoio, e colaboração para realização deste trabalho, suas contribuições e sugestões construtivas engrandeceram esse estudo.
Ao Prof. MSc. Bruno Medrado Araújo pelo profissionalismo, disponibilidade, atenção e constante incentivo, além da essencial colaboração na coleta de amostras dos cães.
À Profª. MSc. Marlene 0eves Antunes pelo apoio fundamental durante o decorrer da pós-graduação, a senhora passou de uma ex-professora e para uma grande amiga.
À Profª. Dra. Maria Irma Seixas Duarte, Profª. Dra. Carla Pagliari e Elaine Raniero Fernandes do Laboratório da Disciplina de Patologia de Moléstias Transmissíveis da Faculdade de Medicina/Universidade de São Paulo (FM/USP) pela disponibilidade e colaboração na realização da histopatologia e imunohistoquímica.
Ao Dr. Roberto Hiramoto do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, pela gentil contribuição na realização desse trabalho, através da disponibilização dos Kit’s de Teste Rápido para LVC, e das cepas positivas e negativas para controle dos testes.
Aos membros do Centro de Controle de Zoonoses de Araguaína – TO, especialmente a Dra. Rosangela, pela cordialidade, a Mara e o Leonardo pela disponibilidade e auxilio na coleta, a Julice pelas sugestões.
Ao profº. Dr. Ademir João Camargo da Universidade Estadual de Goias pelo auxilio na realização dos testes estatísticos.
vii Aos cães envolvidos nesse estudo, pois eles deram, literalmente sangue por esse trabalho.
Aos professores de graduação e amigos da Fundação de Medicina Tropical, Prof. Adriane de Andrade, Prof. Hebert Batista, Profª. Rosa Sena, Amanda Vidal, Douglas Bringel, Franciano Cardoso, e aos demais colegas pelo empenho e excelente colaboração para realização desse projeto e conquista desse sonho.
Aos fiéis amigos do Instituto de Medicina Tropical do Tocantins (IMT-TO), André, Aline, Alexandre, Lorena, Orleanes e Shirley, pelo incentivo constante e agradável companhia.
Ao Prof. Dr Cláudio Henrique Fernandes da Unitins Agro pela colaboração na realização da coleta dos cães.
As Pessoinhas maravilhosas: Andrés, Bruna, Camila, Juliana, Marina, Rose, Dona Fran, Solange do laboratório de Protozoologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT-SP) USP – São Paulo, pelas valiosas contribuições e demonstrações de amizade que me permitiram concluir com êxito este trabalho.
À amiga Verissa Martins, companheira incansável, que esteve presente em várias etapas da minha vida, contribuindo, sofrendo, vibrando, incentivando. Obrigada por tudo, amiga.
À amiga Virginia Marques por me receber gentilmente no seu apartamento em São Paulo, pelo incentivo constante, pelos diálogos e passeios para distrair e diminuir a ansiedade.
A todos da turma de mestrado, pela amizade, confraternizações, brincadeiras, conversas, por todos os momentos compartilhados durante o curso.
À FMTTO, pelo apoio institucional e financeiro, sem o qual não teria sido possível a realização desta pesquisa.
viii
Estudo comparativo entre métodos de diagnóstico da Leishmaniose Visceral
em cães procedentes de Araguaína – Tocantins.
RESUMO
A leishmaniose visceral é uma zoonose típica de áreas tropicais, dependente da tríade: hospedeiro (homem), vetor (flebotomíneo) e reservatório (cão e animais silvestres). Nos países do novo mundo o protozoário responsável pela infecção é Leishmania chagasi. No Brasil, até o presente momento, os surtos da doença estão associados à presença de cães soropositivos e em várias regiões geográficas a epidemia canina precedeu a humana. Lutzomya longipalpis é o principal vetor, possui ampla distribuição geográfica no novo mundo, sendo apontado como o principal responsável pela persistência da doença em várias áreas tropicais e neotropicais do planeta. O Brasil é responsável por 90% dos casos ocorridos na América Latina e a região Nordeste do país registra os maiores índices da infecção seguida pela região Sudeste, Norte, Centro-Oeste e Sul, respectivamente. Era considerada uma enfermidade de caráter eminentemente rural e, mais recentemente, vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte. O estado do Tocantins destaca-se como um dos maiores responsáveis pelo aumento das estatísticas envolvendo a leishmaniose visceral humana na região Norte do Brasil. Araguaína é responsável por aproximadamente 50% dos casos de leishmaniose visceral humana notificados anualmente no Tocantins, e ainda detém o maior número de notificações de leishmaniose visceral canina do Estado. Para o efetivo controle do reservatório canino é preciso haver acurácia no diagnóstico. O diagnóstico laboratorial desta enfermidade continua sendo um desafio. Observa-se um amplo espectro clínico da doença, tanto em humanos, como em animais e segundo alguns autores este fato é responsabilizado, em parte, por dificuldades no diagnóstico laboratorial. Por esta razão, propôs-se avaliar o emprego dos métodos: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Teste Rápido (DPP®), Imunohistoquímica (IH), Imunoensaio Enzimático (ELISA) e Coloração pela Hematoxilina Eosina (HE) em 20 amostras de soro e de linfonodos de cães, considerados positivos para leishmaniose visceral canina, que seguiram para eutanásia no Centro de Controle de Zoonoses de Araguaína em 2009. Foram encontrados 100% de positividade através da RIFI, 95% tanto por DPP®, como por PCR, 90% por ELISA, e 25%, em cada um dos testes IH e HE. Com o objetivo de realizar um estudo comparativo entre os testes, empregou-se o método Kappa de Cohen. Melhores resultados de concordância foram observados quando se comparou ELISA com DPP® obtendo índice Kappa (0,643) considerado bom, conforme parâmetros sugeridos por Landis & Koch (1977). Os resultados obtidos através do presente trabalho, permitem propor o emprego do teste rápido DPP® em inquérito soroepidemiológico canino tendo em vista sua praticidade e facilidade de execução quando se compara com o ELISA.
Palavras-chave: Leishamionse visceral canina, diagnóstico, sorológico, parasitológico, molecular.
ix ABSTRACT
Visceral leishmaniasis is a zoonotic disease typical of tropical areas, dependent on the triad: host (man), vector (sandfly) and reservoir (dogs and wild animals). In the new world countries the infection is responsible for protozoan Leishmania chagasi. In Brazil, until now, outbreaks of disease are associated with the presence of seropositive dogs and in various geographic regions the epidemic preceded the human canine. Lutzomyia longipalpis is the main vector, has a wide geographical distribution in the new world, having been appointed as the main responsible for the persistence of the disease in many tropical and neotropical the planet. Brazil accounts for 90% of cases occurring in Latin America and the Northeast region recorded the highest rates of infection followed by Southeast, North, Midwest and South, respectively. It was considered an illness of a rural and more recently has expanded into urban areas of medium and large. The state of Tocantins, Brazil stands out as one of the most responsible for the increase of statistics involving human visceral leishmaniasis in northern Brazil. Araguaina is responsible for approximately 50% of cases of human visceral leishmaniasis reported annually in Tocantins, and still has the largest number of reports of canine visceral leishmaniasis in the state. For the effective control of the canine reservoir, there must be accurate in the diagnosis. The laboratory diagnosis of this disease remains a challenge. There is a wide clinical spectrum of disease in both humans and animals and according to some authors, this fact is blamed, in part, to difficulties in laboratory diagnosis. For this reason, we proposed to evaluate the use of methods: Immunofluorescence Assay (RIFI), Polymerase Chain Reaction (PCR), Quick Test (DPP®), Immunohistochemistry (IH), Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Staining by hematoxylin and eosin (HE) in 20 samples of serum and lymph of dogs, considered positive for canine visceral leishmaniasis, would go for euthanasia by the Center for Zoonosis Control from Araguaina in 2009. We found 100% positive by IFA, 95% for both DPP®, for PCR, 90% for ELISA and 25% in each test HI and HE. Aiming to do a comparative study between the methods, we used the method of Cohen's Kappa. Best agreement results were observed when compared with DPP® ELISA getting Kappa (0.643) considered good, according to parameters suggested by Landis & Koch (1977). The results obtained from this study, allow us to propose the use of DPP® rapid test in canine seroepidemiological survey in view of its convenience and ease of implementation when compared with ELISA.
x LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição de casos autóctones de leishmaniose visceral segundo município, Brasil 2002... 17 Figura 2. Distribuição da leishmaniose visceral no mundo... 17 Figura 3. Ciclo biológico da Leishmania sp... 19 Figura 4. Casos confirmados de leishmaniose visceral humana, região norte e Tocantins. 1990 a 2008*... 25 Figura 5. Óbitos por leishmaniose visceral humana na região norte e Tocantins, no período de 2000 a 2006... 27 Figura 6. Municípios do Tocantins segundo estratificação epidemiológica da Leishmaniose Visceral com registro de Lu. longipalpis... 28 Figura 7. Ciclo de transmissão da leishmaniose visceral canina... 37 Figura 8. Percentual de positividade resultante do emprego de seis métodos laboratoriais em amostras de soro e tecidos de 20 cães, naturalmente infectados por leishmaniose visceral, procedentes de Centro de Controle de Zoonoses de Araguaína –TO, durante o ano de 2009... 65 Figura 9. Análise dos amplificados de PCR em gel de agarose a 1,5%, referente as 20 amostras fixadas em etanol de linfonodos de cães de Araguaína, 2009... 66 Figura 10. Gel de Agarose 1,5% dos produtos de PCR, PM: Padrão de Peso Molecular – 100 pb. C0: Controle Negativo – sem DNA. CP: Controle Positivo para Leishmania sp... 66 Figura 11. Formas amastigotas, cor marrom, presentes em linfonodo do cão nº 09,
procedente de Araguaína – TO. Aumento (600x)... 67 Figura 12. Corte de tecido de linfonodo do cão nº 10 submetido a coloração por hematoxiliona/eosina. Aumento de (600x)... 67
xi LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Características dos Oligonucleotideos utilizados na Reação em Cadeia da Polimerase - PCR (K13A-K13B)... 61 TABELA 2. Parâmetros sugeridos por Landis & Koch (1977) para interpretar a estatística de Kappa... 64 TABELA 3. Percentual de Concordância e Índice Kappa resultante da análise (dois a dois) dos métodos ELISA e RIFI, com os demais testes empregados no estudo... 68 TABELA 4. Percentual de Concordância e Índice Kappa resultante da análise (dois a dois) dos métodos PCR, DPP®, HE e IH, com os demais testes empregados no estudo... 68
xii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CCZ - Centro de Controle de Zoonoses DNA - Ácido Desoxirribonucléico
dNTP - Desoxiribonucleotídeos trifosfatados DO - Densidade Óptica
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético (do inglês Ethylenediamine tetraacetic acid)
ELISA - Ensaio Imunoenzimático (ELISA – do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
FAST - Teste de Aglutinação Rápida (do inglês Fast Agglutination-screening Test) FM/USP - Faculdade de Medicina da USP
FMTTO - Fundação de Medicina Tropical do Tocantins H2O2 - Peróxido de Hidrogênio
HCl - Ácido Clorídrico HE - Hematoxilina Eosina
HIV - Vírus da Imunodeficiência Humana
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IH - Imunohistoquímica
IMT-SP - Instituto de Medicina Tropical de São Paulo kDNA - DNA de Cinetoplasto
LACEN - Laboratório Central LV - Leishmaniose Visceral LVC - Leishmaniose Visceral Canina LVH - Leishmaniose Visceral Humana
M - Molar
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento mg - Miligrama ml - Mililitros mM - Milimolar mm - Milímetros MS - Ministério da Saúde N - Normalidade nm - Nanômetros ºC - Graus centígrados
OMS - Organização Mundial de Saúde OPAS - Organização Panamericana de Saúde OPD - Orto-fenilenodiamina
Pb - Pares de bases
PBS - Solução salina tamponada com fosfatos (do inglês phosphate buffer saline) PBSTL - Solução salina tamponada com fosfatos, adicionada a Tween e Leite PCLV - Programa de Controle da Leishmaniose Visceral
xiii PCR - Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - do inglês Polimerase Chain Reactton) pH - Potencial hidrogeniônico
RFC - Reação de Fixação do Complemento RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta RPM - Rotações por Minuto
SDS - Dodecil sulfato de sódio
SESAU - Secretaria de Estado da Saúde do Tocantins SFM - Sistema fagocitário mononuclear
Taq - Thermus aquaticus (enzima de DNA polimerase termoestável) TBE - Tris, Borato e EDTA
Tris-HCl - Tampão Tris-HCl TE - Tris e EDTA µl - Microlitros µm - Micrômetros µg - Microgramas
xiv SUMÁRIO
1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 15
1.1 HISTÓRICO... 15
1.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA... 16
1.3 AGENTE ETIOLÓGICO, CICLO EVOLUTIVO E TRANSMISSÃO... 18
1.4 ASPECTOS RELACIONADOS AOS VETORES... 21
1.5 ASPECTOS RELACIONADOS AOS RESERVATÓRIOS... 22
1.6 URBANIZAÇÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL... 23
1.7 LEISHMANIOSE VISCERAL NO TOCANTINS... 24
1.7.1 Leishmaniose Visceral Humana... 25
1.7.2 Leishmaniose Visceral Canina... 28
1.8 ASPECTOS CLINICOS... 30
1.8.1 Leishmaniose Visceral Humana... 30
1.8.2 Leishmaniose Visceral Canina... 31
1.9 TRATAMENTO E CONTROLE DA LEISHMANIOSE VISCERAL ... 32
1.9.1 Tratamento da Leishmaniose Visceral Humana... 32
1.9.2 Tratamento da Leishmaniose Visceral Canina... 35
1.9.3 Medidas de Controle... 37
1.10 DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL... 42
1.10.1 Métodos Parasitológicos... 43 1.10.2 Métodos Sorológicos... 45 1.10.3 Métodos Moleculares... 49 2 JUSTIFICATIVA... 52 3 OBJETIVOS... 53 3.1 OBJETIVO GERAL... 53 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS... 53 4 A0IMAIS E MÉTODOS... 55 4.1 ÁREA DE ESTUDO... 55
4.2 ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA... 55
4.3 LOCAL DE TRABALHO... 56
xv
4.4.1 Obtenção de Soros e Linfonodos Cervical e Poplíteo... 56
4.4.1.1 Sedação e Coleta Sanguínea... 56
4.4.1.2 Eutanásia e Obtenção de Linfonodos... 57
4.5. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS UTILIZADOS... 58
4.5.1 Ensaio Imunoenzimático – ELISA... 58
4.5.2 Reação de Imunofluorescência Indireta – RIFI... 59
4.5.3 Teste Rápido DPP® Leishmania Visceral Canina... 59
4.5.4 Reação em Cadeia da Polimerase – PCR... 60
4.5.4.1. Amplificação de D-A por PCR... 61
4.5.5 Estudo Histológico... 62 4.5.6 Estudo Imunohistoquímico... 63 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 63 5 RESULTADOS... 65 6 DISCUSSÃO... 69 CO0CLUSÕES... 73 REFERÊ0CIAS BIBLIOGRÁFICAS... 74 APÊ0DICES... 94
16 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 HISTÓRICO
A leishmaniose visceral - LV, também conhecida como calazar, é uma antropozoonose típica de áreas tropicais, endêmica em várias regiões do mundo. É causada por um protozoário flagelado, intracelular obrigatório que se reproduz dentro do sistema fagocitário mononuclear (SFM) dos mamíferos. É uma doença cíclica dependente da tríade: hospedeiro (homem), vetor (flebotomíneo) e reservatório (cão e animais silvestres) (MELO et al., 2004; VERONESI e FOCACCIA, 2005).
A correta descrição da LV foi realizada pela primeira vez em 1835 na Grécia. Posteriormente houve relatos da doença na Índia no ano de 1869, a enfermidade era denominada como Kala-azar (DEANE, 1956; MARZOCHI et al., 1981).
