UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
MAELINE SANTOS MORAIS CARVALHO
ANÁLISE, POR MEIO DE TELEMETRIA, DA EVOLUÇÃO
TEMPORAL DA PRESSÃO ARTERIAL E FREQUÊNCIA CARDÍACA,
EM RATOS SUBMETIDOS A ESTRESSE CRÔNICO
PIRACICABA 2018
MAELINE SANTOS MORAIS CARVALHO
ANÁLISE, POR MEIO DE TELEMETRIA, DA EVOLUÇÃO
TEMPORAL DA PRESSÃO ARTERIAL E FREQUÊNCIA CARDÍACA,
EM RATOS SUBMETIDOS A ESTRESSE CRÔNICO
Piracicaba 2018
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Odontologia, na Área de Fisiologia Oral.
Este exemplar corresponde à versão final da dissertação defendida pela aluna Maeline Santos Morais Carvalho, orientada pela Profª. Dra. Fernanda Klein Marcondes.
Orientadora: Profª Dra. Fernanda Klein Marcondes MmmmmmmMaMarcondes
Dedicatória
Dedico este trabalho a minha mãe, Marcia Helena, por sempre estar ao meu lado, por toda sua dedicação, amor, confiança e por sempre me guiar pelo caminho onde Deus é o nosso melhor mestre.
Ao meu esposo Guilherme, por acreditar em mim, me guiar e sempre me incentivar a alcançar meus sonhos.
Agradecimentos
À Deus, pois sem ele nada é possível e, é graças a ele que somos capazes de atingir todo nosso pontencial.
À minha querida orientadora Profª. Dra. Fernanda Klein Marcondes, que mesmo diante das minhas inúmeras dificuldades sempre se mostrou solícita e generosa. Obrigada por ter acreditado em mim, pelos seus ensinamentos, paciência e incentivo.
Ao meu querido esposo Guilherme, por sempre estar comigo diante dos meus desafios, por seu companheirismo em todos os momentos, pelo seu carinho, e por sempre me incentivar a dar o meu melhor na busca dos meus objetivos. Obrigada por fazer parte da minha vida!
À minha linda Avó Helena, que me criou com muito amor, amizade, carinho, me tornando a pessoa que sou hoje.
À minha irmã Danaine, pelo amor e carinho.
Às minhas amigas, Lais e Gizele, pela cumplicidade, amizade, apoio durante momentos difíceis e, por estarem comigo desde o início dessa caminha. Obrigada por fazerem parte da minha vida!
Às professoras Dra. Michelle Franz Montan Braga Leite e Dra. Patrícia Oliveira
de Lima, pelo aceite e colaborações como componentes da banca da primeira fase de
qualificação. Suas sugestões e correções foram fundamentais para o desenvolvimento desse trabalho.
Às professoras Dra. Michelle Franz Montan Braga Leite, Dra. Patrícia Oliveira de
Lima e Silvia Cristina Crepaldi Alves, pelo aceite e colaborações como componentes da
banca durante a segunda fase de qualificação, pelas correções e sugestões para a versão final dessa dissertação.
Aos professores Dra. Ana Paula Tanno e Dr. Luis Henrique Montrezor, pelo aceite
e colaborações como componentes da banca de defesa. Obrigada por disporem de tempo e conhecimento para analisar este trabalho.
Ao professor Dr. Alexandre Steiner e sua aluna Camila, por terem me recebido em seu laboratório da Universidade Estadual de São Paulo (USP), pela ajuda e colaboração para a relização da cirurgia de insersão do cateter de medição da pressão arterial.
Ao técnico de laboratório Fábio, e minha amiga Gizele, por toda ajuda e suporte durante a realização da cirurgia e cuidados com os animais.
Às secretárias Eliete e Elisa, sempre atenciosas e prestativas.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba/UNICAMP pelas condições oferecidas para realização deste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de dois anos de Bolsa de Mestrado e apoio financeiro para o desenvolvimento desta pesquisa.
À Fundação de Desenvolvimento da Unicamp – FUNCAMP e Fundo de Apoio ao
ensino, à pesquisa, e à extensão – FAEPEX aos auxílios concedidos.
Epígrafe
“Na adversidade, uns desistem, enquanto outros batem recordes.” Ayrton Senna.
RESUMO
O estresse caracteriza-se como uma resposta adaptativa do organismo frente a estímulos aversivos cuja finalidade é preparar o organismo para enfrentar situações de perigo, mantendo sua homeostasia. Porém, a longo prazo, o estresse crônico tem sido apontado como um fator de risco para doenças cardiovasculares. O protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível (ECMI) é um modelo animal útil no estudo dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos efeitos do estresse. O objetivo desse estudo foi avaliar a evolução temporal da pressão arterial e frequência cardíaca de ratos submetidos ao ECMI, por meio da telemetria. Foram utilizados 10 animais com dois meses de idade. Para registro da pressão arterial e frequência cardíaca os animais foram submetidos à cirurgia para inserção do transdutor de medida na aorta abdominal. Após cirurgia e recuperação dos animais, os mesmos foram monitorados continuamente durante 6 semanas (S) consecutivas, e a cada 5 minutos, foram registrados os valores da pressão arterial e frequência cardíaca de cada animal. Durante três semanas consecutivas (2ª, 3ª e 4ª semanas), o ECMI foi aplicado, e observou-se elevação da pressão arterial sistólica (S2=117,6 +/- 13; S3= 118,2 +/- 12,6; S4= 118,0 +/- 13,8 vs. S1= 115,3 +/- 12,2 mmHg), média (S2= 103,7 +/- 12, 2; S3 104,6 +/- 13,0; S4= 104,7 +/- 10,4 vs. S1= 101,4 +/- 10,4 mmHg) e diastólica (S2= 90,9 +/-12,2; S3= 92,0 +/- 14,1; S4= 92,4 +/- 16,2 vs. S1= 88,6 +/- 10,0 mmHg, p< 0,05) em relação aos valores basais registrados na primeira semana de monitoramento (S1). Ao final do protocolo ECMI, houve diminuição da pressão arterial sistólica e média na quinta e sexta semanas em comparação aos valores basais. A pressão arterial diastólica retornou aos valores basais, uma semana após o fim do ECMI. Houve diminuição da frequência cardíaca nas 3 semanas de aplicação do ECMI (S2= 349,5
vs. S3= 358,9 vs. S4= 350,5 batimentos por minuto - bpm) em relação aos valores basais (S1=
363,3 bpm). Esta redução da frequência cardíaca manteve-se até a sexta semana. Com relação ao efeito do ECMI sobre a diferença da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca, entre os períodos claro e escuro do ciclo circadiano, a partir da segunda semana de aplicação do ECMI não houve diferença significativa nos valores de frequência cardíaca entre os períodos claro e escuro (p > 0,05). Nas outras semanas, a frequência cardíaca apresentou-se maior no período escuro em relação ao período claro. Os valores de pressão arterial sistólica, diastólica e média apresentaram-se significativamente maiores no período escuro em relação ao período claro (p < 0,05). Esses resultados evidenciam a precisão do uso da telemetria para a análise temporal dos parâmetros cardiovasculares, em resposta ao ECMI. Os dados também mostram que o ECMI induziu elevação mantida da pressão arterial e alterou a variação circadiana da frequência cardíaca, e sugerem que mecanismos compensatórios, evidenciados pela diminuição da frequência cardíaca, foram ativados para diminuir os prejuízos ocasionados pelo estresse.
