UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
JUCELIO LAGO SATURNO
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COLUNAS CAPILARES MONOLÍTICAS BASEADAS EM SÍLICA HÍBRIDA FUNCIONALIZADA COM
POLI(METILOCTILSILOXANO)
CAMPINAS 2019
SÍNTESE E CARACTERIZAÇÃO DE COLUNAS CAPILARES MONOLÍTICAS BASEADAS EM SÍLICA HÍBRIDA FUNCIONALIZADA COM
POLI(METILOCTILSILOXANO)
Orientadora: Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO JUCELIO LAGO SATURNO E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. CARLA BEATRIZ GRESPAN BOTTOLI.
CAMPINAS 2019
Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Química na área de Química Analítica.
Profa. Dra. Carla Beatriz Grespan Bottoli (Orientadora)
Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Junior (IQ – Unicamp)
Prof. Dr. Anízio Marcio de Faria (UFU - Pontal)
A Ata da Defesa assinada pelos membros da Comissão Examinadora, consta no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Este exemplar corresponde à versão final da Dissertação de Mestrado defendida pelo aluno JUCELIO LAGO SATURNO, aprovada pela Comissão Julgadora em 15 de Março de 2019.
Agradeço primeiramente à profa. Carla Beatriz Grespan Bottoli por ter me dado a oportunidade de ser seu aluno. Obrigado pelos conselhos, compartilhar sua experiência e sempre estar presente.
Também agradeço a todos meus colegas de grupo, Fabiane Pires, Igor Miranda, Marcella, Letícia Shiroma, Lucilia Vilela, Luana Macedo, Luciana, Hery, Leandro, Camila, Lucas, Gabriela Almeida, Karen e Licarion pelo companheirismo.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código de Financiamento 001.
Os suportes cromatográficos monolíticos diferenciam-se dos suportes particulados, principalmente, por possuírem maior permeabilidade. Além disso, os procedimentos de síntese destes materiais são convenientes para o preparo de suportes cromatográficos capilares, devido a serem sintetizados a partir de uma solução líquida, o que permite que a estrutura seja formada dentro do capilar. Neste trabalho, suportes cromatográficos monolíticos capilares baseados em sílica foram preparados através do processo sol-gel e funcionalizados com o poli(metiloctilsiloxano) (PMOS), através de tratamento térmico. Estas colunas foram caracterizadas cromatograficamente, no modo fase reversa, com relação à eficiência, fator de retenção, seletividade metilênica e capacidade de ligação de hidrogênio (αC/P). As
condições de imobilização do polissiloxano foram exploradas utilizando um planejamento fatorial 23, através do qual foi observado aumento da retentividade das
colunas com o aumento da concentração de PMOS, tempo e temperatura de imobilização térmica. Para a resposta eficiência, a concentração de PMOS e principalmente o tempo tiveram efeito positivo. Além disso, dois efeitos de interação envolvendo a temperatura foram significativos e negativos, tempo x temperatura e concentração de PMOS x tempo x temperatura. Os valores destes dois feitos de interação foram negativos devido à diminuição na eficiência que ocorreu para as fases estacionárias que empregaram tempo e temperatura simultaneamente nos níveis mais altos. As caracterizações das fases estacionárias quanto às seletividades foram realizadas para as colunas funcionalizadas com PMOS e com a coluna monolítica de fase C18 quimicamente ligada. As seletividades metilênicas foram bastante similares para todas as colunas, já a capacidade de ligação de hidrogênio teve grande influência das condições de imobilização do PMOS. Foram observados valores expressivamente baixos de αC/P para as colunas funcionalizadas com PMOS,
indicando um recobrimento do suporte satisfatório. Além destas colunas apresentarem maior seletividade entre a cafeína e o fenol do que a coluna de fase quimicamente ligada, estas colunas também apresentaram maior eficiência. Nos testes de estabilidade, em condições brandas, as colunas funcionalizadas com PMOS apresentaram oscilação e progressiva redução no fator de retenção. Apesar desta perda de retentividade, no teste realizado pelo período mais longo, por 17 dias, foi observado que a coluna funcionalizada com PMOS continuou capaz de resolver a mistura teste de alquilbenzenos até o fim deste período. As condições de preparo do suporte monolítico também foram exploradas, visando obtenção de uma nova estrutura monolítica com menores domínios e mais homogênea. Neste estudo, duas variáveis foram exploradas, a temperatura de gelificação e a proporção de MTMS. Com o aumento da temperatura foi observada uma expressiva redução no tamanho dos macroporos, já com o aumento da proporção de MTMS, foi obtida uma estrutura formada por esqueletos cilíndricos e com menor variação no tamanho dos macroporos.
Monolithic chromatographic supports differ from the particulate packings mainly due to their higher permeability. In addition, the synthetic procedures for these materials are convenient for the preparation of capillary chromatographic columns, since they can be synthesized from a liquid solution, which allows the structure to be formed within the capillary. In this work, silica-based monolithic capillary chromatographic columns were prepared through the sol-gel process and functionalized with poly(methyloctylsiloxane) (PMOS) by thermal treatment. These columns were characterized chromatographically, in the reversed-phase mode, with respect to efficiency, retention factor, methylene selectivity and hydrogen bonding capacity (αC/P). The polysiloxane immobilization conditions were studied using a 23
factorial design, through which an increase in column retentivity with the increase of PMOS concentration, time and temperature was observed. For the efficiency response, the concentration of PMOS and especially the time had a positive effect. In addition, two interaction effects involving temperature were significant and negative, time x temperature and PMOS concentration x time x temperature. The negative values of these effects are due to the decrease of efficiency for stationary phases that employed temperature and time simultaneously at the higher level. The characterization of the columns as selectivities were performed for PMOS functionalized columns and for a C18 chemically bonded phase monolithic column. For the methylene selectivity, all the columns presented a similar value. However, a great influence of the PMOS immobilization conditions was observed for the hydrogen bonding capacity. Expressively low αC/P values were observed for PMOS columns, indicating a
satisfactory support coverage. Besides the higher selectivity between caffeine and phenol than seen with the chemically bonded phase column, they also presented higher efficiency. Regarding to columns stability, under mild conditions, PMOS functionalized columns showed oscillation and progressive reduction of the retention factor. Although retentivity loss was seen in the longest stability evaluation, which lasted 17 days, it was observed that the PMOS functionalized column continued to be able to resolve the alkylbenzenes test mixture until the end of the evaluation. The monolithic support preparation conditions were also studied, aiming at obtaining a new monolithic structure with smaller domains and more homogeneous structure. In this study, two variables were explored, the gelation temperature and the MTMS proportion. The increase in gelation temperature resulted in a significant reduction of the macropore sizes, while by increasing the MTMS proportion a structure formed by cylindrical skeletons and with lower macropore size variation was obtained.