O agente etiológico da LV foi descrito inicialmente por Willian Boog Leishman em 1900. James Donovan em 1903 observou a presença de estruturas ovais com 2 a 3 µm de diâmetro em esfregaços sanguíneos obtidos de pacientes residentes na Índia, idêntico ao encontrado por Leishman. No entanto os relatos de Leishman só foram publicados em 1903, em virtude da coincidência nas datas de publicação os pesquisadores foram homenageados através do nome dado ao parasito - Leishmania donovani (CANTARINO, 1998).
A LV foi descrita pela primeira vez em cães por Nicolle e Comte (1908). Esses pesquisadores durante o desenvolvimento de um trabalho na Tunísia encontraram Leishmania em cães, sugerindo a introdução da L. chagasi no Novo Mundo, através da provável vinda de cães infectados acompanhando os primeiros colonizadores portugueses e espanhóis.
No Brasil, o primeiro registro de leishmaniose visceral humana - LVH ocorreu em 1913 por Migone no Paraguai, de amostra proveniente de paciente do Mato Grosso (MIGONE, 1913). No entanto, o inicio dos estudos sobre Leishmaniose no país ocorreram com os relatos de Penna (1934), que durante a realização de uma pesquisa com objetivo de diagnosticar e detectar focos de distribuição da febre amarela no Brasil encontrou 41 casos positivos para Leishmania (LV) em indivíduos procedentes das regiões Norte e Nordeste (Bahia, Sergipe, Alagoas, Pernambuco, Ceará, Piauí, Rio Grande do Norte e Pará).
17 Em seguida, Chagas et al., (1938) em Belém – PA observaram os primeiros casos da infecção em cães. Concomitantemente, teve inicio o processo de descoberta da principal espécie vetora Lutzomyia longipalpis (DEANE e DEANE, 1954b).
1.2 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
A LV ocorre na maioria das regiões tropicais e subtropicais do mundo. Está presente em todos os continentes, com exceção da Antártida e Austrália (DEREURE, PRATLONG e DEDET, 1999). É endêmica em 88 países (22 das Américas e 66 no Velho Mundo) (MONTEIRO; LACERDA e ARIAS, 1994), com mais de 90% dos casos provenientes de Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão (VANNIER-SANTOS; MARTINY e SOUSA, 2002; MENDES et al., 2003; MELO et al., 2004) a maioria dos casos associada às condições de pobreza e desnutrição infantil.
A incidência anual de casos de LV no mundo é de aproximadamente 500.000 novos casos, em torno de 50.000 mortes causadas por LV a cada ano (MENDES et al., 2003).
Na América Latina destacam-se os casos ocorridos na Argentina (SALOMON et al., 2008), Colômbia (CORREDOR et al., 1989a), Honduras (NUERNBERGER; RAMOS e CUSTÓDIO, 1975), Bolívia, Equador, Guatemala, Paraguai, Suriname (MILES et al., 1999), México (MONROY-OSTRIA; HERNANDEZ-MONTES e BAKER, 2000), Nicarágua (BELLI et al., 1999) e Venezuela (DELGADO et al., 1998; ZERPA et al., 2000). Nas Américas, a grande maioria dos casos autóctones da LV estão representados no Brasil, onde a LV está presente em 21 das 27 unidades federadas (MONTEIRO, 2002) e 90% dos casos ocorridos na America Latina são registrados no Brasil (COURA, 2005). As áreas de transmissão da doença no Brasil estão representadas na Figura 1.
18 Figura 1. Distribuição de casos autóctones de Leishmaniose Visceral segundo município, Brasil 2002.
Fonte: SINAN- COVEV/ CGDT/DEVEP/SVS/MS.
No ano de 2009 foram notificados no Brasil 3.892 casos de LV, assim distribuídos: Região Nordeste (49,8%), Região Sudeste (21,2%), Região Norte (19,9%), Região Centro-Oeste (8,9%) e Região Sul com apenas (0,3%) (BRASIL, 2010 – SINAN).
O número de municípios brasileiros com casos notificados de LV aumentou visivelmente nos últimos anos, acompanhando a intensificação da doença, conforme demonstração da distribuição de casos de leishmaniose visceral no mundo, segundo a OMS (Figura 2).
19 Figura 2. Distribuição da Leishmaniose Visceral no Mundo.
Fonte: WHO, 2009.
Segundo a Organização Pan Americana de Saúde/Organização Mundial de Saúde (OPAS/OMS), a LV é considerada como uma doença negligenciada de categoria 3, pois o campo da saúde pública não possui ferramentas efetivas para o controle avançado. Nos últimos anos foi registrada uma média anual de 3.357 casos humanos e 236 óbitos (OPAS, 2006).
1.3 AGENTE ETIOLÓGICO, CICLO EVOLUTIVO E TRANSMISSÃO
A LV é causada por protozoários da ordem Kinetoplastida, família Trypanossomatidae, gênero Leishmania, tendo três espécies: no velho mundo a Leishmania (L.) donovani (LAVERAN e MESNIL, 1903) é responsável pela doença na Índia, Paquistão, China Oriental, Bangladesh, Nepal, Sudão e Kênia, e a Leishmania (L.) infantum (NICOLLE, 1908) na Ásia Central e Sudoeste, nordeste da China, norte da África e Europa Mediterrânea. No novo mundo a espécie Leishmania (L.). chagasi (CHAGAS et al., 1937) é o agente etiológico da LV.
Shaw (2006) realizou um estudo utilizando técnicas bioquímicas e moleculares, e considerou a L. chagasi e a L. infantum, como única espécie, sugerindo o uso do nome Leishmania (L). infantum chagasi. Devido à ausência de um consenso a respeito desse assunto, neste trabalho optou-se pela denominação L. chagasi ao parasito em questão, por se tratar de um estudo realizado no Brasil.
O protozoário apresenta um ciclo biológico heteroxênico, apresentando duas formas distintas: a forma promastigota, presente no vetor (Lutzomyia longipalpis) que se caracteriza por ser flagelada e considerada como a forma infectante (transmitida pelo vetor aos novos hospedeiros - homem, cães ou animais selvagens), e a forma aflagelada ou amastigota, encontrada no interior de macrófagos e monócitos, apresentando um tropismo pelo sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros e reservatórios (LAINSON; RYAN e SHAW, 1987; KILLICK-KENDRICK, 1990).
Os parasitos multiplicam-se assexuadamente por divisão binária simples tanto no hospedeiro vertebrado quanto no invertebrado, apesar de existirem evidências para a
20 possibilidade de troca de material genético sexual e parasexualmente (BASTIEN; BLAINEAU e PAGES, 1992).
Nos flebotomíneos as formas amastigotas, ingeridas durante o repasto sanguíneo, se diferenciam em formas flageladas, as promastigotas, que são, posteriormente, inoculadas na pele de mamíferos durante novo repasto, conforme ilustração na Figura 3.
Figura 3. Ciclo biológico da Leishmania sp. Fonte: www.dpd.cdc.gov/dpdx
L. chagasi é transmitida pela fêmea da espécie Lu. longipalpis, apresenta hábito hematófago, especialmente durante seu período reprodutivo, em virtude da demanda por um suprimento protéico necessário a produção de ovos. A ingestão de sangue em um animal infectado com macrófagos contendo formas amastigotas de L. chagasi ocasiona a infecção do vetor. Decorridos alguns dias (aproximadamente sete dias), as formas amastigotas sofrem alterações bioquímicas e estruturais e convertem-se em formas intermediárias (exclusiva do vetor) denominadas paramastigotas e começam a fixar-se nas paredes do aparelho digestivo
21 do inseto até atingir a probóscide do inseto, se transformam na forma flagelada infectante denominada promastigota. Considera-se que o acúmulo destas formas na probóscide do inseto promova um aumento na freqüência destes repastos, possivelmente ampliando o número de animais picados. Esta obstrução parcial da probóscide provocaria, também, um movimento de regurgitação do conteúdo (inclusive com formas promastigotas do parasito) para o interior do hospedeiro durante o ato de sugar o sangue o que facilitaria a disseminação da infecção entre um número maior de hospedeiros (LAINSON e RANGEL, 2005).
