Desenvolvimento da aplicação informática InterPharm para estudar a interação entre fármacos

(1)

Desenvolvimento da aplica¸c˜

ao

inform´

atica InterPharm para

estudar a intera¸c˜

ao entre f´

armacos

Por

Ana Rita Fernandes de Sousa

Orientador: Doutor Lio Fidalgo Gon¸calves

Disserta¸c˜ao submetida `a

UNIVERSIDADE DE TR ´AS-OS-MONTES E ALTO DOURO para obten¸c˜ao do grau de

MESTRE

em Engenharia Electrot´ecnica e de Computadores, de acordo com o disposto no DR – I s´erie–A, Decreto-Lei no

74/2006 de 24 de Mar¸co e no Regulamento de Estudos P´os-Graduados da UTAD

DR, 2a

s´erie – Delibera¸c˜ao no

(2)

(3)

Desenvolvimento da aplica¸c˜

ao

inform´

atica InterPharm para

estudar a intera¸c˜

ao entre f´

armacos

Por

Ana Rita Fernandes de Sousa

Orientador: Doutor Lio Fidalgo Gon¸calves

Disserta¸c˜ao submetida `a

UNIVERSIDADE DE TR ´AS-OS-MONTES E ALTO DOURO para obten¸c˜ao do grau de

MESTRE

em Engenharia Electrot´ecnica e de Computadores, de acordo com o disposto no DR – I s´erie–A, Decreto-Lei no

74/2006 de 24 de Mar¸co e no Regulamento de Estudos P´os-Graduados da UTAD

DR, 2a

s´erie – Delibera¸c˜ao no

(4)

(5)

Orienta¸c˜ao Cient´ıfica :

Doutor Lio Fidalgo Gon¸calves

Professor Auxiliar do Departamento de Engenharias

Universidade de Tr´as-os-Montes e Alto Douro

(6)

(7)

”A imagina¸cão é mais importante que a ciência, porque a ciência é limitada, ao passo que a imagina¸cão abrange o mundo inteiro.”

Albert Einstein (1879 – 1955)

(8)

(9)

UNIVERSIDADE DE TR ´AS-OS-MONTES E ALTO DOURO Mestrado em Engenharia Electrot´ecnica e de Computadores

Os membros do Júri recomendam à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro a aceita¸cão da disserta¸cão intitulada “ Desenvolvimento da aplica¸cão informática InterPharm para estudar a intera¸cão entre fármacos ” realizada por Ana Rita Fernandes de Sousa para satisfa¸cão parcial dos requisitos do grau de Mestre.

Dezembro 2015

Presidente: Doutor Jo˜ao Agostinho Batista de Lacerda Pav˜ao,

Professor Auxiliar da Universidade de Tr´as-os-Montes e Alto Douro

Vogais do J´uri: Doutora Teresa Maria de Gouveia Torres Feio Mendon¸ca,

Professor Auxiliar da Universidade de Aveiro

Doutor Lio Fidalgo Gon¸calves,

Professor Auxiliar do Departamento de Engenharias da Universidade de Tr´as-os-Montes e Alto Douro

(10)

(11)

Desenvolvimento da aplica¸c˜ao

inform´atica InterPharm para

estudar a intera¸c˜ao entre f´armacos

Ana Rita Fernandes de Sousa

Submetido na Universidade de Tr´as-os-Montes e Alto Douro para o preenchimento dos requisitos parciais para obten¸c˜ao do grau de

Mestre em Engenharia Electrot´ecnica e de Computadores

Resumo — A intera¸cão de fármacos é uma área da farmacologia com bastante interesse de estudo, pois é poss´ıvel combinar fármacos no sentido de descobrir novas terapias mais eficientes com menor toxicidade para o doente. O efeito da mistura de dois componentes pode ser aditivo (o efeito da combina¸cão é igual à soma dos efeitos dos fármacos isolados), antagónico (é necessária maior quantidade de fármacos na mistura para atingir o mesmo efeito isoladamente), ou sinérgico (para obter o mesmo efeito, na mistura a dose dos fármacos é menor que a dose isolada de cada fármaco). Para a determina¸cão do efeito existente na combina¸cão de fármacos existem vários métodos desenvolvidos, como por exemplo o princ´ıpio do efeito mediano de Chou e Talalay e o método de Greco que combina métodos mais antigos num novo método mais completo. Na presente disserta¸cão é apresentada uma nova aplica¸cão informática, InterPharm, desenvolvida em MatlabR

, que permite aos investigadores analisar o efeito existente na combina¸cão de dois fármacos em determinada terapia. Foram feitas experiências para diferentes combina¸cões de fármacos e os resultados produzidos são semelhantes aos obtidos por outros softwares já existentes.

Palavras Chave: Intera¸cão de fármacos, aplica¸cões informáticas, sinergismo, antagonismo, aditividade, superf´ıcie de ajuste, efeito mediano.

(12)

(13)

Development of a software application

InterPharm to study drug-drug interaction

Ana Rita Fernandes de Sousa

Submitted to the University of Tr´as-os-Montes and Alto Douro in partial fulfillment of the requirements for the degree of Master of Science in Electrical Engineering and Computers

Abstract — The drug-drug interaction is an area of pharmacology with great interest of study because it is possible to combine drugs in order to discover new therapies more effective with less toxicity to the patient. The effect of the mixture of two components may be additive (the effect of the combination is equal to the sum of the effects of the individual drugs), antagonistic (requires more amount of drug in the mixture to achieve the same effect alone) or synergistic (for the same effect in mixing the dose of drugs is less than the dose of each drug alone). To determine the effect of drug combination there are several developed methods such as the principle of the median-effect of Chou and Talalay and Greco’s method that combines the oldest methods in a new and more complete method. In this thesis is presented a new software application, InterPharm developed in MATLAB, which allows researchers to analyze the effect on the combination of two drugs in certain therapy. Experiments were made for different drug combinations, and the results are similar to those obtained by other existing software.

Key Words: Drug-drug interaction, software application, synergism, antagonism, additivity, surface fit, median-effect.

(14)

(15)

Agradecimentos

Este espa¸co é dedicado àqueles que deram a sua contribui¸cão para que esta disserta¸cão fosse realizada. A todos eles deixo aqui os meus sinceros agradecimentos.

Os meus agradecimentos ao Professor Doutor Lio Gon¸calves, Professor Auxiliar do Departamento de Engenharias da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, pela orienta¸cão, pela sua motiva¸cão, pela confian¸ca na minha capacidade de trabalho, e pelas suas sugestões e ensinamentos fundamentais para a realiza¸cão da disserta¸cão. Aos meus colegas do Mestrado em Engenharia Electrotécnica e de Computadores da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro pelo seu acolhimento e simpatia e aos meus amigos pelo apoio.

Ao João, um agradecimento especial pelo apoio e carinho diários, pelas palavras doces e pela transmissão de confian¸ca e de for¸ca, em todos os momentos. Pelo companheirismo e amizade, e pelo modo como me aturou ao longo desta árdua etapa.

Por último, um agradecimento especial aos meus pais, Amélia e Henrique, pelo modelo que são de esfor¸co e dedica¸cão, por tudo o que sou hoje, por não medirem esfor¸cos, apesar das dificuldades, para que eu chegasse a esta etapa da minha vida que sempre souberam ser um dos meus maiores objetivos, pelo carinho, apoio e for¸ca, pela paciência e por me darem a confian¸ca necessária para realizar os meus sonhos.

(16)

Aos meus irm˜aos, Diogo e Eduardo, pelo apoio e carinho, e pela preocupa¸c˜ao pelo meu bem-estar.