ABSTRACT
Stress is characterized as an adaptive response of the body to aversive stimuli whose purpose is to prepare the body to face dangerous situations while maintaining its homeostasis. However, in the long term, chronic stress has been pointed out as a risk factor for cardiovascular diseases. The moderate and chronic mild unpredictable stress protocol (CMS) is a useful animal model in the study of the pathophysiological mechanisms involved in the effects of stress. The objective of this study was to evaluate the temporal evolution of blood pressure and heart rate of rats submitted to CMS by means of telemetry. Ten animals with two months of age were used. For the recording of blood pressure and heart rate, the animals underwent surgery for insertion of the measurement transducer into the abdominal aorta. After surgery and recovery of the animals, they were monitored continuously for 6 consecutive weeks (W), and every 5 minutes, the blood pressure and heart rate values of each animal were recorded. During three consecutive weeks (2nd, 3rd and 4th weeks) CMS was applied, and systolic blood pressure was elevated (S2 = 117.6 +/- 13; S3 = 118.2 +/- 12.6; S4 = 118.0 +/- 13.8 vs. S1 = 115.3 +/- 12.2 mmHg), mean (S2 = 103.7 +/- 12.2, S3 104.6 +/- 13, 0, S4 = 104.7 +/- 10.4 vs. S1 = 101.4 +/- 10.4 mmHg) and diastolic (S2 = 90.9 +/- 12.2, S3 = 92.0 + - 14.1, S4 = 92.4 +/- 16.2 vs. S1 = 88.6 +/- 10.0 mmHg, p <0.05) from the baseline values recorded in the first week of monitoring. At the end of the CMS protocol, there was a decrease in systolic and mean blood pressure at the fifth and sixth weeks in comparison to the baseline values (W1). Diastolic blood pressure returned to baseline, one week after the end of CMS. There was a decrease in heart rate during the 3-week CMS application (W2 = 349.5 vs. W3 = 358.9 vs. W4 = 350.5 beats per minute - bpm) when compared with baseline values (W1 = 363.3 bpm). This reduction in heart rate was maintained until the sixth week. With regard to the effect of CMS on the difference in systolic, diastolic, mean and heart rate, between the light and dark periods of the circadian cycle, from the second week of CMS (p> 0.05). In the other weeks, the heart rate was higher in the dark period than the light period. The values of systolic, diastolic and mean arterial pressure were significantly higher in the dark period in relation to the clear period (p <0.05). These results demonstrate the accuracy of the use of telemetry for the temporal analysis of cardiovascular parameters in response to CMS. The data also show that CMS induced sustained elevation of blood pressure and altered the circadian variation of heart rate, and suggest that compensatory mechanisms, evidenced by the decrease of the heart rate, were activated to reduce the damages caused by the stress.
Sumário
1 INTRODUÇÃO ... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 14 3 PROPOSIÇÃO ... 19 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 20 4.1 Animais...20 4.2 Delineamento Experimental...20 4.3 Procedimento cirúrgico...22 4.3.1 Anestesia ... 22 4.3.2 Cirurgia... 22 4.3.3 Pós-cirúrgico ... 234.3.4 Monitoramento dos parâmetros cardiovasculares ... 23
4.4 Protocolo de Estresse...24 4.5 Análise estatística...25 5 RESULTADOS ... 26 6 DISCUSSÃO ... 34 7 CONCLUSÃO ... 40 8 REFERÊNCIAS ... 41
1 INTRODUÇÃO
O estresse é considerado um dos problemas de saúde mais importantes na sociedade moderna. Pode ser definido como uma experiência subjetiva desencadeada por qualquer estímulo aversivo que resulte em mudanças sistêmicas generalizadas e não específicas (Nicolaides, 2015 Sanches et al., 2016) as quais promovem ajustes cardiorrespiratórios e comportamentais e simultaneamente, inibem respostas não essenciais durante a exposição a agentes estressores. Estas respostas adaptativas são benéficas e fundamentais para a homeostasia do organismo (Tanno e Marcondes, 2002; Bajer et al., 2015). No entanto, a cronificação deste processo devido à falha e/ou ausência de mecanismos adaptativos, causa uma série de respostas deletérias que podem comprometer o estado de saúde físico e mental do indivíduo (Ursin e Eriksen, 2004; Charmandari et
al., 2005; Nicolaides et al., 2015).
Além de isquemia miocárdica (Barbirato et al., 2010), cardiomiopatia (Lemos et al., 2008) e formação de placas ateroscleróticas (Mcewen, 2005), a hipertensão arterial é uma das complicações desencadeadas pelo estresse crônico, uma doença altamente prevalente que afeta aproximadamente 80 milhões de pessoas nos Estados Unidos e 1 bilhão de indivíduos em todo o mundo (Mozaffarian et al., 2015), sendo a principal causa de doenças e perda geral da saúde (Lim et al., 2013). O cérebro é um dos principais órgãos alvo afetados pela hipertensão arterial. Assim, excluindo a idade, a hipertensão é o fator de risco mais importante para a doença cerebrovascular levando a acidente vascular encefálico e demência (Iadecola et al., 2016).
As altas taxas de mortalidade e morbidade decorrentes de doenças cardiovasculares, sua associação com respostas desencadeadas pelo estresse, alterações no controle de peso corporal e depressão, requerem estudos que contribuam para melhor compreensão dos mecanismos fisiológicos envolvidos na associação entre estresse e alterações cardiovasculares.
Devido às limitações inerentes à pesquisa envolvendo seres humanos, a utilização de modelos animais representa uma importante ferramenta experimental em pesquisas sobre o tema. Embora, esteja bem fundamentado na literatura que roedores se adaptam à aplicação repetida de um mesmo estímulo estressor, esta adaptação não ocorre no protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível (ECMI) (Moreau et al., 1993; Willner, 2005; Neves et al., 2012). Neste protocolo, a aplicação de diferentes estímulos estressores ao longo de 7 dias durante 3 semanas consecutivas, induz elevação mantida dos níveis de corticosterona em ratos que pode ser observada até 15 dias após a aplicação do estímulo estressor, além de menor ganho de peso corporal final em ratos estressados em comparação com ratos não estressados, confirmando a eficácia do ECMI e a ausência de adaptação aos estressores (Neves et al., 2012).
Porém, o uso de animais como objeto de pesquisa tem sido cada vez mais discutido na literatura, e a utilização de tecnologias que possibilitam a redução do número de animais, sem que haja prejuízo à confiabilidade e precisão dos resultados obtidos, tornou-se elemento fundamental no meio científico (Graham e Prescott, 2015). Assim, buscando a redução do número de animais e aquisição de dados mais precisos da evolução temporal da pressão arterial e frequência cardíaca em ratos e camundongos submetidos a diferentes protocolos experimentais, a telemetria representa importante ferramenta metodológica in vivo sendo uma das principais escolhas de pesquisadores para monitoramento a longo prazo das variações cardiovasculares (Kurtz et al., 2005, Salman et al., 2015; Segreti et al., 2016).
Considerando os efeitos negativos do estresse sobre os eventos cardiovasculares, torna-se importante a busca de alternativas que melhor auxiliam no conhecimento dos processos fisiológicos envolvidos, e no desenvolvimento de medidas profiláticas e terapêuticas mais eficientes. Assim, o objetivo desse estudo foi analisar os efeitos do ECMI sobre a evolução temporal da pressão arterial e frequência cardíaca de ratos monitorada por telemetria.
2 REVISÃO DE LITERATURA
Síndrome geral da adaptação foi o primeiro nome dado ao fenômeno observado por Selye (1936), ao expor animais a diferentes estímulos aversivos, cujas respostas hormonais, foram generalizadas, não específicas evidenciadas pela presença de úlceras pépticas, atrofia do sistema imunológico e aumento das glândulas adrenais. O termo estresse posteriormente foi proposto e descrito como uma resposta adaptativa, não específica, do individuo a estímulos físicos ou psicoemocionais, na tentativa de manter a homeostasia e enfrentar a situação percebida como ameaçadora à vida e ao equilíbrio interno (Selye, 1936).
Mais tarde, Mason (1968) mostrou que a resposta do organismo frente a estímulos aversivos tinha caráter específico e que dependiam do tempo de exposição, tipo do agente estressor e características individuais (Tanno e Marcondes, 2002; Bajer et al., 2015, Sanches et al., 2016).