Figura 1- a) Curva de Van Deemter. b) Contribuições de cada termo da equação de
van Deemter à altura de prato de acordo com a velocidade linear da fase móvel. ... 21
Figura 2 – Ilustração de um cromatograma: tM, tempo de retenção do soluto não retido; tR, tempo de retenção do soluto retido e W, largura do pico na linha de base. ... 22
Figura 3 - Medidas no pico cromatográfico utilizadas para o cálculo do fator de assimetria (As) e fator de alargamento (TF). Reproduzido de [6]. ... 25
Figura 4 – Componentes típicos de um cromatógrafo a líquido capilar. ... 26
Figura 5 – Coluna capilar recheada com partículas esféricas. ... 29
Figura 6 - Coluna tubular aberta. ... 30
Figura 7- Estrutura monolítica. Adaptado de [18] com permissão da Elsevier... 31
Figura 8 – Diagrama pseudo-ternário da influência da quantidade de PEG, silica e solvente na formação dos macroporos da estrutura monolítica. Adaptado de [22] com permissão da American Chemical Society. ... 34
Figura 9 - Influência da temperatura na formação de mesoporos utilizando uma solução de NH4OH 1 mol L-1 por 3 dias. Adaptado de [18] com permissão da Elsevier. ... 36
Figura 10– Influência do diâmetro de poro na pressão capilar gerada por água em um monolíto de sílica. Adaptado de [23] com permissão da Springer Nature. ... 37
Figura 11 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura de suporte monolítico que se separou da parede interna do capilar devido ao encolhimento. Imagem produzida pelo próprio autor. ... 38
Figura 12 – Estruturas dos trialcóxissilanos OTMS, VTMS e FTMS. ... 39
Figura 13 – Estrutura geral de um organossilano utilizado para funcionalização do tipo fase ligada. R1 = grupo reativo e R = grupo não reativo. ... 42
Figura 14 – Estrutura do octadeciltrimetóxissilano. ... 43
Figura 15 – Diferentes formas que o octadeciltrimetóxissilano podem se ligar com a sílica. ... 43
de [35]. ... 46 Figura 18 – Eluição de cafeína e fenol em fase estacionária de fase ligada C18 a) não capeada e b) capeada. Condições cromatográficas: Volume de injeção 20 µL, fase móvel metanol-água 75:25 (v/v), vazão 1 mL min-1 e detecção em 280 nm. Adaptado
de [48] com permissão da Elsevier. ... 50 Figura 19 – Interação da cafeína e fenol com uma fase estacionária quimicamente ligada. Imagem produzida pelo próprio autor. ... 50 Figura 20 – Efeito da densidade da fase ligada no fator de retenção da cafeína e do fenol. Adaptado de [49] com permissão da Elsevier. ... 52 Figura 21 – Princípio de funcionamento um microscópio eletrônico de varredura. ... 54 Figura 22 – Instrumentação utilizada para os experimentos de imobilização térmica do PMOS no suporte capilar... 61 Figura 23– Espectro de absorção no infravermelho do PMOS. ... 67 Figura 24 - Curva da análise termogravimétrica do PMOS. Aquecimento de 50 oC a
100 oC com taxa de 10 oC min -1 em atmosfera inerte. ... 68
Figura 25 - Micrografia da seção transversal suporte monolítico de sílica. A barra vermelha corresponde à escala de 100 µm. Imagem obtida com aproximação de 500x. ... 69 Figura 26 – Variação da pressão com a velocidade da fase móvel acetonitrila-água 40:60 (v/v) a 20 oC. Dimensões da coluna monolítica: (170 x 0,2) mm. Coluna
comercial: (150 x 0,3) mm recheada com partículas porosas de 5 µm. ... 70 Figura 27 – Cromatogramas da eluição da mistura de alquibenzenos em uma coluna monolítica a) sem PMOS e b) com PMOS (Coluna 1). Identificação dos picos 1) uracila, 2) benzeno, 3) tolueno, 4) etilbenzeno, 5) propilbenzeno, 6) butilbenzeno e 7) pentilbenzeno. Condições cromatográficas como descrito na seção 3.7.1. ... 72 Figura 28 – Variação de ln(k) do pentilbenzeno com relação à porcentagem de acetonitrila na fase móvel. ... 73 Figura 29 – Valores dos efeitos do planejamento fatorial 23 para a resposta fator de
retenção (k). As barras verticais representam o intervalo de confiança (95%). ... 76 Figura 30 – Cromatogramas das colunas: a) Coluna 4. b) Couna 8. Eluição da mistura de alquilbenzenos. Fase móvel: acetonitrila:água 40:60 (v/v), vazão: 1,6 µL min-1,
Figura 31 - Valores dos efeitos do planejamento fatorial 23 para a resposta Eficiência
(N m-1). As barras verticais representam o intervalo de confiança (95%). ... 78
Figura 32 – Comparação dos cromatogramas de Colunas 7 (réplica), 11 e 12. Eluição a 1,6 uL min-1 em acetonitrila-água 40:60 (v/v). Parâmetros cromatográficos: k (fator
de retenção) e N m-1 (pratos por metro) calculados para o composto mais retido
(pentilbenzeno). Identificação dos picos 1) uracila, 2) benzeno, 3) tolueno, 4) etilbenzeno, 5) propilbenzeno, 6) butilbenzeno e 7) pentilbenzeno. ... 80 Figura 33 - Imagens de SEM de dois suportes monolíticos preparados pelo mesmo procedimento, mas apresentando características diferentes: a) Coluna 7 - diâmetro de esqueleto: 3,4 a 5,2 µm, macroporos: 6,6 a 20 µm. b) Coluna 7 (réplica) - diâmetro de esqueleto: 1,4 a 2,8 µm, macroporos: 5,0 a 22 µm. A barra vermelha corresponde à escala de 100 µm. ... 81 Figura 34 - Comparação entre os valores de αCH2, αC/F e k. ... 83
Figura 35 – Cromatogramas das eluições de 1) uracila, 2) cafeína e 3) fenol. Testes referentes à Figura 34. Condições cromatográficas: fase móvel acetonitrila:água 85:15, vazão 2 uL min-1, detecção em 215 nm. a) Coluna 7 (réplica 2), b) Coluna 8 (réplica)
e c) Coluna 13 (fase ligada C18). ... 85 Figura 36 - Estabilidade das colunas com relação ao fator de retenção do pentilbenzeno. Teste realizado a 25 oC e fase móvel acetonitrila:água 40:60 (v/v).
Variação calculada com relação ao valor inicial. ... 86 Figura 37 - Estabilidade das colunas com relação à eficiência para o pentilbenzeno. Teste realizado a 25 oC e fase móvel acetonitrila:água 40:60 (v/v). Variação calculada
com relação ao valor inicial. ... 87 Figura 38 - Estabilidade das colunas com relação ao fator de retenção do butilbenzeno. Teste realizado a 25 oC e fase móvel acetonitrila:água 40:60 (v/v). Variação calculada
com relação ao valor inicial. ... 88 Figura 39– Cromatogramas obtidos no início e no último teste de estabilidade de uma réplica da Coluna 7. Eluição da mistura teste de alquilbenzenos. Vazão 1,6 uL min-1,
fase móvel acetonitrila:água 40:60 (v/v). Parâmetros cromatográficos k (fator de retenção) e N m-1 (Pratos por metro) calculados para o composto mais retido
(pentilbenzeno). ... 89 Figura 40 – Curvas de Van Deemter das colunas funcionalizadas a diferentes temperaturas. A altura de prato foi calculada para o pentilbenzeno em acetonitrila-água 50:50 (v/v). ... 91
barra vermelha corresponde à escala de 100 µm. ... 92 Figura 42 – Imagens de SEM de suportes monolíticos preparados como descrito na seção 3.5.1, variando apenas a porcentagem de MTMS na quantidade total de precursor utilizada. a) 10% de MTMS, Macroporos: 5,1 – 19,3 µm. Diâmetro de Esqueleto 3,6 - 5,2 µm. b) 15% de MTMS Macroporos: 3,1 – 19,2 µm. Diâmetro de Esqueleto 3,1 - 7,7 µm e c) 20% de MTMS Macroporos: 4,2 – 8,6 µm. Diâmetro de Esqueleto 1,7 - 3,0 µm. ... 93 Figura 43 - Imagens de SEM da Coluna 7 - a) e b), e das colunas preparadas reproduzindo procedimentos da literatura - Coluna M1: c) e d) e Coluna M2: e) e f). ... 95
Tabela 1 – Classificação das técnicas de cromatografia líquida de acordo com o .... 26 Tabela 2 – Fatores e níveis do planejamento fatorial 23. ... 62
Tabela 3 – Condições do experimento realizado em triplicata para o cálculo do erro experimental. ... 63 Tabela 4 - Composição da mistura sol e temperatura de gelificação das colunas preparadas reproduzindo procedimentos da literatura. ... 94
𝒖 - Velocidade linear da fase móvel
𝒖𝟎 – Velocidade linear superficial da fase móvel
A – Termo da equação de van Deemter referente aos múltiplos caminhos AIBN – 2,2 - azobisisobutironila