No hospedeiro vertebrado as formas amastigotas se multiplicam nos vacúolos parasitóforos até o rompimento dos macrófagos parasitados e invasão de novos macrófagos, ocorrendo então a disseminação hematogênica para outros tecidos ricos em células Sistema Fagocitário Mononuclear - SFM como linfonodos, fígado, baço e medula óssea (FEITOSA, 2006)
Costa e Pereira (1990) destacam a preocupação, não somente com o inseto, mas também com determinadas áreas, os pés de serra e boqueirões são os principais locais de transmissão da doença, por causa da umidade e dos demais fatores que favorecem o desenvolvimento dessa enfermidade, principalmente devido o vetor ser encontrado mais facilmente nessas áreas. Sendo assim, uma atenção especial deve ser dada ao meio ambiente, que pode aumentar o risco de infecção.
Marcondes (2001) afirma que tal dificuldade em se controlar a doença é possivelmente por conta da grande dispersão dos criadouros e a falta de conhecimento sobre suas características.
Alguns autores citam a transfusão sanguínea como uma possível forma de transmissão em seres humanos, não tão comun, ressaltam que o sangue pode permanecer contaminado com parasitas viáveis por até 30 dias a 4ºC (DEY e SINGH, 2006).
Em alguns países europeus a transmissão através do compartilhamento de seringas por usuários de drogas tem sido relatada, estando associado também à transmissão do vírus HIV, o que intensifica a evolução de ambas as enfermidades (PASQUAU et al., 2005).
Existem relatos de que a transmissão congênita já foi observada em humanos (MEINECKE et al., 1999), no caso dos cães é rara e não foi comprovada nos estudos realizados por Andrade et al., (2002). Os prováveis mecanismos relacionados com esse episódio e de que, as células do sistema fagocítico mononuclear parasitadas atravessem a fina
22 membrana que separa a circulação fetal materna ou que a contaminação aconteça durante o contato do sangue materno e fetal no momento do parto (NEVES et al., 2000).
1.4 ASPECTOS RELACIONADOS AOS VETORES
No Brasil, duas espécies de vetores denominados flebotomíneos estão relacionadas com a transmissão da LV, Lutzomya longipalpis e Lutzomya cruzi. A primeira espécie citada é o principal vetor (DEANE e DEANE, 1954a; DEANE, DEANE e ALENCAR, 1955a; DEANE, 1956), sendo o único de grande importância pela sua capacidade vetorial, e pela sua ampla distribuição geográfica no novo mundo. E a segunda espécie é capaz de atuar como vetor de importância secundaria (TRAVI et al., 1996; GALATI et al., 1997).
É um inseto pequeno, seu tamanho varia de 1 a 3 mm, seus vôos são curtos e baixos, conferindo um comportamento saltitante e uma dispersão não superior a 200m. São conhecidos popularmente como mosquito palha, tatuquiras, birigui, entre outros (GONÇALVES; ROZEMBAUM e CUNHA, 1986).
Originalmente era encontrado em matas participando do ciclo primário de transmissão da doença. Progressivamente houve adaptação desse inseto para o ambiente rural. A ocupação desordenada pelo homem de áreas próximos de encostas e/ou matas, acarretando desequilíbrios ambientais, favoreceu a instalação do ciclo extraflorestal da doença, beneficiando seu caráter peridomiciliar (UCHÔA et al., 2001).
Recentemente no final da década de 80, verificou-se a adaptação deste vetor aos ambientes urbanos, em periferias de grandes centros, podendo ser encontrados no peridomicílio, como em galinheiros, chiqueiro, canil, paiol, entre outros ambientes e também no intradomicílio (DEANE e DEANE, 1954b; 1962).
Lutzomya longipalpis possui hábito noturno quando busca ativamente os animais para seu repasto sangüíneo. Adapta-se facilmente a variadas temperaturas, sendo que o período de maior transmissão da LV ocorre durante e logo após a estação chuvosa, quando há um aumento da densidade populacional do inseto (FERRO; MORRISON e TORRES, 1995; SHERLOCK, 1996).
Apenas as fêmeas realizam hematofagia, sendo capazes de transmitir o parasito. Quando infectadas pelo parasito tornam-se vetores da doença, podendo transmiti - la para os
23 hospedeiros vertebrados, são responsáveis pela manutenção do ciclo do parasito na natureza (DEANE, 1956).
1.5 ASPECTOS RELACIONADOS AOS RESERVATÓRIOS
O cão é considerado como o principal reservatório no ambiente doméstico e peridoméstico, apontado como o principal responsável pela persistência da LV em várias áreas tropicais e neotropicais do planeta. Fato observado tanto nas Américas como no Mediterrâneo (CHAGAS et al., 1937; DESJEUX, 1996).
Já no ambiente silvestre os animais incriminados como hospedeiros vertebrados, são principalmente: as raposas Dusycion vetulus (=Lycalopex vetulus), encontrada infectada no Sudoeste do Ceará, Brasil (DEANE e DEANE, 1954a) e Cerdocyon thous, na Região Amazônica – Brasil (LAINSON; SHAW e LINS, 1969), e o gambá Didelphis marsupialis, na Venezuela (CORREDOR et al., 1989b).
O cão constitui importante fonte de infecção no Brasil, devido ao grande contingente de animais assintomáticos com intenso parasitismo cutâneo verificado em várias áreas endêmicas estudadas (SHERLOCK et al., 1984; BRASIL, 2006a).
Marzochi et al., (1985) em estudo realizado no Rio de Janeiro verificaram que 43,5% dos cães examinados não apresentavam sinais clínicos sugestivos da infecção, mas após necropsia observaram que dos 40 animais estudados, foram evidenciadas Leishmania em 39 animais (97,5%).
Quanto ao papel do homem como reservatório da Leishmania chagasi, e ser fonte de infecção durante os surtos epidêmicos, existe a necessidade de estudos mais aprofundados acerca do potencial de transmissão do ser humano, antes de se comparar o comportamento destas epidemias com o calazar indiano, onde não há a existência de reservatório animal e a transmissão se dá diretamente homem-vetor-homem (COSTA e PEREIRA, 1990).
No Brasil, até o presente momento, todos os surtos descritos na literatura estão associados com a presença de cães soropositivos. Em várias regiões geográficas a epidemia canina precedeu a epidemia humana (CAMARGO-NEVES et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2001).
24 1.6 URBANIZAÇÃO DA LEISHMANIOSE VISCERAL
Inicialmente a leishmaniose visceral no Brasil, tinha um caráter eminentemente rural e, mais recentemente, vem se expandindo para as áreas urbanas de médio e grande porte (BRASIL, 2006a).
Na América do Sul, especialmente no Brasil, a migração e a urbanização estão evidenciadas desde a década de 1980 (BRASIL, 1984; MARZOCHI et al., 1983; 1985; 1987; GENARO et al., 1990; JERÔNIMO et al., 1994; SILVA et al., 1997; TAVARES, 2000; OLIVEIRA et al., 2001; SILVA et al., 2001a), e contribuem fortemente para o aumento da doença.
O fato foi observado claramente a partir da década de 90, quando ocorreram mudanças no padrão de episódios da doença, com registro de casos nas grandes cidades, e isso não quer dizer apenas as periferias, mas também as regiões nobres, contestando o que era observado anteriormente a esta década, em que se considerava esta doença como sendo apenas do meio rural e de cidades do interior ou até mesmo de áreas periféricas das grandes metrópoles. Acreditava-se ainda que o gênero Lutzomyia tivesse pouca resistência e não conseguiria agüentar as condições ambientais urbanas e também poluídas (ROSA, 2006).
Nos últimos anos os dados epidemiológicos demonstram a periurbanização e a urbanização da leishmaniose visceral, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e dentre as epidemias ocorridas, destaca-se Palmas (TO), além dos municípios de Três Lagoas (MS) e Campo Grande (MS) (BRASIL, 2006a).
Em um estudo realizado por Costa (2008), tratou-se da caracterização e especulações acerca da urbanização da leishmaniose visceral no Brasil. Segundo o autor as hipóteses ou explicações apresentadas até o momento para o processo de urbanização da leishmaniose visceral americana são insatisfatórias. Uma possível seria que, as mudanças na ecologia e biologia do vetor, Lutzomyia longipalpis, poderiam explicar as feições epidemiológicas urbanas da doença.