A reação de estresse tem como característica ativar mecanismos que prepare o organismo a lutar ou fugir de um determinado estímulo estressor, redirecionando substratos energéticos para órgãos vitais, alterando respostas comportamentais e inibindo respostas não essenciais. A primeira fase chamada de fase de alarme ou excitação caracteriza-se pela ativação do sistema nervoso simpático e do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, resultando em aumento na secreção de catecolaminas (norepinefrina e epinefrina) pelas fibras simpáticas e medula da adrenal e de glicocorticoides pelo córtex da adrenal. A fase seguinte denominada fase de resistência ocorre quando o estímulo é mantido e a capacidade de reação do organismo diminui desenvolvendo mecanismos para adaptação ao agente estressor. Se o estímulo permanece, respostas adaptativas cessam, e a fase de exaustão se inicia. Nessa fase, deficiência dos mecanismos adaptativos pode levar a respostas prejudiciais desenvolvidas quando o estímulo estressor é mantido por tempo prolongado ou é muito intenso (Loures et al., 2002) ou, se o indivíduo apresenta susceptibilidade genética ou doenças de base (Selye, 1936; Krantz e Manuck, 1984; Tanno e Marcondes, 2002, Mcewen, 2005).
Com base nessas fases, muitos estudos têm demonstrado que o estresse é a uma das principais causas de doenças cardiovasculares, mudanças metabólicas e emocionais no século XXI (Purdy, 2013). A ausência de mecanismos adaptativos, essenciais para restaurar a homeostasia, contribui para o desenvolvimento de dislipidemias, diabetes, hipertensão, infarto agudo do miocárdio, acidente vascular encefálico, aterosclerose e outros fatores de risco cardiovasculares (Chrouso e Gold, 1992; Wiesli, 2005; Goldstein e Kopin, 2007; Marcondes et al., 2012, Hering et al., 2015).
Essas doenças possuem grande impacto na sociedade moderna e, segundo a American
vasculares encefálicos chegaram a $316,6 bilhões de dólares entre os anos de 2011 e 2012 (Mozaffarian et al., 2016). Além disso, os custos envolvidos no tratamento de doenças crônicas, como as cardiovasculares, associada a fatores de risco como o diabetes e a obesidade, deverão saltar de $273 para $818 bilhões de dólares até 2030 (Heidenreich, 2011; Mozaffarian et al., 2016, Sanches, 2016). Nos Estados Unidos, a hipertensão é o principal fator de risco para doenças cardiovasculares, atingindo cerca de 80 milhões de pessoas, sendo a principal causa de morte (Benjamin et al., 2017).
No Brasil, a hipertensão afeta 32,5% (36 milhões) dos adultos, mais de 60% dos idosos, contribuindo direta ou indiretamente para 50% das mortes por doença cardiovascular (Scala et al., 2015). A hipertensão associada ao diabetes, suas complicações cardiovasculares e renais têm alto impacto na perda de produtividade do trabalho e na renda familiar (Abegunde et al., 2007). Em 2013 houve 1.138.670 mortes, das quais 339.672 (29,8%) foi devido a doenças cardiovasculares a principal causa de morte no Brasil (Malachias et al., 2016).
Na sociedade atual, a alta prevalência de doenças cardiovasculares devido ao estresse está estreitamente relacionada com desordens emocionais, como a depressão (Buckley et al., 2010; Sanches, et al, 2016). Porém, a relação entre depressão e doenças cardiovasculares é complexa e bidirecional. Embora essa relação ainda não esteja bem definida, é sabido que pacientes com patologias cardíacas apresentam maior probabilidade de desenvolver depressão (Grippo e Johnson, 2002) devido à disfunção do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, aumento na secreção de glicocorticoides e mudanças na secreção de monoaminas (serotonina e norepinefrina) e componentes do sistema imune, citocinas (Grippo, 2005, 2009, Sanches et al, 2016). Curiosamente, estudos têm apontado os eventos cardiovasculares agudos que os estressores emocionais (mentais) podem acarretar (Hering et al., 2015). Estresse emocional causado por catástrofes naturais potencialmente fatais, como terremotos, tem sido associado ao aumento significativo da incidência de morte cardíaca súbita (Leor et al., 1996). Além de desastres naturais, a participação em eventos sociais como copa do mundo foi responsável por desenvolver efeitos adversos semelhantes, evidenciados pelo aumento do número de infarto agudo do miocárdio e arritmias cardíacas em espectadores durante a final da Copa do Mundo de futebol de 2006 (Wilbert-Lampeu et al., 2008).
A utilização de modelos animais representa uma importante ferramenta experimental em pesquisas complementando estudos clínicos e epidemiológicos. Nos protocolos ECMI (Moreau 1993; Willner, 2005) modificado por Neves et al., (2009, 2012), roedores são expostos a diferentes estímulos estressores alternadamente. Estudos anteriores demonstraram que ao submeter ratos aos diferentes estímulos estressores do protocolo ECMI, estes desenvolveram anedonia, sintoma semelhante à depressão humana evidenciada pela diminuição no consumo e preferência a sacarose
(Costa, 2010), dislipidemia e supersensibilidade à fenilefrina, 15 dias após a interrupção da aplicação do estímulo estressor (Neves et al., 2009; 2012). Em experimentos in vitro, em aorta torácica isolada, observou-se disfunção endotelial, evidenciada pela diminuição da produção de óxido nítrico, aumento da produção de ânion superóxido (Marcondes et al, 2011) e redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina (Neves et al., 2012). Nas semanas de aplicação do ECMI também houve elevação da pressão arterial sistólica e diastólica, em relação à semana anterior ao estresse. E a elevação da pressão sistólica e diastólica mantiveram-se respectivamente até uma e duas semanas após o fim do ECMI (Almeida, 2013).
O sistema renina angiotensina (SRA) é o principal regulador da pressão arterial e homeostase (Crowley e Coffman, 2012). Porém, quando ativado de forma exacerbada, como, por exemplo, em resposta ao estresse crônico (Gradman, 2009; Grippo e Johnson, 2009), pode colaborar diretamente para o desenvolvimento de doenças sistêmicas como a hipertensão arterial (Santos et al, 2012, Dong, et al., 2015). Esse aumento se dá devido a maior estimulação simpática, resultando em maior atividade das fibras simpáticas que inervam as células justagromerulares renais (Phillips, 1987). Consequentemente, ocorre aumento na liberação de renina que ao ser convertida pela enzima conversora de angiotensina (ECA) promove a síntese de angiotensina II um potente vasoconstritor, promovendo aumento da resistência periférica e elevação da pressão arterial (Loures et al., 2002).
Experimentos avaliando o papel do SRA em ratos submetidos ao ECMI mostraram aumento na atividade da renina e ECA circulantes, e aumento da atividade da ECA na aorta torácica de animais estressados em relação ao grupo controle. Além desses resultados, animais tratados com o antagonista do receptor AT1, losartan e submetidos ao ECMI apresentaram menor aumento da pressão arterial e dos hormônios do estresse, e não apresentaram alterações na aorta torácica (Sanches, 2012; Sanches, et al., 2013).
A compreensão da evolução temporal da variação da pressão arterial em resposta ao ECMI é importante para melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos nas alterações cardiovasculares acima descritas. Os resultados acima descritos referentes à avaliação da pressão arterial foram obtidos pelo método de pletismografia de cauda, uma vez por semana, não permitindo identificar os momentos de aumento da pressão arterial ao longo de cada semana.
Embora o uso de animais seja muito importante, na realização de pesquisa da área biomédica que, possibilitam diagnosticar e tratar uma série de doenças (Graham e Prescott, 2015), modelos alternativos à experimentação animal têm sido cada vez mais discutidos no meio cientifico. O uso de tecnologias avançadas com o propósito de diminuir o número de animais sem comprometer a qualidade e reprodutibilidade dos dados obtidos, resgata os princípios dos 3Rs na
experimentação, propostos por Russel e Burch em 1959. Os princípios dos 3Rs envolve Reduction,
Refinement e Replacement dos procedimentos utilizados na experimentação animal, visando o uso
de menor número de animais utilizados nas pesquisas científicas (Ranganatha e Kippast, 2012). Passam então a ser utilizadas técnicas de análise estatística e aquisição de dados mais modernos (Doke e Dhawale, 2013), procedimentos experimentais que minimizam a dor, estresse e sofrimento dos animais (Ranganatha e Kippast, 2012) e equipamentos mais precisos para coleta de dados quantitativos e qualitativos.
