FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITOS DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Borrelia anserina.
LEIZINARA GONÇALVES LOPES
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
EFEITOS DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Borrelia anserina.
LEIZINARA GONÇALVES LOPES
Botucatu – SP Junho de 2015
Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutora.
Lopes, Leizinara Gonçalves.
Efeitos da luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio na inativação da Borrelia anserina / Leizinara Gonçalves Lopes. - Botucatu, 2015
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Orientador: Raimundo Souza Lopes Coorientador: Antonio Claudio Tedesco Capes: 50501003
1. Borrelia. 2. Fotoquimioterapia. 3. Ftalocianinas. 4. Ave poedeira - Doenças. 5. Emulsões.
Nome do Autor: Leizinara Gonçalves Lopes
Título: EFEITOS DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Borrelia anserina.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Raimundo Souza Lopes Presidente e Orientador
Departamento de Clínica Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu – SP.
Profa.Dra. Regina Kiomi Takahira Membro
Departamento de Clínica Veterinária
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP – Botucatu – SP.
Prof. Dr. José Jurandir Fagliari
Membro
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal – SP.
Prof. Dr. Aureo Evangelista Santana
Membro
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal – SP.
Prof. Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca
Membro
Departamento de Epidemiologia e Saúde Pública
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro – UFRRJ – Seropédica – RJ.
COMISSÃO DE ÉTICA
Protocolo n° 122/2013 – CEUA
“
Seja você quem for, seja qual for a posição social que você tenha na vida,
a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta muita força, muita
determinação e sempre faça tudo com muito amor e com muita fé em Deus,
que um dia você chega lá. De alguma maneira você chega lá.
”DEDICATÓRIA
Para meus pais e irmão,
Pela amizade, afeto, amor e carinho.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus que com sua infinita bondade e sabedoria guiou-me em todos os momentos, e colocou pessoas tão especiais no meu caminho.
Agradeço aos meus pais, que me deram a vida e me ensinaram a vivê-la com dignidade, que iluminaram os caminhos obscuros, que me dedicaram amor, afeto e carinho, que se doaram inteiros para que eu pudesse realizar os meus sonhos, pela espera e compreensão durante minhas longas viagens. A vocês, meus pais, não bastaria dizer, que não tenho palavras para agradecer tudo isso. Mas é o que acontece agora, quando procuro uma forma verbal de exprimir uma emoção ímpar. Amo vocês!
Ao meu irmão, pela amizade e companheirismo. Meu melhor amigo. Aos professores, Dr. Raimundo Souza Lopes, Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca e ao Dr. Antonio Claudio Tedesco, pela amizade, orientação, confiança, paciência, ensinamentos e estímulos para realização deste trabalho.
A mestranda Daniela Dabus, por compartilhar além do projeto e seus desafios com esforço e dedicação disponibilizados, agradeço pela amizade, que com certeza é um dos maiores ganhos que tive no doutorado.
Aos meus avós e todos os meus familiares, que mesmo distantes, são fundamentais em minha vida.
Aos meus amigos pela ajuda, aos momentos inesquecíveis e apoio nas dificuldades, Giovanna Gelsi, Paulo Argollo, Brayan López, Loreanna Bertolucci, Lucca Baptistella de Napoli, Fernanda Almeida Rabelo, Fernanda dos Santos Sandim, José Roberto dos Santos Júnior, Mauro Yukio Shiroma, Carolina Martins, Bruno Ceolin, Maurício Wilmsen, Fernanda Rodrigues, Bruna dos Santos, Jussara Shimono, Cristiana Morais e Adriana Figueira.
Ao Dr. Adivaldo Henrique da Fonseca, pós-graduandos Bruna Baeta, Matheus Cordeiro e Márcio Cepeda, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRRJ - RJ, que tão prontamente nos auxiliou no exames de Ensaio de Imunoadsorção Enzimático indireto.
Aos funcionários do Laboratório Clínico Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Mácio José Figueira e Marcos Montanha Ramos, pela amizade, incentivo e pelo auxílio nas dosagens bioquímicas.
Aos funcionários e amigos do Departamento de Zoonoses e Saúde Pública, pelo carinho, convívio, amizade, ensinamentos e ajuda.
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio financeiro para realização deste projeto de pesquisa.
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Valores de referência de Gallus Gallus fisiológicos para Volume Globular (VG em %), Proteína Plasmática Total (PPT em g/dL) e Alanina Aminotrasferase (ALT em UI/L) segundo Campbell in Thrall et al., (2012). Triglicérideos (mg/dL), Colesterol (mg/dL), Fosfatase Alcalina (FA em UI/L), Aspartato Aminotransferase (AST em UI/L) segundo o Sistema Internacional de Informação das Espécies (Conventional U.S.A. Units –Outubro de 1999)……… 23
TABELA 2 - Médias ± desvios-padrão dos valores da espiroquetemia (x106/mL) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015. ... 47
TABELA 3 -
TABELA 4 - Médias ± desvios-padrão dos valores da eação em Cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) (x105mL) de galinhas
poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 49
TABELA 5 - Médias ± desvios-padrão dos valores do ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (ELISA indireto) padronizado (CDO*100/CUT off) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 50
TABELA 6 - Médias ± desvios-padrão dos valores de volume globular (VG) (%) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 51
1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 52
TABELA 8 - Médias ± desvios-padrão dos valores de colesterol (mg/dL) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 53
TABELA 9 - Médias ± desvios-padrão dos valores de triglicerídeos (mg/dL) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). A morte das galinhas está apresentada com números entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 54
TABELA 11 - Médias ± desvios-padrão dos valores de alanina aminotransferase (UI/L) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015... 56
TABELA 12 - Médias ± desvios-padrão dos valores de aspartato aminotransferase (UI/L) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Número de aves mortas está apresentada entre parênteses. Botucatu -SP, 2015. ... 57
TABELA 13 - Médias ± desvios-padrão dos valores da espiroquetemia (x 105/mL) em meio de cultivo Barbour-Stoenner-Kelly
(BSK), em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Entre parênteses mediana e percentis 25 e 75% de espiroquetas. Botucatu -SP, 2015. ... 58
análise, com intervalo de cinco dias entre cada análise. Classificação de motilidade representada em cruzes (+): ++++ motilidade intensa, +++ vigorosa, ++ ativa, + pouco ativa. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença) e grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... 60
TABELA 15 - Médias ± desvios-padrão dos valores da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) (x105/mL) de
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 - Galinhas poedeiras receptoras da linhagem Nova Gen, com aproximadamente 770 dias de vida, dispostas em gaiolas individuais, com sistema de água automatizado. .... 16
FIGURA 2 - (A) Hidratação dos frangos doadores com solução de cloreto de sódio, técnica realizada 3 vezes ao dia, durante cinco dias. (B) Local de colheita de sangue total por meio de venopunção ulnar. (C) Local de colheita de sangue total por meio de venopunção metatarsica. (D) Inoculação intramuscular de 0,5 mL de soro com Borrelia anserina, em frango para replicação e doação de soro parasitado...