Com intuito de preencher lacunas no conhecimento sobre esse processo de urbanização, ele citou algumas linhas de pesquisa prioritárias: - a investigação do papel de
25 cães na amplificação da transmissão da doença nas cidades; - ensaios de campo com novos inseticidas; - investigação dos determinantes ecológicos ou moleculares que participam da transmissão de Leishmania chagasi.
O mais novo estado da federação, Tocantins passou um processo de migração populacional devido às grandes possibilidades de emprego e perspectivas de desenvolvimento. O estado recebeu uma grande população oriunda de áreas urbanas e rurais, oferecendo em troca baixa qualidade de vida, tendo esses indivíduos que viverem em condições sub-humanas (NASCIMENTO, 2005).
Maués (2008) afirma que o aumento da densidade populacional e a migração da população da zona rural para as cidades e sua concentração principalmente nas áreas periféricas, está estritamente relacionada com o processo de urbanização e expansão da enfermidade no estado do Tocantins.
1.7 LEISHMANIOSE VISCERAL NO TOCANTINS
O Tocantins está inserido na área corresponde a Amazônia Legal, um dos biomas mais complexos e ricos do mundo e entre os nove estados que o integra, o Tocantins é o que atualmente possui a maior incidência de leishmaniose visceral em humanos.
Acredita-se na possibilidade da LV ter sido introduzida na Região Amazônica Brasileira, por meio de cães infectados acompanhando imigrantes procedentes da Região Nordeste, no entanto, na época da descoberta da leishmaniose visceral no estado do Pará (PENNA, 1934). O acesso a esta região era unicamente realizado por barco ou avião, colocando em discussão a possibilidade de uma fonte silvestre autóctone de infecção (LAINSON, 1983; RANGEL e LAINSON, 2003).
Foram registrados casos humanos em Roraima, Pará e Tocantins, com o maior número de casos no Estado do Pará, seguido por Tocantins e Roraima (CASTELLON e DOMINGOS, 1991; GUERRA et al., 2004; BRASIL, 2006a).
26 1.7.1 Leishmaniose Visceral Humana
No Estado do Tocantins, o calazar humano é notificado desde 1989, um ano após a criação do Estado, pois os casos anteriores foram notificados como ocorridos no Estado de Goiás.
Desde então, apenas no ano de 1991 não houve notificação de nenhum caso, mas a partir deste ano o número de notificações foi crescente, aumentando de 06 em 1992 para 226 em 2002, com 82,7% (1591 casos) dos casos notificados apenas no período de 1999 a 2005, o que demonstra a expansão da doença no Estado (BRASIL, 2006b).
No período de 1999 a 2003, o Estado do Tocantins apresentou o maior número de notificações da Região Norte, com a taxa de incidência aumentando de 0,79 /100.000 habitantes em 1999 para de 19,91/100.000 em 2003 (BRASIL, 2006b), considerada a maior taxa de incidência já registrada no país. O Estado do Tocantins destaca-se como um dos maiores responsáveis pelo aumento das estatísticas envolvendo a LVH na região Norte do Brasil. Conforme demonstração na figura 4.
Distribuição de Casos de LVH na Região Norte e Tocantins, no período de 1990 a 2008
35 53 99 84 118 117 133 152 112 375 366 299 333 437 543 660 684 847 772 7 0 6 12 33 48 69 97 58 185 182 154 188 237 154 176 225 437 418 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Ano N ú m e ro d e C a s o s R e g is tr a d o s
Região Norte Tocantins
Figura 4. Casos confirmados de leishmaniose visceral humana, região norte e Tocantins. 1990 a 2008*. (* Dados sujeitos a revisão).
27 Com a elevação do número de casos no Estado, medidas de vigilância e controle foram implementadas nos municípios onde ocorreram a maioria dos casos e a incidência diminuiu a partir de 2003, porém de acordo com os dados do Ministério da Saúde, até 2004 o Tocantins ainda apresentava a maior taxa de incidência de LV do país (12,04/100.000) (BRASIL, 2006b).
Segundo a Gerência de Núcleo das Leishmanioses/SESAU-TO, os casos de LVH em 2008 somaram 1.462 casos notificados, e um coeficiente de incidência de 11.41 casos/10.000 habitantes (TOCANTINS, 2009).
Desde 1999 observou-se no Estado um grande aumento no número de casos humanos, com a maioria dos casos registrados na cidade de Palmas-TO, capital do Estado, que após sua criação em 1989, atraiu um grande contingente humano, vindo de diversas regiões do Estado do Tocantins e do Brasil e com eles os animais de estimação, possíveis reservatórios. Pouco se discute sobre a origem e as causas da elevação no número de casos na capital e em cidades do interior do Estado do Tocantins (SANTOS, 2008).
As informações sobre a distribuição e prevalência de LVC no Estado do Tocantins estão restritas aos inquéritos realizados pela Secretaria de Estado da Saúde, através dos Centros de Controle de Zoonoses e Secretarias Municipais de Saúde e o conhecimento destas informações é essencial para o estabelecimento de medidas de controle apropriadas, bem como para nortear estudos epidemiológicos que possam contribuir para o controle da doença (SANTOS, 2008).
De acordo com o sistema de notificação de agravos (SINANNET) o Estado do Tocantins notificou, em 2007, 392 casos novos confirmados de leishmaniose visceral sendo que destes, 196 são de Araguaína correspondendo a 50% do total de casos do Estado.
Diante dos indicadores de letalidade encontrados no Estado, o programa de controle da LV, estabelecido pela SESAU-TO, realiza ações com objetivo de reduzir as taxas de letalidade e grau de morbidade, através do diagnóstico e tratamento precoce dos casos, bem como diminuir os riscos de transmissão mediante controle da população de reservatórios e do agente transmissor. (BRASIL, 2007 – SINAN).
Observa-se na figura 5 o número de óbitos por LVH na região norte, e a representação do Tocantins, no período de 2000 a 2006.
28
Óbitos de Leishmaniose Visceral Humana na Região Norte e Tocantins, no período de 2000 a 2006 10 7 18 30 40 37 34 3 2 11 19 20 10 11 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 2000 2001 2002 2003 3004 2005 2006 Ano N ú m e ro d e Ó b it o s
Região Norte Tocantins
Figura 5. Óbitos por Leishmaniose Visceral Humana na Região Norte e Tocantins, no período de 2000 a 2006.
Fonte: SINAN/SVS/MS - 2009.
Considerando a distribuição da LVH no Tocantins, o município de Araguaína detém o maior número de notificações. Estando classificado como município de transmissão intensa de casos humanos, portanto possui indicação de atividades de controle químico (borrifação) e inquérito canino censitário.
Em 2009 os municípios do Tocantins estão classificados como sendo 11 de transmissão intensa, 05 de transmissão moderada, 55 de transmissão esporádica, 19 de transmissão vulnerável receptiva, 47 sem transmissão vulnerável e 02 sem transmissão não vulnerável para esta doença. Os municípios de Araguaína e Palmas, classificados como de transmissão intensa, notificaram 275 e 34 casos, respectivamente (TOCANTINS, 2009).
29 Figura 6. Municípios do Tocantins segundo estratificação epidemiológica da Leishmaniose Visceral com registro de Lu. longipalpis.
Fonte: GRASER, 2009.
1.7.2 Leishmaniose Visceral Canina
Do ponto de vista epidemiológico, a LV canina tem sido considerada mais importante do que a doença humana, visto que tem a maior prevalência, e têm sido detectados parasitos na pele de muitos animais assintomáticos residentes em áreas endêmicas (MARZOCHI et al., 1985).
Nas Américas, a doença canina só veio a ser reconhecida com os estudos realizados por Evandro Chagas (CHAGAS et al., 1937; 1938), na região Norte do Brasil, estado do Pará. A partir daí, Deane e Deane (1955b) estudaram a LVC no Brasil, em uma área de grande endemicidade no nordeste brasileiro, o Ceará. Em estudo comparativo entre a infecção humana e canina encontraram Leishmania na pele de 16,3% dos indivíduos e em 77,6% dos cães naturalmente infectados.
