Estudo da relação entre a proliferação celular e a expressão da Cox-2 em mastocitomas caninos

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Estudo da relação entre a proliferação celular e a

expressão da Cox-2 em mastocitomas caninos

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Andrea Cristina Vilela Ferreira

Orientador: Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira

Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Estudo da relação entre a proliferação celular e a

expressão da Cox-2 em mastocitomas caninos

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Andrea Cristina Vilela Ferreira

Orientador: Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira

Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Estudo da relação entre a proliferação celular e a

expressão da Cox-2 em mastocitomas caninos

Dissertação de Mestrado em Biologia Clínica Laboratorial

Andrea Cristina Vilela Ferreira

Orientador: Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira

Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires

Composição do Júri:

_________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________

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“As Doutrinas expostas no presente trabalho são da exclusiva responsabilidade do autor”

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Resumo

A pele do cão, em estado fisiológico, contém 4 a 12 mastócitos por campo de maior ampliação, localizando-se preferencialmente na derme e junção dermoepidérmica.

O mastocitoma é a neoplasia cutânea mais frequente no cão tendo um comportamento biológico muito diverso.

Vários autores têm pesquisado sobre parâmetros clínicos ou patológicos que possam ser meios úteis de diagnóstico / prognóstico. No entanto, o conhecimento biopatológico desta doença é ainda insuficiente, sendo a elaboração de novos estudos de elevada importância.

O objectivo principal deste trabalho é averiguar a existência de uma associação entre o índice de proliferação celular (medido pelo Ki-67) e a expressão da ciclooxigenase-2 (Cox-2), tentando compreender os mecanismos envolvidos na progressão tumoral dos mastocitomas caninos.

Foram analisados 50 tumores (15 de grau I, 17 de grau II e 18 de grau III), nos quais foram avaliados alguns parâmetros epidemiológicos e clínicos, como a raça e o sexo dos animais e o tamanho do tumor. Avaliou-se a proliferação tumoral (pelo Ki-67) e a presença da enzima ciclooxigenase-2 por métodos imunohistoquímicos.

A análise estatística efectuada revelou a existência de associações estatisticamente significativas. Tumores de maior grau histológico (p < 0,0001), de maior tamanho (r = 0,451,

p = 0,001) e com maior número de aberrações celulares (p < 0,0001) eram mais proliferativos. Também mastocitomas que apresentavam maior índice de proliferação eram mais ulcerados (p < 0,0001), possuíam maior actividade juncional (p = 0,01), maior crescimento infiltrativo (p < 0,0001), maior número de mitoses (r = 0,748, p < 0,0001) e menor quantidade de estroma (p = 0,01).

Quanto maior o grau histológico (p = 0,012) do tumor, maior a intensidade de marcação por Cox-2. Mastocitomas marcados mais intensamente por Cox-2 eram mais ulcerados (p = 0,015), tinham menos quantidade de estroma (p = 0,007) e apresentavam mais aberrações celulares (p = 0,004).

O presente estudo demonstra que o índice de proliferação celular, Ki-67 e a intensidade de marcação pela Cox-2 são duas variáveis que se associam de forma estatisticamente significativa (p = 0,04).

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Assim, este resultado sugere que a Cox-2 poderá estar envolvida na progressão tumoral dos mastocitomas, e um dos mecanismos envolvidos poderá ser a modulação da proliferação das células tumorais.

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Abstract

The dog skin in physiological sate has 4 to 12 mast cell in a higher magnification field, locating preferentially in the dermis and in the dermal-epidermal junction.

Mast cell tumors are the cutaneous neoplasms most common in dogs and it has a very diverse biological behavior.

Several authors have been researching about clinical or pathological parameters that could be usefull means of diagnosis / prognosis. However, knowledge of the biopathology of this disease is still insufficient, so is important the elaboration of more studies.

The main purpuse of this study is to investigate a possible connection between the cell proliferation index (measure by Ki-67) and the expression of cyclooxygenase-2 (Cox-2), trying to understand the mechanisms that are involved in the tumoral progression of canine mast cell tumors.

50 tumors were analyzed (15 of grade I, 17 of grade II and 18 of grade III). Epidemiological and clinical parameters like race and gender of the dogs and tumor size were evaluated. Imunohistochemical tests were also performed to analyze the tumoral proliferation (by Ki-67) and the expression of Cox-2.

The statistical analyses reveled the existence of statistical significant associations. Tumors of higher histological grade (p < 0,0001), of larger size (r = 0,451, p = 0,001) and with a higher number of cellular aberrations (p < 0,0001) were more proliferative. Also mast cell tumors that presented higher proliferation index were more ulcerated (p < 0,0001), had more junctional activity (p = 0,01), greater infiltrative growth (p < 0,0001), higher mitoses number (r = 0,748, p < 0,0001) and less stroma (p = 0,01).

The biggest the histological grade (p = 0,012) of the tumor, the biggest the intensity labelling by Cox-2. Mast cell tumors that were labelled more sorely by Cox-2 were more ulcerated (p = 0,015), had fewer stroma quantity (p = 0,007) and presented more cellular aberrations (p = 0,004).

This study shows that the cellular proliferation index Ki-67 and the intensity labelling by Cox-2 are two parameters that are statistically significant (p = 0,04). The results suggest that Cox-2 may be involved in the tumoral progression of canine mast cell tumors, and one of the engaged mechanism could be the modulation of tumoral cells proliferation.

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Índice geral

Resumo ……….iii

Abstract ……….. ………...v

Índice geral………...vi

Índice de quadros e figuras ………...viii

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos……….…....ix

Agradecimentos ………...…...x

1. Introdução ………...1

1.1. Mastócitos……….……….………...1

1.2. Mastocitomas ……….………...1

1.3. Índice de proliferação celular: Ki-67……….. ………....4

1.4. Ciclooxigenase 2 ………....5

2. Objectivos ……….... 9

3. Material e Métodos ………10

3.1. Material………...10

3.2. Métodos………...10

3.2.1. Determinação do índice mitótico……….….10

3.2.2. Análise histológica……….10

3.2.3. Análise imunohistoquímica………...11

3.2.4. Avaliação da imunorreactividade…. ………. 13

3.2.5. Determinação da fracção proliferativa pelo Ki-67……….13

3.2.6. Avaliação da Cox-2 ………..14

3.2.7. Avaliação de outras variáveis…….……….….15

3.2.8. Avaliação de variáveis epidemiológicas e clínicas………..16

3.2.9. Análise estatística………...17

4. Resultados ………...18

4.1. Dados epidemiológicos e clínicos ………18

4.1.1 Sexo………..18

4.1.2 Raça……….18

4.1.3 Tamanho………..18

(10)

4.3.1. Proliferação celular pelo Ki-67……….20

4.3.2. Cox-2: extensão da marcação………...20

4.3.3. Cox-2: intensidade da marcação………..20

4.4. Associações estatísticas ………...21

4.4.1. Associação entre o grau histológico e as variáveis clínicas e histológicas………...21

4.4.2. Associação entre o grau histológico e as variáveis imunohistoquímicas (Ki-67 e Cox-2)..………...21

4.4.3. Associação entre o índice de proliferação celular Ki-67 e as variáveis histológicas………...22

4.4.4. Associação entre intensidade de marcação de Cox-2 e as variáveis clínicas e histológicas………...24

4.4.5. Associação entre Cox-2 e Ki-67………25

5. Discussão ………....26

6. Conclusões ………..32

(11)

Índice de figuras

Figura 1: Imagem de uma preparação histológica de mastocitoma com marcação pelo

anticorpo anti-Ki-67 (400x)………..14

Figura 2: Imagem de uma preparação histológica com marcação citoplasmática moderada pela Cox-2 (400x)………. 14

Figura 3: Associação entre o grau histológico e a intensidade de marcação da Cox-2……...22

Índice de quadros

Quadro 1: Critérios de classificação histopatológica dos mastocitomas cutâneos…………..11