Neste contexto, para o monitoramento dos parâmetros cardiovasculares in vivo, envolvidos no diagnóstico de várias doenças sistêmicas como a hipertensão, temos duas metodologias validadas na literatura científica (Whitesall et al., 2004; Malkoff, 2005; Greene, et al., 2007; Loria, et al., 2015; Annoni, et al., 2015). Um desses métodos é a plestimografia de cauda que permite ao pesquisador obter de forma não invasiva os valores da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca (Malkoff, 2005). Apesar de se tratar de uma metodologia eficiente no monitoramento da pressão arterial e da frequência cardíaca, a pletismografia limita o pesquisador a adquirir apenas um registro dos parâmetros fisiológicos durante o momento ou dia de monitoramento, de forma pontual. Este método também demanda uma adaptação do animal ao aparelho, com contenção do mesmo, e requer um ambiente com estrutura como sala com isolamento acústico, sendo um método mais suscetível às variações provocadas pelo ambiente, além de ser necessário maior número de animais para comparar os registros obtidos (Krege et al., 1995; Whitesall et al., 2004, Malkoff, 2005, Sanches, 2012).
Diferentemente da pletismografia, estudos utilizando o sistema de telemetria implantável que permite monitorar continuamente a pressão arterial sistólica e diastólica, e a frequência cardíaca em animais também tem sido muito utilizado (Hess et al., 1996; Handoko et al., 2008; Veitenheimer e Osborn, 2011). O método consiste na inserção de um transdutor de medida em uma das artérias do animal (carótida, aorta abdominal, femoral) e permite ao pesquisador observar as variações da pressão arterial 24hs por dia, permitindo o registro contínuo e duradouro de variáveis fisiológicas em animais conscientes e não estressados. Fornecendo medidas precisas, evitando artefatos de estresse inerentes ao uso de restrição física ou química. (Kramer e Kinter, 2003; Kramer e Remie, 2005; Segreti, et al., 2016).
Sendo a assim, a telemetria tornou-se uma importante ferramenta na aquisição de dados mais precisos e detalhados dos eventos fisiopatológicos em experimentos in vivo, sendo uma das principais escolhas de pesquisadores para monitoramento a longo prazo das variações cardiovasculares. (Kurtz et al., 2005, Salman et al., 2015; Segreti et al., 2016). Embora se trate de uma metodologia invasiva, ela permite ao pesquisador analisar e obter diferentes medições ao longo
do dia do mesmo animal, sobre diferentes estímulos, contribuindo para a utilização do menor número de animais sem perder a qualidade e quantidade de dados obtidos, um dos objetivos da implementação dos 3Rs na experimentação (Doke e Dhawale, 2015; Graham e Prescott, 2015).
Desse modo, devido aos diversos indícios da participação do estresse no desenvolvimento de doenças cardiovasculares que podem evoluir para quadros muitas vezes letais ou incapacitantes, buscou-se observar mais detalhadamente por meio da telemetria uma metodologia de ponta que permite a aquisição de dados precisos, a evolução temporal da pressão arterial e frequência cardíaca de ratos submetidos a estresse crônico monitorados ao longo de 6 semanas.
3 PROPOSIÇÃO
Objetivo Geral: Avaliar os efeitos do estresse crônico moderado e imprevisível sobre a evolução temporal da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca de ratos monitorados por telemetria.
Objetivos Específicos: Monitorar, durante 6 semanas, os valores da pressão arterial e frequência cardíaca antes, durante e após a aplicação do ECMI, e descrever a variação temporal destes parâmetros identificando os efeitos do ECMI.
Avaliar o efeito do estresse crônico sobre a amplitude da pressão arterial e frequência cardíaca durante o ciclo claro e escuro.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Neste estudo, foram utilizados 10 animais machos Sprague-Dawley SPF ("specific patogen free") pesando entre 250 e 300 g no início do experimento, fornecidos pelo Centro multidisciplinar de Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas. No início do experimento 16 animais foram submetidos à cirurgia para inserção do transdutor de aferição da pressão arterial e frequência cardíaca. No entanto, 2 animais morreram por complicações cirúrgicas e 4 animais não apresentaram registro da pressão arterial e frequência cardíaca, devido ao deslocamento do transdutor inserido. Todos os experimentos foram previamente aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Estadual de Campinas (Processo CEUA nº4219-1; ANEXO 1) e estão de acordo com as exigências do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).
Os animais chegaram com 21 dias de idade e passaram por um período de adaptação e crescimento no Biotério da Faculdade de Odontologia de Piracicaba. Eles foram alojados em gaiolas individuais com maravalha autoclavada, em rack para ratos ALESCO®, em sala climatizada (22 ± 2ºC), com ciclo claro/escuro de 12/12h (luzes acendendo às 06h00) e alimentação ad libitum com ração para ratos Purina®.
As trocas das gaiolas foram realizadas pela pesquisadora duas vezes por semana (às segundas e quintas-feiras) e o peso dos animais foi monitorado uma vez por semana (às segundas-feiras) por 12 semanas. Considerando que o dispositivo para avaliar a pressão pesava 7,8 gramas, estes foram subtraídos do peso de cada animal. A entrada na sala de experimento foi rigorosamente controlada, permitida apenas aos pesquisadores responsáveis com vestimenta adequada (Avental, luvas, máscara, protetores de pés). Os ratos foram eutanasiados, por decapitação 15 dias após fim do protocolo de estresse.
4.2 Delineamento Experimental
Durante o período de adaptação os animais foram manipulados para registro do peso e para os procedimentos relacionados à troca e limpeza das gaiolas. Completos 2 meses de idade, os animais foram submetidos a cirurgia para inserção do transdutor modelo (TA11PA-C40) para registro da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca. Para recuperação do peso e restabelecimento dos ritmos circadianos da pressão arterial e frequência cardíaca (Greene et al., 2007; Salman, et al., 2015), foram aguardadas duas semanas (Figura 1).
Quinze dias após recuperação cirúrgica, conforme descrito a seguir, os animais foram monitorados por 6 semanas ininterruptas e a cada cinco minutos foram registrados os valores dos parâmetros fisiológicos de cada animal.
Semana (S1) = semana controle de registro da pressão arterial (sistólica, diastólica e média) e frequência cardíaca, 15 dias após a cirurgia, antes da aplicação do ECMI.
Semana (S2, S3 e S4) = semana de registro da pressão arterial (sistólica, diastólica e média) e frequência cardíaca, durante a aplicação do ECMI.
Semana (S5 e S6) = semana de registro da pressão arterial (sistólica, diastólica e média) e frequência cardíaca, após aplicação do ECMI.
Na semana (S1), foram ativados os transdutores de registro da pressão arterial, os animais foram alojados em gaiolas colocadas sobre o receiver e submetidos aos procedimentos relacionados à troca e limpeza das gaiolas.
Durante as semanas (S2, S3 e S4) foram aplicados os estímulos estressores do protocolo ECMI. Nas duas últimas semanas foram registrados os valores da pressão arterial e frequência cardíaca após fim do protocolo ECMI (S5 e S6).
Figura 1 - Fluxograma do delineamento experimental.
4.3 Procedimento cirúrgico 4.3.1 Anestesia
Os animais foram anestesiados com Isoflurano 5% em 1 litro de Oxigênio em uma câmara anestésica medindo (13 cm de largura x 25 cm de comprimento x 12,5 cm de altura) contendo anestésico e oxigênio. Após a indução anestésica, foi realizada tricotomia de aproximadamente 5 cm em região abdominal. Durante o procedimento cirúrgico a anestesia foi mantida em 2,5 a 3% de Isoflurano e os animais foram manipulados em decúbito dorsal em mesa cirúrgica por aproximadamente 40 minutos (Data Science, 2012; Salman, et al., 2015; Segreti, et al., 2016; Steiner et al., 2017 ).