18
FIGURA 3 - Inoculação de 0,25 mL de soro parasitado com Borrelia anserina tratado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio, nas galinhas poedeiras receptoras, por via intramuscular (músculo peitoral). (B) Tratamento do sangue parasitado com Borrelia anserina na tentativa de inativação com luz visível associada à fatlocianina de cloro-alumínio. O aparelho de irradiação de luz LED, não pode ser exposto devido a processo de registro de patente... 22
FIGURA 4 -
(A e B) Pesagem e aferição de temperatura das aves poedeiras. (C) Microscópio de campo escuro utilizado para contagem de espiroquetas (D) Contagem de espiroquetas em momento de pico com concentração de 0,44x106
FIGURA 5 - Ave do grupo doença apresentado sinais clínicos compatíveis com borreliose: prostração, sonolência e penas arrepiadas. Fonte: Lopes, 2015 Fezes diarréicas escretadas pelas aves imunossupremidas, as quais apresentaram grave desidratação... 40
FIGURA 6 - (A) Galinha poedeira dos grupo controle com crista pigmentada de coloração avermelhada, ave clinicamente saudável. (B) Galinha poedeira do grupo doença com crista de colocação pálida, caracterizando sinal clínico de anemia. (C) Galinha poedeira do grupo tratado que após receber soro parasitado tratado com luz visível associada a ftalocianina de cloro-alumínio, retomou a capacidade de ovipostura... 41
FIGURA 7 - Valores médios do ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (ELISA indireto) padronizado (CDO*100/CUT off) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... 43
FIGURA 8 - Valores médios dos valores de volume globular (VG) (%) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... 44
galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... .
45
FIGURA 10 - Valores médios de colesterol (mg/dL) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... 46
FIGURA 11 - Valores médios de triglicerídeos (mg/dL) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... .
47
FIGURA 12 - Valores médios de fosfatase alcalina (UI/L) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado), grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015... 48
FIGURA 14-
Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015...
Valores médios de aspartato aminotransferase (UI/L) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015...
50
51
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 -
Grupos e conduta experimental utilizada, etapas (composto por seis galinhas poedeiras) e in vitroin vivo
(composto por seis placas contendo meio de cultivo BSK).. 19
QUADRO 2 -
Momentos de análises laboratoriais da primeira etapa experimental (in vivo).)...
23
QUADRO 3 -
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ALT Alanina Aminotransferase AST Aspartato Aminotransferase BSK
BHI DNA ELISA
ESC FA IgY LV
Barbour-Stoenner-Kelly Brain Heart Infusion Ácido Desoxirribonucleico
Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Esfregaço Sanguíneo Corado
Fosfatase Alcalina Imunoglobulina Y Luz Visível
MCE Microscópio de Campo Escuro PPT
PBS
Proteína Plasmática Total Tampão Fosfato-salino qPCR
RNA
Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa Ácido Ribonucleico
TFD VG
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 02
2. REVISÃO DE LITERATURA... 05
2.1. Borreliose... 05
2.2. Borrelia anserina... 06
2.3.Terapia Fotodinâmica... 08
2.4. Inativação com ftalocianina associada à luz visível... 09
3. MATERIAL E MÉTODOS... 13
3.1. Local da pesquisa... 13
3.2. Animais experimentais... 14
3.3. Manejo dos animais... 14
3.4. Colheita das amostras... 15
3.5. Etapas e grupos experimentais... 18
3.5.1. Primeira etapa experimental... 19
3.5.2. Segunda etapa experimental... 19
3.5.3. Redução de patógenos por meio de tratamento com uz visível associada à fatlocianina de cloro-alumínio... 20
3.6. Momentos das avaliações laboratoriais... 21
3.7. Avaliação laboratorial... 23
3.7.1. Etapas experimentais... 23
3.7.1.1. Exame clínico... 23
3.7.1.2. Avaliação da espiroquetemia por meio de Microscopia de Campo Escuro... 24
3.7.1.3. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa... 24
3.7.1.4. Ensaio de Imunoadsorção Enzimático Indireto... 25
3.7.1.5. Volume Globular (VG) e Proteína Plasmática Total (PPT)... 27
3.7.1.6. Bioquímica sérica... 27
3.8. Análise Estatística... 27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 30
LOPES, L.G. EFEITOS DA LUZ VISÍVEL ASSOCIADA À FTALOCIANINA DE CLORO-ALUMÍNIO NA INATIVAÇÃO DA Borrelia anserina. Botucatu, 2015.
94p. Tese – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
RESUMO
A terapia fotodinâmica se apresenta como uma opção clínica promissora para o tratamento de tumores e, de infecções causadas por vírus e bactérias por meio do uso de fotossensibilizadores não tóxicos. A ftalocianina, quando associada à luz visível, possui propriedades fotofísicas vantajosas apresentando alta absorção na faixa de espectro luminoso vermelho. A borreliose aviária é uma doença aguda e septicêmica, causada pela bactéria Borrelia anserina, transmitida pelo carrapato Argas miniatus, podendo levar a morte. A enfermidade possui grande importância econômica para a avicultura, por causar alto índice de mortalidade em aves. O estudo teve como objetivo verificar se o soro parasitado com Borrelia anserina, tratado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio, quando inoculado in vivo, é capaz de provocar a enfermidade, e quando in vitro, mantém sua capacidade de crescimento em meio Barbour-Stoenner-Kelly. Foram utilizados 11 frangos doadores de soro parasitado e 42 galinhas receptoras, separadas em sete grupos experimentais, in vivo e in vitro, para ambas as etapas. Grupo controle, grupo doença parasitado com B. anserina, grupo Imunossupressão, grupo luz visível, grupo nanoemulsão, grupo ftalocianina e grupo tratado realizado com luz visível associada à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio. O acompanhamento foi realizado a cada cinco dias, durante 45 dias após a inoculação, com realização de exame clínico, espiroquetemia, reação em cadeia da polimerase quantitativa, dosagem de Imunoglobulina Y, colesterol, triglicerídeos, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase, volume globular e proteína plasmática total. Foi possível concluir que a associação de luz visível e ftalocianina de cloro-alumínio tem efeito favorável no controle da enfermidade, redução da carga parasitária e taxa de mortalidade.
LOPES, L.G EFFECTS OF VISIBLE LIGHT ASSOCIATED WITH CHLORO- ALUMINUM PHTHALOCYANINE IN INACTIVATION OF Borrelia anserina. Botucatu, 2015. 94p. Thesis - Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu, Universidade Estadual Paulista.
ABSTRACT
Photodynamic therapy is presented as a promising clinical option for the treatment of tumors, viruses and bacteria through the use of nontoxic photosensitizers. When the phthalocyanine is combined with visible light, have advantageous on the photophysical properties presenting high absorption in the red light spectrum range. Avian Spirochetosis is an acute and septicemic disease, caused by the bacterium Borrelia anserina, transmitted by Argas miniatus and can lead to death. The disease has great economic importance to the poultry industry, because this causes a high mortality in aviculture. The study had as objective to determine the serum infested with Borrelia anserina, treated using visible light associated with chloro-aluminum phthalocyanine, when inoculated in vivo, is capable of causing illness, and when in vitro, retains its capacity for growth amid Barbour-Stoenner-Kelly. Were used 11 chicken serum donors parasitized and 42 receiving chickens, in seven separate experimental groups, in vivo and in vitro for both steps. Control group, parasitized disease group B. anserina, immunosuppression group, light group visible, nanoemulsion group, phthalocyanine group and treated group conducted with visible light associated with emulsion chloro-aluminum phthalocyanine. Follow-up was conducted every five days, for 45 days after inoculation with conducting clinical examination, spirochetemia, quantitative polymerase chain reaction, Immunoglobulin Y dosage, cholesterol, triglycerides, alkaline phosphatase, alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase, Globular volume and plasma total protein. It was concluded that visible light association and chloro-aluminum phthalocyanine has a favorable effect on the control of the disease, reduction in parasite burden and mortality rate.