Quadro 2: Variáveis imunohistoquímicas categóricas e contínuas ………....15

Quadro 3: Variáveis histológicas categóricas e contínuas ………...…..16

Quadro 4: Variáveis epidemiológicas e clínicas, categóricas e contínuas ……….17

Quadro 5: Distribuição dos diferentes parâmetros histológicos pela totalidade da amostra e pelos diferentes graus………19

Quadro 6: Distribuição das variáveis contínuas mitoses e tamanho, pelos diferentes graus………..20

Quadro 7: Avaliação da imunorreactividade à proteína Ki-67………...20

Quadro 8: Avaliação da imunorreactividade à enzima Cox-2……….21

Quadro 9: Associação entre o grau histológico e o índice Ki-67………22

Quadro 10: Associação entre o índice de proliferação celular Ki-67 e variáveis clínico histológicas………23

Quadro 11: Associação entre a intensidade de marcação da Cox-2 e as variáveis clinico histológicas………...24

Quadro 12: Associação entre a intensidade de marcação da Cox-2 e as variáveis contínuas mitoses e tamanho……….25

Quadro 13: Associação entre intensidade de marcação de Cox-2 e o índice de Ki-67…...………25

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Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

μl – Microlitro μm – Micrometro χ2 – Teste Qui-quadrado

AINEs – Anti inflamatórios não esteróides ADN – Ácido desoxirribonucleico

ANOVA – Análise de variância

CD2 (LFA2) – Cluster of differentiation 2 Cox – Ciclooxigenase

Cox-1 – Ciclooxigenase 1 Cox-2 – Ciclooxigenase 2

DAB - Tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina d.p. – Desvio padrão

IgE – Imunoglobulina E Kd- Kilodalton

Ki-67 – proteína Ki-67

MIB-1- Mindbomb E3 ubiquitin protein ligase 1 n- Número de observações

p - Nível de significância estatística PBS - Tampão fosfato salino PGE2- Prostaglandina 2

PGI2 – Prostaciclina

pH – Potencial de hidrgénio r- Coeficiente de correlação ® – Marca registada

SCF - Stem Cell Factor SRD - Sem raça definida

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Agradecimentos

Durante um ano de trabalho todos os que nele se envolvem, de algum modo, passam por bons e maus dias. No final, é reconfortante perceber que todos os maus momentos se ultrapassaram e resta a alegria de dever cumprido. Pelas circunstâncias da vida este ano foi muito especial. Também considero especiais as pessoas que me ajudaram durante o seu curso.

À minha orientadora Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira, agradeço por ter aceitado a tarefa de me orientar. Obrigada pela compreensão, atenção, tempo e sabedoria investidos.

À minha co-orientadora Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires, agradeço além do tempo dedicado, os ensinamentos, a paciência e a tolerância.

A todo o pessoal do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro pela ajuda prestada sempre que foi precisa.

Às colegas Keily e Helena, porque sem a sua ajuda, a realização deste trabalho teria sido muito mais custosa.

Aos meus tios Nilza e Isidro, pelas suas palavras de incentivo, por todo o carinho e fico por aqui, ou teria que escrever outra tese para conseguir explicar o que significa tudo que fizeram por mim...

À Inês e ao Marco, pela paciência, pelas palavras de ânimo nos momentos mais complicados, por não me deixarem desistir, por toda a amizade e carinho que sei que sentem por mim.

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Estudo da relação entre a proliferação celular e a expressão da Cox-2 em mastocitomas caninos

1. Introdução

1.1. Mastócitos

Os mastócitos são células localizadas no tecido conjuntivo, principalmente, perto dos capilares sanguíneos e, nos locais de potencial entrada de microorganismos no corpo, como pele, pulmões, tubo digestivo e vias genito-urinárias (Seeley, 2001; Burkitt, 1994). São células com origem na medula óssea, que induzem a inflamação através da libertação de mediadores químicos (Seeley, 2001).

Estas células possuem uma grande quantidade de receptores da imunoglobulina E (IgE), pelo que são associadas à imunidade adquirida e atopia. Por outro lado, os seus receptores acoplados à proteína G, transmitem sinais derivados da activação do complemento, de danos de tecidos, inflamação e isquemia, colocando assim os mastócitos no centro da resposta imune inata e processos inflamatórios crónicos (Laffargue et al, 2002). O mesmo autor sublinha que os mastócitos são activados pela IgE.

Um estudo realizado em indivíduos com cancro do pulmão, mostra que algumas das substâncias produzidas pelos mastócitos aceleram o crescimento do mesmo. Provou-se que produtos como a histamina, factor de crescimentos dos fibroblastos e a heparina são promotores da angiogénese tumoral. E, mais recentemente, também se sabe que a triptase dos mastócitos é um potente factor angiogénico (Tomita et al, 2000).

Estas células foram descritas pela primeira vez em cães no ano 1905 por Bashford (Strefezzi, 2009). A pele do cão, em estado fisiológico, contém 4 a 12 mastócitos por campo de maior ampliação, apresentando-se em maior número no pavilhão auricular e no focinho, e localizando-se preferencialmente na derme e na junção dermoepidérmica (Oliveira, 2008).

1.2. Mastocitomas

O mastocitoma é a neoplasia cutânea mais frequente no cão, compreendendo 10 a 15% dos tumores cutâneos caninos e 11 a 27% das neoplasias malignas. Esta neoplasia em termos biológicos comporta-se de modo diversificado, variando de uma massa benigna até uma doença metastizante e fatal (Oliveira, 2008).

Os mastocitomas cutâneos podem surgir da derme ou do tecido conjuntivo subcutâneo, apresentando diversas características macroscópicas, facto que dificulta ou impossibilita fazer

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previsões sobre o comportamento deste tipo de neoplasia, quando se tem por base apenas estas características (Strefezzi et al., 2010).

Devido à difícil previsão do comportamento biológico e, consequentemente, de definição dos tratamentos a efectuar, a pesquisa de indicadores prognósticos (e diagnósticos) mais precisos para o mastocitoma cutâneo canino tem vindo a intensificar-se nos últimos anos (Oliveira, 2008).

Diversos estudos revelam uma mutação do gene c-kit que codifica o domínio justamembranar do receptor tirosina-cinase do stem cell factor (SCF), em mastócitos neoplásicos de cães (Bariani et al., 2007). A principal mutação descrita em estudos realizados com humanos e em roedores foi uma duplicação que leva à fosforilação constitutiva do receptor, sem necessidade de ligação com SCF. Isto explica o crescimento descontrolado dos tumores e a relação positiva das duplicações com a malignidade do mastocitoma (Zemke et

al., 2002).

Um estudo realizado, por Schernthaner et al, no ano de 2001, sugere que os mastócitos de indivíduos com mastocitose sistémica, expressam um antigénio cluster of differentiation 2 (CD2 ou LFA2) reactivo. Os autores consideraram este facto muito relevante já que o CD2 tem expressão fisiológica em timócitos, células T activadas e num subgrupo de células

natural killer, enquanto que os mastócitos normais e outras células mielóides são,

aparentemente, CD2 negativas.

A etiologia dos mastocitomas, não sendo ainda totalmente compreendida, parece ser multifactorial. Mas, o facto de haver raças predispostas, indica a existência de um componente genético. Noutros casos, mastocitomas foram relacionados com inflamações crónicas, aplicação de substâncias irritantes na pele e até mesmo etiologia viral (De Oliveira, 2011).

O diagnóstico é realizado recorrendo a uma citologia, após colheita do material por aspiração por agulha fina, sendo a coloração aconselhada o azul de toluidina, uma vez que esta é das que melhor cora os grânulos dos mastócitos, principalmente em tumores pouco diferenciados nos quais a quantidade de grânulos é insuficiente para poderem ser detectados utilizando outros métodos de coloração (Strefezzi et al, 2009). No entanto, uma biopsia excisional deve ser efectuada para elaborar a gradação tumoral (Oliveira, 2008).