A todos que acreditaram em mim, que sempre me apoiaram e ajudaram, prometo n˜ao desiludir. Um sincero obrigado!

UTAD, Ana Rita Fernandes de Sousa

Barcelos, 1 de Setembro de 2015

(17)

´Indice geral

Resumo xi

Abstract xiii

Agradecimentos xv

´Indice de tabelas xix

´Indice de figuras xxi

Gloss´ario, acr´onimos e abreviaturas xxv

1 Introdu¸cão 1 1.1 Motiva¸cão . . . 2 1.2 Objetivos . . . 4 1.3 Organiza¸cão da Disserta¸cão . . . 4 2 Estado da Arte 7 2.1 Intera¸cão de fármacos. . . 8 2.1.1 Farmacocinética . . . 9 2.1.2 Farmacodinâmica . . . 10

2.1.3 Intera¸c˜ao a n´ıvel molecular . . . 11

2.2 M´etodos de an´alise do efeito . . . 13

2.2.1 Aditividade de Loewe. . . 14

2.2.2 Independˆencia de Bliss . . . 15 xvii

(18)

2.2.3 Princ´ıpio do Efeito Mediano . . . 16

2.2.4 Isobolograma . . . 20

2.2.5 Modelo de Greco . . . 24

2.2.6 Resposta em superf´ıcie . . . 26

2.3 Ferramentas Computacionais: MATLABR , GUIDE e Report Generator . . . 28

2.4 Aplica¸c˜oes Inform´aticas. . . 30

2.4.1 CompuSyn. . . 30

2.4.2 CalcuSyn . . . 31

2.4.3 Curve Fitting toolbox . . . 32

3 Desenvolvimento da aplica¸c˜ao InterPharm 35 3.1 Algoritmos do programa Interpharm . . . 35

3.2 Metodologia utilizada . . . 36

3.2.1 Figura 1 - InterPharm . . . 36

3.2.2 Figura 2 - Nova experiˆencia . . . 37

3.2.3 Figura 3 - Novo f´armaco . . . 37

3.2.4 Figura 4 - Nova combina¸c˜ao de f´armacos . . . 38

3.2.5 Figura 5 - Nova combina¸c˜ao de f´armacos . . . 39

3.2.6 Figura 6 - Salvar Experiˆencia . . . 39

3.2.7 Figura 7 - Calcular Parˆametros . . . 40

3.2.8 Figura 8 - Gerar o Relat´orio . . . 41

3.2.9 Figura 9 - Superf´ıcie de Ajuste. . . 42

3.2.10 Figura 10 - Isobolograma . . . 43

3.2.11 Figura 11 - Relat´orio . . . 44

4 Apresenta¸c˜ao e discuss˜ao dos resultados 45 4.1 Caso de estudo I- Rotenone e Pyrethrins . . . 45

4.2 Caso de estudo II - ADP e o-PAL . . . 49

4.3 Caso de estudo III - MTX e Ara-C . . . 52

4.4 Caso de estudo IV- Sunitinib malate e Meloxicam . . . 56

5 Conclus˜ao e trabalho futuro 67

Referˆencias bibliogr´aficas 69

(19)

´Indice de tabelas

4.1 Toxicidade letal de Rotenone e Pyrethrins para as moscas: r´acio constante da Combina¸c˜ao R:P de 1:5 e 1:15 (Adotado da Tabela 18 de Pharmcol Rev. 58: 621-681, 2006). . . 46

4.2 Resultados obtidos pelo CompuSyn e InterPharm no caso de estudo I 46

4.3 Inibi¸cão da enzima álcool desidrogenase de f´ıgado de cavalo com inibidor competitivo (ADP) e não competitivo (o-PAL). Rácio constante da Combina¸cão 1:17.4 apenas na diagonal (Adotado da Tabela 9 de Pharmacol Rev. 58: 621-681, 2006). . . 49

4.4 Resultados obtidos pelo CompuSyn e InterPharm no caso de estudo II 50

4.5 Inibi¸cão da incorpora¸cão de [6-H]dUrd no ADN de células leucémicas L1210 por MTX e Ara-C. Rácio constante da Combina¸cão 1:0.782 (Adotado da Tabela 19 de Pharmacol Rev. 58: 621-681, 2006). . . 53

4.6 Resultados obtidos pelo CompuSyn e Interpharm no caso de estudo III 54

4.7 Meloxicam aumenta sinergicamente o efeito in vitro de Sunitinib malate (T24). . . 57

4.8 Meloxicam aumenta sinergicamente o efeito in vitro de Sunitinib malate (5637). . . 58

(20)

4.9 Meloxicam aumenta sinergicamente o efeito in vitro de Sunitinib malate (HT1376). . . 58

4.10 Resultados obtidos pelo InterPharm no caso de estudo IV . . . 59

(21)

´Indice de figuras

1.1 Fotomicrografia representativa que mostra a morfologia das células da bexiga de linhas celulares HCV29, T24, 5637 e HT1376. São observados corpos apoptóticos (seta preta), citoplasma (aster´ısco) e células apoptóticas (triângulo) (Arantes-Rodrigues et al.,2013a).. . . 3

2.1 Representa¸cão esquemática do comportamento farmacocinético de um fármaco (Kwon, 2002). . . 10

2.2 Representa¸cão esquemática de farmacocinética, farmacodinâmica e rela¸cão farmacocinética/farmacodinâmica de um fármaco. Cp(t) e

Ce(t) são as concentra¸cões de fármaco no plasma e no local de atua¸cão,

respetivamente (Kwon,2002). . . 11

2.3 Representa¸cão esquemática dos mecanismos de inibi¸cão. (A) Inibi¸cão competitiva, inibidor (c´ırculos cinzentos) e fármaco (c´ırculos pretos) ligam-se ao mesmo s´ıtio. (B) Inibi¸cão não competitiva, inibidor (quadrados cinzentos) e fármaco ligam-se a locais diferentes (Lee and Kong, 2009). 12

2.4 Esquema da rea¸c˜ao de dois inibidores (quadrados) n˜ao competitivos ligando-se no mesmo local (Breitinger, 2012).. . . 13

(22)

2.5 Esquema da rea¸cão de dois inibidores (quadrados e triângulos) mutuamente não exclusivos e não competitivos ligando-se a locais diferentes (Breitinger,

2012). . . 13

2.6 Ilustra¸c˜ao do ´ındice de intera¸c˜ao. P = (Dy,1,0) representa a dose de

f´armaco 1 que produz o efeito y, Q = (0, Dy,2) representa a dose de

f´armaco 2 que produz o efeito y e U = (d1,d2) representa a dose na

combina¸c˜ao que produz o mesmo efeito y. O caso A representa a situa¸c˜ao de sinergismo e o caso B antagonismo (Lee and Kong,2009). 15

2.7 Exemplo t´ıpico de um gr´afico Fa-CI (Chou, 2006). . . 19

2.8 Exemplo t´ıpico de um gr´afico Fa-DRI (Chou,2006). . . 21

2.9 Equa¸c˜ao do efeito mediano como a conjuga¸c˜ao das teorias de Michaelis-Menten, Hill, Scatchard e de Henderson-Hasselbalch (Chou, 2006). . . 21

2.10 Isobolograma para um determinado efeito, onde a dose de fármaco A isolado é A=20 e de fármaco B é B=100. O ponto Q é um par de doses que obtêm o mesmo efeito com menores quantidades de fármaco, ou seja é sinérgico, enquanto que o ponto R é antagónico (é necessária mais quantidade de fármaco). O ponto P aparece muito perto da linha de aditividade, o que pode indicar aditividade (Tallarida,2001). 22