1. INTRODUÇÃO
A borreliose aviária é causada pela bactéria Borrelia anserina, descrita pela primeira vez em 1891, por Sakharoff, que relatou uma epidemia em gansos na Rússia, causando processo anemiante e altas taxas de morbidade (SOARES, et al., 2000). No Brasil, em 1903, foi identificado por Marchoux e Salimbeni, o carrapato Argas spp, o agente transmissor da enfermidade.
A infecção é caracterizada por causar anemia, hipertermia, polidipsia, sonolência, inapetência e diarreia, pode evoluir para cianose com hipotermia, transtornos paralíticos e morte (SHOMMEIN e KHOGALI, 1974; BANDOPADHYAY e VEGAD, 1983).
Na década de 80, a borreliose era considerada uma doença severa que ameaçava a produção avícola, principalmente em pequenas propriedades. Atualmente, com a industrialização na criação de aves, a incidência do vetor se estabelecer na produção intensiva, é menor (ARAGÃO, 1911; GORRIE, 1950; ATALIBA, 2006).
Porém, devido a nova propensão de criação no sistema orgânico, aves criadas ao ar livre, visando o bem-estar animal, há preocupação com o ressurgimento do vetor neste sistema de criação, podendo elevar a incidência da enfermidade (CAB, 2002).
A pesquisa e o desenvolvimento de novos protocolos de tratamento utilizando a terapia fotodinâmica é uma opção terapêutica para diversas doenças de origem bacteriana, parasitária, viral e neoplásica, que acometem seres humanos e animais (MINNOCK et al., 1996; ESCOBAR et al., 2006; MACLEAN et al., 2008; SILVA et al., 2009), tornando-se uma alternativa promissora para a inativação, redução e/ou eliminação da borreliose.
O processo da terapia fotodinâmica envolve o uso de um fotossensibilizador (ftalocianina), que cora o agente alvo (Borrelia anserina) e em associação com a luz, promove o fotodano aos agente patogênico.
Este estudo teve como objetivos:
2. Verificar os efeitos da luz visível associada à ftalocianina na inativação da Borrelia anserina no sangue de animais susceptíveis (Gallus gallus domesticus).
3. Verificar se a Borrelia anserina presente no soro tratado por terapia fotodinâmica, cresce ao ser cultivada em meio de cultura.
4. Verificar se o sangue parasitado com Borrelia anserina tratado com luz visível associada à ftalocianina, quando inoculado em animais susceptíveis, é capaz de provocar a enfermidade.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Borreliose
As bactérias do gênero Borrelia (Swellengrebel, 1907), pertencentes a ordem Spirochaetales, família Spirochaetaceae, possuem o formato helicoidal, com 15 a 20 flagelos, três a 10 espiras, e medem de 0,2 a 0,5 mm por 3 a 30 mm. Este organismo tem protoplasma cilíndrico envolto pela membrana celular, da qual partem flagelos, possui externamente outra membrana contendo proteínas de superfície (KRIEG e HOLT, 1984; BARBOUR e HAYES, 1986), são gram-negativas e microaerófilas (AUSTIN, 1993).
São reconhecidas cinco enfermidades causadas por microrganismos do gênero Borrelia, que afetam os animais e/ou o homem. A primeira descrita foi a febre recurrente humana e tem como agente Borrelia recurrentis, cujos vetores são carrapatos Ornithodorus sp. e piolhos do gênero Pediculus sp. (PAVLOVSKY, 1965; HOOGSTRAAL, 1985). A borreliose bovina é causada por B. theileri, agente que também pode infectar ovinos e é transmitida por carrapatos ixodídeos, principalmente, Rhipicephalus microplus (CALLOW, 1967; MATTON e MELCKEBEKE, 1990). O aborto epizoótico bovino, é causado por B. coriaceae; o vetor é Ornithodorus coriaceus (JOHNSON et al., 1987; ZINGG e LEFEBVRE, 1994).
2.2. Borrelia anserina
A borreliose aviária é uma doença septicêmica aguda, cosmopolita, que acomete diferentes ordens de aves (galiformes, anatídeos, passeriformes, columbiformes e algumas aves silvestres) (WOUDA et al., 1975; QUINN et al., 1994), causada pela bactéria Borrelia anserina (SAKHAROFF, 1891). Os vetores são carrapatos do gênero Argas spp., servindo como reservatórios naturais, nos quais as espiroquetas sobrevivem por longos períodos (DaMASSA e ADLER, 1979; BURGDORFER et al., 1985).
O modo de transmissão das borrelias pode ser de modo vertical, transovariano e/ou horizontal, transestadial. Nas espécies transmitidas pelos argasídeos ocorre primordialmente a forma transovariana, o que é bem característico no gênero Argas spp. parasitado com B. anserina (BARBOUR e HAYES, 1986).
No momento da transmisssão, a saliva do carrapato exerce propriedades farmacológicas, como o bloqueio de células fagocitárias e inflamatórias do hospedeiro, facilitando a penetração e disseminação do patógeno (RIBEIRO et al., 1987; URIOSTE et al., 1994).
Quando os carrapatos sugam aves infectadas, as espiroquetas atravessam a parede do intestino e atingem o celoma, podendo ser encontradas após três dias no líquido coxal dos carrapatos. Após 14 dias, em virtude da multiplicação das espiroquetas, estas podem estar presentes em todo o organismo do carrapato, em particular nas glândulas salivares e nos tubos de Malpighi. Nesta fase, Argas spp. são exímios transmissores, inoculando as espiroquetas, tanto por meio do líquido coxal, quanto pela saliva (BIER, 1985; BONÉ, 1939).
De acordo com Hutyra et al., (1947), as espiroquetas se multiplicam primeiro no fígado, baço e medula óssea. Após quatro a seis dias migram para o sangue onde causam febre e acúmulo celular perivascular nos órgãos.
dois dias (SHOMMEIN e KHOGALI, 1974; BANDOPADHYAY e VEGAD, 1983; LABRUNA et al., 1999).
A borreliose aviária se manifesta por hipertermia e polidipsia, sonolência, inapetência, diarreia, evoluindo para cianose com hipotermia, podendo ocorrer transtornos paralíticos e morte. Autores relataram a ocorrência de anemia nas aves infectadas por B. anserina (HUTYRA et al., 1947, SHOMMEIN e KHOGALI, 1974, BANDOPADHYAY e VEGAD, 1983), alterações hematológicas que cursaram paralelamente ao período de espiroquetemia, podendo evoluir em alguns casos para auto-cura (LISBÔA et al., 2008). Achados comuns de necropsia são hepatomegalia, com presença de manchas esbranquiçadas e esplenomegalia (BOERO, 1967; BIER, 1985).
Existe uma correlação com o pico de espiroquetemia e o aumento de trombócitos, acompanhado pelo volume globular e eritrócitos, caracterizando resposta medular. O aumento proteínas plasmáticas totais nesse período, pode ser em função da diarreia que ocasiona perda de líquido plasmático e, consequentemente, hemoconcentração (LISBÔA et al., 2008).