Relativamente ao prognóstico, o grau histológico tem sido considerado o critério mais consistente, entre as variáveis histopatológicas. O sistema de gradação histológico mais

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utilizado é o de Patnaik mas, têm-se verificado diversos problemas na compreensão dos critérios descritos nesta classificação (Oliveira, 2008). Consideram-se 3 graus histológicos:

Grau I: Tumor bem circunscrito, não capsulado, epiderme intacta, células pequenas, núcleos pequenos redondos a ovais, nucléolos indistinguíveis, mitoses raras.

Grau II: Células pleomórficas, maiores e em camadas mais profundas do que os de grau I, núcleos moderadamente aumentados, nucléolos óbvios mas pequenos, baixa actividade mitótica.

Grau III: Células grandes e pleomórficas. Localizam-se mais profundamente no tecido sub-cutâneo, margens celulares indistinguíveis, núcleos grandes redondos a ovais, nucléolos proeminentes, moderada actividade mitótica com mitoses atípicas.

Este sistema de classificação dos mastocitomas em graus tem vindo a mostrar a existência de uma grande subjectividade, como confirmam investigações realizadas (Northrup et al., 2005), existe uma discrepância significativa (de 50,3% a 62,1%) entre patologistas experientes, no que se refere à distribuição dos tumores pelos três graus.

Romansik et al., (2007), confirma que existe um desacordo em padronizar o grau histológico como meio de inferir sobre o prognóstico dos mastocitomas, pelo motivo acima descrito.

Ainda no que toca ao valor preditivo do grau histológico referente ao prognóstico dos mastocitomas caninos (em termos de recorrência local dos tumores), existem estudos com resultados contraditórios (Séguin et al., 2006). Lesões tumorais classificadas com grau II apresentam um comportamento biológico mais variado do que tumores com grau I e grau III. O mesmo autor explica que tumores de grau I têm usualmente bom prognóstico e tumores de grau III costumam metastizar. Assim, são as lesões de grau II que deixam maiores dúvidas quanto ao prognóstico da doença e, estuda-se se indicadores de proliferação celular poderão oferecer um meio de análise que permita separar entre tumores deste grau, os mais dos menos agressivos.

Uma outra investigação efectuada por Preziosi et al., (2007), avaliou cada parâmetro histopatológico usado para formular os graus de Patnaik e testou a sensibilidade de cada um deles em termos de prognóstico, tentando perceber quais poderiam ser usados para inferir sobre a recorrência do tumor e na sobrevivência de cães com mastocitoma cutâneo. Os resultados demonstraram que, entre os critérios analisados, o crescimento invasivo e o número de mitoses têm uma elevada significância no prognóstico e podem ser indicadores de

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confiança, evitando o uso de parâmetros mais subjectivos como a diferenciação celular e a morfologia nuclear.

Para a avaliação do mastocitoma são ainda usadas, entre outras, várias características histológicas como a presença de ulceração microscópica, a quantidade de estroma, a presença de aberrações celulares, a degradação de colagénio, a actividade juncional, o número de mitoses e tamanho do tumor (Oliveira, 2008).

De acordo com Oliveira, (2008), o tratamento mais comum é a excisão cirúrgica do tumor. Se este não for completamente removido, aconselha-se radioterapia, em mastocitomas de grau I ou II. Mas, no caso dos tumores serem indiferenciados, é aconselhada remoção cirúrgica agressiva e a utilização de tratamentos pós-cirúrgicos, como o uso de quimioterapia.

1.3. Índice de proliferação celular: Ki-67

A proteína Ki-67 é uma proteína não histónica, com peso molecular de cerca de 345 a 349 Kd que apresenta uma vida média de 1 hora e está codificada no cromossoma 10 (em humanos). O seu nome tem origem na sua descoberta que ocorreu em Kiel, na 67ª placa de cultura (Barbosa et al., 2003). A proteína Ki-67 foi inicialmente identificada como um antigénio que era reconhecido pelo anticorpo monoclonal Ki-67, estando presente nos núcleos de células nas fases G1, S, G2 e M do ciclo celular, mas não na fase G0. O Ki-67 é vital para a proliferação celular, já que a sua remoção (usando nucleótidos antisense) bloqueia a mitose (Hongyuan et al., 2003). O mesmo autor refere que o Ki-67 desempenha um papel importante na organização da cromatina. A expressão antigénica do Ki-67 atinge o máximo nas fases G2 / M (Vieira et al., 2009).

Zuccari et al., (2008) concluiu que avaliar a proliferação celular através do Ki-67 é vantajoso já que tumores com maior índice de proliferação são mais agressivos. Este índice pode ainda oferecer uma informação de natureza preditiva significativa na utilização de quimioterapia adjuvante.

Num estudo realizado em cancro de mama (em humanos), concluiu-se que o índice de Ki-67 era significativamente maior em tumores malignos do que em não malignos (Wintzer et

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Já em mastocitomas caninos, vários estudos referem que a imunoexpressão de Ki-67 tem uma associação significativa quer com o grau histológico, quer com a taxa de sobrevivência (Oliveira, 2008; Poggiani et al., 2012; Vascellari et al., 2013).

Num outro estudo, Scase et al., (2006), concluiu que o índice de proliferação Ki-67 mostrou ser um indicador prognóstico independente do grau histológico de Patnaik, para mastocitomas cutâneos caninos. A descoberta mais importante deste estudo foi que é possível dividir mastocitomas de grau II com base na expressão do Ki-67, sendo que cães com tumores que expressem Ki-67 > 1,8 têm uma taxa de sobrevivência substancialmente menor (aos 1, 2 e 3 anos) do que cães com tumores que tenham Ki-67 inferior a 1,8.

Ozaki et al., (2007), também concluiu que o Ki-67 pode ser usado como um marcador para estimar a sobrevivência em casos de excisão cirúrgica incompleta de tumores. Mas, não encontraram resultados que suportem que este índice por si só possa ser usado como factor de prognóstico para recorrência local em tumores de grau histológico II.

Outros estudos ainda, referem o Ki-67 como o preditor clínico do comportamento biológico de neoplasias malignas, porque este permite diagnosticar a síntese de ADN do tumor com o aumento da marcação de células malignas por este antigénio (Barbosa et al., 2003).

A avaliação deste índice é um método usado em vários laboratórios de patologia, por ser relativamente barato e de fácil realização, mas, a subjectividade na avaliação dos resultados e o facto de estar presente em células em proliferação, quer tumorais, quer normais têm sido apontadas como principais limitações (Azambuja, 2007).

1.4. Ciclooxigenase 2

O papel da enzima ciclooxigenase-2 (Cox-2) em tumores tem sido objecto de diversificados estudos, visto existir uma relação entre a sua expressão e o desenvolvimento de neoplasias. Esta isoenzima costuma estar ausente na maioria das células não neoplásicas e a sua expressão é provocada por factores de crescimento, reacções inflamatórias, promotores de tumores e vários oncogenes (Prada et al., 2011).

Foram inicialmente identificadas duas isoformas das ciclooxigenases (Cox): a ciclooxigenase-1 (Cox-1) e a Cox-2. As duas possuem uma estrutura proteica similar, mas são codificadas por genes distintos e têm diferentes funções biológicas. A Cox-1 é expressa constitutivamente em muitos tecidos tendo um importante papel na regulação de funções

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fisiológicas normais (Pires et al., 2010). Já a Cox-2 está geralmente ausente de células normais, sendo induzida a sua produção pelos factores referidos anteriormente por Prada et al. (2011) e também por radicais livres de oxigénio e radiação ultravioleta, acrescenta Garcia, (2009). A isoforma Cox-2 também tem expressão constitutiva em alguns tecidos: placenta, mácula densa renal e cérebro (Garcia, 2009). Mais recentemente foi descrita uma terceira Cox, designada ciclooxigenase-3, que é expressa no coração e no córtex cerebral (Bersano, 2006).