4.3.2 Cirurgia
Após tricotomia da região abdominal, foi realizado pré-assepsia com álcool iodado 10% e utilizando técnica asséptica, foi realizado laparotomia de 5 cm em linha média abdominal (Figura 2) . A cavidade abdominal foi exposta e, para acesso à aorta abdominal, os órgãos foram deslocados utilizando gaze embebida em solução salina estéril. Posteriormente à localização da aorta abdominal, foi introduzida uma linha de sutura em região ascendente da aorta e um “clamper” em região descendente para interromper o fluxo sanguíneo local. (Data Science, 2012; Salman, et al., 2015; Segreti, et al., 2016; Steiner et al., 2017).
Por meio de uma incisão na aorta abdominal, foi inserido o cateter do transdutor de medida PA-C40 na luz do vaso e fixado com cola Vetbond. Uma vez validado o sucesso da fixação do cateter, o transdutor foi fixado com linha de sutura na camada interna do abdômen e a pele foi suturada com linha para sutura Suturin e desinfetada com iodo 10%. Seguido a fixação do cateter, os animais foram medicados com Enrofloxacina (antibiótico) 1ml/kg e Cetroprofeno (anti-inflamatório) 1ml/kg subcutâneo, e permaneceram na sala de cirurgia até retorno da anestesia. O isoflurano foi descontinuado e o animal permaneceu em oxigênio (Steiner et al., 2017).
Figura 2 - Inserção do trandutor PA-C40 na aorta abdominal.
Fonte: Imagem adaptada do manual de inserção de cateter de pressão arterial DSI, 2012.
4.3.3 Pós-cirúrgico
Os animais foram cuidadosamente acompanhados pela pesquisadora durante uma semana após procedimento cirúrgico. Para alívio e controle da dor, foi administrado mais uma dose de anti-inflamatório Cetroprofeno 1 ml/kg subcutâneo 12 horas após fim do procedimento cirúrgico. (Salman et al., 2015; Segreti et al., 2016, Steiner et al., 2017)
O peso dos animais foi monitorado durante a semana de recuperação cirúrgica. Um animal foi sacrificado por apresentar indícios de sofrimento com perda de peso maior que 20% e paraplegia dos membros inferiores (> 1 semana).
4.3.4 Monitoramento dos parâmetros cardiovasculares
Quinze dias após recuperação cirúrgica, os animais foram submetidos ao procedimento de registro da pressão arterial. Para isso, no dia pré-estabelecido, as gaiolas dos animais foram colocadas sobre uma placa individual denominada receiver, cuja função é extrair os dados da pressão arterial de cada animal e enviar ao sistema computacional. Os animais foram mantidos sobre o receiver durante todo o protocolo experimental. Em seguida, foi ativado o transdutor implantado, mediante a passagem de um imã no exterior da parede abdominal do animal. Para verificar a ativação do transdutor foi utilizado um rádio em frequência AM o qual emitia um som ao
aproximar-se do animal. Desta forma, o transdutor passou a registrar a cada 5 minutos os valores da pressão arterial sistólica, diastólica e frequência cardíaca de cada animal individualmente (Figura 3) (Senador et al., 2010, Steiner et al., 2017). Os dados foram armazenados e extraídos para análise por meio do sistema de telemetria, conforme instrução do fabricante (Data Science International, St. Paul, MN, 2012).
Figura 3 – Parâmetros cardiovasculares sendo registrados.
Fonte: autoria própria
4.4 Protocolo de Estresse
Na 2ª, 3ª e 4ª semanas do período experimental, os animais foram submetidos ao protocolo ECMI (Tabela 1). O protocolo de ECMI consiste na aplicação de diferentes estímulos estressores ao longo de 7 dias, repetindo-se os procedimentos por 3 semanas consecutivas (Neves et al., 2009, 2012).
Figura 4 - Imobilização aplicada em ratos Sprague-Dawley
Os animais permaneceram imobilizados durante 1 hora, utilizando-se tubos de polietileno o qual se ajusta ao tamanho do corpo do animal impedindo sua movimentação (Figura 4). Durante todo período em que permaneceram imobilizados os animais foram privados de água e alimento (Neves et al., 2009, Sanches, 2016).
Tabela 1- Protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível.
Manhã Tarde
Segunda-feira 8:00 - 9:00 Imobilização 13:00 – 14:00 Imobilização.
18:00 Iluminação Contínua durante a noite.
Terça-feira 8:00 – 9:00 Imobilização 14:00 – 15:00 Imobilização seguida de privação de
água e comida durante 17 horas.
Quarta-feira 8:00 – 10:00 Acesso restrito a
comida por 2 horas
13:00 – 14:00 Imobilização seguida de privação de
água por 18 horas. Quinta-feira 8:00 – 10:00 Exposição a garrafas de
água vazias.
11:00 – 12:00 Imobilização
14:00 – 15:00 Imobilização seguida de alojamento em
gaiolas com maravalha úmida durante 17 horas.
Sexta-feira 8:00 – 9:00 Imobilização 18:00 ciclo claro/escuro invertido (até 8 hs da segunda
feira seguinte.
4.5 Análise estatística
A diferença entre os pesos dos animais antes e após o protocolo ECMI foi comparada utilizando-se o teste t de Student para dados pareados (Bioestat 5.0). Para análise das medidas repetidas da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca utilizou-se a Análise de Variância seguida do Teste de Tukey-Kramer para comparação múltipla das médias. Valores de
p menores do que 0,05 foram indicativos de significância estatística. Todos os cálculos estatísticos
foram efetuados por meio do sistema SAS (SAS Institute Inc. SAS/STAT Software, Version 9.3. Cary, NC, 2011).
Além das análises estatísticas, para elaboração dos gráficos Box plot utilizamos as médias da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca de cada animal de acordo com as semanas e/ou dias de montoramento. (R Core Team (2017). (R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R-project.org/.)
5 RESULTADOS
O peso corporal final (503,7 +/- 31,2 g), determinado 15 dias após fim do protocolo ECMI, foi significativamente maior em relação ao peso inicial (412,3 +/- 26,7 g; p< 0,001).
A figura 5 mostra o impacto dos estímulos estressores sobre a evolução temporal da pressão arterial sistólica (Fig. 5A), diastólica (Fig. 5B) média (Fig. 5C) e frequência cardíaca (Fig. 5D) de ratos submetidos ao protocolo ECMI de acordo com as semanas do período experimental.
Ao longo do período experimental, a pressões arteriais (sistólica e média), apresentaram o mesmo perfil de evolução. Durante as três semanas de aplicação do protocolo ECMI houve aumento significativo da pressão arterial sistólica e média (Fig. 5A; 5C; p<0,05) em relação à semana controle (S1), porém 15 dias após término do protocolo ECMI, observou-se redução da pressão arterial sistólica e média a valores inferiores aos observados na semana controle (S1).
A pressão arterial diastólica apresentou elevação no decorrer das três semanas de aplicação do ECMI, em relação aos valores observados na semana anterior, e nas duas semanas após o ECMI houve retorno aos valores basais monitorados uma semana antes do protocolo ECMI (Fig. 5B; p<0,05).
Nas semanas de estresse (S2 S3 e S4), assim como, nas duas semanas após fim da aplicação dos estímulos estressores (S5 e S6) houve queda significativa da frequência cardíaca em relação à semana controle (S1) (Fig. 5D).
Figura 5 – Evolução da pressão arterial e frequência cardíaca durante 6 semanas.
Valores da pressão arterial sistólica (A), diastólica (B), média (C), e frequência cardíaca (D) de ratos submetidos ao ECMI, determinada por telemetria durante 6 semanas consecutivas. Médias com letras distintas são significativamente diferentes (p<0,05; ANOVA para medidas repetidas + teste de Tukey). N = 10 animais. (S1 = controle / S2, S3, S4 = estresse / S5, S6 = fim do protocolo de estresse).
A seguir, estão apresentadas as figuras referentes à evolução temporal da pressão arterial sistólica, diastólica e frequência cardíaca, considerando as médias diárias destes parâmetros (Fig. 6, 7, 8).