2.11 Isobolas aditivas de uma combina¸c˜ao de f´armacos para diferentes n´ıveis de efeito (Tallarida, 2006). . . 25

2.12 Superf´ıcie tridimensional de dose-efeito, obtida pela experiˆencia de Greco (Greco et al., 1990). . . 26

2.13 Superf´ıcie de ajuste aos pares de doses ao longo do efeito. Ilustra¸c˜ao de um ponto acima da superf´ıcie que indica sinergismo (Tallarida,

2001). . . 27

2.14 Janela do software MATLABR

GUIDE (mat). . . 29

2.15 Janela resultante da compila¸c˜ao (mat). . . 29

2.16 Interface do software CalcuSyn (bio). . . 31

2.17 Interface da aplica¸c˜ao Curve Fitting toolbox da MathWorks. . . 32

3.1 Interface do InterPharm - Primeira janela gerada pelo programa. . . . 36

3.2 Interface do InterPharm - Janela principal da experiˆencia. . . 37 xxii

(23)

3.3 Interface do InterPharm - Cria¸c˜ao de um f´armaco isolado. . . 38

3.4 Interface do InterPharm - Escolha dos f´armacos constituintes da combina¸c˜ao. 38

3.5 Interface do InterPharm - Cria¸cão da combina¸cão de dois fármacos. . 39

3.6 Interface do InterPharm - Sele¸c˜ao da pasta onde se salva a experiˆencia. 40

3.7 Interface do InterPharm - C´alculo de Dm, CI e DRI para determinado valor de Fa. . . 41

3.8 Interface do InterPharm - Escolha dos fármacos, combina¸cões e informa¸cão presente no relatório. . . 42

3.9 Interface do InterPharm - Introdu¸c˜ao da matriz de dados para gerar a superf´ıcie. . . 43

3.10 Interface do InterPharm - Escolha dos n´ıveis de efeito. . . 43

3.11 Interface do InterPharm - Relat´orio em HTML. . . 44

4.1 Curva dose-efeito. . . 47

4.2 Gr´afico efeito mediano. . . 47

4.3 Gráfico CI.. . . 47 4.4 Gráfico log(CI). . . 47 4.5 Gráfico DRI.. . . 48 4.6 Gráfico log(DRI). . . 48 4.7 Isobolograma. . . 48 4.8 Curva dose-efeito. . . 50

4.10 Gráfico CI.. . . 51 4.11 Gráfico log(CI). . . 51 4.12 Gráfico DRI. . . 51 4.13 Gráfico log(DRI). . . 51 4.14 Isobolograma. . . 52 4.15 Superf´ıcie de ajuste. . . 52 4.16 Curva dose-efeito. . . 54

4.18 Gr´afico CI.. . . 55

4.19 Gr´afico log(CI). . . 55 xxiii

(24)

4.20 Gr´afico DRI. . . 55

4.21 Gr´afico log(DRI). . . 55

4.22 MTX e Ara-C - Isobolograma. . . 56

4.23 An´alise Imunofluorescente. Apoptose celular apresenta-se a fluorescente (Arantes-Rodrigues et al., 2013a). . . 57

4.26 Gr´afico CI.. . . 60

4.27 Gr´afico log(CI). . . 60

4.28 T24 - Isobolograma. . . 60

4.29 T24 - Superf´ıcie de ajuste. . . 61

4.32 Gr´afico CI.. . . 62

4.34 5637 - Isobolograma. . . 63

4.35 5637 - Superf´ıcie de ajuste. . . 63

4.38 Gr´afico CI.. . . 64

4.40 HT1376 - Isobolograma. . . 65

4.41 HT1376 - Superf´ıcie de ajuste. . . 65

(25)

Gloss´

ario, acr´

onimos e

abreviaturas

Lista de acr´

onimos

Sigla Expans˜ao 2D Bidimensional 3D Tridimensional

ADN Acido Desoxirribonucleico´ Ara-C 1-β-D-arabinofuranosilcitosina

α Parâmetro de intera¸cão que indica a magnitude do efeito C50A Concentra¸cão do fármaco A que produz 50% do efeito

CI Combination Index (´Indice de Combina¸c˜ao) DOM Document Object Model

DRI Dose-reduction index (Índice de redu¸cão da dose) Dm Dose necessária para produzir o efeito mediano

m Coeficiente de Hill que confere sigmoicidade `a curva dose-efeito

dx Dose do f´armaco x na combina¸c˜ao que produz o efeito E

Dx Dose isolada do f´armaco x que produz o efeito E

(26)

Sigla Expans˜ao

EDx,y Dose isolada do f´armaco y que produz x% do efeito

E Efeito

Emax Efeito m´aximo

fa Fra¸cão afetada fu Fra¸cão não afetada

γ coeficiente de Hill (declive da curva dose-efeito) GUI Graphical user interface

GUIDE Graphical user interface design environment IC50 Concentra¸c˜ao de f´armaco para inibir 50%

LD50 Dose letal

p e q Coeficientes de Hill

r Qualidade da reta de ajuste R R´acio entre dois f´armacos RMSE Root mean squared error SSE Sum of squares due to error

Lista de abreviaturas

Abreviatura Significado(s) a.C. antes de Cristo e.g. por exemplo et al. e outros (autores) i.e. isto ´e, por conseguinte

(27)

1

Introdu¸c˜

ao

O uso de produtos medicinais pelos humanos já é bastante antigo, devido à necessidade de combater doen¸cas e pelo instinto de sobrevivência.

No século 16 a.C., Papiro de Ebers (Egipto) utilizou vários fármacos, como sangue de lagarto, ópio, gordura de castor, no desenvolvimento de diversas terapias de cura. Hipócrates inaugurou uma nova era para a cura de doen¸cas, através de leis naturais e afirmou que o corpo tem amplos recursos naturais para a recupera¸cão e o papel do médico é remover ou reduzir os impedimentos da defesa natural (Levine et al.,

2004).

Com o tempo novas terapias surgiram utilizando a combina¸cão de fármacos para melhorar a eficácia dos tratamentos, o que se denomina por intera¸cão de fármacos. A avalia¸cão destas intera¸cões mudaram drasticamente ao longo da última década devido ao desenvolvimento dos medicamentos, o aumento do conhecimento de enzimas que metabolizam os fármacos e pelo desenvolvimento de ferramentas para estudar a intera¸cão de fármacos (Huang et al., 2008).

(28)

2 CAPÍTULO 1. INTRODUÇ ÃO

1.1 Motiva¸c˜

ao

O fenómeno das intera¸cões de fármacos constitui na atualidade um dos temas mais importantes e debatidos da farmacologia. A prescri¸cão simultânea de vários fármacos e consequente administra¸cão é uma prática comummente utilizada em terapias clássicas, com a finalidade de aumentar a eficácia dos tratamentos, reduzir a toxicidade, e/ou tratar doen¸cas coexistentes.

Os fármacos são substâncias qu´ımicas e podem interagir entre si, com nutrientes ou agentes qu´ımicos ambientais, desencadeando respostas benéficas, para ampliar os efeitos da terapia, ou indesejadas, como a redu¸cão do efeito. É necessário desenvolver métodos para verificar o efeito da combina¸cão de diferentes componentes de forma a ajudar os profissionais da saúde aquando da prescri¸cão a doentes, ou em experiências para a descoberta de novas terapias.