A Cox-1 e a Cox-2 quer em termos da sua estrutura biológica, quer da sua enzimologia são ambas homodiméricas, apresentam grupo heme e são proteínas glicosadas com dois locais activos (Smith et al., 1996).

As ciclooxigenases são enzimas que catalizam a produção de prostaglandinas a partir do ácido araquidónico. (Bersano, 2006). Costa, (2009), completa que as Cox são bifuncionais, já que além da actividade descrita anteriormente, estas também funcionam como peroxidases.

Carvalho et al. (2004) explica que a síntese de prostaglandinas pode ser despoletada por vários estímulos que activam receptores membranares acoplados a proteína G, o que resulta na activação da fosfolipase A2 (ou no aumento da concentração de Ca2+ intracelular).

A fosfolipase A2 actua nos fosfolípidos membranares, hidrolisando em particular a

fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina, o que leva à libertação do ácido araquidónico. Este, por sua vez será usado como substrato nas vias enzimáticas das ciclooxigenases.

As enzimas Cox-1 e Cox-2 apresentam uma subtil diferença no que se refere ao requerimento de ácido araquidónico: baixas concentrações deste ácido são favoráveis à acção da Cox-2 (Tanioka et al., 2000).

Foi demonstrado que alguns dos receptores de prostaglandinas se podem também localizar na membrana nuclear e os seus ligandos actuam como factores de transcrição, nomeadamente o estudo em causa refere que a prostaciclina (PGI2) é um ligando endógeno

que estimula a transcrição dos activadores de proliferação do peroxissoma que são responsáveis pela regulação do metabolismo lipídico, pela diferenciação e proliferação celular (Carvalho et al., 2004).

Particularmente, a acção da Cox-2 leva a um aumento da produção de prostaglandinas, como a prostaglandina E2 (PGE2), o que provoca uma diminuição da resposta imunitária. Este

facto dificulta a eliminação de células neoplásicas; bem como leva à ocorrência de um decréscimo na actividade de linfócitos T, de macrófagos, da produção de anticorpos e de

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relacionada com o desenvolvimento de imunossupressão e com o estímulo do crescimento dos tumores.

Um estudo realizado por Prada et al. (2011) mostra que a Cox-2 é expressa em mastocitomas cutâneos caninos. Os resultados deste estudo divergiram dos resultados de um estudo anterior mas, foi utilizado um anticorpo primário diferente em cada uma das investigações.

Está provado que os anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) afectam directamente a acção das Cox, ou modificando as ligações covalentes da enzima, ou competindo com o substrato pelo seu centro activo (Garcia, 2009). No entanto, ao tentar bloquear a acção da Cox-2, muitas vezes bloqueiam também a acção da Cox-1, facto indesejável, pois leva à ocorrência de efeitos adversos como lesões renais agudas por diminuição da perfusão renal ou quadros gastro-intestinais (Muro et al., 2008).

O local de ligação dos inibidores da Cox-2 é estruturalmente maior do que o da Cox-1, factor que tem levado ao desenvolvimento de agentes que bloqueiam especificamente a acção da Cox-2 e não da Cox-1 (Kummer et al., 2002). Os inibidores selectivos da Cox-2 têm hoje um particular interesse dado que estes fármacos tendem a diminuir a síntese de prostaglandinas através da sua inibição, logo anulando a proliferação celular (Garcia, 2009).

Millanta et al., 2006 refere que existem estudos que descrevem inibidores específicos da Cox-2 como responsáveis pela redução completa ou parcial do tamanho de neoplasias, nomeadamente em carcinoma de células transicionais da bexiga e em carcinoma das células escamosas orais (ambos em cães), o que indica a Cox-2 como um potencial alvo para a terapêutica de diversos tumores.

Hiroyoshi et al., (2006), reforça que os inibidores da Cox-2 têm sido recentemente alvo de estudos que os investigam como possíveis agentes de tratamento para tumores malignos. E vários estudos já realizados, como o de De Nardi, (2006) em neoplasia da mama, o de Millanta et al., (2006) em carcinoma mamário invasivo, e os de Miyashita et al., (2006) e Takatori et al., (2007), ambos em carcinoma das células escamosas do esófago, confirmam que a imunorreactividade da Cox-2, vai aumentando com o grau de malignidade dos tumores. Um outro estudo (em cancro cervical humano) efectuado por Ferrandina et al., (2003), investigou se um curto tratamento com inibidores da Cox-2 iria exercer alguma acção modulante na expressão antigénica do Ki-67 (e da clivagem de um marcador de apoptose), e os resultados mostraram que o uso de inibidores faz diminuir quer a expressão da Cox-2, quer do marcador de proliferação celular.

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O trabalho desenvolvido por Millanta et al., (2006) tinha como finalidade avaliar a possível existência de uma correlação entre a expressão de Cox-2 e algumas características clínico-patológicas e marcadores moleculares prognósticos em carcinomas mamários invasivos (em cães e gatos). Este autor refere que uma das conclusões mais importantes do seu trabalho foi que quando a expressão de Cox-2 era mais elevada, o prognóstico era pior, em ambas as espécies. E, explica que, tal como em oncologia humana, a Cox-2 tem capacidade de induzir formação de metástases, promovendo, por exemplo, a produção e activação de metaloproteinases de matriz. Afirma ainda que a Cox-2 parece estar envolvida nos processos de progressão tumoral, afectando a proliferação e adesão celulares, a vigilância imunitária, a mitose, a apoptose e a angiogénese.

(22)

2. Objectivos

Com a realização deste trabalho pretende-se fazer uma análise dos seguintes aspectos: -Estudar a expressão da Cox-2 e a proliferação tumoral (medida pelo Ki-67), através de estudos de imunohistoquimica.

-Avaliar a relação entre a expressão da Cox-2 e a proliferação tumoral com várias características clínico-patológicas

-Aferir sobre a associação existente entre a expressão de Cox-2 e a proliferação tumoral (pelo Ki-67) e interpretar os resultados dessa associação.

(23)

3. Material e métodos

3.1. Material

Neste estudo foram analisados 50 mastocitomas dos arquivos do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.

3.2. Métodos

3.2.1. Determinação do índice mitótico

Foi estudado o índice mitótico, o qual foi avaliado analisando em cinco campos de maior ampliação (40x) e efectuando a média do número de mitoses nesses campos, utilizando a coloração de azul de toluidina.

3.2.2. Análise histológica

Os tumores foram classificados em três graus histológicos, de acordo com a categorização proposta pela Organização Mundial de Saúde que considera como grau I tumores bem diferenciados, como grau II tumores diferenciados moderadamente e como grau III tumores indiferenciados. Os critérios de classificação histopatológica avaliados, foram os a seguir descritos no quadro 1, e seguem as normas utilizadas por Oliveira, (2008):

(24)

Quadro 1: Critérios de classificação histopatológica dos mastocitomas cutâneos

Grau I Grau II Grau III

Localização histológica

Derme e espaço interfolicular

Derme profunda e tecido subcutâneo; alguns estendem-se aos tecidos envolventes

Substitui o tecido subcutâneo e os tecidos profundos Morfologia celular Redondas, monomórficas, citoplasma percetível, com grânulos de tamanho médio Redondas a ovóides, moderadamente pleomórficas, com células fusiformes dispersas e células gigantes; maioria com contorno celular distinto e grânulos finos; algumas têm contorno indistinto, grânulos grandes e hipercromáticos

Redondas, ovóides, ou fusiformes, pleomórficas, de tamanho médio; citoplasma indistinto com grânulos finos e não óbvios; muitas células gigantes e células multinucleadas Morfologia nuclear Redondo, com cromatina condensada

Redondo a indentado com cromatina dispersa e nucléolo único; algumas com duplo núcleo Indentado a redondo vesiculado, com um ou mais nucléolos proeminentes; células binucleadas comuns Organização, celularidade e reacção do estroma Organizadas em cordões ou pequenos grupos, separadas por colagénio dérmico maduro Moderada a altamente celulares, organizadas em grupos com um fino estroma fibrovascular (por vezes espesso e fibrocolagenoso com áreas de hialinização) Celular, organizada em toalha, compacta; estroma fibrovascular ou espesso e fibrocolagenoso com áreas de hialinização

Mitoses _Nenhuma Raras (0-2/campo de maior

ampliação)

Comuns (3-6/campo de maior ampliação)

Edema e

necrose Mínima

Áreas de edema difuso e necrose

Edema, hemorragia e necrose comuns

Adaptado de Oliveira, (2008).