De acordo com Boero (1967), a heterofilia observada na evolução da enfermidade, está relacionada com multiplicação das espiroquetas no sangue até atingir o pico de espiroquetemia, substituida a partir deste momento por uma monocitose e posteriormente, no momento de cura clínica das aves, há o predomínio de linfócitos.
Leucocitose observada no desenvolvimento da enfermidade indica uma resposta à infecção por B. anserina. Na contagem diferencial de leucócitos, os heterófilos predominam nas fases iniciais do processo inflamatório (JAIN, 1986). Outro fator que favorece a leucocitose durante o pico de espiroquetemia, é a desidratação que provoca hemoconcentração (LISBÔA et al., 2008).
resposta exagerada de macrófagos, hiperplasia dos órgãos do SMF, eritrofagocitose e hemossiderose.
O aumento nos valores do eritrograma pode estar relacionado ao início da melhora clínica em decorrência da diminuição da espiroquetemia (LISBÔA et al., 2006).
A enfermidade possui grande importância econômica para a avicultura, por causar alto índice de mortalidade em aves jovens. Dessa forma, os hemoparasitas vêm sendo cada vez mais estudados e pesquisados em aves, devido as perdas econômicas causadas (LISBÔA et al., 2008).
O diagnóstico pode ser realizado por meio da visualização das espiroquetas em esfregaços sanguíneos corados (ESC), microscopia de campo escuro (MCE) (HUTYRA et al., 1947) e técnicas sorológicas como a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e de biologia molecular como a Reação de Polimerase em Cadeia (PCR), são altamente sensíveis e específicas para o diagnóstico de borreliose (APPEL, 1990; MOURITSEN et al., 1996).
2.3. Terapia Fotodinâmica
A TFD consiste em modalidade terapêutica que envolve a combinação de luz visível, fármacos fotossensibilizantes e oxigênio molecular tecidual com o objetivo de promover a destruição de células alvo e agentes patogênicos (SILVA at el., 2009; ÇAMUR et al., 2011). A técnica de inativação ocorre devido a absorção da luz pelo corante, na presença de oxigênio molecular que desencadeia processos fotofísicos e biológicos que resultam na formação de espécies reativas de oxigênio capazes de agredir constituintes celulares e ocasionar a morte celular por apoptose ou necrose (PASS, 1993, GARDNER et al., 2010; DUTTA et al., 2011). Isoladamente o fotossensibilizador ou a luz não devem causar fotodano as células (SILVA et al., 2009).
A estimulação do fotossensibilizador depende do comprimento de onda no qual a luz é absorvida. Esse fenômeno é seletivo e a eficiência da absorção difere entre as substâncias (MILANIC et al., 2011). Assim, para a eficiência da TFD sob o aspecto fotofísico, o fotossensibilizador deve ser fotoquimicamente ativo e com alta eficiência de absorção na faixa de luz vermelha ao infravermelho (600-900 nm) (FARAHI et al., 2010), deve ser o mais específico possível, atingindo predominantemente as células alvo, não deve ser tóxico na ausência de radiação e produzir oxigênios reativos com o maior tempo de vida (OCHSNER, 1997).
Na fototoxicidade ou fotodano da reação fotodinâmica estão implicados múltiplos fatores, como: classe do fotossensibilizador, dose, via de administração, absorção, especificidade e distribuição nas células alvo, tipo de fonte de luz e intervalo entre administração do fotossensibilizador e a exposição à fonte de luz (PASS, 1993; WIEDMANN et al., 2004). Na destruição das células alvo, mediada por espécies citotóxicas de oxigênio e de radicais livres, estão envolvidos mecanismos diretos, apoptose e/ou necrose, e indiretos como a resposta imune e inflamatória (WIEDMANN et al., 2004; AHMAD et al., 2000; NAKASEKO et al., 2003).
2.4. Inativação com ftalocianina associada à luz visível
fotobiológico esperado (SIBATA et al., 2004; CASTANO et al., 2006; SILVA et al., 2009).
As ftalocianinas são corantes altamente conjugados, de intensa pigmentação, apresentam alta absorção de luz, destacam-se as altas estabilidades térmica e química, não toxicidade, a atividade oxiredução bem definida e caráter elétrico. São eficientes geradores de oxigênio singleto, altamente seletivos e de rápida eliminação do organismo (LEZNOFF e LEVER, 1989; SILVA et al., 2009). Devido a estas características as ftalocianinas têm sido amplamente empregadas na eletroquímica e utilizadas em TFD, como produto fotossensibilizador (LEZNOFF e LEVER, 1989; FERREIRA et al., 2004).
A síntese da ftalocianina ocorreu por acidente em 1907, quando Braun e Tcherniac conduziram um experimento com ftalimida e anidrido acético, que, após reagirem, originavam o-cianobenzamida. Esta substância era a ftalocianina, embora seu nome atual só tenha sido usado pela primeira vez em 1933, por Dent e colaboradores (1934), cujo grupo de pesquisa foi o primeiro a elucidar parte da composição da molécula, determinando que era constituída por quatro unidades isoindol em uma estrutura altamente conjugada (CENTURION, 2010).
Recentemente, diversos tipos de ftalocianinas metálicas têm sido objeto de estudo, em especial as de cloro-alumínio, níquel, cobre e ferro (CENTURION, 2010).
Como fotossensibilizadores de fácil produção, as ftalocianinas possuem propriedades fotofísicas vantajosas para a TFD (ZHU et al., 2006). As ftalocianinas são corantes sintéticos semelhantes às porfirinas, sua lipofilicidade contribui para sua localização nas membranas plasmáticas, e consequentemente, para a ação fotodinâmica (ROSENTHAL, 1991). O metal central possui influência considerável em sua propriedade fotossensibilizadora (ANHOLT e MOAN, 1992), por apresentar alta absorção na faixa de espectro luminoso vermelho (670-780 nm) (OGUNSIPE e NYOKONG, 2005; ÇAMUR et al., 2011).
como Índia e Rússia para o tratamento de cânceres de mama e pele, do tipo não melanoma (BROWN et al., 2004; SILVA et al., 2009). A pouca disponibilidade comercial é devido a ausência de estudos clínicos utilizando a associação das ftalocianinas a uma fonte de luz (SILVA et al., 2009).
A irradiação pode ser realizada utilizando fontes de luz, como por exemplo as lâmpadas de luz fluorescente, que apresentam como vantagem o baixo custo do sistema de iluminação, mas produzem luz não-coerente, ou seja, formada por comprimentos de ondas que não estão na mesma frequência e direção, e apresentam componente térmico nocivo prejudicial às células alvo, mas que pode ser eliminado por filtros. Os lasers também são utilizados como fontes de iluminação, porque produzem luz coerente, são compostas por um único comprimento de onda, apresentam fibras ópticas que facilitam o direcionamento da luz para os locais de iluminação que permitem o cálculo da dose de luz. A desvantagem dos lasers é o alto custo do equipamento. O Diodo Emissor de Luz (LED) é a fonte de luz mais utilizada na TFD, por produzir luz coerente, monocromática e com fibra óptica, sendo em sistemas de luz de simples manuseio e com baixo custo na produção (SILVA et al., 2009).
Os comprimentos de luz utilizados na TFD devem estar na faixa conhecida como janela terapêutica, entre 400 a 800 nm, onde há máxima transmitância tecidual, permitindo a absorção da luz pelo fotossensibilizador, provocando o fotodano desejado (MANG et al., 2008; SILVA et al., 2009).
3. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi realizados em duas etapas experimentais. Na primeira etapa, fase in vivo foram utilizadas aves da espécie Gallus gallus domesticus, com realização dos exames de diagnóstico laboratorial e imunossupressão das aves, irradiação do soro parasitado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio e inoculação do soro irradiado. Na segunda etapa foi realizada a fase in vitro, no qual foram realizados exames laboratóriais para diagnóstico de borreliose das amostras cultivadas em meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) enriquecido com 6% de soro de coelho. Para ambas as etapas experimentais foi realizado acompanhamento por 45 dias, com intervalo entre momentos de cinco dias.
Este estudo encontra-se de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal e foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Campus de Botucatu, Protocolo n° 122/2014 – CEUA (Anexo 1).
3.1. Local da pesquisa
As análises laboratoriais foram realizadas no Laboratório Clínico Veterinário "Profa. Dra. Aguemi Kohayagawa", Departamento de Clínica Veterinária, na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e no Departamento de Microbiologia e Imunologia, Laboratório de Virologia e Diagnóstico Molecular do Instituto de Biociências, da Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho", Campus Botucatu - SP.
As galinhas foram mantidas em gaiolas, localizadas em baias adaptadas cedidas pelo Departamento de Zoonoses e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, "Júlio de Mesquita Filho", Campus Botucatu - SP.
3.2. Animais experimentais
Foram utilizados um total de 53 aves da espécie Gallus gallus domesticus. Os doadores do soro parasitados foram onze frangos com aproximadamente 50 dias de vida e 42 galinhas poedeiras receptoras, da linhagem Nova Gen, com aproximadamente 770 dias de vida, foram separadas em sete grupos experimentais.
Um frango foi utilizado para replicação da cepa PL de soro parasitado, à amostra de soro parasitado com B. anserina colhida foi aliquotada e inoculada em dez frangos, estes serviram de doadores de soro parasitado para Terapia Fotodinâmica (TFD) e inoculação dos grupos experimentais.
Foram definidos sete grupos experimentais: Grupo 1 (controle) formado por seis aves clinicamente saudáveis não foram expostas a nenhum tratamento ou inoculação; Grupo 2 (doença) formado por seis aves que receberam inoculação de soro parasitado com B. anserina; Grupo 3 (tratado) formado por seis aves que receberam soro parasitado com B. anserina e tratado por luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio; Grupo 4 (luz visível) formado por seis aves que receberam soro parasitado tratado por luz visível; Grupo 5 (nanoemulsão) formado por seis aves que receberam soro parasitado associado a nanoemulsão (substância diluidora da fatlocianina); Grupo 6 (ftalocianina) formado por seis aves que receberam soro parasitado associado a emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio; Grupo 7 (imunossupressão) formado por seis aves que foram submetidas à imunossupressão.
3.3. Manejo dos animais
As aves foram acomodadas em gaiolas suspensas, dispostas homogeneamente em ambiente telado e ventilado e recebiam água à vontade em bebedouros automáticos (Figura 1) e aproximadamente 100 gramas de ração por dia, elaborada com suplemento mineral-vitamínico isento de coccidiostático e sem promotor de crescimento (Anexo 3).
FIGURA 1. Galinhas poedeiras receptoras da linhagem Nova Gen, com aproximadamente 770 dias de vida, dispostas em gaiolas individuais, com sistema de água automatizado. Fonte: Lopes, 2015.
3.4. Colheita das amostras
soro contendo B. anserina. Foi obtido o volume de aproximadamente 6,0 mL de soro parasitado, separado em dez alíquotas de 0,5 mL.
Posteriormente realizado cultivo de 0,5 mL de soro parasitado por B. anserina em caldo e ágar Brain Heart Infusion (BHI), para garantir que não existia qualquer tipo de contaminação do soro obtido após replicação. As nove alíquotas restantes de 0,5 mL de soro parasitado, foram inoculadas por via intramuscular em dez frangos, de aproximadamente 3,0 kg.
As aves doadoras foram hidratadas com 20 mL de solução de cloreto de sódio, 3 vezes ao dia, durante o período de inoculação até o pico de espiroquetemia (Figura 2 - A), neste momento foi realizada a coleta de sangue total por meio de venopunção ulnar e/ou metatársica (Figura 2 – B e C), com animal contido adequadamente e realizada a devida antissepsia no local, utilizando tubos contendo gel ativador de coágulo. Após a colheita, o sangue total foi centrifugado a 5.000 rpm por 10 minutos, para separação do soro contendo a B. anserina. Obteve-se o volume de aproximadamente 2,5 mL de soro por ave. Posteriormente, foi realizado um “Pool” das dez amostras colhidas, onde formamos um único inóculo com volume aproximado de 20 mL e concentração de 0,44x106 espiroquetas/mL de soro, obtidos por contagem em
Câmara de Neubauer EM Microscópio de Campo Escuro.
Do volume total de 20 mL, foi aliquotado 40 amostras com 0,25 mL por alíquota, para inoculação dos grupos: G2 (doença), G3 (tratado), G4 (luz visível), G5 (nanoemulsão) e G6 (fatlocianina) in vivo e in vitro, cada grupo com seis animais e seis placas de cultivo. Uma alíquota com volume de 0,5 mL de soro parasitado, foi utilizada para realização de cultivo em caldo e agar BHI, para garantir que estava presente no soro parasitado apenas B. anserina e nenhum outro patógeno.
(A) (B)
(C) (D)
3.5. Etapas e grupos experimentais
O experimento compreendeu em duas etapas simultâneas. A fase in vivo foi denominada de primeira etapa, e a fase in vitro, denominada de segunda etapa, ambas com mesmo número de amostras e momentos experimentais, realizadas simultameamente (Quadro 1).
QUADRO 1. Grupos e conduta experimental utilizada, etapas in vivo (composto por seis galinhas poedeiras) e in vitro (composto por seis placas contendo meio de cultivo BSK).
Grupos (in vivo e in vitro)
Abreviação Conduta experimental
Controle G1 Soro obtido de aves saudáveis
Doença G2 Inoculação de soro obtido de aves parasitadas com Borrelia anserina (0,44x106 espiroquetas/ mL)
Tratado G3 Soro parasitado com Borrelia anserina tratado por luz visível associada à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio
Luz visível G4 Soro parasitado com Borrelia anserina irradiado por luz visível
Nanoemulsão G5 Soro parasitado com Borrelia anserina associado a emulsão utilizada na diluição da ftalocianina de cloro-alumínio
Ftalocianina G6 Soro parasitado com Borrelia anserina associado à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio
3.5.1. Primeira etapa experimental (in vivo)
As galinhas foram submetidas a um período de sete dias de adaptação; posteriormente foram realizados exames de diagnóstico: exame clínico (Feitosa, 2008), avaliação da espiroquetemia por meio de microscopia de campo escuro (MCE) (Dhawedkar e Dhanesar, 1983). A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) protocolo padronizado no Laboratório de Virologia e Diagnóstico Molecular, do Departamento de Microbiologia e Imunologia, do Instituto de Biociências da UNESP. A dosagem de imunoglobulina Y (IgY) protocolo padronizado no Laboratório de Doenças Parasitárias, do Departamento de Epidemiologia e Saúde Pública, da UFRRJ. As análises bioquímicas de colesterol, triglicerídeos, fosfatase alcalina (ALP), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST), volume globular (VG) e proteína plasmática total (PPT) segundo Thrall (2012), das 42 aves para servir como referência de padrão normal, momento zero (M0).