Ao longo dos anos foram desenvolvidos vários métodos para análise da intera¸cão de fármacos e com a evolu¸cão da tecnologia foi poss´ıvel automatizá-los. Já existe algum software comercial nesta área, porém, são produtos com pre¸cos bastante avultados. Investigadores desta área sem conhecimentos profundos de matemática e informática têm dificuldades na análise do efeito se não tiverem oportunidade de comprar um software comercial.

Na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, no departamento de Ciências Veterinárias foram realizados vários estudos na área da farmacologia no sentido de descobrir novas terapias. Assim, houve necessidade de verificar o efeito existente através de métodos matemáticos já existentes, analisando os dados obtidos pelas experiências realizadas.

Visando este ´ultimo argumento, pretende-se contribuir com um software, InterPharm, desenvolvido em MATLABR

, visto ser um software bastante popular em ambiente académico e pela facilidade de uso, com o intuito de melhorar e facilitar a análise de dados de combina¸cões de componentes através de algoritmos e métodos clássicos

(29)

1.1. MOTIVAC¸ ˜AO 3

inclu´ıdos nos software comerciais.

A principal motiva¸cão para este trabalho foi o facto de investigadores da UTAD na área da farmacologia terem identificado esta lacuna - de não ter dispin´ıvel um software gratuito que possam usar sempre que fazem combina¸cão de fármacos e pretendam inferir se o efeito combinado é sinérgico/aditivo/antagónico. Alguns artigos foram publicados no seguimento destes estudos pelo departamento de Ciências Veterinárias (Arantes-Rodrigues et al.,2013a,b) e serviram de casos de estudo para testar a aplica¸cão desenvolvida (Figura 1.1).

Figura 1.1– Fotomicrografia representativa que mostra a morfologia das células da bexiga de linhas celulares HCV29, T24, 5637 e HT1376. São observados corpos apoptóticos (seta preta), citoplasma (aster´ısco) e células apoptóticas (triângulo) (Arantes-Rodrigues et al.,2013a).

(30)

4 CAPÍTULO 1. INTRODUÇ ÃO

1.2 Objetivos

O objetivo principal da presente disserta¸cão é o desenvolvimento de um programa para o estudo do efeito da intera¸cão de fármacos, denominado InterPharm, que permita efetuar a análise do efeito da combina¸cão de dois componentes, com a possibilidade de escolher se os fármacos são mutuamente exclusivos ou não exclusivos e quais os métodos de estudo. Também permite o cálculo do ´ındice de combina¸cão, CI, o ´ındice de redu¸cão da dose, DRI, a dose mediana, DM, e apresenta gráficos e

tabelas com os dados simulados.

Para al´em deste objetivo principal pretende-se:

• Entender e apresentar os fundamentos da intera¸c˜ao de f´armacos.

• Familiarizar-se com as metodologias e algoritmos existentes da intera¸c˜ao de f´armacos.

• Familiarizar-se e estabelecer comunica¸c˜ao entre as aplica¸c˜oes MATLAB R, GUIDE e Report Generator.

• Testar a fiabilidade do programa InterPharm, atrav´es de diferentes casos de estudo, para cada um dos efeitos.

• Comparar os parâmetros obtidos na aplica¸cão desenvolvida com software já existentes.

1.3 Organiza¸c˜

ao da Disserta¸c˜

ao

Esta disserta¸cão encontra-se estruturada em cinco cap´ıtulos. Neste Cap´ıtulo fornece-se uma introdu¸cão de enquadramento e aprefornece-senta-fornece-se a motiva¸cão e objetivos da disserta¸cão.

(31)

1.3. ORGANIZAÇ ÃO DA DISSERTAÇ ÃO 5

No Cap´ıtulo 2 é feita uma revisão da literatura, onde se expõem os conceitos relacionados com a intera¸cão de fármacos e quais os efeitos existentes. Seguidamente faz-se um levantamento dos métodos de análise do efeito e as ferramentas computacionais já desenvolvidas nesta área.

No Cap´ıtulo 3 é apresentada a aplica¸cão desenvolvida nesta disserta¸cão, bem como os métodos utilizados e a explica¸cão das funcionalidades existentes.

O Cap´ıtulo 4 cont´em os resultados de v´arios casos de estudo para cada um dos efeitos poss´ıveis (antagonismo, sinergismo e aditividade).

No Cap´ıtulo 5 são apresentadas as conclusões baseadas nos resultados obtidos no Cap´ıtulo 4 e faz-se uma discussão destes. Também se perspetivam desenvolvimentos futuros.

(32)

(33)

2

Estado da Arte

Neste cap´ıtulo apresentam-se os principais conceitos referentes à intera¸cão de fármacos, os métodos existentes para inferir que tipo de efeito existe e a evolu¸cão histórica desta área da farmacologia.

Ao longo da vida do Homem sempre houve uma procura pelo tratamento de doen¸cas através da utiliza¸cão de plantas, animais e extratos de solo. Com o avan¸co da tecnologia, farmacologia, isolamento e s´ıntese de fármacos foi poss´ıvel descobrir várias terapias (Breitinger, 2012).

Há mais de 100 anos que a intera¸cão de fármacos e os seus efeitos são estudados. Vários métodos foram criados para analisar os dados porém ao longo dos anos mudaram drasticamente (Prichard and Shipman, 1990). Com o aparecimento de princ´ıpios de análise de fármacos e o avan¸co da tecnologia foi poss´ıvel implementar estes algor´ıtmos, criando assim aplica¸cões informáticas que são mais rápidas e precisas no cálculo dos efeitos de determinadas combina¸cões de componentes, melhorando esta área da farmacologia.

O uso de múltiplos fármacos com diferentes modelos e mecanismos de a¸cão pode direcionar o efeito para um único alvo ou doen¸ca de forma a ser tratado mais

(34)

8 CAP´ITULO 2. ESTADO DA ARTE

eficientemente. Os resultados favoráveis do sinergismo incluem o aumento da eficácia do efeito do tratamento, a diminui¸cão da dosagem mas mantendo ou aumentando a eficácia evitando toxicidade, minimizar ou diminuir a resistência aos fármacos e fornecer sinergismo seletivo contra o alvo. Estes benef´ıcios da intera¸cão de fármacos têm levado a este ser o tratamento mais utilizado para as doen¸cas mort´ıferas, como o cancro e doen¸cas infeciosas (por exemplo a SIDA) (Chou, 2006).

2.1 Intera¸c˜

ao de f´

armacos

As intera¸cões biológicas de agentes ativos são um aspeto importante da farmacologia e da biomedicina. A intera¸cão de fármacos descreve a atividade biológica que resulta da presen¸ca de vários fármacos ao mesmo tempo no organismo (Breitinger, 2012). Existem várias situa¸cões cl´ınicas em que tal fenómeno ocorre deliberadamente de forma a melhorar os tratamentos, como por exemplo:

• A combina¸cão de fármacos citotóxicos no tratamento de tumores e infe¸cões, requerem baixas concentra¸cões de cada fármaco de forma a obter melhores efeitos com menores efeitos colaterais.

• A combina¸cão de antibióticos é um exemplo de combina¸cão de melhores efeitos com menores efeitos secundários e redu¸cão do desenvolvimento da resistência.

• Muitas situa¸cões cl´ınicas requerem a administra¸cão de vários fármacos devido a várias doen¸cas. Porém nestes casos não são estudados os efeitos do conjunto de fármacos, e tal deveria ser avaliado.

• O efeito de um fármaco quando por sua vez não consegue atingir o efeito desejado, pode ser aumentando pela combina¸cão com outro fármaco.