As – Fator de assimetria
B - Termo da equação de van Deemter referente à difusão longitudinal
C - Termo da equação de van Deemter referente à resistência à transferência de massa
C18 – Grupo octadecil
CLC – Cromatografia líquida capilar (do inglês, capillary liquid chromatography) FTMS – Feniltrimetóxissilano
H - Altura de prato
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência, (do inglês, high performance liquid chromatography)
IC - Intervalo de confiança k – Fator de retenção K - Permeabilidade
L – Comprimento da coluna
LC – Cromatografia líquida (do inglês, liquid chromatography)
SEM – Microscopia eletrônica de varredura (do inglês, scanning electron microscopy) MTMS – Metiltrimetóxissilano
N – Número de pratos OTMS – Octiltrimetóxissilano PBD – Polibutadieno
PMODS – Poli(metiloctadecilsilano) PMOS – Poli(metiloctilsiloxano) Rs - Resolução cromatográfica s – Desvio padrão
s2 – Variância
TF – Fator de alargamento (do inglês, tailing fator) TMOS – Tetrametilortossilano
VTMS – Viniltrimetóxissilano α – Fator de separação
1. INTRODUÇÃO ... 18
1.1. Cromatografia líquida - conceitos fundamentais ... 18
1.1.1. Teoria dos Pratos ... 18
1.1.2. Teoria da Velocidade ... 19
1.1.3. O modo cromatográfico de fase reversa ... 21
1.2. Parâmetros cromatográficos ... 22
1.2.1. Fator de retenção ... 22
1.2.2. Fator de separação (seletividade) ... 23
1.2.3. Número de pratos (eficiência) ... 23
1.2.4. Resolução ... 24
1.2.5. Simetria do pico cromatográfico ... 24
1.3. Cromatografia líquida capilar ... 25
1.4. Fases estacionárias para cromatografia líquida capilar ... 28
1.4.1. Colunas recheadas ... 29
1.4.2. Colunas tubulares abertas ... 30
1.4.3. Colunas capilares monolíticas ... 31
1.4.3.1. Colunas capilares monolíticas orgânicas ... 32
1.4.3.2. Colunas capilares monolíticas inorgânicas ... 32
1.4.3.3. Colunas capilares monolíticas híbridas ... 39
1.5. Funcionalização de suportes cromatográficos baseados em sílica para utilização no modo de fase reversa ... 41
1.5.1. Funcionalização do tipo fase ligada (silanização) ... 41
1.5.2. Funcionalização de sílica porosa por imobilização de polissiloxanos ... 43
1.6. Caracterização de fases estacionárias através da seletividade ... 48
1.6.1. Seletividade metilênica (αCH2) ... 48
1.6.2. Capacidade de ligação de hidrogênio (αC/F) ... 49
1.7. Caracterizações de suportes monolíticos capilares ... 52
2. OBJETIVOS ... 57
3. EXPERIMENTAL ... 58
3.1. Materiais ... 58
3.2. Equipamentos ... 58
3.3. Análises físico-químicas do PMOS ... 59
3.3.1. Espectroscopia de Absorção no Infravermelho do PMOS ... 59
3.3.2. Análise Termogravimétrica do PMOS ... 59
3.4. Pré-tratamento do capilar ... 59
3.5. Síntese das fases estacionárias ... 59
3.5.1. Preparo do suporte monolítico ... 59
3.5.2. Imobilização térmica do PMOS no suporte monolítico ... 60
3.5.3. Planejamento fatorial para as condições de imobilização do PMOS ... 61
3.5.3.1. Cálculo dos efeitos ... 62
3.5.3.2. Erro experimental (s) ... 62
3.5.3.3. Variância dos efeitos (s2(efeito))... 63
3.5.3.4. Intervalo de confiança (IC) a 95% para os efeitos ... 63
3.5.4. Preparo da coluna monolítica de fase ligada C18 ... 64
3.6. Caracterização do suporte monolítico... 64
3.6.1. Determinação da permeabilidade do suporte ... 64
3.6.2. Caracterização microscópica ... 64
3.7. Avaliação cromatográfica das fases estacionárias ... 65
3.7.1. Condições cromatográficas para o planejamento fatorial 23 ... 65
3.7.2. Caracterização das fases estacionárias pelo fator de separação (seletividade) ... 65
3.7.2.1. Seletividade metilênica (αCH2) ... 65
3.7.2.2. Capacidade de ligação de hidrogênio (αC/F). ... 66
3.8. Testes de estabilidade das fases estacionárias ... 66
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 67
4.1. Caracterização do PMOS ... 67
4.2. Caracterização do suporte monolítico... 68
4.2.1. Microscopia eletrônica de varredura (SEM) ... 68
4.3.1. Planejamento fatorial 23 ... 73
4.3.2. Efeito de tempos mais longos de imobilização térmica ... 79
4.3.3. Réplicas das colunas do planejamento fatorial preparadas com tempo de imobilização térmica de 24 h ... 81
4.4. Caracterização cromatográfica pelo fator de separação (seletividade) ... 82
4.4.1. Seletividade metilênica ... 83
4.4.2. Capacidade de ligação de hidrogênio ... 84
4.5. Estabilidade das colunas ... 86
4.5.1. Estabilidade das colunas funcionalizadas com PMOS... 86
4.5.2. Comparação das estabilidades da coluna monolítica funcionalizada com PMOS com uma coluna monolítica de fase ligada C18 ... 87
4.6. Curvas de van Deemter ... 90
4.7. Estudo das condições de preparo do suporte monolítico... 91
4.7.1. Temperatura de gelificação ... 91
4.7.2. Proporção de MTMS ... 92
4.7.3. Sínteses descritas na literatura ... 93
5. CONCLUSÕES ... 97
6. SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS... 98
1. INTRODUÇÃO
1.1. Cromatografia líquida - conceitos fundamentais
A cromatografia líquida é uma técnica de separação que utiliza uma fase líquida, chamada fase móvel, para eluir uma mistura que entra em contato com outra fase, chamada fase estacionária. De acordo com as diferentes solubilidades dos componentes da mistura entre a fase estacionária e a fase móvel, ocorre a separação, uma vez que os componentes da mistura que possuem maior solubilidade na fase estacionária demoram mais para eluir [1].
Porém, existem muitos outros fatores, além das diferentes solubilidades dos solutos entre fase móvel e fase estacionária, que interferem em uma separação cromatográfica. A maioria destes fatores são fenômenos físico-químicos, os quais dispersam a banda de amostra que permeia a coluna cromatográfica. Os principais modelos teóricos que visam descrever estes fenômenos são a Teoria dos Pratos e a Teoria da Velocidade.
1.1.1. Teoria dos Pratos
A Teoria dos Pratos aplica o conceito de pratos de colunas de destilação para explicar a dispersão da banda de soluto na coluna cromatográfica. De acordo com a teoria dos pratos, a coluna cromatográfica é dividida em distâncias imaginárias, que são os pratos. A altura destes pratos é correspondente ao tempo necessário para que seja estabelecido o equilíbrio do soluto entre fase estacionária e fase móvel. Analogamente a uma coluna de destilação, quanto mais pratos uma coluna cromatográfica possuir, mais provável é que ocorra a separação de determinada mistura. Portanto, uma coluna que possui maior número de pratos (N), possui maior eficiência de separação. O número de pratos depende do tamanho da coluna cromatográfica e, por isso, a eficiência pode ser expressa em pratos por metro de coluna (N m-1) ou altura de prato (H, em unidades de distância), a qual é inversamente
proporcional ao número de pratos, então, quanto menor for a altura de prato de uma coluna, maior sua eficiência.
1.1.2. Teoria da Velocidade
A Teoria da Velocidade considera uma coluna contínua e vários fenômenos físico-químicos que influenciam no alargamento da banda cromatográfica. Dentre estes fenômenos estão a difusão longitudinal, taxa de transferência de massa, perfis do fluxo, taxa de adsorção-dessorção, etc. Vários autores na década de 1940 divulgaram descrições destes fenômenos através de tratamentos matemáticos [2], [3]. Em 1956, van Deemter et al. [3], através de simplificações dos tratamentos matemáticos da Teoria dos Pratos e da Teoria da Velocidade, demonstrou que ambas teorias descreviam a função da massa de um soluto em função do seu volume eluído através de uma coluna cromatográfica como uma função gaussiana, possibilitando representar o resultado da Teoria da Velocidade em altura de prato. Esta combinação das teorias resultou na equação mais conhecida na área de cromatografia, a equação de van Deemter (Equação 1).