Posteriormente foi realizada a imunossupressão das aves dos grupos: G2 (doença), G3 (tratado), G4 (luz visível), G5 (nanoemulsão), G6 (fatlocianina) e G7 (imunossupressão) utilizando 30 mg de acetato de metilprednisolona (Depo, Medrol®), por via intramuscular, em dose única (ATALIBA et. al., 2007), com intuito de tornar as aves mais susceptíveis à infecção com Borrelia anserina. No dia seguinte, foi realizado o tratamento do sangue parasitado por B. anserina utilizando luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio.
Imediatamente após o tratamento, foi feita a inoculação de 0,25 mL do soro parasitado tratado nas aves receptoras, por via intramuscular (músculo peitoral) (Figura 3). A inoculação dos grupos experimentais foi realizada de acordo com o citado anteriormente no item 3.2. Animais experimentais.
Foi realizado o acompanhamento diário das aves por 45 dias; a cada cinco dias foram realizados exames diagnósticos, nos dias cinco, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 45 após inoculação.
3.5.2. Segunda etapa experimental (in vitro)
posteriormente, foi realizada a inoculação de seis placas por grupo, dos sete grupos in vitro em meio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK) enriquecido com 6% de soro de coelho. G1 (controle - placa) foi inoculado com sangue proveniente de animais saudáveis, sem borreliose; G2 (doença - placa) recebeu inoculação de cepa parasitada por B. anserina; G3 (tratado - placa) foi inoculado com sangue proveniente de animais imunossuprimidos; G4 (luz visível - placa) recebeu soro parasitado tratado por luz visível; G5 (nanoemulsão - placa) recebeu soro parasitado associado apenas a nanoemulsão utilizada na diluição da ftalocianina; G6 (ftalocianina - placa) recebeu soro parasitado associado à emulsão de ftalocianina de cloro-alumínio; G7 (Imunossupressão - placa) recebeu cepa parasitada tratada por meio da luz visível associada à ftalocianina de cloro-aluminio.
Para realização da inoculação em meio de cultura, obteve-se soro com as espiroquetas segundo protocolo descrito por Labruna et al., (1999), onde foi colhido o volume de aproximadamente 60 mL de sangue total, em tubos contendo gel ativador de coágulo, deixando coagular em temperatura ambiente por 2 a 3 horas, do volume de soro obtido foi utilizado 0,25 mL para inoculação em 2 mL do meio BSK, acondicionado em placas de cultivo celular. Todo o processo de inoculação foi feito em fluxo laminar com material estéril.
O acompanhamento foi realizado por 45 dias, onde a cada cinco dias, eram realizados exames diagnósticos e 0,5 mL do meio deve ser repicado para um novo meio e o restante congelado a -80°C com solução de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10%.
3.5.3. Redução de patógenos por meio de tratamento com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio
concentração de 5 uM. Este material foi submetido ao período de 15 minutos de incubação e posterior irradiação unilateral de luz visível com comprimento na faixa descrita acima, na dose de luz de 10 J/cm-2, agitado constantemente
por um intervalo de tempo proporcional a dose utilizada de modo que a irradiação fosse uniforme em toda a amostra, com duração de 18 minutos e 30 segundos. Todo o processo foi feito em fluxo laminar com material estéril. Após os procedimentos de inativação as amostras foram inoculadas em aves imunossuprimidas para posterior avaliação.
(A) (B)
FIGURA 3. Inoculação de 0,25 mL de soro parasitado com Borrelia anserina tratado com luz visível associada à ftalocianina de cloro-alumínio, nas galinhas poedeiras receptoras, por via intramuscular (músculo peitoral). (B) Tratamento do sangue parasitado com Borrelia anserina na tentativa de inativação com luz visível associada à fatlocianina de cloro-alumínio. O aparelho de irradiação de luz LED, não pode ser exposto devido a processo de registro de patente. Fonte: Lopes, 2015.
3.6. Momentos das avaliações laboratoriais
Na primeira etapa foram realizadas colheitas de sangue total das aves, durante o período de 45 dias de experimento, a cada cinco dias foram realizadas análises laboratoriais, totalizando dez momentos diferentes de análise. Os momentos de análises laboratoriais podem ser observados no Quadro 2.
pré-inoculação de meio de cultivo BSK, pois neste momento não havia nenhum tipo de adicional no meio. Os momentos de análise podem ser conferidos no Quadro 3.
QUADRO 2. Momentos de análises laboratoriais da primeira etapa experimental (in vivo).
Momento Abreviação Avaliação clínica e laboratorial das aves Momento 0 M0 Pré inoculação – Dia zero
Momento 1 M1 5 dias após da inoculação
Momento 2 M2 10 dias após da inoculação
Momento 3 M3 15 dias após da inoculação
Momento 4 M4 20 dias após da inoculação
Momento 5 M5 25 dias após da inoculação
Momento 6 M6 30 dias após da inoculação
Momento 7 M7 35 dias após da inoculação
Momento 8 M8 40 dias após da inoculação
Momento 9 M9 45 dias após da inoculação
QUADRO 3. Momentos de análises laboratoriais da segunda etapa experimental (in vitro).
Momento Abreviação Avaliação laboratorial do meio de cultivo
Momento 1 M1 5 dias após da inoculação
Momento 2 M2 10 dias após da inoculação
Momento 3 M3 15 dias após da inoculação
Momento 4 M4 20 dias após da inoculação
Momento 5 M5 25 dias após da inoculação
Momento 6 M6 30 dias após da inoculação
Momento 7 M7 35 dias após da inoculação
Momento 8 M8 40 dias após da inoculação
3.7. Avaliação laboratorial
Como intervalos de referência fisiológicos, foram utilizados os dados do Sistema Internacional de Informação das Espécies (Conventional U.S.A. Units –Outubro de 1999), Gallus Gallus, calculado para ambos os sexos e todas as idades combinadas, são valores de referência de amostras apresentadas por 11 instituições, e Campbell in Thrall et al., (2012).
TABELA 1. Valores de referência de Gallus Gallus fisiológicos para volume globular (VG em %), proteína plasmática total (PPT em g/dL) e alanina aminotrasferase (ALT em UI/L) segundo Campbell in Thrall et al., (2012). triglicérideos (mg/dL), Colesterol (mg/dL), Fosfatase Alcalina (ALP em UI/L), aspartato aminotransferase (AST em UI/L) segundo o Sistema Internacional de Informação das Espécies (Conventional U.S.A. Units –Outubro de 1999).
VG
(%) (g/dL) PPT Triglicérideos (mg/dL) Colesterol (mg/dL) (UI/L) ALP (UI/L) AST (UI/L) ALT 23 A 55 2,5 a 4,5 57 a 2207 76 a 296 107 a 5030 125 a 299 19 A 50
3.7.1. Etapas experimentais
Na primeira etapa experimental (in vivo), foram analisadas em dez momentos, a cada cinco dias, foram realizados: exame clínico, MCE, qPCR, IgY, VG, PPT e bioquímica sérica.
Na segunda etapa experimental (in vitro), as amostras de meio de cultivo obtidas foram analisadas em nove momentos, a cada cinco dias, foram realizadas as análises de MCE e qPCR.