Existem três classes diferentes de intera¸cão de fármacos: aditividade, antagonismo e sinergismo, porém não existe consenso quanto à terminologia da intera¸cão de fármacos por parte dos cientistas. Aditividade é quando a resposta à combina¸cão

(35)

2.1. INTERAÇ ÃO DE F ÁRMACOS 9

dos fármacos é igual à esperada dada pela rela¸cão dose-efeito dos fármacos, ou seja é a soma dos efeitos. Antagonismo verifica-se quando a resposta é menor que a esperada, isto é o resultado é menor que a soma dos efeitos individuais. Sinergismo ocorre quando a resposta é maior que a esperada (Breitinger, 2012; il Lee,2010).

O efeito antagónico pode também ser designado por: intera¸cão negativa, sub-aditiva e sinergismo negativo. Sinónimos para intera¸cão sinérgica são positiva, potencia¸cão e aumento. O termo aditividade tem como sinónimos zero, intera¸cão nula, indiferen¸ca e independência (Bliss) (il Lee, 2010).

2.1.1 Farmacocin´

etica

A farmacocinética é uma disciplina do âmbito da farmacologia e esclarece a a¸cão farmacológica, in vivo, de um fármaco em diferentes órgãos e tecidos do organismo tendo em conta a dose administrada. Tem um papel importante para prever as quantidades dos fármacos e suas concentra¸cões em fun¸cão do tempo nos diferentes tecidos.

Os processos básicos que um fármaco sofre no organismo são absor¸cão, distribui¸cão, metabolismo e excre¸cão (Figura 2.1) (Kwon, 2002), estes eventos sequenciais são designados por processos ADME.

• Absor¸cão: é a primeira etapa e inicia-se com a escolha do tipo de administra¸cão até ao momento em que o fármaco entra na corrente sangu´ınea. Caso a administra¸cão seja intravenosa ou intra-arterial não existe esta etapa, se o medicamento for administrado por via oral é aqui onde se verificam as intera¸cões (S.Rodrigues, 2009). Alguns fatores que interferem nesta etapa são o pH do meio, patologias (p.e., úlceras), dose do fármaco administrado, concentra¸cão do fármaco na circula¸cão sistémica e no local de a¸cão, caracter´ısticas qu´ımicas do fármaco, entre outros.

• Distribui¸cão: o fármaco é distribu´ıdo pelo organismo através da circula¸cão. O fármaco passa inicialmente por órgãos de maior vasculariza¸cão (p.e. pulmões

(36)

Figura 2.1– Representa¸cão esquemática do comportamento farmacocinético de um fármaco (Kwon,2002).

e cora¸cão) e depois sofre redistribui¸cão por tecidos menos irrigados (p.e. tecido adiposo). Nesta fase é onde o fármaco chega à zona de atua¸cão (Kwon,2002).

• Metabolismo: fase onde o fármaco é transformado num composto mais hidrossolúvel para posterior excre¸cão. Existem duas fases, a primeira onde existe oxida¸cão, redu¸cão e hidrólise e a fase de conjuga¸cão com substâncias endógenas (S.Rodrigues, 2009).

• Excre¸cão: o f´ıgado é o órgão responsável pela prepara¸cão do fármaco para a excre¸cão. Os compostos são removidos do organismo para o meio externo (S.Rodrigues, 2009).

2.1.2 Farmacodinˆ

amica

A farmacodinâmica é a fase onde há intera¸cão do fármaco com o recetor, o resultado desta intera¸cão produz o efeito terapêutico. A maioria dos fármacos atua sobre recetores espec´ıficos para desencadear a sua a¸cão farmacológica (S.Rodrigues,2009).

(37)

2.1. INTERAÇ ÃO DE F ÁRMACOS 11

Figura 2.2 – Representa¸cão esquemática de farmacocinética, farmacodinâmica e rela¸cão farmacocinética/farmacodinâmica de um fármaco. Cp(t) e Ce(t) são as concentra¸cões de

f´armaco no plasma e no local de atua¸c˜ao, respetivamente (Kwon,2002).

A farmacodinâmica é o estudo da rela¸cão entre a concentra¸cão de um fármaco no local de atua¸cão, onde os recetores estão localizados, e a magnitude da sua eficácia farmacológica (Kwon, 2002).

Quando o local de atua¸cão do fármaco não é no plasma, a concentra¸cão de fármaco no plasma é diferente do local de atua¸cão, é necessário desenvolver um modelo para estabelecer a rela¸cão entre a chamada concentra¸cão efeito, Ce(t), e a concentra¸cão

plasmática, Cp(t), e um modelo farmacodinâmico que estabelece a rela¸cão entre o

efeito induzido pelo f´armaco e a concentra¸c˜ao efeito, Ce(t) (Figura 2.2) .

2.1.3 Intera¸c˜

ao a n´ıvel molecular

Ao n´ıvel molecular os fármacos interagem com enzimas e podemos ter dois tipos de intera¸cão: inibi¸cão competitiva e inibi¸cão não competitiva.

Na inibi¸cão competitiva, a enzima tem uma zona ativa onde o substrato será convertido em produto. Aquando da apresenta¸cão de uma mistura à zona ativa o fármaco e o substrato natural da enzima competem pelo s´ıtio ativo da enzima (Figura 2.3A). Este fenómeno é conhecido por liga¸cão mutuamente exclusiva. À medida que a concentra¸cão de substrato se torna superior ao inibidor, o substrato passa a deslocar o inibidor do s´ıtio ativo da enzima reativando-a (Breitinger, 2012).

No caso da inibi¸cão não competitiva, a enzima possui uma zona ativa, onde se liga o substrato, e uma outra zona diferente onde se liga o inibidor, assim não há interferência por parte do inibidor e a enzima fica ativa (Figura 2.3B) (Breitinger,

(38)

Figura 2.3 – Representa¸cão esquemática dos mecanismos de inibi¸cão. (A) Inibi¸cão competitiva, inibidor (c´ırculos cinzentos) e fármaco (c´ırculos pretos) ligam-se ao mesmo s´ıtio. (B) Inibi¸cão não competitiva, inibidor (quadrados cinzentos) e fármaco ligam-se a locais diferentes (Lee and Kong,2009).

Tanto no caso da inibi¸cão competitiva como na inibi¸cão não competitiva existe um efeito sinérgico pois a enzima está ativa (Breitinger,2012).

Se dois inibidores não competitivos se ligam ao mesmo s´ıtio na enzima este s´ıtio só pode estar ocupado pelo inibidor A ou B, mas nunca pelos dois inibidores ao mesmo tempo (Figura 2.4). Se um inibidor está presente e o outro é adicionado pode-se observar uma grande inibi¸cão do efeito, assim existe um efeito aditivo.

No caso de existirem dois locais diferentes de liga¸cão para inibidores não competitivos, os dois inibidores podem-se ligar simultaneamente à enzima (Figura 2.5), assim existe liga¸cão mutuamente não exclusiva. Neste tipo de inibi¸cão não haverá um efeito aditivo mas sim superaditivo, ou antagónico, devido à grande inibi¸cão das enzimas por parte dos dois inibidores (Breitinger, 2012).

(39)

2.2. M´ETODOS DE AN ´ALISE DO EFEITO 13

Figura 2.4– Esquema da rea¸c˜ao de dois inibidores (quadrados) n˜ao competitivos ligando-se no mesmo local (Breitinger,2012).

Figura 2.5 – Esquema da rea¸cão de dois inibidores (quadrados e triângulos) mutuamente não exclusivos e não competitivos ligando-se a locais diferentes (Breitinger,2012).