No primeiro dia de aplicação do protocolo ECMI, houve elevação da pressão sistólica em relação ao mesmo dia da semana controle (dia 8 - semana S1, dia 15 - semana S2; box plot verde). Durante os dias de aplicação do protocolo ECMI, observou-se aumento da pressão sistólica, sendo os maiores valores observados às sextas-feiras (dias 19 – S2; 26 – S3 e 33 – S4; box plot em vermelho, Fig. 6) e menores valores aos sábados e domingos (dias 20,21 – S2; dias 27,28 – S3 e dias 34,35 - S4; box plot amarelo).
A B
Figura 6 – Evolução da pressão arterial sistólica durante os dias de aplicação do ECMI.
Evolução temporal da pressão arterial sistólica (mmHg) de ratos submetidos ao ECMI de acordo com os dias. Resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. Os dias da semana estão identificados em cores distintas. Verde (segunda-feira), Vermelho (sexta-feira), Amarelo (sábados e domingos) do respectivo protocolo ECMI.
O ECMI também induziu elevação da pressão arterial diastólica a partir do primeiro dia de aplicação dos estímulos estressores (dia 15- semana S2; box plot verde) quando comparado ao mesmo dia da semana controle (dia 8 – semana S1; box plot verde). Nos dias 19, 26 e 33 (box plot vermelho) que correspondem às sextas-feiras de cada semana do protocolo ECMI foram registrados os maiores valores de pressão arterial diastólica durante todo período experimental. Os dias 20,21 – S2; dias 27,28 – S3 e dias 34,35 – S4 (box plot amarelo, Fig. 7) apresentaram os menores valores de pressão arterial diastólica durante o protocolo ECMI
Figura 7 – Evolução da pressão arterial diastólica durante os dias de aplicação do ECMI.
Evolução temporal da pressão arterial diastólica (mmHg) de ratos submetidos ao ECMI de acordo com os dias. Resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. Dias da semana estão identificados em cores distintas. Verde (segunda-feira), Vermelho (sexta-feira), Amarelo (sábados e domingos) do respectivo protocolo ECMI.
Diferentemente da pressão arterial sistólica e diastólica observou-se diminuição da frequência cardíaca dos animais a partir do segundo dia de aplicação do ECMI (dia 16 – S2). Embora os maiores valores da frequência cardíaca durante as semanas de estresse tenham sido registrados às sextas-feiras, estes são inferiores aos valores registrados no mesmo dia da semana controle (S1) (Fig. 8; S1 363,3 vs. S2 349,5 vs. S3 358,9 vs. S4 350,5 bpm). O registro de menor frequência cardíaca foi observado às terças-feiras da primeira e segunda semana de estresse e segunda-feira da terceira semana, diferindo do padrão observado nos valores da pressão sistólica e diastólica.
Figura 8 – Frequência cardíaca de ratos submetidos ao ECMI.
Frequência cardíaca de ratos submetidos ao ECMI de acordo com os dias. Resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. Dias da semana estão identificados em cores distintas. Verde (segunda-feira), Vermelho (sexta-(segunda-feira), Amarelo (sábados e domingos) do respectivo protocolo ECMI. Azul, menor valor de frequência cardíaca durante ECMI.
Foi também avaliado o efeito do estresse sobre as variações circadianas dos valores da pressão sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca. Durante o período escuro (18h às 6h) os valores da pressão arterial sistólica e média foram significativamente maiores em relação ao período claro (6h às 18h) nas semanas S1, S2, S3, S4, S5 e S6 (Fig. 9; 10; p<0,05). Nas semanas S2, S3 e S4 de aplicação do protocolo ECMI houve aumento da pressão arterial entre os ciclos claro e escuro em relação à semana S1. Após fim do protocolo de estresse nas semanas S5 e S6 houve queda da pressão arterial sistólica e média durante o ciclo claro e escuro em relação à semana controle (S1).
Figura 9 – Amplitude da pressão arterial sistólica durante o ciclo claro e escuro.
Pressão arterial sistólica (mmHg) de ratos submetidos ao protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível durante o ciclo claro / escuro. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. * Indica significância estatística entre os parâmetros fisiológicos monitorados durante a mesma semana. (ANOVA para medidas repetidas seguido de teste de Tukey-Kramer p<0,05). (S1 = controle / S2, S3, S4 = estresse / S5, S6 = fim do protocolo de estresse).
Figura 10 – Amplitude da pressão arterial média durante o ciclo claro e escuro.
Pressão arterial média (mmHg) de ratos submetidos ao protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível durante o ciclo claro / escuro. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. * Indica significância estatística entre os parâmetros fisiológicos monitorados durante a mesma semana. (ANOVA para medidas repetidas seguido de teste de Tukey-Kramer p<0,05). (S1 = controle / S2, S3, S4 = estresse / S5, S6 = fim do protocolo de estresse).
Observou-se diferença estatística nos valores da pressão arterial diastólica entre o ciclo claro e escuro da mesma semana (Fig. 11; p<0,05). Houve aumento da pressão arterial diastólica entre os ciclos durante o protocolo ECMI em relação à semana controle e redução da diferença
108 110 112 114 116 118 120 122 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Pr e ssão ar te ri al si st ól ic a (m m Hg ) Semana Claro Escuro
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94.0 96.0 98.0 100.0 102.0 104.0 106.0 108.0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Pr e ssão ar te ri al m é d ia (m m Hg ) Semana Claro Escuro
estatística na semana (S4) entre o ciclo claro e escuro. Nas semanas S5 e S6 observou-se retorno aos valores basais da pressão arterial diastólica.
Figura 11 – Amplitude da pressão arterial diastólica durante o ciclo claro e escuro.
Pressão arterial diastólica (mmHg) de ratos submetidos ao protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível durante o ciclo claro / escuro. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. * Indica significância estatística entre os parâmetros fisiológicos monitorados durante a mesma semana. (ANOVA para medidas repetidas seguido de teste de Tukey-Kramer p<0,05). (S1 = controle / S2, S3, S4 = estresse / S5, S6 = fim do protocolo de estresse).
Com relação à frequência cardíaca, nas semanas anteriores e posteriores à aplicação do ECMI, os animais apresentaram média da frequência cardíaca maior no período escuro em relação ao período claro. Embora na primeira semana de estresse (S2) esta diferença tenha se mantido, nas semanas seguintes (S3 e S4) do protocolo do ECMI, não houve diferença significativa entre os valores da frequência cardíaca nos períodos claro e escuro (Fig. 12; p> 0,05).
84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Pr e ssão ar te ri al d ia st ól ic a (m m Hg ) Semana Claro Escuro
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Figura 12 – Amplitude da frequência cardíaca durante o ciclo claro e escuro.
Frequência cardíaca de ratos submetidos ao protocolo de estresse crônico moderado e imprevisível durante o ciclo claro / escuro. Os resultados estão apresentados em média ± erro padrão. N = 10 animais. * Indica significância estatística entre o ciclo claro e escuro durante a mesma semana. (ANOVA para medidas repetidas seguido de teste de Tukey-Kramer p<0,05). (S1 = controle / S2, S3, S4 = estresse / S5, S6 = fim do protocolo de estresse). 300.0 310.0 320.0 330.0 340.0 350.0 360.0 370.0 380.0 390.0 400.0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 Fr e q u ê ci a ca rd ía ca (bp m ) Semana Claro Escuro
6 DISCUSSÃO
Os dados obtidos neste estudo mostram que o ECMI aumentou a pressão arterial sistólica, diastólica e média, e diminuiu a frequência cardíaca de ratos monitorados por telemetria.
O sistema cardiovascular participa ativamente no processo adaptativo em resposta ao estresse seja pelo aumento da frequência cardíaca, da contratilidade, do débito cardíaco ou da pressão arterial (Krantz e Manuck, 1984). Em um organismo saudável a reação aos estímulos estressores promove respostas protetoras essenciais que ajudam na sobrevivência durante situações de perigo iminente. A ativação do sistema nervoso simpático e do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal resulta em liberação de mediadores cuja função é preparar o organismo para lutar ou fugir de um determinado estímulo estressor, redirecionando substratos energéticos para órgãos vitais, alterando respostas comportamentais e inibindo respostas não essenciais (Selye, 1936; Krantz e Manuck, 1984; Tanno e Marcondes, 2002, Mcewen, 2005; Hering, et al., 2015).