3.7.1.1. Exame clínico
realizada a pesagem por meio de balança digital e aferição de temperatura utilizando termômetro clínico de mercúrio seguindo referência semiológica descrita por Werther in Feitosa (2008).
3.7.1.2. Avaliação da espiroquetemia por meio de Microscopia de Campo Escuro (MCE)
A avaliação da concentração de espiroquetas in vivo, foi realizada em câmara de Neubauer em microscópio de campo escuro (Nikon E200®), com objetiva de 20x. Utilizando para contagem, quando necessário, a diluição do soro parasitado em solução salina de PS, na concentração de 1:10, a espiroquetemia foi avaliada tambeém quanto a sua motilidade seguindo protocolo semelhante ao de Dhawedkar e Dhanesar (1983), sendo classificada em cruzes, onde quatro cruzes representam motilidade intensa, três cruzes representam motilidade vigorosa, duas cruzes representam motilidade ativa, uma cruz representa pouco ativa e o número zero representa ausência de motilidade.
3.7.1.3. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR)
O DNA das amostras de sangue das galinhas foi extraído de 10 μL do sangue total, utilizando-se o Illustra Blood Mini Spin Kit. O DNA das amostras de meio de cultura foi extraído de 10μL do meio BSK, posterirormente foi centrifugado a 10.000rpm/min, durante 10 minutos e o sobrenadante foi retirado, o conteúdo foi ressuspendido em 100μL de H2O nuclease free e
100μL de resina Chelex 110® (BioRad), novamente o sobrenadante foi retirado e acondionado em um tubo ependorff. Controles negativos, água nuclease free, foram adicionados a cada placa teste.
(CGTCAGCTATTAATGCTTCAAGAAA) e B. anserina fla gene 127-151 (CGTCAGCTATTAATGCTTCAAGAAA).
As reações de qPCR foram realizadas em placas contendo 96 poços de 0,5mL, onde foi adicionado 18μL da solução de trabalho, composta por 1.000μL de goTaq® qPCR Master Mix Promega, 60μL de cada primer e 680μL água nuclease free, e 2μL de amostra de DNA extraído, totalizando o volume final de 20μL.
O DNA extraído das amostras de sangue e do meio de cultura BSK, foi amplificado por meio de PCR em Tempo Real para a determinação da carga parasitária, utilizando o equipamento 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems).
A reação consistiu em 2uL de amostra de DNA total, 10uL de Go Taq SYBR Master Mix (Promega), 6pmol de cada primer e água nucleasse-free para completar 20uL. Os ciclos de tempo e temperatura consistiram em uma desnaturação inicial por 5 minutos a 95ºC, seguida de 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, e a curva de dissociação (15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, 30 segundos a 95ºC e 15 segundos a 60ºC), para cada placa testada, foi adicionado um controle negativo (água nuclease free).
Para a realização da curva-padrão, foram utilizadas amostras de DNA extraídas de sangue total de galinhas positivas para Borrelia anserina, nas concentrações decrescentes de 440000, 44000, 4400, 440, 44 espiroquetas/μL, todas analisadas em duplicata. Os dados foram coletados e analisados com o auxílio do Programa 7550, Software v.2.0.6. Para todas as análises considerou-se slope de -3,724 a - 3,717, R2 de 0,998, intercept de 40,439 e eficiência de 85,563%, para as análises dos resultados.
3.7.1.4. Ensaio de Imunoadsorção Enzimático indireto (ELISA indireto)
Os soros obtidos das poedeiras foram submetidos à pesquisa de anticorpos da classe de Imunoglobulina Y (IgY) contra antígeno bruto de B. anserina utilizando o Ensaio de Imunoadsorção Enzimático (ELISA) indireto padronizado por Cordeiro et al. (2012).
oriunda de Pedro Leopoldo - MG, diluído a 5 μg/mL em tampão carbonato pH 9,6 e incubadas durante 12 horas em câmara úmida à 4ºC. Após a sensibilização, as placas foram lavadas três vezes com Tampão salino fosfato (PBS Tween 20 0,05% pH 7,4); posteriormente bloqueadas com 200 μL de Leite em pó 6% diluído em PBST e incubadas em câmara úmida por 90 minutos, em estufa bacteriológica a 37º Celsius. Em seguida realizou-se novamente três lavagens das placas com PBST.
Foram utilizadas 10 amostras negativas de animais previamente testados e um controle positivo em duplicata de um animal inoculado com antígeno inativado de B. anserina. Os 10 controles negativos, o controle positivo e os soros testes foram diluídos na concentração de 1:800 em PBST e dispostos 100 μL nas placas, que foram incubadas à 37º Celsius por 90 minutos e, posteriormente lavadas como na etapa anterior. Então, foi disposto 100 μL do conjugado IgG de coelho (KPL®) na diluição de 1:4000 em PBST com mais 90 minutos de incubação nas condições citadas anteriormente, seguindo novamente as lavagens das placas. Após esta última incubação foram empregados 100 μL do substrato revelador Paranitrofenilfosfato de Sódio (PNPP - SIGMA Chemical) diluído em Tampão de Dietanolamina pH 9,8 na concentração de 1 mg/mL. As leitura das placas foram realizadas em espectrofotômetro para microplacas de 96 poços, durante 15 minutos (Termo Scientific® Uniscience Multiskan FC), sob comprimento de onda de 405 nm.
A linha de corte (cut off) foi obtida e estimada pelo valor das médias das densidades ópticas dos controles negativos multiplicado por 2,5. A atividade imunológica dos soros testes foi calculada para determinação das amostras positivas em cada diluição, considerando o soro controle positivo e os negativos, como a equação a seguir (MACHADO et al., 1997):
Valor real = (Densidade óptica amostra – média de negativos) (Média de positivos – média de negativos)
obtiveram um resultado acima de 100 foram consideradas positivas (CORDEIRO et al. 2012).
3.7.1.5. Volume Globular (VG) e Proteína Plasmática Total (PPT)
A determinação da Concentração do Volume Globular (VG) foi feita seguindo o método de microhematócrito, conforme descrito por Weiss e Wardrop (2010). A determinação da concentração de Proteína Plasmática Total (PPT) foi realizada pela técnica de refratometria, segundo Feldman (2000).
3.7.1.6. Bioquímica sérica
As amostras de sangue foram centrifugadas a 5.000 rpm por 10 minutos imediatamente após a colheita; em seguida o soro foi congelado para posterior análise. A concentração de colesterol, triglicerídios, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase foram obtidas pela dosagem no analisador bioquímico com kit da BioClin®, no aparelho Cobas Mira Plus da Roche®.
3.8. Análise Estatística
Para análise da espiroquetemia do meio de cultivo foi realizado o Teste de Kruskal-Wallis e quando significativo (P<0,05) foi feito o Teste de Tukey para comparação das medianas (P<0,05), o mesmo protocolo foi seguido para realização da espiroquetemia dos animais, porém foi aplicado Teste de Friedman para comparação dos momentos e quando significativo (P<0,05) foi feito o Teste de Tukey para comparação das medianas (P<0,05).