𝐻 = 𝐴 +𝐵
𝑢+ 𝐶𝑢 (Equação 1)
Onde H é altura de prato, 𝑢 é a velocidade linear da fase móvel, A, B e C são constantes.
De acordo com a equação de van Deemter a altura de prato pode ser expressa pela soma de três contribuições, representadas por três termos, geralmente chamados de termos A, B e C.
O termo B refere-se ao alargamento da banda devido ao gradiente de concentração dentro da coluna. Quanto maior for o tempo que o soluto permanece na coluna, mais a banda se alargará, portanto, esta contribuição ao alargamento de banda é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel.
O termo A refere-se ao alargamento da banda causado pela tortuosidade do leito cromatográfico formado por partículas. Além de existirem múltiplos caminhos possíveis para os solutos passarem, as diferenças geométricas entre estes caminhos resultam em diferenças de velocidade da fase móvel ao longo da seção radial da coluna.
O termo C refere-se à resistência à transferência de massa causada pela lenta difusão dos solutos entre fase estacionária e fase móvel. O atraso dos solutos que se encontram retidos na fase estacionária com relação àqueles que se encontram na fase móvel e continuam movendo-se ao longo da coluna resultam em mais um fenômeno que contribui para o alargamento da banda cromatográfica [4].
O gráfico da altura de prato (ordenada) versus velocidade da fase móvel (abscissa) é chamado de curva de van Deemter e apresenta, geralmente, um perfil parabólico, como pode ser observado na Figura 1. Este gráfico é bastante útil para identificar a velocidade da fase móvel (ou vazão), na qual a coluna apresenta a maior eficiência e, também, para caracterizar o perfil cinético da coluna. A inclinação na curva correspondente à região posterior da altura mínima de prato mostra qual a perda de eficiência que ocorre quando a vazão é aumentada. Uma coluna que possui menor inclinação, possivelmente, possibilita separações mais rápidas, devido ao uso de vazões mais altas sem perda de eficiência.
A equação de van Deemter considera os fenômenos representados pelo termo A como independentes da velocidade da fase móvel, o que não é observado experimentalmente. Devido a esta incoerência, alguns autores preferem utilizar a equação de Knox (Equação 2) para discutir propriedades de uma fase estacionária [4].
𝐻 = 𝐴𝑢1/3+𝐵
𝑢+ 𝐶𝑢 (Equação 2)
Onde H é altura de prato, 𝑢 é a velocidade linear da fase móvel, A, B e C são constantes com os mesmos significados das constantes da equação de Van
Figura 1- a) Curva de Van Deemter. b) Contribuições de cada termo da equação de van Deemter à altura de prato de acordo com a velocidade linear da fase móvel.
1.1.3. O modo cromatográfico de fase reversa
Existem muitos modos de cromatografia líquida, classificados de acordo com as características da fase móvel e da fase estacionária. O modo cromatográfico de fase reversa consiste na utilização de uma fase estacionária de caráter hidrofóbico e fase móvel de caráter mais polar que a fase estacionária. Geralmente, as fases móveis consistem em uma mistura de água e metanol ou água e acetonitrila, enquanto que as fases estacionárias mais comuns contêm cadeias alquílicas em sua superfície. O modo de fase reversa é o modo de cromatografia líquida mais utilizado devido à sua aplicabilidade na separação de uma ampla faixa de compostos neutros, ionizáveis ou iônicos. Outras vantagens como a facilidade de realizar eluição por gradiente e possibilidade de utilizar amostras contendo alta proporção de água, fazem deste modo de cromatografia líquida mais utilizado [5].
Velocidade linear da fase móvel
A ltu ra d e p ra to Altura mínima de prato Velocidade ótima
Velocidade linear da fase móvel
A ltu ra d e p ra to a) b) C A B
1.2. Parâmetros cromatográficos
Nesta seção são apresentados os principais parâmetros cromatográficos que podem ser obtidos a partir de um cromatograma, como o ilustrado na Figura 2.
Figura 2 – Ilustração de um cromatograma: tM, tempo de retenção do soluto não
retido; tR, tempo de retenção do soluto retido e W, largura do pico na linha de base.
1.2.1. Fator de retenção
Este parâmetro permite mensurar a capacidade de retenção da fase estacionária sem a interferência do volume do sistema cromatográfico, pode ser calculado de acordo com a (Equação 3).
𝑘 =𝑡𝑅−𝑡𝑀
𝑡𝑀 (Equação 3)
Onde k é o fator de retenção, tR é o tempo de retenção do soluto retido e tM é o
tempo de retenção do soluto não retido. W
tM
tR
Momento da
injeção Tempo
Soluto não retido
1.2.2. Fator de separação (seletividade)
O fator de separação é um parâmetro cromatográfico que mede a capacidade da fase estacionária em diferenciar dois determinados solutos, portanto, tem o significado de seletividade. Este parâmetro é calculado pela razão dos fatores de retenção de dois determinados solutos, de acordo com a (Equação 4).
𝛼1/2 =𝑘1
𝑘2 (Equação 4)
Onde 𝛼1/2 é o fator de separação entre o soluto 1 e o soluto 2, k1 é o fator de
retenção do soluto 1, o mais retido, e k2 é o fator de retenção do soluto 2.
1.2.3. Número de pratos (eficiência)
Este parâmetro mede o quanto a banda cromatográfica se dispersa e pode ser calculado de acordo com a (Equação 5). Devido à dependência do comprimento da coluna, a eficiência é frequentemente expressa em pratos por metro de coluna (Equação 6) ou altura de prato (Equação 7).
𝑁 = 16𝑡𝑅2 𝑊2 (Equação 5) 𝑁 𝑚−1 =𝑁 𝐿 (Equação 6) 𝐻 = 𝐿 𝑁 (Equação 7)
Onde N é o número de pratos, H é a altura de prato, W é a largura do pico cromatográfico na linha de base e L é o comprimento da coluna.
1.2.4. Resolução
Este parâmetro mede a separação entre dois picos. Pode ser calculado utilizando os tempos de retenção e as larguras dos picos (Equação 8) ou o número de pratos, o fator de separação e o fator de retenção (Equação 9). O mínimo valor de resolução para a separação total entre dois picos é o valor de 1,5.
𝑅𝑠 = 2 𝑡𝑅2−𝑡𝑅1 𝑊2−𝑊1 (Equação 8) 𝑅𝑠 = √𝑁 2 4 𝛼2/1−1 𝛼2/1 𝑘2 𝑘2+1 (Equação 9)
Onde Rs é a resolução, tR1 e tR2 são o tempo de retenção do soluto 1 e 2,
respectivamente, W2 e W1 são as larguras dos picos dos solutos 2 e 1,
respectivamente e k2 é o fator de retenção do soluto 2.
1.2.5. Simetria do pico cromatográfico
A simetria de um pico cromatográfico pode ser calculado a 10% da altura do pico, de acordo com a Equação 10, ou a 5% do pico, de acordo com a Equação 11. O primeiro é chamado de fator de assimetria (As), já o segundo chama-se fator de alargamento (TF, do inglês tailing factor)
𝐴𝑠 = 𝑏
𝑎 (Equação 10)
Onde As é o fator de assimetria e b e a são as larguras de cada metade do pico
𝑇𝐹 =𝑎+𝑏
2𝑎 (Equação 11)
Onde TF é o fator de alargamento e b e a são as larguras de cada metade do pico (dividido pelo seu ápice) a 5% da altura do pico (Figura 3).
Figura 3 - Medidas no pico cromatográfico utilizadas para o cálculo do fator de assimetria (As) e fator de alargamento (TF). Reproduzido de [6].
1.3. Cromatografia líquida capilar
A cromatografia líquida capilar (CLC, do inglês, capillary liquid chromatography) é uma técnica que se originou da miniaturização da técnica comercial de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, do inglês, high performance liquid chromatography). Assim como em HPLC, o cromatógrafo a líquido capilar é constituído pelos mesmos componentes típicos da instrumentação de um HPLC: bomba, injetor, forno da coluna, coluna cromatográfica, detector e um processador dos dados eletrônicos (Figura 4).