Sendo assim, as mudanças cardiovasculares que resultam na alteração da pressão arterial se tornam muito importantes, pois permitem que o corpo se adapte às mudanças físicas e emocionais durante todo o período necessário em resposta ao agente estressor, proporcionando fluxo sanguíneo adequado aos tecidos (Mcewen, 2005) e melhorando a resposta inotrópica miocárdica à estimulação.
Porém, quando mecanismos adaptativos não ocorrem de forma adequada, devido à alta intensidade do estímulo estressor (Loures et al., 2002) ou características individuais (Krantz e Manuck, 1984; De Mattos et al., 2006) efeitos deletérios como o desenvolvimento de algumas doenças podem ser observados (Ursin e Eriksen, 2004; Nicolaides et al, 2015).
Embora em nosso estudo experimental o ECMI não tenha desencadeado hipertensão, a significativa elevação dos valores médios da pressão arterial sistólica, diastólica e média observados nas semanas de aplicação do protocolo ECMI, está de acordo com estudos que mostram o estresse psicológico crônico como uma das principais causas de pressão arterial elevada sustentada (Sparrenberger et al., 2009; Landsbergis et al., 2013). A ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal em seres humanos (Whitworth et al., 1984; Connell et al, 1987) e em animais (Willard e Fuller, 1969) tem se mostrado um dos mecanismos que afetam a pressão arterial, principalmente mediados pela liberação de catecolaminas, cortisol (humanos), corticosterona (animais) endorfinas e aldosterona (Zimmerman e Frohlich, 1990; Lu et al., 2000; Tanno e Marcondes, 2002).
Em estudo anterior do nosso grupo de pesquisa, foi observado que o ECMI promoveu aumento na concentração plasmática de corticosterona, catecolaminas e dislipidemia até 15 dias após fim dos estímulos estressores garantindo a eficácia do protocolo no desenvolvimento de estresse crônico (Neves et al., 2009, 2012). Observou-se também aumento da pressão arterial
sistólica, a partir da segunda semana do ECMI, avaliada uma vez por semana pelo método de pletismografia de cauda, que se manteve até uma semana após o ECMI, assim como, aumento da pressão arterial diastólica, mantido até 2 semanas após o estresse (Almeida, 2013).
No presente estudo observou-se diminuição da pressão arterial sistólica e média a partir da primeira semana após fim do protocolo ECMI a valores menores do que os monitorados uma semana antes do protocolo de estresse. Observou-se também retorno aos valores basais da pressão arterial diastólica uma semana após fim do protocolo ECMI, que se manteve até uma semana depois.
A divergência nos dados citados anteriormente, talvez possa ser explicada, pela diferença da metodologia empregada no registro da pressão arterial e o uso do mesmo animal como controle dele mesmo. A forma pontual de registro e suscetibilidade do método as condições ambientais, (Krege et al., 1995; Whitesall et al., 2004, Malkoff, 2005, Sanches, 2012), pode ter contribuído para que não se observasse o retorno da pressão arterial sistólica e diastólica aos valores basais, assim como a diminuição da frequência cardíaca.
Sendo assim, os dados obtidos por meio da telemetria permitiu avaliar de forma precisa e detalhada a evolução da pressão arterial durante o protocolo ECMI, os resultados aqui apresentados mostram a riqueza e os diferentes ângulos que essa metodologia permite ao pesquisador investigar, sem que artefatos de restrição física interfiram nos resultados. A utilização da telemetria em animais de pesquisa para capturar a natureza altamente dinâmica da pressão arterial ao longo do tempo representou um avanço significativo na pesquisa cardiovascular (Kurtz et al., 2005 Salman et al., 2015; Segreti et al., 2016), além de contribuir para utilização do menor número de animais.
Outro aspecto importante da telemetria é ela permitir a exploração de dados durante, minutos, horas e dias. Um importante resultado mostrado nas figuras 6 e 7 evidencia o efeito crescente da pressão arterial sistólica e diastólica ao longo dos dias de aplicação do ECMI, confirmando o efeito crônico do protocolo de estresse, e a não adaptação dos animais aos estímulos aversivos, visto que diferentes estímulos são aplicados durante o protocolo e apresentam reações diferentes entre si. Além das diferentes respostas aos estímulos estressores que podemos observar nessas figuras, outro ponto importante observado, foram os valores de maior pressão indicados às sextas-feiras de cada semana do ECMI, esse aspecto expõe o efeito crônico acumulativo do protocolo de estresse, mas ressalta a importância da escolha adequada do instrumento de medição e do dia de medição da pressão arterial, pois embora estudos mostrem que tanto a telemetria, quanto a pletismosgrafia são duas metodologias eficazes no estudo de alterações cardiovasculares (Whitesall
et al., 2004) o objetivo do estudo é que irá direcionar a melhor metodologia para investigar os eventos cardiovasculares.
Além dos efeitos pressóricos ocasionados pelo ECMI, observamos em nosso estudo diminuição da frequência cardíaca ao longo das semanas e/ou dias de aplicação do protocolo de estresse crônico que se manteve até 15 dias após, esses dados sugerem que mecanismos adaptativos de controle da pressão arterial possam ter sido ativados e que os efeitos do ECMI sobre a pressão estão relacionados a efeitos vasculares periféricos e não à estimulação simpática do cronotropismo cardíaco (Almeida, 2013). A diminuição da frequência cardíaca nas semanas de estresse diferentemente do aumento da pressão sistólica e diastólica poderia estar relacionada à bradicardia reflexa mediada pelo sistema baroceptor (Irigoyen et al., 2001).
Os resultados aqui observados das variações cardiovasculares contribuem com estudos previamente descritos. Ao aplicar o protocolo ECMI em ratos observou-se supersensibilidade à fenilefrina um agonista de receptor alfa 1 na aorta torácica, com endotélio intacto, isolada de animais estressados em relação ao grupo controle. Sendo assim, a hipótese levantada por esses autores foi que a supersensibilidade à fenilefrina poderia estar relacionada à menor biodisponibilidade de oxido nítrico (Neves, et al., 2009).
Observando esses achados, Almeida et al. (2013), então propôs observar os efeitos do ECMI sobre as alterações vasculares. Os resultados mostraram que o ECMI reduziu em 61% a resposta vasodilatadora à acetilcolina (Ach) em relação ao grupo controle que apresentou 96% de relaxamento induzido pela Ach, associada à menor produção de oxido nítrico (NO) na aorta torácica isolada de animais estressados, em relação ao grupo controle, diante desses resultados, concluiu-se que o ECMI induz disfunção endotelial e reduz a biodisponibilidade de óxido nítrico na aorta de ratos.
Chung et al, (2010) ao expor animais ao estresse por imobilização durante 14 dias observou elevação da pressão arterial sistólica e diminuição do relaxamento arterial em resposta a Ach, mas não ao nitropusiato de sódio (SNP), sugerindo que a imobilização prejudica a função endotelial e provoca hipertensão arterial.
Na literatura, encontramos vários indícios que a síntese e biodisponibilidade de (NO) pelas células endoteliais desempenham um papel importante no relaxamento dos vasos, contribuindo para modulação do tônus vascular (Saravanakumar e Raja, 2011). Um endotélio saudável libera continuamente substâncias potencialmente vasodilatadoras em resposta a resistência vascular. A disfunção endotelial resulta de um desequilíbrio entre a produção e liberação de fatores de relaxamento endotelial (Romero et al., 2016). E, tem sido apontada como causa de uma variedade de estados patológicos, incluindo alteração das propriedades anticoagulantes e
anti-inflamatórias do endotélio (De Caterina et al., 1995; Watson et al., 2008), assim como, considerada não apenas como a manifestação mais adiantada da aterosclerose (Napoli et al., 2006), mas também como fator prognóstico para predizer eventos cardiovasculares (Schachinger et al., 2000; Dong et al., 2015), como elevação da pressão arterial (Ribeiro et al., 1992; Paulis et al., 2008), redução do diâmetro interno arterial, aumento da resposta aos componentes dos fatores contráteis derivados do endotélio e aumento da resistência periférica (Paulis et al., 2010).