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
FIGURA 4. (A e B) Pesagem e aferição de temperatura das aves poedeiras. (C) Microscópio de campo escuro utilizado para contagem de espiroquetas (D) Contagem de espiroquetas em momento de pico com concentração de 0,44x106 espiroquetas/mL, observação do campo em Câmara de Neubauer em
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Primeira etapa experimental (in vivo)
4.1.1. Avaliação da espiroquetemia por meio de Microscopia de Campo Escuro (MCE)
Médias e desvios-padrão dos valores da espiroquetemia (x106/mL) de
aves poedeiras, em dez momentos de análise, está descrito na tabela 2 e a avaliação quantitativa da motilidade das espiroquetas (%) está descrito na tabela 3.
No grupo controle (G1), aves saudáveis, não foram observados sinais clínicos da enfermidade e a espiroquetemia foi zero, para todos os momentos. O grupo doença (G2), apresentou espiroquetemia com valores médios 3,5x106 espiroquetas/mL, com 16,66% de motilidade ativa (++), 50% de motilidade vigorosa (+++) e 33,34% sem motilidade no momento 1, cinco dias após inoculação de soro parasitado com B. anserina. Ocorreu a morte de cinco galinhas, índice de mortalidade de 83,33% entre os momentos 1 e 2, período coincidente com o pico de espiroquetemia, o que encontra-se de acordo com as observações de Lisbôa et al., (2006). O grupo tratado (G3), aves que receberam soro parasitado com B. anserina irradiado com luz visível associado à ftalocianina de cloro-alumínio, obteve valores médios de espiroquetemia iguais a zero, no entanto, uma ave no momento 1, apresentou espiroquetemia 0,005x06 espiroquetas/mL, sendo que destas 16,66% apresentavam motilidade
vigorosa (+++) e o restante de 83,34% não apresentou motilidade, e ainda nesta ave não foram observados sinais clínicos da borreliose. As aves deste grupo apresentaram 50% de mortalidade. sendo o grupo que apresentou o menor índice de mortalidade, com perda de uma ave no momento 2 e duas no momento 3.
morte de uma ave no momento 1, duas no momento 2, uma no momento 5 e uma no momento 9. Aos 45 dias, o grupo luz visível apenas 1 galinha permaneceu viva. O grupo nanoemulsão (G5), aos 5 dias após inoculação, apresentou valores médios de espiroquetemia de 2,5x106 espiroquetas/mL,
com motilidade vigorosa (+++) e morte de uma galinha. No momento 2, morreram 4 aves e uma aos 45 dias. Os valores médios de espiroquetemia do grupo fatalocianina (G6), no momento 1, foi de 4,8x106 espiroquetas/mL, com
motilidade vigorosa (+++) de 100%, no momento 2 a média foi de 2,6x106
espiroquetas/mL, com motilidade vigorosa (+++) de 16,66% dos indivíduos, neste momento houve morte de quatro aves e no momento seguinte morte de 2 aves.
(A) (B) .
(C)
4.1.2. Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa (qPCR)
Os valores médios e desvios-padrão da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) (x105) de aves poedeiras, em dez momentos de análise,
está descrito na tabela 4.
No G1, não houve amplificação do gene de B. anserina. O G2 amplificou com maior valor aos cinco dias, 5,06x105 espiroquetas/mL, apresentou alta
taxa de mortalidade (83,33%) após este momento, sendo que a ave que sobreviveu apresentou sinais clínicos característicos da enfermidade, como prostração, penas arrepiadas, sonolência, anorexia e diarreia (Figura 17), porém com reestabelecimento clínico no momento 6, com aproximadamente 30 dias após inoculação da B. anserina, retornando a se alimentar e com fezes normais.
(A) (B) (C)
FIGURA 6. (A) Galinha poedeira dos grupo controle com crista pigmentada de coloração avermelhada, ave clinicamente saudável. (B) Galinha poedeira do grupo doença com crista de colocação pálida, caracterizando sinal clínico de anemia. (C) Galinha poedeira do grupo tratado que após receber soro parasitado tratado com luz visível associada a ftalocianina de cloro-alumínio, retomou a capacidade de ovipostura. Fonte: Lopes, 2015.
O G3 obteve os menores valores médios de amplificação, cinco dias após a inoculação apresentou 1,12x105 e aos dez dias 2,26x105
quantificação de 4,97x105 espiroquetas/mL, no momento 1 e 2,33x105
espiroquetas/mL no momento 3. Houve amplificação para o G5, nos momentos 1 com 5,01x105 espiroquetas/mL e no momento 8 com 2,24x105
espiroquetas/mL. O G6 obteve quantificação de 4,84x105 espiroquetas/mL no
momento 1 e 2,35x105 espiroquetas/mL no momento 2, com maior taxa de
mortalidade, atingindo 100% no momento 5. As aves do G7 não amplificaram o gene da bactéria B. anserina.
4.1.3. Ensaio de Imunoadsorção Enzimático indireto (ELISA indireto) para determinação de IgY
Os valores médios e desvios-padrão do ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (ELISA indireto) padronizado (CDO*100/CUT off) de aves poedeiras, em dez momentos de análise, estão descritos na tabela 5 e figura 7.
Foi possível observar a concentração média de IgY no G1 entre 17,5 e 46,7 g/dL. Notou-se aumento significativo dos níveis séricos de IgY no G2 iniciando com seis galinhas e valores médios de 21,8 g/dL, havendo alta taxa de mortalidade entre cinco e dez dias após inoculação da B. anserina, período que coincide com o pico de espiroquetemia (Ataliba et al., 2007 e Lisbôa et al., 2008), e a partir do momento 2 foi avaliado a resposta na produção de IgY de um indivíduo, atingindo ao final dos 45 dias o valor médio de 311,0 g/dL. O G3 no momento 0, apresentou o menor valor médio inicial de 4,0 g/dL e no momento 9 o valor médio de 206,9 g/dL, demonstrando um comportamento crescente. Os maiores valores médios de IgY, foram observados no G4 com concentração de 335,3 g/dL no momento 9 e no G5 com concentração de 329,0 g/dL no momento 8. O G7 apresentou comportamento semelhante ao grupo controle.
FIGURA 7. Valores médios do ensaio de imunoadsorção enzimático indireto (ELISA indireto) padronizado (CDO*100/CUT off) de galinhas poedeiras, que receberam soro parasitado com Borrelia anserina, em dez momentos de análise, com intervalo de cinco dias. Grupo 1 (Controle), grupo 2 (Doença), grupo 3 (Tratado) Grupo 4 (Luz visível), grupo 5 (Nanoemulsão), grupo 6 (Ftalocianina) e grupo 7 (Imunossupressão). Botucatu -SP, 2015.
4.1.4. Volume Globular (VG)
As médias e desvios-padrão de volume globular (VG) (%) de aves poedeiras, em dez momentos de análise, estão descritos na tabela 6 e figura 8. O G1 manteve-se dentro do intervalo de referência fisiológico segundo Thrall et al., (2012). O G2 apresentou redução significativa no momento 1 e 3, com valores médios VG = 15% e momentos 4 e 5, com valores médios VG = 20%, a partir do momento 3 apenas um indivíduo foi avaliado. Como o período de patência pode ser caracterizado por redução dos valores de VG, o animal manteve por um período mais longo o VG reduzido, apresentando valores maiores VG = 33% aos 30 dias. Segundo Lisbôaet al., (2008) e Cepeda (2015) o período de patêncai da borreliose é de 5 a 6 dias. O G3 apresentou valores médios de VG abaixo do fisiológico, entre os momentos 2 e 5.