Figura 4 – Componentes típicos de um cromatógrafo a líquido capilar.
Existem várias técnicas de cromatografia líquida miniaturizada e estas podem ser classificadas de acordo com o diâmetro interno da coluna cromatográfica (Tabela 1).
Tabela 1 – Classificação das técnicas de cromatografia líquida de acordo com o diâmetro interno da coluna. Adaptado de [7].
Diâmetro interno da coluna Vazão Nome da técnica 3,2-4,6 mm 0,5-2,0 mL min-1 HPLC 1,5-3,2 mm 100-500 µL min-1 LC microbore 0,5-1,5 mm 10-100 µL min-1 Micro-LC 150-500 µm 1-10 µL min-1 CLC 10-150 µm 10-1000 nL min-1 Nano-LC
A redução do diâmetro interno na coluna para 150-500 µm resulta na necessidade de adequação de toda instrumentação. O injetor deve ser capaz de inserir na coluna cromatográfica volumes baixos, da ordem de nanolitros, para evitar
Solvente
Bomba Injetor Detector
Amostra Descarte Processamento dos dados eletrônicos Forno da coluna Coluna
a saturação da fase estacionária. Como uma quantidade tão pequena de amostra se tornaria altamente diluída no volume de um sistema de HPLC convencional, há a necessidade da redução do volume de todo sistema cromatográfico, principalmente do volume que se encontra após a saída da coluna, que caso não seja suficientemente reduzido, pode desfazer toda separação que ocorreu na coluna. Uma vez que o sistema cromatográfico possui um volume tão pequeno, torna-se necessária a utilização de uma bomba capaz de fornecer vazões da ordem adequada (Tabela 1) e com precisão e exatidão [8].
A redução da vazão de HPLC para CLC é tão expressiva que o consumo de fase móvel em CLC pode ser até 1000 vezes menor do que o utilizado em HPLC convencional, o que torna a CLC uma técnica econômica com relação ao consumo de solventes.
Outra vantagem da miniaturização é a utilização de capilares de sílica fundida em vez de tubos de metal como tubos de coluna. Os capilares de sílica fundida oferecem diversas vantagens sobre os tubos de metal, como maior inércia química, transparência e possibilidade de ligações com sua superfície interna. A sílica fundida é um material sintético de alta pureza e sua transparência pode ser utilizada para verificar a presença de grandes irregularidades no leito cromatográfico utilizando um microscópio ótico. Já a possibilidade de ligações químicas com a parede interna do capilar deve-se à presença dos silanóis na superfície interna deste, o que amplia a possibilidade de desenvolvimento de novos materiais aplicados como suporte cromatográfico.
Considerando a caracterização e quantificação de amostras, a miniaturização da cromatografia líquida mostra-se como uma evolução natural e inevitável da técnica.
Uma vez que uma maior eficiência cromatográfica significa uma banda cromatográfica com menor volume, o sistema cromatográfico deve possuir também um volume morto reduzido para evitar a formação de câmaras de dispersão, analogamente como já comentado sobre a inserção de um volume menor de amostra no sistema. Portanto, a obtenção de maiores eficiências está diretamente relacionada com a necessidade de miniaturização da técnica [9].
A miniaturização também parece ser o único meio para a obtenção do ‘’dispositivo ideal de análise química’’ em que diversas técnicas de separação, quantificação e identificação são integradas em um único dispositivo [10]. Tal possibilidade pode ser exemplificada pelo sucesso do acoplamento da CLC com a espectrometria de massas. Este acoplamento resulta em uma ferramenta com enorme utilidade analítica pois as duas técnicas complementam-se. Enquanto o espectrômetro de massas proporciona grande poder de caracterização de substâncias e alta sensibilidade à quantidade de massa, a parte cromatográfica ao separar os componentes de uma mistura, permite a obtenção dos espectros de massas de cada um destes componentes sem a interferência dos demais. Quando é utilizado o electrospray como modo de ionização, a vazão ótima para melhor detectabilidade é de 5 a 10 μL min-1. Para uma instrumentação convencional atingir vazões tão baixas
são necessárias adaptações, como a utilização de divisores de fluxo ou colunas cromatográficas de menor diâmetro interno [11], enquanto para um equipamento de cromatografia capilar estas adaptações não são necessárias [7].
Apesar destas vantagens, a CLC não tem recebido a atenção suficiente para que a técnica alcance a mesma popularidade que a HPLC, principalmente por parte dos grandes fabricantes de equipamentos. Os equipamentos de CLC que são comercializados atualmente consistem meramente em um equipamento de HPLC convencional que recebeu adaptações para operar a baixas vazões. O volume total do equipamento continua sendo o mesmo, resultando em conexões capilares excessivamente longas, que aumentam a dispersão da banda cromatográfica e o tempo de análise. Outro exemplo da falta de atenção que a CLC tem recebido é a baixa variedade de fases estacionárias para CLC disponíveis comercialmente [7].
1.4. Fases estacionárias para cromatografia líquida capilar
As fases estacionárias para cromatografia líquida capilar podem ser classificadas em três grandes grupos, de acordo com o tipo de suporte que contêm: recheadas, monolíticas ou tubulares abertas.
1.4.1. Colunas recheadas
As colunas recheadas são preenchidas com partículas geralmente de sílica porosa, como ilustrado na Figura 5.
Figura 5 – Coluna capilar recheada com partículas esféricas.
No início do desenvolvimento da técnica de HPLC, na década de 1970, as colunas recheadas eram preenchidas com partículas irregulares e de aproximadamente 10 µm de diâmetro. Progressivamente ao longo do tempo, tornaram-se mais regulares e seu diâmetro foi sendo reduzido, possibilitando um incrível aumento na eficiência cromatográfica. Esta redução do tamanho das partículas tornou necessária a utilização de pressões mais elevadas para manter uma vazão adequada [12]. No início de 1980 já existiam colunas capilares recheadas com partículas de 5 µm e 3 µm, utilizando sistemas cromatográficos capazes de operar até 400 bar [13]. Atualmente, as colunas comerciais capazes de fornecer as maiores eficiências são recheadas com partículas de 1,8 µm de diâmetro e requerem uma instrumentação capaz de operar a 1000 bar [9], [14].
A evolução das colunas recheadas neste sentido, reduzindo o tamanho das partículas para abaixo de 1,0 µm e requerendo pressões da ordem de 2400 bar, resultaria no surgimento de inúmeras dificuldades, como o aquecimento da coluna [9], as dificuldades em empacotar adequadamente partículas pequenas e desenvolver sistemas cromatográficos que suportem tais pressões [15]. Devido à estas previsões,
Camada de poliimida
uma linha de pesquisa bastante ativa atualmente é o desenvolvimento de novos suportes cromatográficos que apresentem alta permeabilidade.
1.4.2. Colunas tubulares abertas
As colunas tubulares abertas contêm um suporte composto por uma camada fina que recobre apenas a parede interna do capilar, como ilustrado na Figura 6.
Figura 6 - Coluna tubular aberta.
Este tipo de coluna atingiu grande sucesso em cromatografia a gás, mas em cromatografia líquida é o tipo de coluna menos utilizado. Sua baixa popularidade deve-se a extrema baixa capacidade de amostra, que resulta da reduzida área superficial do suporte pelicular e da necessidade de utilização de capilares de diâmetro interno menores que 10 µm. Esta baixa capacidade de amostra impõe dificuldades instrumentais, como injetores capazes de injetar volumes da ordem de picolitros e detectores adequados para quantidades de massa tão baixas. A baixa capacidade de amostra pode ser amenizada com a utilização de capilares mais longos, o que inevitavelmente resulta em análises mais lentas.
A principal vantagem destas colunas é a possibilidade de obtenção de eficiências extremamente altas, devido à ausência dos alguns efeitos de dispersão de banda, como os múltiplos caminhos [16].