3.2.3. Análise imunohistoquímica

Para a análise imunohistoquímica foram utilizadas amostras preservadas em formol a 10%, incluídas em parafina. No micrótomo foram realizados cortes seriados de cada um dos tumores com 3 µm de espessura, que foram colocados em lâminas revestidas com solução de Silane (3-Aminopropyltriethoxysilane, Sigma ®), de acordo com a metodologia convencional. Antes de estarem preparados para a realização da técnica de imunohistoquímica, os cortes permaneceram por 48 horas na estufa a 37ºC, para secagem e melhor aderência às lâminas.

(25)

A expressão das proteínas em estudo foi avaliada pelo método indirecto da estreptavidina-biotina-peroxidase, utilizando a solução de 3,3-diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) como agente cromogéneo.

Neste estudo, a mácula densa de rim de cão jovem foi utilizada para servir de controlo positivo da Cox-2.

Para controlo positivo do anticorpo Ki-67, marcador de proliferação, foi utilizada pele (camada basal da epiderme). Nos cortes usados como controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído por tampão fosfato salino (PBS) com pH=7,4. Todas as incubações foram realizadas em câmara húmida horizontal, Bio Optica®.

A expressão imunohistoquímica de ambos os anticorpos foi obtida pelo método indirecto com uso de um complexo estreptavidina-biotina-peroxidase, utilizando o kit Ultravision Detection System, Labvision Corporation®, Fremont, CA, USA (as suas componentes figuram em negrito).

Os cortes foram desparafinados em xilol durante 30 minutos e hidratados com uma série de álcoois de concentração decrescente (100%, 90%, 80% e 70%).

Como método de recuperação antigénica, os cortes foram submetidos a um pré-tratamento térmico em microondas, efectuado de modo distinto para cada anticorpo:

- Cox-2: 4 ciclos de 5 minutos no microondas, na potência de 750 Watts, com as lâminas imersas em tampão citrato. Entre cada ciclo adicionou-se água destilada suficiente para cobrir as lâminas.

- Ki-67: 3 ciclos de 5 minutos no microondas, na potência de 750 Watts, com as lâminas imersas em tampão citrato. Entre cada ciclo adicionou-se água destilada suficiente para cobrir as lâminas.

Após tratamento térmico foram deixados a arrefecer à temperatura ambiente por cerca de 30 minutos.

A inibição das peroxidases endógenas foi conseguida com peróxido de hidrogénio a 3%, durante 30 minutos, sendo o seu excesso removido com PBS, numa lavagem durante 5 minutos.

Os cortes foram então incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos com Ultra VBlock®. Em seguida, procedeu-se à incubação com o anticorpo monoclonal anti-Cox-2 (Clone 33, Transduction Laboratories®), na diluição de 1:50 ou o anticorpo monoclonal Ki-67 (clone MIB-1, DAko), na diluição 1:100 em PBS com pH=7,4, por um período de 24

(26)

Após o referido período de incubação, o anticorpo primário foi removido com três lavagens com tampão PBS e os cortes foram incubados 10 minutos com Biotinylated Goat 19 Polivalent® à temperatura ambiente. Efectuaram-se duas lavagens com PBS e nova incubação de 10 minutos com Streptavidin Peroxidase® à temperatura ambiente, à qual se seguiu nova lavagem por 5 minutos em PBS.

A revelação das lâminas foi efectuada com uma incubação de 5 minutos em solução de tetra-hidrocloreto de 3,3’-diaminobenzidina (DAB) SIGMA® diluído em PBS, à qual se adicionou 1,2 µl de H2O2 (a 30%) por cada mililitro de solução. O tempo de reacção foi

controlado por visualização ao microscópio óptico, de forma a evitar que surgisse uma coloração de fundo que poderia prejudicar a avaliação da imunorreactividade. No final deste tempo procedeu-se à lavagem em água corrente morna por dez minutos.

Posteriormente, para a realização do contraste nuclear ou contra-coloração, as lâminas foram imersas numa solução de Hematoxilina de Gill, durante 1 minuto.

Finalmente, as lâminas foram desidratadas, com passagens por álcoois de concentração crescente, por 5 minutos cada (95%,100%), diafanizadas em xilol e montadas, utilizando a resina sintética Entellan (Merck®).

3.2.4. Avaliação da imunorreactividade

A imunorreactividade foi avaliada por dois observadores independentes, sem conhecimento prévio do respectivo diagnóstico.

3.2.5. Determinação da fracção proliferativa pelo Ki-67

Foi considerada imunorreactividade quando a marcação ocorria no núcleo, independentemente da intensidade de marcação. Efectuou-se a observação exaustiva de cada preparação na sua totalidade, seleccionando-se a área do tumor com positividade nuclear mais elevada e homogénea. A observação da área seleccionada foi realizada com a objectiva de 40x, tendo-se determinado, em termos percentuais, a fracção de núcleos positivos, num total de pelo menos 1000 células tumorais, contabilizadas em 8 a 10 campos (Oliveira, 2008). As contagens foram efectuadas sempre pelo mesmo observador, num microscópio Nikon FXA®, com ocular com quadrícula, tendo em conta a morfologia celular. As áreas superficiais e as áreas profundas foram evitadas devido à presença de infiltrado inflamatório. A figura 1 revela

(27)

uma imagem de uma preparação histológica de um mastocitoma cutâneo canino com marcação pelo anticorpo anti-Ki-67.

Figura 1: Imagem de uma preparação histológica com marcação pelo anticorpo anti-Ki-67 (400x).

3.2.6. Avaliação da Cox-2

A imunorreactividade foi indicada pela presença de distinta marcação castanha citoplasmática. A figura 2, mostra uma imagem de uma preparação histológica que revela a marcação por Cox-2. Foram avaliadas a extensão da marcação (que classifica a percentagem de células imunorreactivas) e a intensidade da marcação, (Queiroga et al., 2007) como se descreve no quadro 2.

(28)

Quadro 2: Variáveis imunohistoquímicas categóricas e contínuas

3.2.7. Avaliação de outras variáveis

Além da análise imunohistoquímica de Cox-2 e Ki-67, da determinação do índice mitótico e da avaliação do grau histológico (pelos métodos já descritos), foram também avaliadas outras características histológicas como a presença de ulceração microscópica, de actividade juncional, o crescimento infiltrativo, a quantidade de estroma, a degradação de colagénio, a existência de aberrações celulares, como explica o quadro 3.

Variáveis imunohistoquímicas categóricas Categorias

Extensão de marcação da Cox-2 0- Ausência de marcação 1- 1 a10% células marcadas 2- 11 a 50% células marcadas 3- 51 a 80% células marcadas 4- 81 a 100% células marcadas Intensidade de marcação da Cox-2 0- Negativo

1 (+)- Intensidade fraca 2 (++)- Intensidade moderada 3 (+++)- Intensidade forte Variáveis imunohistoquímicas contínuas

(29)

Quadro 3: Variáveis histológicas categóricas e contínuas

3.2.8. Avaliação de variáveis epidemiológicas e clínicas

O tamanho do tumor, a raça dos animais e o sexo dos mesmos, foram também analisados de acordo com o resumido no quadro 4.