2.2 M´

etodos de an´

alise do efeito

O primeiro modelo para descrever a intera¸cão entre fármacos foi proposto por Fraser em 1872 e era um modelo teórico que descrevia o antagonismo entre atropina1

e fisostigmina2 ₍_{Prichard and Shipman}_, ₁₉₉₀_{). Este modelo teve problemas na}

representa¸cão em três dimensões. Após 50 anos, um farmacologista alemão, Loewe,

1

F´armaco alcal´oide que age inibindo a atividade do neurotransmissor acetilcolina. 2´

(40)

explorou as alternativas `a representa¸c˜ao deste modelo.

Historicamente, existem três modelos de intera¸cão mais utilizados: independência de Bliss, aditividade de Loewe e princ´ıpio do efeito mediano (il Lee, 2010), métodos que serão abordados mais à frente.

2.2.1 Aditividade de Loewe

O modelo de aditividade de Loewe foi descrito pela primeira vez em 1926. Este trabalho é a base de modelos contemporâneos utilizados para analisar a intera¸cão de dois componentes diferentes (Zhao et al., 2010).

A equa¸c˜ao geral de aditividade de Loewe ´e definida por (Lee et al., 2010; il Lee,

2010; Lee and Kong, 2009):

´Indice de Intera¸c˜ao = d1 D1 + d2 D2            < 1, sinergismo = 1, aditividade > 1, antagonismo (2.1)

A forma espec´ıfica ´e:

´Indice de Intera¸c˜ao = d1

ED50,1.(_EE−E_max_−E0 )1/Y1

+ d2

ED50,2.(_EE−E_max_−E0 )1/Y2

(2.2)

onde d1 e d2 s˜ao as doses de cada f´armaco na mistura que permite um efeito, E,

e D1 e D2 s˜ao as doses isoladas de cada f´armaco que produzem o mesmo efeito, E

(Figura 2.6).

Devido às dificuldades em expressar o seu método através de superf´ıcies tridimensionais, atendendo a que não dispunha de meios computacionais, o farmacologista alemão criou o termo isobola, que significa linha de igual eleva¸cão e foi copiada dos cartógrafos. As isobolas são proje¸cões bidimensionais de superf´ıcies tridimensionais (Prichard and

(41)

Figura 2.6 – Ilustra¸cão do ´ındice de intera¸cão. P = (Dy,1,0) representa a dose de fármaco

1 que produz o efeito y, Q = (0, Dy,2) representa a dose de f´armaco 2 que produz o efeito

y e U = (d1,d2) representa a dose na combina¸c˜ao que produz o mesmo efeito y. O caso A

representa a situa¸c˜ao de sinergismo e o caso B antagonismo (Lee and Kong,2009).

Shipman, 1990).

Loewe utiliza uma isobola reta para intera¸cões zero quando os fármacos combinados têm mecanismos de a¸cão e rela¸cão dose-efeito semelhantes. Este método é a base do método do Isobolograma que será abordado mais à frente (il Lee, 2010).

2.2.2 Independˆ

encia de Bliss

A independência de Bliss (1939) é um modelo que implica que dois fármacos não cooperem farmacológica ou fisiologicamente um com o outro de forma a que cada componente se comporte de maneira independente. A equa¸cão geral da independência de Bliss (Equa¸cão (2.3)) e a equa¸cão espec´ıfica (Equa¸cão (2.4)) são as seguintes (il Lee, 2010):

(42)

16 CAP´ITULO 2. ESTADO DA ARTE E − E0 Emax− E0 = 1 (1 + ( d1 ED50,1) −γ1)(1 + ( d2 ED50,2)−γ2) (2.4)

Na equa¸cão (2.3), f u13 , f u2 e f u12 são as fra¸cões de tecido não afetadas pelo

tratamento para os fármacos 1 e 2 e na combina¸cão. Na equa¸cão (2.4), a primeira fra¸cão é a fra¸cão do efeito resultante da mistura de d1 e d2. d1 e d2 são as doses de

cada f´armaco na mistura que corresponde ao efeito E. ED50,ii = 1, 2 ´e a dose isolada

dos fármacos que produzem 50% do efeito máximo (Emax) e γ1 e γ2 são coeficientes

de Hill (declive da curva dose-efeito) (il Lee, 2010).

A independência de Bliss apresenta como vantagem o facto de poder ser diretamente calculado a partir de dados de experiências minimamente amostrados sem interpola¸cão da curva de resposta ou itera¸cões para encontrar as ra´ızes (Prichard and Shipman,

1990).

2.2.3 Princ´ıpio do Efeito Mediano

O princ´ıpio do efeito mediano (Equa¸cão (2.5)) é originário de Chou e Talalay em 1984 (Chou and Talalay, 1984), este método da intera¸cão de fármacos foi desenvolvido através da combina¸cão do princ´ıpio f´ısico-qu´ımico da lei da massa-a¸cão com o princ´ıpio matemático de indu¸cão e dedu¸cão (Chou and Talalay, 1977;Chou, 2006).

A equa¸c˜ao do efeito mediano ´e dada por (Chou and Talalay, 1984):

fa/fu = (D/Dm)m (2.5)

onde D é a dose, fa e fu são as fra¸cões afetadas e não afetadas do sistema pela

dose D, respetivamente, Dm ´e a dose necess´aria para produzir o efeito mediano e

m ´e o coeficiente de Hill que confere sigmoicidade `a curva dose-efeito. Se fa+fu=1,

podem-se obter v´arias formas da equa¸c˜ao (2.5) (Chou and Talalay,1984):

3

fa - fra¸cão afetada, por exemplo para um carcinogénico é a fra¸cão de células cancer´ıgenas que não sobrevive; fu - fra¸cão não afetada, fra¸cão de células que sobrevive.

(43)

fa/(1 − fa) = [(fa)−1− 1]−1 = [(fu)−1− 1] = (D/Dm)m

fa= 1/[1 + (D/Dm)]m

D = Dm[f a/(1 − fa)]1/m

A equa¸c˜ao do efeito mediano (equa¸c˜ao (2.5)) pode ser linearizada aplicando logaritmos de ambos os lados,

log(fa/fu) = m.log(D) − m.log(Dm)

O gráfico obtido por esta equa¸cão permite saber qual o declive, m, e a interce¸cão do gráfico dose-efeito com o eixo efeito mediano, ou seja quando fa=fu, fa/fu=1

e consequentemente y=log(fa/fu)=0, que permite determinar log(Dm) e o valor de

Dm (Chou and Talalay, 1984).

Para analisar o efeito de múltiplos fármacos e verificar se existe sinergismo, antagonismo ou aditividade é essencial a seguinte informa¸cão:

• É necessária uma defini¸cão quantitativa de soma uma vez que o sinergismo implica mais do que a soma e o antagonismo é menos que a soma dos efeitos.

• É preciso saber a rela¸cão dose-efeito para o fármaco 1, fármaco 2 e a sua mistura, ou seja o rácio do fármaco 1 em rela¸cão ao fármaco 2 (Chou and Talalay, 1984).

Se dois fármacos (e.g., D1 e D2) têm efeitos que são mutuamente exclusivos, isto é os

fármacos da combina¸cão atuam de forma dependente um do outro, então a soma dos efeitos combinados (fa)1,2 pode ser calculado através de (Chou and Talalay, 1984):

(44)

18 CAP´ITULO 2. ESTADO DA ARTE (fa)1,2 (fu)1,2 = (fa)1 (fu)1 + (fa)2 (fu)2 = = (D)1 (ED50)1 + (D)2 (ED50)2 (2.6)

onde fa é a fra¸cão afetada e fu é a fra¸cão não afetada, ED50 é a concentra¸cão do

fármaco que é necessária para produzir 50% do efeito. Note que fa+ fu=1 ou fa

=1-fu (Chou and Talalay,1984).