Suporte poroso Sílica fundida
1.4.3. Colunas capilares monolíticas
As colunas monolíticas são constituídas por uma estrutura contínua e porosa, sendo que esta porosidade é composta principalmente por macroporos e mesoporos. A Figura 7 mostra a estrutura de um monolito constituído por esqueletos cilíndricos interconectados de forma simétrica. Os macroporos são de alguns micrômetros, enquanto que os mesoporos são de 5 a algumas dezenas de nanômetros. Para monolitos, é bastante comum a utilização do termo domínio, que se refere à soma do tamanho do macroporo e do esqueleto de sílica [17].
Os macroporos são os principais meios de fluxo da fase móvel, que permitem que estas colunas possuam alta permeabilidade. Já os mesoporos, que ficam situados no esqueleto de sílica, contêm a maior parte da área superficial do material, permitindo alta interação dos solutos com a fase estacionária.
As colunas monolíticas podem ser classificadas como orgânicas, inorgânicas ou híbridas.
1.4.3.1. Colunas capilares monolíticas orgânicas
As colunas monolíticas orgânicas são preparadas utilizando uma mistura composta de monômeros, iniciador de polimerização e uma mistura de solventes porogênicos. A polimerização é induzida por calor ou luz ultravioleta e uma grande variedade de monômeros pode ser empregada na fabricação dos monolitos, permitindo ampla disponibilidade de fases estacionárias [17].
Os monolitos orgânicos foram aplicados, principalmente, para a separação de substâncias de elevada massa molar, como proteínas, e seu desempenho na separação de moléculas de baixa massa molar era relativamente insatisfatório, apresentando baixa eficiência. Este baixo desempenho foi atribuído à estrutura irregular e a pequena área superficial do material, que tendia a diminuir ainda mais quando em contato com solventes orgânicos, devido à estrutura sofrer inchaço nesta condição. Apesar de os monolitos orgânicos apresentarem eficiência menor que os monolitos inorgânicos para separação de moléculas pequenas, formas de preparo recentes permitiram minimizar esta diferença, através da obtenção de monolitos orgânicos com alta área superficial. Além disso, os monolitos orgânicos são superiores aos baseados em sílica com relação à estabilidade em pH maior que 10 e não apresentam fenômeno de encolhimento durante a síntese, facilitando o preparo de colunas de diâmetro interno superior à 200 µm [19].
1.4.3.2. Colunas capilares monolíticas inorgânicas
Os monolitos inorgânicos, compostos principalmente por sílica, foram relatados a partir de 1960, mas foram aplicados como fase estacionária para HPLC apenas por volta de 1996, com o trabalho de Minakushi et al. [20]. O principal método de síntese destes monolitos é o processo sol-gel, no qual ocorre uma polimerização hidrolítica entre alcóxidos de silício (Esquema 1). O método recebe o nome sol-gel devido a ocorrer a transição de uma fase sol (dispersão de partículas) para uma fase gel, com o decorrer da polimerização. Geralmente, é utilizado apenas o tetrametil-orto-silano (TMOS) ou uma mistura deste com metil-trimetóxi-silano (MTMS) [21]. A
superfície interna do capilar é tratada com hidróxido de sódio para aumentar a quantidade de silanóis expostos e melhorar a ligação entre a parede interna do capilar e o monolito que será formado.
Esquema 1- Reações do processo sol-gel. Etapa 1: hidrólise ácida do TMOS, etapa 2: policondensação dos silanóis produzidos na primeira etapa.
Formação dos macroporos
As reações do Esquema 1 têm cinética dependente da concentração de água, tipo de alcóxido de silício e concentração de catalisador. A catálise ácida é a mais usada, sendo utilizada, geralmente, uma solução aquosa de ácido acético 0,01 mol L-1. A formação dos macroporos do monolito ocorre de acordo com mecanismos
de nucleação e crescimento de oligômeros de sílica, os quais são altamente influenciados pela composição da mistura sol e da temperatura na qual ocorre a transição sol-gel. Estes mecanismos envolvem um fenômeno de separação de fases que acontece com o crescimento dos oligômeros de sílica que vão perdendo solubilidade no meio aquoso. Frequentemente, são utilizados aditivos para interferir na separação de fases, como o PEG (polietilenoglicol). Uma vez que este aditivo interfere na separação de fases, o tamanho dos macroporos pode ser controlado de acordo com sua quantidade na mistura sol, enquanto que o volume destes
TMOS Rede de sílica
amorfa H+ H2O 4 Etapa 1 Etapa 2 CH3OH 3 4
macroporos pode ser controlado de acordo com a quantidade de solvente [22]. A influência destes componentes da mistura sol na morfologia do monolito pode ser observada na Figura 8. Este diagrama exemplifica como maiores quantidades PEG reduzem o tamanho dos macroporos, enquanto que uma maior proporção de solvente permite obter maior volume de poro.
Figura 8 – Diagrama pseudo-ternário da influência da quantidade de PEG, silica e solvente na formação dos macroporos da estrutura monolítica. Adaptado de [22] com
permissão da American Chemical Society.
Alcóxido de silício PEG
Solvente Separação de fases macroscópica Sem macroporos Menores macroporos M ai or vo lum e de p or o
Envelhecimento
Após ocorrer a transição sol-gel dentro do capilar, este é mantido a uma temperatura constante por aproximadamente 20 horas. Esta etapa é chamada de envelhecimento do gel, na qual este adquire maior resistência mecânica e características mais adequadas para ser utilizada como fase estacionária, como menor distribuição de tamanho de poro [22].
Formação dos mesoporos
A estrutura monolítica após a gelificação é macroporosa e microporosa. Porém, para a separação de moléculas de até 500 Da, o mais adequado é que o suporte cromatográfico possua mesoporos em vez de microporos. Devido a isso, os monolitos de sílica recebem um tratamento adicional para a formação dos mesoporos [18].
A formação dos mesoporos ocorre quando a solução contida no gel é básica, através da dissolução e reprecipitação da sílica. O método mais comum utilizado é incluir ureia na mistura sol e aquecer o gel por algumas horas, causando a decomposição da ureia e tornando o meio básico. A temperatura tem grande influência no processo, como mostrado na Figura 9. Outras variáveis que também influenciam são o tempo e concentração de ureia. Quanto maior o tempo e a quantidade de ureia, maior a média e a distribuição do tamanho dos mesoporos [18].
Figura 9 - Influência da temperatura na formação de mesoporos utilizando uma solução de NH4OH 1 mol L-1 por 3 dias. Adaptado de [18] com permissão da
Elsevier.
Secagem
A etapa de secagem é geralmente realizada simultaneamente à formação dos mesoporos, pois a temperatura utilizada para ambos pode ser a mesma. Esta é uma etapa crítica no preparo de materiais monolíticos, pois, nesta, a estrutura monolítica pode sofrer desde encolhimento e pequenas fraturas e até se partir completamente. Este sempre foi um dos principais desafios no preparo de peças monolíticas através do processo sol-gel, que ocorre devido a um fenômeno físico, a tensão na estrutura monolítica causada pela pressão capilar formada quando o solvente evapora dos poros. Quanto maior a pressão capilar, maior a tensão que a peça monolítica sofrerá. Os fatores mais influentes na intensidade desta pressão são a velocidade de secagem, o tamanho dos poros e a viscosidade e tensão superficial do solvente nos poros [23]. Devido a isso a formação dos mesoporos se torna
Diâmetro de Poro (Dp, nm) V o lu m e d e P o ro Di fe re n ci al , (dV p / (log Dp ) / cm 3 g -1 )
importante na etapa de secagem. Quanto menor o tamanho dos mesoporos, maior será a pressão capilar, especialmente abaixo de 20 nm, como mostrado na Figura 10.
Figura 10– Influência do diâmetro de poro na pressão capilar gerada por água em um monolíto de sílica. Adaptado de [23] com permissão da Springer Nature.