Variáveis histológicas categóricas Categorias

Ulceração Ausente

Presente Actividade juncional Ausente Presente Crescimento infiltrativo Ausente Presente Quantidade de estroma Escassa

Moderada Abundante Degradação de colagénio Escassa

Moderada Abundante Aberrações celulares Ausentes

Presentes

Grau histológico Grau I

Grau II Grau III Variáveis histológicas contínuas

(30)

. Quadro 4: Variáveis epidemiológicas e clínicas, categóricas e contínuas

3.2.9. Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa estatístico Statistical Pachage for the Social Sciences (SPSS), Chicago, IL, USA, versão 15.0 para Windows.

Como análise descritiva das variáveis contínuas, usou-se a média, o desvio padrão (d. p.), mínimo e máximo. Os resultados foram expressos da forma média ± desvio padrão. Usou-se a análiUsou-se descritiva das variáveis categóricas, com o cálculo de frequências e percentagens das categorias.

Para analisar as variáveis contínuas entre si, utilizou-se o método de correlação de Pearson. A relação bivariante entre as variáveis categóricas foi estudada pelo método de qui quadrado (χ2). A relação bivariante entre as variáveis categóricas e contínuas foi avaliada com a aplicação dos testes de análise de variância (ANOVA). Foi também usado o teste de Tukey, para se realizar a comparação múltipla das médias. As associações com valores de p < 0,05 foram consideradas significativas.

Variáveis epidemiológicas

e clínicas categóricas Categorias

Sexo Fêmea

Macho

Raça Boxer

Sem Raça Definida (SRD) Outras raças

Variáveis epidemiológicas e clínicas contínuas Tamanho (cm)

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4. Resultados

Neste trabalho foram estudados 50 mastocitomas cutâneos, que pertenciam a 50 cães.

4.1. Avaliação de dados epidemiológicos e clínicos

4.1.1. Sexo

Dos tumores analisados 24 (48,0%) ocorreram em fêmeas e 26 (52,0%) ocorreram em machos.

4.1.2. Raça

Neste estudo 15 (30,0%) mastocitomas pertenciam a cães da raça Boxer, 17 (34,0%) pertenciam a cães de outras raças e 18 (36,0%) mastocitomas pertenciam a cães sem raça definida (SRD).

4.1.3. Tamanho

O tamanho médio dos tumores analisados, em centímetros, foi de 1,88 + 1,27, com mínimo de 0,8 e máximo de 6.

4.2. Avaliação histopatológica

Os tumores estudados consistiam em lesões dérmicas ou subcutâneas, apresentando a maioria dos tumores, 60,0%, crescimento infiltrativo (n=30). No que se refere à actividade juncional, metade dos tumores (50,0%, n = 25) tinha a junção dermoepidérmica afectada.

A degradação do colagénio foi considerada escassa em 13 tumores, a que corresponde 26,0% dos casos, foi considerada moderada em 18 tumores, a que corresponde 36,0% dos casos e foi considerada abundante em 19 tumores, a que corresponde 38,0% dos casos analisados.

As mitoses apresentaram uma média de 2,30 + 2,63, variando o seu número entre 0 e 9 por campo de maior ampliação (40x).

(32)

Dos 50 mastocitomas analisados, relativamente ao grau histológico classificaram-se do seguinte modo, tendo por base os critérios de Patnaik et al., (1984): quinze de grau I (30,0%); dezassete de grau II (34,0%) e dezoito de grau III (36,0%).

Foi considerada presente ulceração microscópica em 32,0% dos mastocitomas (n = 16).

A quantidade de estroma foi considerada abundante em 10 casos (20,0%), moderada em 16 casos (32,0%) e escassa em 24 casos (48,0%).

Foram observadas aberrações celulares em 40,0% dos mastocitomas (n = 20), estando estas ausentes em 60,0% (n = 30) das amostras. O quadro 5 e o quadro 6 resumem os valores obtidos.

Quadro 5: Distribuição dos diferentes parâmetros histológicos pela totalidade da amostra e pelos diferentes

graus

Parâmetros histológicos

Grau I Grau II Grau III Total

n (%) n (%) n (%) n (%)

Ulceração microscópica Ausente 15 (100) 12 (70,6) 7 (38,9) 34 (68,0) Presente 0 (0) 5 (29,4) 11 (61,1) 16 (32,0) Actividade juncional Ausente 10 (66,7) 10 (58,8) 5 (27,8) 25 (50,0) Presente 5 (33,3) 7 (41,2) 13 (72,2) 25 (50,0) Crescimento infiltrativo Ausente 14 (93,3) 6 (35,3) 0 (0) 20 (40,0) Presente 1 (6,7) 11 (64,7) 18 (100) 30 (60,0) Quantidade de estroma Escasso 2 (13,3) 8 (47,1) 14 (77,8) 24 (48,0) Moderado 9 (60,0) 6 (35,3) 1 (5,6) 16 (32,0) Abundante 4 (26,7) 3 (17,6) 3 (16,7) 10 (20,0) Degradação de colagénio Escassa 6 (40,0) 6 (35,3) 1 (5,6) 13 (26,0) Moderada 7 (46,7) 5 (29,4) 6 (33,3) 18 (36,0) Abundante 2 (13,3) 6 (35,3) 11 (61,1) 19 (38,0) Aberrações celulares Ausente 15 (100,0) 14 (82,4) 1 (5,6) 30 (60,0) Presente 0 (0) 3 (17,6) 17 (94,4) 20 (40,0)

(33)

Quadro 6: Distribuição das variáveis contínuas mitoses e tamanho, pelos diferentes graus.

Mitoses Grau histológico I (média + d.p.) II (média + d.p.) III (média + d.p.) 0,80 + 1,37 1,00 + 1,41 4,78 + 2,51 Tamanho 1,00 + 0,53 1,88 + 1,34 2,61 + 1,19 4.3. Avaliação imunohistoquímica

4.3.1. Proliferação celular pelo Ki-67

Relativamente à proteína Ki-67, a reacção positiva foi nuclear (incluindo células em mitose) e a percentagem média de reactividade foi de 10,92 + 11,62, tendo sido o valor mínimo de 1 e o valor máximo de 50 (quadro 7).

Quadro 7: Avaliação da imunorreactividade à proteína Ki-67

Ki-67

Média Desvio Padrão Mínimo Máximo

10,92 11,62 1 50

4.3.2. Cox-2 – Extensão da marcação

No que se refere à extensão da marcação (quadro 7), em quatro mastocitomas não se observou marcação nas células tumorais (8,0%), nove casos tiveram extensão 1 (18,0%), oito extensão 2 (16,0%) e vinte e nove extensão 3 (58,0%).

4.3.3. Cox-2 – Intensidade da marcação

Em relação à intensidade de marcação, obtiveram-se as seguintes frequências: quatro mastocitomas sem marcação (8,0%), nove de intensidade 1 (18,0%), vinte de intensidade 2 (40,0%) e dezassete de intensidade de marcação 3 (34,0%).

Os resultados referentes à imunorreactividade da Cox-2 encontram-se resumidos no quadro 8.

(34)

Quadro 8: Avaliação da imunorreactividade à enzima Cox-2

Cox-2 Extensão Intensidade

0 1 2 3 Total 0 1 2 3 Total

n 4 9 8 29 50 4 9 20 17 50

% 8,0 18,0 16,0 58,0 100 8,0 18,0 40,0 34,0 100

4.4. Associações estatísticas

4.4.1. Associação entre o grau histológico e as variáveis clínicas e histológicas

O grau associou-se de forma estatisticamente significativa com a ulceração (p = 0,001), com o crescimento infiltrativo (p < 0,0001), com a quantidade de estroma (p = 0,004), com a degradação de colagénio (p = 0,036), com a presença de aberrações celulares (p < 0,0001), com o número de mitoses (p < 0,0001) e com o tamanho (p = 0,001).

Assim, os tumores que apresentam um maior grau são, de forma geral, ulcerados, têm crescimento infiltrativo, mostram maior degradação de colagénio e observam-se mais aberrações celulares. Já relativamente ao estroma, mastocitomas de maior grau apresentam menos estroma.