Além disso, verificou que a infecção experimental de flebotomíneos era mais frequente e intensa quando os insetos se alimentavam em cães (75%) do que em pacientes humanos (28,5%). Estas observações, bem como as de outros trabalhos que têm estudado a
Transmissão Intensa + vetor
Transmissão Moderada + vetor
Transmissão Esporádica + vetor
Sem Transmissão + vetor
30 doença canina em áreas endêmicas de LVH, mostram o cão como a principal fonte de infecção para os flebotomíneos (MARGONARI et al., 2006).
Isto se deve a alta prevalência da doença no animal nessas regiões e pela presença do parasito na sua pele, o que favorece a infecção do inseto vetor e, conseqüentemente, a transmissão ao homem (BRENER, 1957; ALENCAR, 1959; DEANE e DEANE, 1962; IVERSSON et al., 1983; MARZOCHI, et al., 1985).
Deane (1956) esclareceu o papel do cão na manutenção da transmissão da LV no ciclo peridomiciliar, confirmando sua atuação como principal reservatório.
O centro de controle de zoonoses de Araguaína - CCZ, no período de janeiro a dezembro de 2007 realizou inquérito canino nas áreas com transmissão de casos humanos, nas quais foram colhidas 6.317 amostras, sendo 2.321 soros reagentes, 3.178 não reagentes, 709 indeterminados e 109 hemolisados. Também foram executadas atividades de controle químico, resultando num total de 5551 imóveis borrifados no mesmo período.
Em 2007, além de Araguaína outros 55 municípios do Tocantins encaminharam amostras de soro canino aos Laboratórios Centrais - LACEN, perfazendo o total de 24.902 amostras analisadas, obtendo positividade em 5.397 amostras de cães (TOCANTINS, 2009).
Em 2008 a estimativa da população canina na zona urbana de Araguaína era de 9136 animais. Neste período foram encaminhadas para o Laboratório de Saúde Pública do município o total de 7.922 amostras para análise, destas 2.519 cães apresentaram resultado positivo, 4.172 cães foram descartados, pois apresentaram resultado negativo, e 690 cães obtiveram resultado indeterminado. Até o mês de novembro de 2008, já haviam sido eutanasiados 2.232 cães soro positivos (ARAGUAÍNA, 2009).
Com base nos números registrados pelo Centro de Controle de Zoonoses de Araguaína, é possível constatar que a LVC no município vêm crescendo progressivamente ano a ano, fato que gera preocupação ao Ministério da Saúde.
No decorrer de 2008, sessenta e três dos 139 municípios do estado enviaram amostras de soro canino ao LACEN, essas amostras resultaram no total de 35.997 ensaios sorológicos realizados. Das análises realizadas, foi confirmado positividade para LVC de 7.580 amostras, que representa 21,3% de positividade do total de amostras recebidas (TOCANTINS, 2009).
31 De todas as amostras suspeitas de LVC oriundas de Araguaína enviadas para análise no LACEN, temos 8,4% de positividade em 2005, 32,5% em 2006, 36,7% em 2007, 32% em 2008 e 44% em 2009 (ARAGUAÍNA, 2009; ARAGUAÍNA, 2010).
Vale ressaltar que em 2009 dos 2.980 cães soropositivos para LV, foi constatado que em 73% dos casos os cães foram eutanasiados e os 27% restantes, morreram por outros agravos, ou ocorreram mudanças de endereço dos proprietários, e outros apresentaram contraprovas realizadas em laboratórios particulares escolhidos pelos proprietários do cão, indicando resultados contrários. (CRUZ et al., 2010)
1.8 ASPECTOS CLINICOS
1.8.1 Leishmaniose Visceral Humana
A LV pode não apresentar manifestações em humanos, assim, a doença assume um curso assintomático, sem qualquer manifestação clínica aparente. Por outro lado, têm-se casos em que a doença apresenta uma história natural, característica, dita como “forma clássica do calazar” (TOLEDO; MARZOCHI e COUTINHO, 1983).
O curso clínico da doença pode depender tanto de fatores relacionados à natureza da resposta imune do hospedeiro, à virulência do parasito, à baixa idade e ao estado nutricional do paciente. Os indivíduos infectados podem apresentar desde a forma assintomática, até uma doença de evolução fatal (PEDROSA E ROCHA, 2004).
No período inicial ou fase aguda, a sintomatologia pode incluir febre com duração inferior a quatro semanas, palidez cutâneo-mucosa e hepatoesplenomegalia, sintomas esses que variam para cada paciente. A evolução da doença é seguida pelo período de estado, caracterizado por febre irregular, associada ou não a emagrecimento progressivo, palidez cutâneo-mucosa e aumento da hepatoesplenomegalia. Geralmente é um quadro clínico arrastado, freqüentemente com mais de dois meses de evolução, acometendo o estado geral do paciente (BRASIL, 2005a).
Caso não seja estabelecido o diagnóstico e tratamento, a doença evolui progressivamente para o período final, com febre contínua e comprometimento mais intenso
32 do estado geral. Instala-se a desnutrição (cabelos quebradiços, cílios alongados e pele seca) e edema dos membros inferiores podendo evoluir para anasarca. Outras manifestações importantes incluem hemorragias (epistaxe, gengivorragia e petéquias), icterícia e ascite. Nesses pacientes, o óbito geralmente é determinado por infecções bacterianas e/ou sangramentos (BRASIL, 2005a).
Associadas aos sinais e sintomas, as alterações laboratoriais se fazem presentes evidenciando muitas vezes anemia, trombocitopenia, leucopenia e baixa de albumina, elevação dos níveis das aminotransferases, das bilirrubinas e aumento discreto dos níveis de uréia e creatinina (PEREIRA, 2003; BRASIL, 2006a).
Segundo o Ministério da Saúde, deve ser considerado suspeito de LV todo paciente que apresentar febre e esplenomegalia associada ou não a hepatomegalia, obtendo confirmação diagnóstica por Enzyme-linked immune assay (ELISA), e diagnóstico parasitológico ou Imunofluorescência Indireta (BRASIL, 2003).
1.8.2 Leishmaniose Visceral Canina
A LVC é uma doença sistêmica grave cujas manifestações clínicas dependem do tipo de resposta imunológica expressada pelo animal infectado. O quadro clínico de cães infectados apresenta um espectro de características clínicas que varia do aparente estado sadio a um grave estágio final (CABRAL et al., 1998).
Apesar da grande diversidade de sinais clínicos da LVC, existem animais aparentemente saudáveis e aqueles que exibem sintomatologia característica de estágios finais da enfermidade. Um fato intrigante é que a doença canina pode permanecer clinicamente inaparente por longos períodos (LONGSTAFFE et al., 1983).
O período de incubação é variável e difícil de ser determinado, uma vez que, em condições naturais, não se consegue estabelecer com segurança o momento da infecção. Em termos gerais, varia de 3 meses até vários anos (GENARO, 2000).
Desta forma, os sinais clínicos e o tempo de aparecimento da doença não são previsíveis, podendo ocorrer ausência total dos sinais, e até uma síndrome clinica caracteriza por: febre, emagrecimento progressivo, alopécia, anemia – geralmente normocítica e normocrômica, hipergamaglobulinemia, descamação cutânea e outras dermatites, ulceração
33 cutânea –normalmente nas orelhas, articulações, focinho e cauda, áreas de hiperqueratose, conjutivite, onicogrifose, apatia, diarréia, vômito, linfadenopatia, edema das patas e, tardiamente, paresia das patas posteriores e caquexia (DEANE e DEANE, 1955b; BRENER, 1957; ALENCAR, 1959; MARZOCHI et al., 1985; ABRANCHES et al., 1991; GENARO, 2000).
As principais lesões da LVC observada em cães, no Velho e Novo Mundo, ocorrem em órgãos ricos em células do sistema fagocítico mononuclear, como baço, fígado, linfonodos, medula óssea, rins, pulmões, intestino e pele (BOGLIOLO, 1956; ALENCAR, 1959; TAFURI et al., 1996; TAFURI; OLIVEIRA e MELO, 2001; LIMA et al., 2004).