Se o efeito de dois fármacos (e.g., D1 e D2) são mutuamente não exclusivos, isto é

têm modos diferentes de a¸cão e têm um local espec´ıfico e independente de intera¸cão, a soma dos efeitos combinados (fa)1,2 pode ser calculado através de (Chou and

Talalay, 1984): (fa)1,2 (fu)1,2 = (fa)1 (fu)1 +(fa)2 (fu)2 + (fa)1.(fa)2 (fu)1.(fu)2 = = (D)1 (ED50)1 + (D)2 (ED50)2 + (D)1.(D)2 (ED50)1.(ED50)2 (2.7)

Quando são colocados os resultados experimentais nas equa¸cões (2.6) ou (2.7), se a soma dos dois termos na equa¸cão (2.6) ou a soma dos três termos na equa¸cão (2.7) é maior, igual ou menor que 1, então pode-se inferir que existe antagonismo, aditividade ou sinergismo, respetivamente. Para quantificar estes efeitos foi necessário haver uma designa¸cão, assim criou-se o termo Combination index (CI) (Figura2.7). Para fármacos mutuamente exclusivos, CI é dado por (Chou and Talalay, 1984):

CI = (D)1 (Dx)1

+ (D)2 (Dx)2

(2.8)

(45)

Figura 2.7 – Exemplo t´ıpico de um gr´afico Fa-CI (Chou,2006).

CI = (D)1 (Dx)1 + (D)2 (Dx)2 + (D)1.(D)2 (Dx)1.(Dx)2 (2.9)

Para os dois casos, quando CI:            < 1, sinergismo = 1, aditividade > 1, antagonismo

Um dos maiores objetivos do efeito sinérgico de uma combina¸cão é a possibilidade de reduzir as doses dos fármacos que são utilizados, mantendo a eficácia. Neste sentido foi criado o termo Dose-reduction index (DRI) por Chou em 1988. O ´ındice de redu¸cão da dose é uma medida que indica a quantidade de cada dose que pode ser diminu´ıda, numa combina¸cão sinérgica, comparando com as doses de cada fármaco isolado (Equa¸cão (2.11)) (Chou, 2006).

(46)

diminui¸cão da toxicidade mantendo a eficácia da terapia. Quanto maior o valor de DRI maior é a diminui¸cão da dose para um determinado efeito mas não garante, necessáriamente, que haja sinergismo, como se pode verificar pela rela¸cão de CI e DRI na equa¸cão (2.10) (Figura 2.8) (Chou,2006).

CI = (D)1 (Dx)1 + (D)2 (Dx)2 = 1 (DRI)1 + 1 (DRI)2 (2.10) Assim, (DRI)1 = (Dx)1 (D)1 , (DRI)2 = (Dx)2 (D)2 (DRI)1 = (Dm)1[fa/(1 − fa)]1/m1 (D)1 , (DRI)2 = (Dm)2[fa/(1 − fa)]1/m2 (D)2 (2.11)

Este método de Chou é uma teoria baseada em quatro resultados fundamentais das ciências biomédicas: a equa¸cão de Michaelis-Menten, a equa¸cão de Hill, a equa¸cão de Scatchard e a equa¸cão de Henderson-Hasselbalch (Figura 2.9). Em 2005 Chou e Martin desenvolveram um software , CompuSyn, para facilitar a simula¸cão e os cálculos automáticos dos parâmetros, através dos dados dose-efeito (Chou, 2006;

Berenbaum, 1977).

2.2.4 Isobolograma

O termos isobola foi utilizado pela primeira vez por Loewe e Muischnek (1926) (Berenbaum,1977). O isobolograma é um método gráfico que existe há vários anos com o propósito de avaliar se existe sinergismo ou antagonismo em combina¸cões de fármacos. Este método é aplicado a pares de fármacos que produzem efeitos semelhantes e quantificáveis que foram testados como uma fun¸cão das respetivas doses ou concentra¸cões. No caso de se pretender estudar mais do que dois fármacos o isobolograma não é aplicado (Tallarida, 2012).

(47)

Figura 2.8– Exemplo t´ıpico de um gr´afico Fa-DRI (Chou,2006).

Figura 2.9– Equa¸c˜ao do efeito mediano como a conjuga¸c˜ao das teorias de Michaelis-Menten, Hill, Scatchard e de Henderson-Hasselbalch (Chou,2006).

(48)

Figura 2.10– Isobolograma para um determinado efeito, onde a dose de fármaco A isolado é A=20 e de fármaco B é B=100. O ponto Q é um par de doses que obtêm o mesmo efeito com menores quantidades de fármaco, ou seja é sinérgico, enquanto que o ponto R é antagónico (é necessária mais quantidade de fármaco). O ponto P aparece muito perto da linha de aditividade, o que pode indicar aditividade (Tallarida,2001).

Para criar um isobolograma é necessário haver rácio constante4_{, onde as curvas}

de dose-efeito de cada fármaco permitem a determina¸cão de cada dose que cria um determinado efeito, como a metade do efeito máximo (E50). A dose E50é desenhada

para cada fármaco como a interce¸cão no sistema de coordenadas cartesianas, em que cada eixo representa as doses individuais de cada fármaco e as duas interce¸cões definem uma linha reta que se designa por linha de aditividade (Figura2.10). Todos os pontos (a,b) nesta linha são pares de doses (Grabovsky and Tallarida, 2004). Quando a isobola para determinado efeito estiver determinada, o par de doses da combina¸cão que experimentalmente produz este efeito pode ser desenhado no gráfico como um ponto. Este ponto vai estar a cima ou abaixo da linha de aditividade e assim determina-se se existe sinergismo ou antagonismo, respetivamente (Grabovsky and Tallarida, 2004).

E = EmaxA/(A + A50)

4

rácio nas doses dos dois fármacos. Exemplo: se dose A=[100 200 300 400] e dose B=[10 20 30 40] o rácio é constante e igual a 10:1.

(49)

e

E = EmaxB/(B + B50)

Neste caso o r´acio, R, ´e R = A/B = A50/B50. Quando os dois componentes

estão presentes em quantidades a e b é poss´ıvel expressar a quantidade de a em equivalência do componente B, designado por b’, e dado por b’ = a/R. Para determinado efeito em que se pretende a dose B, a combina¸cão equivalente é b + b’ = B, ou b + a/R = B. É comum expressar o último na interce¸cão de forma a criar uma linha reta que intercepta A e B (Figura 2.11) (Grabovsky and Tallarida,2004).

a A +

b B = 1

Quando os efeitos (máximos) produzidos pelos fármacos são distintos a análise a efetuar é necessariamente diferente. Considere-se, por conveniência, que o efeito máximo (Ec) para B será de 100 (Grabovsky and Tallarida, 2004).

E = 100B/B + B50

e

E = EcA/A + Ac

A dose da combina¸cão (a,b) dos fármacos A e B são equivalentes à dose b + b’ do fármaco B, onde b’ é obtido pela equa¸cão

b’ = ₁₀₀ B50

Ec(1 + Ac

a ) − 1

(2.12)

A isobola para um efeito espec´ıfico ´e dada por b + b’ = B ou

b + ₁₀₀ B50

Ec(1 + Ac

a) − 1

(50)

Para casos em que as curvas dose-efeito não são descritas por hipérboles, mas são ajustadas por

E = EbBp/(Bp+ B50p )

e

E = EcAq/(Aq+ Aqc)

os coeficientes de Hill (p e q) são utilizados nas equa¸cões dose-efeito e o isobolograma da equa¸cão (2.12) generaliza-se (Tallarida, 2012):

b = Bi− B50 [Eb Ec(1 + Aqc aq) − 1] 1/p (2.14)

Este método de análise permaneceu como padrão nos campos da quimioterapia antiviral e anticancer´ıgena durante mais de 25 anos, devido à sua especificidade de mostrar o efeito para diferentes concentra¸cões de fármaco (Prichard and Shipman,

1990).