Verificou-se que mastocitomas de grau III apresentam maior actividade mitótica, sendo significativas as diferenças entre tumores de grau I e grau II (p < 0,0001) e entre tumores de grau I e grau III (p < 0,0001).

Finalmente, em relação ao tamanho, tumores de maior grau são maiores, existindo uma diferença significativa entre os de grau I e grau III (p < 0,0001).

E, apesar de, com o aumento do grau histológico, a actividade juncional também ter aumentado, esta associação não é estatisticamente significativa (p = 0,056).

4.4.2. Associação entre o grau histológico e as variáveis imunohistoqímicas (Ki-67 e Cox-2)

Observou-se uma associação estatisticamente significativa entre o grau histológico e o índice de proliferação celular, Ki-67 (p < 0,0001). Os valores obtidos estão sintetizados no

(35)

Os tumores de grau I (2,8 + 1,2) apresentam proliferação inferior aos outros e, segundo os testes de Post Hoc, nomeadamente o teste de Tukey, estas diferenças são entre o grupo I e o grupo III (p < 0,0001).

Quadro 9: Associação entre o grau histológico e o índice Ki-67

Ki-67 (média + d. p.)

Grau histológico

I II III p

2,80 + 1,21 5,88 + 3,08 22,45 + 12,43 0,000

O grau histológico tem também, uma relação estatisticamente significativa com a intensidade de marcação de Cox-2 (p = 0,012), apresentando os tumores de grau III uma forte intensidade de marcação; tumores de grau II marcação moderada e tumores de grau I fraca / moderada intensidade. Os resultados desta associação estão descritos na figura 3.

Figura 3: Associação entre o grau histológico e a intensidade de marcação da Cox-2

4.4.3. Associação entre o índice de proliferação celular Ki-67 e as variáveis clínicas e histológicas

(36)

juncional (p = 0,014), entre Ki-67 e o crescimento infiltrativo (p < 0,0001), entre Ki-67 e a quantidade de estroma (p = 0,011) e entre Ki-67 e a presença de aberrações celulares (p < 0,0001).

Os tumores mais proliferativos eram mais ulcerados (19,88 + 14,18), apresentavam maior actividade juncional (14,88 + 13,61), maior crescimento infiltrativo (15,87 + 12,77) e possuíam menor quantidade de estroma, sendo esta diferença entre os grupos com estroma classificado em pouco e moderado (p = 0,009). Em relação à presença de aberrações celulares, estas existiam em maior quantidade nos tumores com maior índice de Ki-67 (19,66 + 12,99). No quadro 10, encontram-se os resultados obtidos, nas associações atrás descritas.

Entre o índice de proliferação celular de Ki-67 e o número de mitoses existe uma correlação significativa (r = 0,748, p < 0,0001) e positiva, o que significa que quando aumenta a imunorreactividade ao Ki-67, aumenta o número de mitoses.

Também entre o índice de proliferação celular Ki-67 e o tamanho se verifica uma relação positiva, na qual quando a imunorreactividade de Ki-67 aumenta, o tamanho do tumor também é maior (r = 0,451, p = 0,001).

Quadro 10: Associação entre o índice de proliferação celular Ki-67 e variáveis clínico-histológicas

Variáveis clínico-histológicas (n) Índice Ki-67 média + d.p. p Ulceração Ausente 34 6,71 7,19 < 0,0001 Presente 16 19,88 14,18

Actividade juncional Ausente 25 6,96 7,59 0,014 Presente 25 14,88 13,61

Crescimento infiltrativo Ausente 20 3,50 1,54 < 0,0001 Presente 30 15,87 12,77 Quantidade de estroma Escassa 24 13,46 2,75 0,011 Moderada 16 4,75 4,66 Abundante 10 9,60 10,37 Degradação de colagénio Escassa 13 6,15 3,87 0,069 Moderada 18 9,61 10,65 Abundante 19 15,43 14,52

Aberrações celulares Ausente 30 5,10 5,45 < 0,0001 Presente 20 19,66 12,99

(37)

4.4.4. Associação entre a intensidade de Cox-2 e as variáveis clínicas e histológicas

Apesar do crescimento infiltrativo não ter uma associação com significado estatístico com a intensidade de marcação de Cox-2 (p = 0,096), mastocitomas com maior intensidade de marcação eram mais invasivos.

Já relativamente à ulceração, a sua associação com a intensidade de Cox-2 foi significativa estatisticamente (p = 0,015), bem como a associação de Cox-2 relativamente ao estroma (p = 0,007) e também foi significativa a associação de intensidade de Cox-2 com aberrações celulares (p = 0,004).

Os mastocitomas marcados com maior intensidade eram mais ulcerados, tinham menos quantidade de estroma e apresentavam mais aberrações celulares. Os resultados obtidos estão discriminados no quadro 11.

Entre a intensidade da Cox-2 e o número de mitoses (p = 0,076), apesar da associação não ter significado estatisticamente relevante, tumores marcados com maior intensidade (+++) apresentam maior índice mitótico (3,24 + 2,84), como mostra o quadro 12.

A intensidade de marcação de Cox-2 e o tamanho não apresentam uma associação estatística significativa (p = 0,183), mas tumores de maior tamanho mostram-se marcados mais intensamente (quadro 12).

Quadro 11: Associação entre a intensidade de marcação da Cox-2 e as variáveis clinico-histológicas

Variáveis clinico-histológicas

Intensidade de marcação da Cox-2

0 1 2 3

p

n (%) n (%) n (%) n (%)

Ulceração Ausente 3 (6,0) 9 (18,0) 15 (30,0) 7 (14,0) 0,015 Presente 1 (2,0) 0 (0) 5 (10,0) 10 (20,0)

Actividade juncional Ausente 2 (4,0) 6 (12,0) 13 (26,0) 4 (8,0) 0,056 Presente 2 (4,0) 3 (6,0) 7 (14,0) 13 (26,0)

Crescimento infiltrativo Ausente 3 (6,0) 6 (12,0) 6 (12,0) 5 (10,0) 0,096 Presente 1 (2,0) 3 (6,0) 14 (28,0) 12 (24,0) Quantidade de estroma Escassa 2 (4,0) 1 (2,0) 10 (20,0) 11 (22,0) 0,007 Moderada 1 (2,0) 8 (16,0) 4 (8,0) 3 (6,0) Abundante 1 (2,0) 0 (0) 6 (12,0) 3 (6,0) Degradação de colagénio Escassa 2 (4,0) 4 (8,0) 5 (10,0) 2 (4,0) 0,287 Moderada 0 (0) 3 (6,0) 9 (18,0) 6 (12,0) Abundante 2 (4,0) 2 (4,0) 6 (12,0) 9 (18,0)

Aberrações celulares Ausente 3 (6,0) 9 (18,0) 13 (26,0) 5 (10,0) 0,004 Presente 1 (2,0) 0 (0) 7 (14,0) 12 (24,0)

(38)

Quadro 12: Associação entre a intensidade de marcação da Cox-2 e as variáveis contínuas mitoses e tamanho

Mitoses

0 1 2 3

1,00 + 0,81 0,67 +1,32 2,50 +2,78 3,24 + 2,84 Tamanho 1,00 + 0,82 1,33 + 1,50 2,05 + 0,94 2,18 + 1,47

4.4.5. Associação entre Cox-2 e Ki-67

Não se verificou uma associação estatisticamente significativa entre a extensão de marcação da Cox-2 e o índice de proliferação celular - Ki-67.

Relativamente à intensidade de Cox-2 e ao índice de proliferação celular Ki-67 verificou-se uma associação estatística significativa, sendo p = 0,041. Os mastocitomas de intensidade moderada (++) ou forte (+++) são mais proliferativos que mastocitomas negativos (0) ou de fraca intensidade de marcação (+). De acordo com o teste de Tukey, as diferenças observadas são entre os grupos 1 (fraca intensidade) e o grupo 3 (de intensidade forte), com p = 0,049. O quadro 13 apresenta os resultados da associação entre as 2 variáveis atrás descritas.