As alterações histopatológicas observadas na LVC são semelhantes às descritas na doença humana (KEENAN et al., 1984), embora as lesões cutâneas nos cães sejam mais intensas e estejam presentes em grande parte dos casos. As alterações laboratoriais, particularmente as hematológicas, revelam anemia normocrômica, linfocitose com leucopenia que pode ser moderada ou intensa, neutrofilia e trombocitopenia (KEENAN et al., 1984; ABRANCHES et al., 1991).
De acordo com a clínica apresentada, e considerando a classificação adotada por Rocha (2002) e Moreira (2003), temos cães: Assintomáticos: que não apresentaram nenhum sinal característico de LVC ao exame clínico; Oligossintomáticos: que apresentaram até três sinais compatíveis de LVC e; Polissintomáticos: que apresentaram mais de três ou todos os sinais comuns à LVC. Independente do tipo clínico que o cão se enquadra, a capacidade de atuar como fonte de infecção é fato notório. Cães sintomáticos e assintomáticos são capazes de infectarem flebotomíneos vetores, mesmo quando apresenta pele sadia (ADLER e THEODOR, 1931), fato evidenciado pelo intenso parasitismo cutâneo, conforme demonstrado por Alvar et al., (1994).
1.9 TRATAMENTO E CONTROLE DA LEISHMANIOSE VISCERAL
1.9.1 Tratamento da Leishmaniose Visceral Humana
34 mundo atualmente, com um impacto significativo nas comunidades de baixa renda, em virtude do baixo investimento no desenvolvimento de novos fármacos.
Em todo o mundo estão disponíveis no arsenal terapêutico da LVH os seguintes fármacos: Stibogluconato de sódio, antimoniato-N-metil glucamina, anfotericina B, anfotericina B lipossomal, pentamidinas (isotionato e mesilato), miltefosine (BRASIL, 2006a) No Brasil, para o tratamento em humanos o fármaco de primeira escolha é o antimoniato N-metil glucamina, um derivado pentavalente (SB+5 – compostos antimoniais pentavalentes). O medicamento é distribuído pelo Ministério da Saúde, recomendado a dose de 20mg de SB+5 Kg/dia, por no mínimo 20 e no máximo 40 dias, com limite de 2 a 3 ampolas/dia (BRASIL, 2006a).
Atua nas formas amastigotas do parasito, inibindo sua atividade glicolítica e a via oxidativa de ácidos graxos. O principal efeito colateral é decorrente de sua ação sobre o aparelho cardiovascular, traduzindo em distúrbios de repolarização, ficando dessa forma contra-indicado em pacientes que fazem uso de beta-bloqueadores e drogas antiarrítmicas (BRASIL, 2006a).
Na área endêmica de Jacobina, Bahia, onde a LV é diagnosticada precocemente, os resultados, são eficazes com 15 dias de tratamento (BADARO et al., 1986).
Relatos demonstram que a duração do tratamento em Fortaleza (REY et al., 2005) com antimoniato variou de 20 a 40 dias, mostrando alta taxa de cura (96%) e baixa toxicidade (4%), como relatado também em Natal (JERÔNIMO et al., 1994).
O desoxicolato sódico de anfotericina B e suas formulações lipossomais são fármacos de tratamento alternativo (em terapia não responsiva aos antimoniais pentavalentes em gestantes, crianças menores de seis meses, cardiopatas e nefropatas).
A anfotericina B lipossomal apresenta custo elevado, impossibilitando o seu uso na rotina do serviço. É indicada aos pacientes graves de leishmaniose visceral, que desenvolveram insuficiência renal ou toxicidade cardíaca durante o uso do Antimoniato de N-metilglucamina e de outras drogas de escolha não obtendo melhora ou cura clínica (BRASIL, 2006a).
São fármacos com atividade leishmanicida mais potente disponível comercialmente, atua nas formas promastigotas e amastigotas do parasita, tanto in vitro quanto in vivo. Seu
35 mecanismo de ação se dá através da ligação preferencial com ésteres (ergosterol ou episterol) presentes na membrana plasmática da Leishmania (BRASIL, 2006a).
É altamente tóxica para as células do endotélio vascular, com comprometimento renal em praticamente todos os pacientes ao longo do tratamento (VERONESI e FOCACCIA, 2005; GOODMAN e GILMAN, 2006).
As principais reações agudas consistem em febre (80%), calafrios, taquipnéia, hipotensão moderada, dor local, flebites, cefaléia, anorexia, convulsões, reação anafilática, arritmia, insuficiência cardíaca e diminuição da filtração glomerular (VERONESI e FOCACCIA, 2005; GOODMAN e GILMAN, 2006).
Outros fármacos com atividade leishmanicida foram introduzidos no tratamento da LVH, como as pentamidinas (isotionato e mesilato) principalmente na Europa e África. Sua eficácia é inferior a dos antimoniais pentavalentes e anfotericina B e seus paraefeitos maiores. A dose utilizada é de 4mg/kg/dia em dias alternados no total de 15 doses, não devendo ultrapassar a 2g como dose total.
Seus efeitos colaterais mais comumente encontrados são anorexia, astenia, náusea, dor abdominal, hipoglicemia prolongada, taquicardia e outras arritmias, insuficiência renal em 25% dos pacientes, geralmente reversível e pancreatite que pode levar ao aparecimento de diabetes mellitus, em 10 a 15% dos casos.
Recentemente uma droga oral (miltefosine) vem sendo utilizada na Índia, com resultados promissores no tratamento do calazar indiano (BRASIL, 2006a).
Os critérios de cura são essencialmente clínicos. Geralmente é caracterizado pelo desaparecimento da febre, redução da hepatoesplenomegalia, melhora dos parâmetros hematológicos, ganho ponderal, retorno do apetite e melhora do estado geral (REY, 1991).
O seguimento deve ser feito aos 3, 6 e 12 meses após o tratamento e na última avaliação se permanecer estável o paciente é considerado curado. As provas sorológicas são de pouca utilidade no seguimento porque negativa tardiamente (JERONIMO et al., 1994)
Antes da introdução dos antimoniais no arsenal terapêutico por Gaspar Vianna (1913) Apud (REY, 1991), estimava-se que a taxa de letalidade dos pacientes variava entre 75 e 95% Em Fortaleza Rey et al., (2005), verificaram que a letalidade foi de 8,7% , sendo semelhante aos relatos de São Paulo (PASTORINO et al., 2002), São Luis (MENDES et al.,
36 2002), Natal (JERONIMO et al., 1994), Brasília (CAMPOS, 1995) e Mato Grosso do Sul (OLIVEIRA et al., 2006).
1.9.2 Tratamento da Leishmaniose Visceral Canina
As tentativas de tratamento da LVC por meio de fármacos tradicionalmente empregadas em humanos como (antimoniato de meglumina, anfotericina B, isotionato de pentamidina, alopurinol, cetoconazol, fluconazol, miconazol e itraconazol), têm tido baixa eficácia.
O tratamento dos cães, no Brasil, é expressamente proibido pelos órgãos de saúde pública, além da resposta terapêutica ser baixa, frequentemente ocorre recidiva da enfermidade durante ou logo após o tratamento. A proibição do uso de produtos destinados a uso humano ou que não possuem registro no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - (MAPA), foi estabelecido pela portaria interministerial Nº 1.426 de 11 de julho de 2008, elaborada e publicada pelo MS, em conjunto com o MAPA. (BRASIL, 2006a),
Com relação ao antimoniato de meglumina (Glucantime®), a dosagem utilizada para o tratamento canino é aproximadamente 10 vezes maior que o recomendado para o tratamento humano. O uso rotineiro de medicamentos em cães induz à remissão temporária dos sinais clínicos, não previne a ocorrência de recidivas, tem efeito limitado na infectividade de flebotomíneos e leva ao risco de selecionar parasitos resistentes aos fármacos utilizadas no tratamento humano. Portanto, o tratamento canino não tem apresentado eficácia e nem diminuído a importância do cão como reservatório do parasito (MORENO et al., 1999; BRASIL, 2006a).
MORENO et al., (1999), cita as desvantagens observadas no tratamento da LVC com o Glucantime®: a seleção de parasitos resistentes a fármacos com o passar do tempo, levando ao risco de selecionar linhagens de parasitos resistentes; o tratamento é doloroso e, para animais de grande porte, é caro; o tratamento gera a falsa impressão de efetividade, induzindo os proprietários na decisão de tratar pessoalmente os animais por curtos períodos, aumentando o risco de falhas no tratamento.