Quanto mais rápida a secagem e maior a tensão superficial do solvente, maior é o estresse que a estrutura sofre na secagem. Devido a isso, o aumento da temperatura de gelificação, que fica em torno de 40 oC até a temperatura de secagem,
ocorre de forma lenta, com taxas da ordem 0,1 a 0,5 oC min-1 [21]. Para reduzir a
tensão superficial do solvente, podem ser adicionados à mistura precursora surfactantes ou os chamados DCCA’s (do inglês, drying control chemical aditives), que são solventes orgânicos que possuem ponto de ebulição elevado e baixa tensão superficial [24]. Diâmetro de poro (Å) P re ssã o Ca pil a r (M P a )
Relação entre a estrutura monolítica e a eficiência cromatográfica
Os primeiros relatos de suportes monolíticos capilares baseados em sílica mostram materiais com morfologia globular e macroporos da ordem de 8 µm. Estas colunas apresentaram curvas de van Deemter expressivamente inclinadas e com baixa capacidade retentiva, provavelmente devido à alta porosidade do suporte [25]. Com o preparo de suportes com menores macroporos, da ordem de 1,3 µm e maiores concentrações de precursor, houve um significativo aumento no desempenho cinético e na capacidade retentiva das colunas. Estas novas colunas capilares apresentaram maior eficiência e permeabilidade que colunas recheadas com partículas de 5,0 µm, demonstrando potencial para separações mais rápidas [26].
As modificações na composição da mistura precursora podem intensificar um dos maiores inconvenientes do processo sol-gel, o fenômeno do encolhimento, que resulta em grandes espaços vazios dentro do capilar [27], como pode ser observado na Figura 11. O encolhimento é resultado da reação de policondensação e do estresse que a estrutura sofre na etapa de secagem. Além dos cuidados referentes à etapa de secagem, alguns autores relatam que a adição do MTMS na mistura precursora reduz o encolhimento, aumentando a probabilidade de sucesso na síntese de um suporte homogêneo.
Figura 11 – Imagem de microscopia eletrônica de varredura de suporte monolítico que se separou da parede interna do capilar devido ao encolhimento. Imagem
Atualmente, o aperfeiçoamento desta classe de colunas representa uma linha de pesquisa ativa, focada principalmente na obtenção de estruturas com menores domínios e mais homogêneas a partir de modificações na composição e diversas operações unitárias envolvidas no seu preparo [28].
1.4.3.3. Colunas capilares monolíticas híbridas
Os monolitos híbridos podem ser sintetizados utilizando trialcóxissilanos que sofrem reações de hidrólise e policondensação, assim como ocorre com os monolitos inorgânicos. Dentre os trialcóxissilanos que já foram utilizados para o preparo de fases estacionárias estão o octil-trimetóxi-silano (OTMS) [29], o viniltrimetóxissilano (VTMS) [30] e o feniltrimetóxissilano (FTMS) [31]. As estruturas destas substâncias podem ser observadas na Figura 12.
Figura 12 – Estruturas dos trialcóxissilanos OTMS, VTMS e FTMS.
A utilização dos trialcóxissilanos oferece como principal vantagem sobre os monolitos preparados apenas com TMOS (inorgânicos) a possibilidade de exclusão da etapa adicional para funcionalização, uma vez que estes organossilanos já contêm um grupo funcional capaz de fornecer seletividade à fase estacionária.
OTMS VTMS FTMS
Os trialcóxissilanos que contêm um grupo vinil são os mais utilizados, devido à reatividade deste grupo possibilitar a formação de ligações químicas através de reações radicalares. Portanto, os alcóxissilanos contendo grupo vinil podem formar ligações siloxano através do processo sol-gel e também ligações carbono-carbono através do grupo vinil, permitindo ao material adquirir características tanto dos monolitos orgânicos quanto dos inorgânicos. Reações desta mesma classe podem ser utilizadas também para adicionar grupos funcionais de interesse na estrutura monolítica. Esta funcionalização pode ser um processo realizado após, ou simultaneamente, à síntese da estrutura monolítica, sendo esta última abordagem chamada de one-pot, que permite que o preparo da coluna seja relativamente rápido, uma vez que a formação da estrutura monolítica e sua funcionalização ocorrem em uma só etapa [19].
O Esquema 2 representa a síntese de um monolito híbrido funcionalizado com um grupo sulfônico, o qual atribuiu ao material propriedades de troca iônica e mostrou-se útil na retenção de proteínas e peptídeos. Neste material, a rede de sílica híbrida foi formada através da policondensação hidrolítica do VTMS e TMOS, já o grupo sulfônico foi introduzido através da reação radicalar entre os grupos vinílicos da estrutura monolítica e do sal 3-sulfopropil metacrilato de potássio [32].
Esquema 2 – Síntese one-pot de monolito híbrido funcionalizado com grupo sulfônico. Adaptado de [32].
Ureia, PEG, HAc 10 mol L-1, AIBN
45 oC/ 60 oC VTMS
Os monolitos híbridos surgiram como uma promessa de um material que unificasse as vantagens dos monolitos inorgânicos (alta eficiência cromatográfica, alta resistência mecânica e alta área superficial) com as vantagens dos monolitos orgânicos (facilidade no preparo, resistência à fase móvel alcalina e ausência do fenômeno de encolhimento). Já foram relatadas colunas híbridas com excelente desempenho cromatográfico (170 000 N m-1) e a abordagem one-pot é um exemplo
de evolução com relação à facilidade de preparo. Esta é uma área de pesquisa relativamente recente que possivelmente continuará atraindo atenção no futuro devido à expectativa de síntese de novos materiais com propriedades únicas, viabilizada pela grande variedade de classes de reações orgânicas que podem ser utilizadas na síntese destes materiais [19].
1.5. Funcionalização de suportes cromatográficos baseados em sílica para utilização no modo de fase reversa
1.5.1. Funcionalização do tipo fase ligada (silanização)
Suportes cromatográficos baseados em sílica possuem caráter químico hidrofílico, devido à presença de silanóis na superfície do material. Portanto, para aplicação destes materiais como fase estacionária em cromatografia no modo fase reversa, é necessário que a superfície do suporte seja quimicamente modificada, de forma que esta adquira caráter hidrofóbico. O método mais utilizado para esta finalidade é através da formação de ligações covalentes entre a sílica e organossilanos. Estes organossilanos têm estrutura geral composta por grupos reativos e grupos não reativos (Figura 13), sendo que os últimos têm grande influência nas propriedades cromatográficas da fase estacionária.
Figura 13 – Estrutura geral de um organossilano utilizado para funcionalização do tipo fase ligada. R1 = grupo reativo e R = grupo não reativo.
No caso de um organossilano que contém apenas um grupo reativo (monofuncional), como o da Figura 13, existe apenas uma possibilidade de reação entre o organo-silano e a sílica, como mostra o Esquema 3.
Esquema 3 – Reação entre o organossilano e o silanol da sílica.
A utilização do silano monofuncional tem como principais vantagens a alta reprodutibilidade e a produção de uma monocamada de organo-silanos sobre a sílica, que garante rápida transferência de massa para a maioria dos solutos.
No caso de um organossilano trifuncional, como o octadeciltrimetóxissilano (Figura 14) e os trialcóxissilanos na Figura 12, também é possível a obtenção de uma monocamada se o meio reacional estiver em condição anidra. Porém, devido a possibilidade de alguns grupos reativos do organossilano não reagirem com a sílica, camadas heterogêneas podem ser formadas, como ilustrado na Figura 15. Os grupos funcionais que não reagem com a sílica, podem reagir com outra molécula de organossilano, ou serem hidrolisados pela água, que constitui a fase móvel, gerando silanóis nos organo-silanos, o que pode ser prejudicial para o desempenho cromatográfico, especialmente para solutos básicos [33].
Figura 14 – Estrutura do octadeciltrimetóxissilano.
Figura 15 – Diferentes formas que o octadeciltrimetóxissilano podem se ligar com a sílica.
1.5.2. Funcionalização de sílica porosa por imobilização de polissiloxanos
Uma forma alternativa de funcionalização da sílica é através da imobilização de polissiloxanos. O primeiro relato de uma fase estacionária para cromatografia líquida preparada utilizando imobilização térmica de polissiloxanos foi o de Figge et al., de 1986 [34]. Neste trabalho, polissiloxanos foram imobilizados em
Sílica ( )17
( )17
( )17 ( )17 ( )17
Camada homogênea Camada heterogênea
sílica porosa utilizando aquecimento a 180 oC por 20 horas. Dois tipos de sílica foram
utilizados, uma que recebeu um pré-tratamento de silanização com trimetilmetóxissilano e outra que não recebeu este tratamento. A quantidade de polissiloxano imobilizado na sílica do primeiro tipo foi relativamente baixa, correspondendo a uma porcentagem de carbono de 3%. Já sobre a sílica que não recebeu a pré-silanização, a porcentagem de carbono foi maior, 6%.