Quadro 13: Associação entre intensidade de marcação de Cox-2 e o índice de Ki-67

Ki-67 (média + d. p.)

0 1 2 3

(39)

5. Discussão

O mastocitoma é a neoplasia cutânea mais frequente no cão, compreendendo 10 a 15% dos tumores cutâneos destes animais. Biologicamente, comporta-se de modo diverso, já que pode variar de uma massa benigna até uma doença metastizante e fatal (representando 11 a 27% das neoplasias malignas) (Oliveira, 2008).

Neste estudo foram analisados 50 mastocitomas, que pertenciam a 50 animais, originários dos arquivos do Laboratório de Histologia e Anatomia Patológica da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro.

Dos casos analisados, a maioria (52,0%) dos mastocitomas ocorreu em machos. A maior parte dos tumores, 36,0%, pertenciam a cães SRD, no entanto, os cães de raça Boxer representam 30,0% dos casos.

Em relação ao tamanho dos mastocitomas, a média foi de 1,88 + 1,27 cm. O tamanho do tumor apresentou uma associação estatisticamente significativa com o grau histológico, sendo os tumores de grau III maiores do que os de grau II e grau I. Estes resultados suportam os dados obtidos noutros estudos, que referem que tumores indiferenciados apresentam maior tamanho, como o de Oliveira, (2008) que investigou os aspectos patológicos do mastocitoma cutâneo canino, a sua relação com características epidemiológicas e clínicas e seu valor prognóstico; e o de Simpson et al., (2004), no qual foi efectuada a avaliação das margens cirúrgicas requeridas para a excisão completa de mastocitomas cutâneos em cães. Os mastocitomas de grau III são, de acordo com a classificação de Patnaik et al., (1984) mais invasivos, possuem células de maiores dimensões e apresentam maior actividade mitótica, características que apoiam este resultado.

Neste trabalho, a maioria dos mastocitomas não apresentava ulceração microscópica (68,0%). Mas, tumores de maior grau histológico eram mais ulcerados: nenhum tumor de grau I apresentava ulceração, contra 61,1% dos tumores de grau III, que eram ulcerados. Estes dados são semelhantes aos obtidos noutros estudos, nomeadamente o de Oliveira, (2008) e o de Gross et al., (2005), referindo que esta característica é bastante frequente em mastocitomas , especialmente nos indiferenciados. De acordo com Poggiani et al., (2012), a associação entre a ulceração e o grau histológico deve-se a um elevado índice de proliferação celular. Sendo aceite que a angiogénese é de suma importância para a progressão tumoral, os vasos sanguíneos do tumor vão-se tornando, no entanto, anormais, em quase todos os aspectos da

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sua estrutura e funções, o que pode prejudicar a perfusão dos tecidos na periferia do tumor, podendo levar à ocorrência de ulceração.

A junção dermoepidérmica estava afectada em metade dos casos estudados. Destes, 72,2% eram tumores de grau III, existindo uma associação estatística significativa entre estas duas variáveis, em que tumores de maior grau têm maior actividade juncional. Como já foi anteriormente referido, a maioria dos mastócitos localizam-se na junção dermoepidérmica (Oliveira, 2008), e a existência de células proliferativas nesta área, caracteriza a actividade juncional.

Foram identificadas aberrações celulares em 40,0% das amostras. Entre os casos em que as aberrações celulares estavam presentes, 94,4% ocorreram em tumores de grau III (tumores de maior grau têm maior número de aberrações celulares). Estes valores estão de acordo com os critérios utilizados na classificação dos mastocitomas cutâneos caninos pelos três graus.

Relativamente ao número de mitoses, a média observada foi de 2,30 + 2,63 e mastocitomas de maior grau apresentavam maior actividade mitótica, sendo significativas as diferenças entre tumores de grau I e grau II (p < 0,0001) e entre tumores de grau I e grau III (p < 0,0001). Também um estudo realizado por Romansik et al., (2007) chegou ao mesmo resultado, referindo que o índice mitótico pode ser usado como um forte indicador prognóstico de vários cancros quer em cães, quer em humanos. O mesmo autor refere que a análise deste índice se torna ainda mais relevante quando as lesões tumorais são classificadas com grau II (nos quais é difícil decidir em que casos se deve administrar terapia seguida à excisão cirúrgica). Esta análise é realmente importante, visto que as diferenças são entre tumores de grau I e graus II e III mas não entre tumores de grau II e grau III.

O grau histológico tem sido o critério mais consistentemente utilizado, de entre as variáveis histopatológicas, relativamente ao prognóstico dos mastocitomas a longo prazo. No entanto, esta variável tem a desvantagem da classificação entre diferentes observadores ser subjectiva e pela heterogeneidade intratumoral (Northrup et al., 2005; Oliveira, 2008; Preziosi

et al., 2007; Romansik et al., 2007) Neste trabalho, a maioria dos tumores (36,0%) eram de

grau III, 34,0% eram de grau II e os restantes 30,0% eram de grau I. Relativamente à subjectividade que pode decorrer desta classificação em graus, a situação que coloca maiores desafios são os mastocitomas de grau II (como já tinha sido referido ao longo deste estudo), porque alguns comportam-se como tumores de grau I, enquanto outros se comportam como

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potenciais de agressividade subestimados, enquanto outras vão receber tratamentos potencialmente tóxicos desnecessariamente.

Neste trabalho, relativamente à proteína Ki-67, a percentagem média de reactividade foi de 10,92 + 11,62, tendo-se observado que tumores de grau I (2,8 + 1,2) apresentam proliferação inferior aos outros e, de acordo com o teste de Tukey, estas diferenças são entre o grupo I e o grupo III (p < 0,0001). Nos tumores de grau II a média foi de 5,88 + 3,08 e nos de grau III foi de 22,45 + 12,42. Estes valores vão de encontro aos já obtidos noutras investigações realizadas anteriormente, nomeadamente por Oliveira, (2008) e Ozaki et al., (2007) que mostraram que tumores com maior índice de proliferação são mais agressivos, ou seja, apresentam maior grau. Zuccari et al., (2008) no seu estudo comparativo sobre a importância de marcadores imunohistoquímicos, em neoplasia mamária, afirma que valores elevados de índice de Ki-67 se correlacionam com o aparecimento de metástases e morte causada pela doença. Assim, a expressão imunohistoquímica do Ki-67 pode ser usada como um indicador de natureza preditiva acerca da evolução da doença.

Ainda relativamente ao facto da subjectividade na classificação de mastocitomas em graus histológicos (nomeadamente na predição do comportamento dos classificados com grau II), Scase et al., (2006), refere que a análise do índice de proliferação Ki-67 pode ser útil, principalmente na subdivisão de mastocitomas de grau II quanto à sua potencial agressividade. Mas, os resultados obtidos por Scase et al., (2006) diferem dos de outros estudos, diz Strefezi et al, (2010). No entanto, este último autor explica que tal diferença se poderá dever ao facto do número de animais analisados por Scase et al., (2006) ser substancialmente superior, sugerindo mais investigação nesta área, para identificar, talvez, dois grupos distintos entre os tumores de grau II em relação à percentagem de células positivas ao Ki-67.

Já, relativamente às restantes variáveis histológicas, o índice de proliferação celular (Ki-67) obteve associação estatisticamente significativa com as mesmas, sendo que tumores mais proliferativos eram mais ulcerados (19,88 + 14,18), apresentavam maior actividade juncional (14,88 + 13,61), maior crescimento infiltrativo (15,87 + 12,77), possuíam menor quantidade de estroma, apresentavam mais aberrações celulares (19,66 + 12,99) e o número de mitoses era maior. Relativamente ao tamanho do tumor, mastocitomas mais proliferativos tinham um maior tamanho. Os resultados que foram obtidos neste trabalho são concordantes com os obtidos por Oliveira, (2008), no qual tumores com maior índice de proliferação eram