37 Os estudos sugerem que o tratamento da LVC, conforme os modelos propostos até então, pode levar a melhoria transitória do quadro clínico laboratorial do cão, redução dos níveis de anticorpos séricos contra o parasito, associados a uma possível redução (também transitória) na carga parasitária em alguns tecidos (MANNA et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008).
Os trabalhos que estudaram a infectividade para flebotomineos são inconclusivos e apresentam evidências de que animais tratados mantêm a capacidade de infectar esses insetos (MIRET et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008).
A literatura sobre o tratamento da LVC no Velho Mundo alerta sobre o perigo potencial de geração e circulação de cepas do parasito resistentes às drogas usualmente utilizadas para o tratamento de seres humanos, tais como: o antimonial pentavalente, anfotericina B e a miltefosine (GRAMICCIA; GRADONI e ORSINI, 1992; CARRIÓ e PORTÚS, 2002).
O surgimento e disseminação de cepas resistentes do parasito como têm ocorrido em alguns países (SUNDAR et al., 2000; SUNDAR, 2001) tem sido alertada em comunidades nas quais o tratamento de cães é praticado (GRAMICCIA; GRADONI e ORSINI, 1992), pode ter caráter irreversível e consequências imprevisíveis.
A miltefosine é utilizada para o tratamento da forma cutânea da leishmaniose humana em alguns países, como: Colombia, Guatemala, Argentina, Venezuela, Paraguai, Equador e Honduras (GRAMICCIA; GRADONI e ORSINI, 1992; ROUGIER et al., 2008). Recentemente, foi lançada para uso veterinário nos países do Mediterrâneo (Portugal, Espanha, Itália, Grécia e Ilha de Chipre), existe a possibilidade de os cães que receberem esse tratamento, e os parasitos que infectarem esses cães tratados, apresentarem resistência e serem disseminados por meio da migração desses animais para os países em que o medicamento tem sido utilizado em humanos.
Durante a realização do II Fórum de discussão sobre o tratamento LVC, em Brasília/DF nos dias 01 e 02 de outubro de 2009, um grupo de expertises em Leishmaniose para tratar da política nacional de vigilância e controle da LV no Brasil (BRASIL, 2009). Com intuito de alterar o ponto de vista científico sobre a proibição do tratamento da LVC com medicamentos utilizados em seres humanos ou não regulamentadas pelo MAPA.
38 Esse grupo concluiu que o tratamento canino representa risco para a saúde pública com graves conseqüências, que vai desde a disseminação da doença nos demais continentes, até a geração de cepas resistentes ao pequeno arsenal disponível para a doença.
1.9.3 Medidas de Controle
Considerando a grande diversidade da doença e de sua epidemiologia, é quase impossível o controle com apenas uma estratégia. No Brasil, assim como no Estado do Tocantins, atualmente as estratégias utilizadas para o controle da leishmaniose visceral são fundamentadas em três medidas:
1) detecção e tratamento de casos humanos; 2) combate ao vetor;
3) investigação da infecção canina com eliminação dos cães soropositivos.
As medidas citadas devem interromper o ciclo de transmissão da doença, cujo percurso está demonstrado na figura 7 (MARZOCHI; SCHUBACH e MARZOCHI 1999; ASHFORD, 2000; BRASIL, 2006a).
Figura 7. Ciclo de Transmissão da Leishmaniose Visceral Canina
Fonte: Manual Técnico da Leishmaniose Visceral Canina – Leishmune – Fort Dodge®
39 Para Deane (1956), os humanos podem ser incriminados como reservatório, ainda que represente pequena importância epidemiológica. Com a utilização de medidas de proteção individual como: repelentes e mosquiteiro, os indivíduos, principalmente, os que exercem contato com a mata, auxiliarão na diminuição da incidência da doença.
Segundo Marzochi; Schubach e Marzochi, (1999), na maioria das vezes as medidas supracitadas são consideradas utópicas, principalmente em países tropicais e em comunidades subdesenvolvidas. O diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos devem ser associados às demais medidas de controle, visando a redução dos índices de morbi-mortalidade.
As ações de controle do vetor são feitas através da vigilância entomológica. O levantamento entomológico tem como objetivos verificar a presença de L. longipalpis e/ou L. cruzi em municípios sem casos humanos de LV ou municípios silenciosos; e também conhecer a dispersão do vetor no município com transmissão esporádica, moderada ou intensa, a fim de apontar naqueles sem casos autóctones de LV as áreas receptivas para a realização do inquérito amostral canino e nos municípios com transmissão da LV orientar as ações de controle do vetor.
O objetivo do monitoramento é conhecer a distribuição sazonal, visando estabelecer o período de maior chance de transmissão da LV, direcionando as medidas de prevenção e controle químico, como a aplicação de inseticidas no interior e nos arredores do domicílio, medida preconizada pelo Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCLV), elaborado pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2003).
A detecção dos reservatórios é realizada principalmente através de inquéritos sorológicos realizados pelos Centros de Controle de Zoonoses, órgãos ligados ao Ministério da Saúde, onde os animais soropositivos são recolhidos e eutanasiados em cumprimento ao Decreto nº. 51.838 - MS, de 14 de março de 1963, o qual estabelece que animais domésticos portadores de leishmaniose visceral devam ser eutanasiados (BRASIL, 2003).
No entanto, ainda existe uma grande resistência dos proprietários em entregar os animais, o que compromete esta ação de controle, pois prolonga o tempo de permanência do reservatório no ambiente.
A eliminação de cães positivos e de vetores no domicílio têm um impacto significativo na redução dos casos humanos, afirmação bem vista tanto para o pesquisador Alencar (1961), como para Sherlock e Almeida (1970).
40 O fato foi comprovado por Magalhães et al., (1980), quando conseguiram controlar a LV no Vale do Rio Doce, Minas Gerais, através do sacrifício de cães positivos pela RFC e/ou por exame de esfregaço por aposição da pele da orelha, do controle vetorial por aplicação de inseticidas e do tratamento de todos os casos humanos com Glucantime®.
Entretanto, Ashford et al., (1998), trabalhando em região endêmica de Jacobina, BA, ao avaliarem o impacto da eliminação de cães soropositivos como medida de controle sobre a incidência da doença, não conseguiram interromper a transmissão, apesar da redução da prevalência de cães soropositivos em 26% (de 36% para 10%).
De fato, a eliminação tardia dos cães, ocasionada pela baixa capacidade de processamento de amostras pelos laboratórios públicos, deixando-os por um longo período atuando como reservatórios, além da baixa sensibilidade dos testes diagnósticos e das dificuldades de identificar o cão assintomático de área endêmica parecem ser capazes de comprometer o sucesso dos programas de controle (SILVA, 2005).
Estes dados sugerem que a eliminação de cães, sem o concurso de outras medidas, é insuficiente para controlar a doença.
Com intuito de estabelecerem medidas complementares David et al., (2001) avaliaram a efetividade do uso de coleiras de deltametrina para proteger os cães contra picadas de flebotomíneos (Lu. Longipalpis). Segundo estes autores, houve um potente efeito de inibição do repasto para ambas as espécies de flebotomíneos utilizadas, variando de 96% a 100% nas primeiras semanas de uso, com progressiva redução do efeito após vinte semanas.
Além disso, observou-se também efeito letal sobre os vetores, com mortalidade máxima na terceira e quarta semanas (91% a 96%). Ademais, foi demonstrada a efetividade dos colares mesmo em animais expostos a intempéries, como sol e chuva, constituindo uma medida de grande valor para proteção individual dos animais (KILLICK-KENDRICK et al., 1997; DAVID et al., 2001).
Reithinger; Teodoro e Davies, (2001) realizaram alguns testes e concluiram que 90% dos flebotomíneos, que realizaram um repasto sangüíneo em cães com essas coleiras, não sobreviveram.
O uso rotineiro dessas coleiras por cães domésticos, na Itália, reduziu o risco desses animais se infectarem com L. (L.) infantum. No Irã, um estudo randomizado mostrou redução da infecção canina para 54% e, também risco de infecção significativamente menor para as