Segundo os autores, a imobilização pode ser justificada pela formação de ligações entre as cadeias poliméricas e a sílica, geradas através da reatividade dos silanóis da sílica com relação às ligações Si-O-Si do polissiloxano, de acordo com o Esquema 4.
Esquema 4 - Reação do polissiloxano com a sílica.
A partir da década de 1990 a imobilização de polissiloxanos em sílica porosa foi extensivamente estudada no laboratório LabCrom da Unicamp como uma alternativa no preparo de fases estacionárias para HPLC. Vários polissiloxanos foram utilizados, como o polidimetilsiloxano (PDMS), poli(metiloctilsiloxo) (PMOS), poli(metiloctadecilsiloxano) (PMODS), poli(metilfenilsiloxano) (PMFS) e poli(butadieno) (PBD), demonstrando que este método de funcionalização pode ser utilizado para obtenção de fases estacionárias com variadas seletividades [35].
Além disso, vários métodos de imobilização foram estudados, como por tratamento térmico, radiação gama e auto-imobilização.
A auto-imobilização é a imobilização dos polissiloxanos no suporte à temperatura ambiente. Nesta condição, o processo ocorre de forma lenta e são necessários dias para que a quantidade de polímero imobilizado resulte em uma fase estacionária com bom desempenho [35].
O PMOS (Figura 16) foi um dos polissiloxanos mais estudados. Caracterizações físicas e químicas comparando os diferentes métodos de imobilização do PMOS forneceram informações importantes, especialmente com relação ao mecanismo de imobilização do PMOS. Dentre as técnicas utilizadas para estas caracterizações estão: análise elementar, cromatografia de permeação em gel, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 29Si e espectroscopia de
absorção no infravermelho [36].
Figura 16 – Estrutura do PMOS.
A análise elementar mostrou que, dentre os três métodos de imobilização utilizados (por tratamento térmico a 120 oC ou 220 oC por 4 h, por radiação gama a 80
kGy e por auto-imobilização por 30 dias a 23 oC), os tratamentos térmicos são os que
são capazes de imobilizar a maior quantidade de polímero. Já no RMN de 29Si, os
tratamentos térmicos foram os que resultaram na maior redução da intensidade do sinal correspondente à presença dos silanóis da sílica, em especial para o tratamento realizado a temperatura de 220 oC, indicando um recobrimento mais completo do
suporte de sílica. Além disso, este tratamento a alta temperatura, também resultou na formação de novas ligações Si-C, que sugere a quebra da cadeia do polímero e formação de novas ligações entre o próprio polímero (entrecruzamento) ou entre a sílica e o polímero, como proposto por Figge et al. [37]. Esta possibilidade de quebra
da cadeia do polissiloxano também é indicada pelo cromatograma de permeação em gel do PMOS extraído após o tratamento térmico, no qual foi observado um pico correspondente a uma estrutura de massa molar menor, que só foi observado para a fase estacionária que recebeu o tratamento térmico a 220 oC [36]. A Figura 17 ilustra
as diferentes formas que um polissiloxano pode ser imobilizado sobre a sílica.
Figura 17 – Formas de deposição de um polissiloxano no poro da sílica a) Recobrimento apenas nas paredes do poro ou b) Preenchimento do poro. Adaptado
de [35].
A espectroscopia de absorção no infravermelho foi especialmente importante para a observação de outra particularidade do tratamento térmico a 220oC,
que foi a absorção correspondente a ligação C=O, indicando a oxidação do PMOS [36].
A oxidação do PMOS, resultando na formação de grupos polares, pode ser prejudicial para o desempenho cromatográfico, como foi observado no trabalho de Bottoli et al. [38]. Neste trabalho, foi observada a expressiva diminuição na eficiência
Ligação covalente Cadeias do polímero Sílica Fase móvel
das fases estacionárias com PMOS imobilizado a temperaturas maiores que 120 oC
em atmosfera oxidante. Já quando a imobilização térmica foi realizada em atmosfera de N2, foram obtidas altas eficiências mesmo, utilizando altas temperaturas, até 300 oC [39].
A boa estabilidade das fases estacionárias preparadas por imobilização térmica de polissiloxanos foi uma das principais características que permitiu avaliar este método de funcionalização de sílica como adequado para o preparo de fases estacionárias para HPLC. Esta estabilidade foi inicialmente demonstrada pelo trabalho de Anazawa et al., no qual as fases estacionárias preparadas com PDMS e PMOS praticamente não apresentaram variação do fator de retenção e eficiência quando lavadas com fase móvel acetonitrila-água 50:50 (v/v) [40]. Em 2012, Borges e Collins [41] realizaram um estudo mais aprofundado sobre a estabilidade das fases estacionárias com PMOS imobilizado termicamente. Neste estudo, os parâmetros cromatográficos foram avaliados durante testes de estabilidade em condições brandas e também em condições altamente agressivas. Nas condições brandas foi utilizada fase móvel com pH neutro e temperatura 23 oC. Já nas condições agressivas, foi
utilizada fase móvel com pH expressivamente básico ou ácido e temperaturas de até 80 oC. As fases estacionárias mostraram-se razoavelmente estáveis por até 5000
volumes de coluna em quase todas as condições. Foi observada rápida degradação apenas quando se utilizou fases móveis com tampão carbonato ou fostato (pH básico), especialmente a altas temperaturas [41].
A alta qualidade das fases estacionárias com polissiloxanos imobilizados permitiu a aplicação destes materiais na separação de diversas misturas compostas por substâncias de interesse comercial como pesticidas, herbicidas e compostos farmacêuticos, que geralmente possuem ampla faixa de polaridade e também características tanto ácidas quanto básicas, portanto, exigem que a fase estacionária possua eficiência e seletividade adequadas para que a mistura seja resolvida [35].
Recentemente, a imobilização térmica de um polissiloxano em suportes monolíticos baseados em sílica para cromatografia líquida capilar foi descrita pela primeira vez pelo nosso grupo de pesquisa. Neste trabalho, o PDMS foi imobilizado em dois tipos de suporte monolíticos: um sintetizado apenas com TMOS, completamente inorgânico, e outro híbrido, sintetizado com uma mistura de TMOS e
MTMS. Estas fases estacionárias foram testadas no modo fase reversa utilizando uma mistura teste composta por alquilbenzenos. As colunas preparadas foram capazes de resolver a mistura teste, indicando que a imobilização térmica de polissiloxanos é um método promissor para estes novos suportes cromatográficos, mas otimizações são necessárias, principalmente devido aos longos tempos de análise e a baixa capacidade de retenção das colunas, pois, foi necessário utilizar fase móvel com baixa força cromatográfica e baixa vazão para separar a mistura de alquilbenzenos [42]. Além disso, propriedades importantes não foram avaliadas, como estabilidade e seletividade com relação a substâncias polares.
1.6. Caracterização de fases estacionárias através da seletividade
1.6.1. Seletividade metilênica (αCH2)
Ao contrário do fator de retenção, a seletividade ou fator de separação é um parâmetro cromatográfico que permite estudar a diferença de retenção entre dois solutos sem a interferência de algumas características do suporte cromatográfico como porosidade e área superficial, o que o torna um parâmetro bastante útil para a caracterização cromatográfica e comparação de tipos de funcionalização de fases estacionárias mesmo que estas fases possuam suportes cromatográficos diferentes [43].
Uma vez que o principal tipo de interação entre soluto e fase estacionária em cromatografia líquida no modo fase reversa é a interação hidrofóbica, a medida desta propriedade torna-se uma das caracterizações mais fundamentais de uma fase estacionária [44].
A hidrofobicidade, também chamada de seletividade metilênica é geralmente determinada utilizando a razão entre o fator de retenção de um alquilbenzeno com n grupos CH2 sobre o fator de retenção de outro alquilbenzeno com