Os dados aqui apresentados in vivo complementam os resultados apresentados por Almeida (2013), que observou aumento da pressão arterial. Naquele estudo, observou-se também menor biodisponibilidade de óxido nítrico em aortas torácicas isoladas de animais submetidos ao estresse crônico. Os dados obtidos no presente estudo e os resultados de Almeida confirmam a efetividade do ECMI no desenvolvimento de alterações cardiovasculares.
Considerando os efeitos do estresse sobre as alterações fisiológicas, estudos que abordam a relação entre estresse e ciclo circadiano têm sido cada vez mais discutidos na literatura (Koch et al., 2017; Douma e Gumz, 2017). Diante disso, também analisamos no presente estudo, as implicações do ECMI sobre as variações da pressão arterial sistólica, diastólica, média e frequência cardíaca durante o ciclo claro e escuro.
Por várias décadas, se sabe que as funções do nosso organismo são coordenadas por um relógio biológico localizado no sistema nervoso central (SNC): núcleo supraquiasmático do hipotálamo (Moore e Eichler, 1972; Stephan e Zucker, 1972; Ralph et al., 1990; Buijs, et al., 2016). Esse relógio recebe informações de luz através das células da retina (Provencio et al., 2000). Essas informações de tempo são passadas para os tecidos periféricos subordinados via sinais humorais e neuronais, regulando os ritmos circadianos do organismo por 24hs de acordo com o ciclo claro e escuro (Buijs et al., 2003; Welsh et al., 2004; Yoo et al., 2004; Liu et al., 2007). Sendo assim, a pressão arterial (Douma e Gumz, et al., 2017), assim como, a atividade do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal e a liberação de glicocorticoides e catecolaminas é regulada de acordo com o ciclo (Koch et al., 2017).
Em nosso estudo, durante três semanas consecutivas de aplicação do protocolo ECMI houve inversão do ciclo claro e escuro às sextas-feiras, sábados e domingos e iluminação contínua durante a noite às segundas-feiras, e observou-se diferença na amplitude da pressão arterial sistólica, diastólica e média dos mesmos animais, durante e após aplicação do protocolo ECMI.
No período escuro os animais apresentaram maior amplitude da pressão arterial durante todo período experimental, estando de acordo com estudos realizados por Segreti et al., (2016) que ao avaliar simultaneamente a pressão arterial e a pressão ventricular esquerda de ratos por 14 dias, observou maior amplitude da pressão arterial durante a noite. Segundo nossos resultados,
observou-se diferença estatística entre a pressão arterial sistólica, diastólica e média durante todo protocolo experimental. Esses dados mostram que o protocolo ECMI não alterou a variação circadiana da pressão arterial desses animais. Este feito foi mais intenso sobre a variação circadiana da frequência cardíaca, pois a partir da segunda semana do protocolo ECMI não houve mais diferença na frequência cardíaca entre os períodos claro e escuro.
Estudos que abordam a influência de fatores ambientais como estressores que promovem desalinhamento do ritmo circadiano apontam a luz como o mais potente estressor circadiano (Koch et al., 2017). Um pequeno pulso de luz administrado em roedores durante a noite induziu aumento na concentração plasmática de corticosterona 60 minutos após início da estimulação. Este aumento foi descrito como independente da liberação do hormônio adrenocorticotrofina (ACTH) em camundongos (Ishida et al., 2005) e dependente em ratos via ativação do eixo hipotálamo- hipófise- adrenal (Mohawk et al., 2007).
Além dos efeitos hormonais observados durante a aplicação de estímulos estressores, Aslani et al., (2014) ao submeter ratos ao protocolo ECMI durante a fase de inatividade (durante o dia) observou sintomas relacionados à ansiedade e depressão (anedonia), porém quando aplicados os mesmos estímulos durante a fase de atividade (durante a noite) esses sintomas não foram desencadeados. Outros estressores como cheiro de gato, imobilização, choque na cauda também tiveram maior impacto se aplicado repetidamente durante a fase inativa (Cohen et al., 2015; Fonken et al., 2016). Estudos cujo objetivo foi mimetizar o estresse psicológico social em humanos, ocasionado por conflitos sociais, apresentou maior impacto se realizados durante a fase de atividade (noite) (Bartlang et al., 2012, 2014, 2015), ao contrário, as respostas aos efeitos metabólicos como ganho de peso foram observados em animais expostos ao estresse durante a fase inativa ou o tempo todo ( Ramirez-Zacarias et al.,1992; Harris, 2015).
Considerando que a interrupção do ritmo circadiano tem sido cada vez mais frequente na sociedade com o aumento do trabalho por turnos, estudos em humanos que buscam entender os efeitos do desalinhamento circadiano observaram aumento significativo da pressão arterial sistólica e diastólica, assim como da proteína C-reativa (PCR) um marcador de inflamação sistêmica em trabalhadores com troca de turno (Morris et al., 2016, 2017). Esse mesmo grupo de pesquisa expôs indivíduos saudáveis ao longo de 8 dias ao desalinhamento circadiano para avaliar os marcadores de risco cardiovasculares. Os sujeitos da pesquisa exibiram aumento na concentração sanguínea de PCR, interleucina-6, resistina e TNFα. Os níveis de interleucina-6, resistina e TNFα demonstraram estar envolvidos na progressão da hipertensão através da ativação inflamatória e disfunção endotelial (Fang et al., 2013).
Além dos efeitos cardiovasculares e inflamatórios provocados pelo desalinhamento circadiano, evidências sugestivas apontam o trabalho por turno como preditor no desenvolvimento de doença cardíaca coronária (Wang et al., 2011; Vetter et al., 2016) distúrbios metabólicos e câncer (Wang et al., 2011).
Com base em nossos resultados, o presente estudo demostrou que o estresse crônico moderado e imprevisível e alterações no ritmo circadiano são fatores importantes para elevação da pressão arterial sustentada e que mecanismos adaptativos de controle da pressão arterial foram acionados evidenciados pela diminuição da frequência cardíaca. Sendo assim, observando a importância da pressão arterial e do ritmo circadiano no impacto da saúde da sociedade moderna, estudos que abordam a interação entre ritmo circadiano, estresse e pressão arterial precisam melhor ser investigados.
7 CONCLUSÃO
A telemetria mostrou-se uma ferramenta importante no monitoramento da pressão arterial e frequência cardíaca de ratos submetidos ao protocolo ECMI, pois permitiu detalhar, ao longo dos dias e semanas de aplicação dos estímulos estressores, a evolução e o comportamento desses parâmetros, de maneira mais precisa.
Considerando os resultados obtidos, o protocolo ECMI induziu elevação mantida da pressão arterial sistólica, diastólica e média, porém mecanismos compensatórios de regulação da pressão arterial foram evidenciados pela diminuição da frequência cardíaca, durante e após a aplicação do protocolo de estresse.
O ECMI também foi capaz de alterar a amplitude da frequência cardíaca durante a segunda e terceira semana de aplicação dos estímulos estressores, evidenciando o estresse como fator importante no desalinhamento do ritmo circadiano da pressão arterial e frequência cardíaca, contribuindo para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares como a hipertensão.
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Bartlang MS, Neumann ID, Slattery DA, Uschold-Schmidt N, Kraus D,Helfrich-Förster C, Reber SO. Time matters: pathological effects of repeated psychosocial stress during the active, but not inactive, phase of male mice. J Endocrinol. 2012 Dec;215(3):425-37. doi: 10.1530/JOE-12-0267.
Bartlang MS, Oster H, Helfrich-Förster C. Repeated psychosocial stress at night affects the circadian activity rhythm of male mice. J Biol Rhythms. 2015 Jun;30(3):228-41. doi: 10.1177/0748730415576192.
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