2.2.5 Modelo de Greco

Greco et al em 1990 apresentou uma nova abordagem para qualificar o efeito numa combina¸cão de fármacos, utilizando cisplatina e 1-β-D-arabinofuranosilcitosina (ara-C) (Figura 2.12). Este método foi desenvolvido adaptando e combinando outros modelos já existentes, como o conceito fundamental dos isobologramas de Loewe, equa¸cões e s´ımbolos foram adaptados de Chou e Talalay, entre outros (Greco et al.,

1990).

A equa¸cão (2.15) contém as concentra¸cões dos fármacos (d1 e d2) como valores de

entrada e α é o parâmetro de intera¸cão, que indica a magnitude do sinergismo, aditividade e antagonismo (il Lee, 2010).

(51)

Figura 2.11 – Isobolas aditivas de uma combina¸c˜ao de f´armacos para diferentes n´ıveis de efeito (Tallarida,2006).

1 = d1

ED50,1.(_EE−E_max_−E0 )1/γ1

+ d2

ED50,2.(_EE−E_max_−E0 )1/γ2

+ αxd1xd2

ED50,1xED50,2.(_EE−E_max_−E0 )(1/2γ1+ 1/2γ2)

(2.15)

A equa¸cão (2.16) define o ´ındice de intera¸cão para a combina¸cão de dois fármacos (il Lee, 2010). ´ındice de Intera¸cão = d1 D1 + d2 D2 = = 1 − α.d1.d2

ED50,1.ED50,2.(_EE−E_max_−E0 )(1/2γ1+ 1/2γ2)

(52)

Quando α > 0, o ´ındice de intera¸cão é menor que um, logo há sinergismo; quando α < 0 o ´ındice de intera¸cão é maior que um, logo há antagonismo; quando α = 0, o efeito é aditivo (il Lee,2010).

Figura 2.12 – Superf´ıcie tridimensional de dose-efeito, obtida pela experiˆencia de Greco (Greco et al.,1990).

2.2.6 Resposta em superf´ıcie

Outro método de avalia¸cão da resposta da combina¸cão de dois fármacos é a resposta através de uma superf´ıcie. É poss´ıvel mostrar a rela¸cão da combina¸cão de dois componentes num gráfico tridimensional, onde as doses representam as coordenadas cartesianas no plano xOy e o efeito é desenhado como a distância vertical acima do plano xOy. Este conjunto de pontos espaciais permite visualizar a rela¸cão dose-efeito na combina¸cão (Tallarida, 2001).

Utilizando os pontos espaciais pode-se criar uma superf´ıcie lisa de ajuste, que representa a aditividade da combina¸cão. Esta superf´ıcie de aditividade é a superf´ıcie de referência utilizada para inferir qual o efeito de combina¸cão presente. Um ponto

(53)

que esteja significativamente acima da superf´ıcie indica sinergismo, porém se um ponto estiver abaixo da superf´ıcie está-se perante um efeito antagónico (Figura2.13) (Tallarida,2001).

Figura 2.13– Superf´ıcie de ajuste aos pares de doses ao longo do efeito. Ilustra¸c˜ao de um ponto acima da superf´ıcie que indica sinergismo (Tallarida,2001).

Os métodos tridimensionais atualmente utilizados para examinar as intera¸cões de fármacos têm muitas vantagens em rela¸cão às aproxima¸cões bidimensionais. Nos modelos tridimensionais é poss´ıvel visualizar a superf´ıcie de resposta; nos modelos 2D quando se pretende analisar o mesmo há uma variável que fica constante tornando a análise incompleta. Também nos modelos 3D é poss´ıvel quantificar o sinergismo e antagonismo, podendo-se assim comparar diferentes combina¸cões e a forma da curva de sinergismo é caracter´ıstica de cada combina¸cão de fármacos.

(54)

2.3 Ferramentas Computacionais: MATLAB

R

,

GUIDE e Report Generator

MATLABR

(matrix laboratory) foi lan¸cado em 1984. No seu site a MathWorksR

define o software MATLABR

como um ambiente interativo para computa¸cão numérica, visualiza¸cão e programa¸cão e é a linguagem de alto n´ıvel utilizada por muitos engenheiros e cientistas no mundo.

As ferramentas, a linguagem e as fun¸cões matemáticas permitem explorar diversas abordagens e chegar a uma solu¸cão mais rápida do que com outras linguagens de programa¸cão tradicionais (e.g. C/C++).

Este software possibilita explorar e visualizar ideias, analisar dados, criar algoritmos e modelos. O MATLABR

pode ser utilizado em várias áreas, como o processamento de imagem e sinal, comunica¸cão, sistemas de controlo, teste e medi¸cão, biologia computacional, finan¸cas computacionais, entre outros, através de novos produtos que são criados para estender as capacidades deste produto, as toolboxes.

O MATLABR

possui duas ferramentas computacionais relevantes para este trabalho, o GUIDE e o Report Generator. O GUIDE (do inglês graphical user interface design environment) é um ambiente de desenvolvimento de interfaces gráficas por parte do utilizador em MATLABR

, que oferece ferramentas para criar interfaces gráficas para aplicaões, as GUIs (sigla do inglês graphical user interface) (Lent, 2013).

A GUI é uma representa¸cão gráfica de uma ou mais janelas que contêm componentes, que tornam a aplica¸cão interativa. O GUIDE codifica automaticamente em MATLABR

a constru¸c˜ao das GUIs, caso o utilizador pretenda maior controlo sobre o design e desenvolvimento da interface pode criar a fun¸c˜ao que define o comportamento e propriedades de cada componente e, assim, desenvolver a GUI programaticamente.

Os componentes da GUI podem incluir botões, botões de rádio, menus, barras de slide, listas, paineis de botões e exibir dados em tabelas ou gráficos (Figura2.14).

(55)

2.3. FERRAMENTAS COMPUTACIONAIS: MATLAB R_,

GUIDE E REPORT GENERATOR 29

Figura 2.14– Janela do software MATLAB R _{GUIDE (}_mat_).

(56)

O produto Report Generator do MATLABR

permite criar um relat´orio formatado em MicrosoftR

Word, HTML ou PDF onde se apresentam os resultados dos programas ou aplica¸c˜oes criados em MATLABR

. Podem-se utilizar modelos já existentes para criar os relatórios através da aplica¸cão Report Explorer ou então conceber um programaticamente usando DOM(Document Object Model ) (Mathworks,2014).

2.4 Aplica¸c˜

oes Inform´

aticas

A Informática Médica é uma área da Engenharia Biomédica que intersecta as ciências

da informa¸cão, as ciências da computa¸cão e a medicina, com a finalidade de desenvolvimento de métodos, tecnologias e dispositivos necessários para a optimiza¸cão de aquisi¸cão,

armazenamento e utiliza¸cão de informa¸cão nas atividades relacionadas com a presta¸cão de servi¸cos médicos e com investiga¸cão biomédica.

Cada vez mais são desenvolvidas aplica¸cões de Informática Médica adotadas a diferentes n´ıveis de cuidados de saúde devido ao desenvolvimento das tecnologias e à crescente necessidade por parte das institui¸cões de saúde, de racionalizar recursos, de cruzar dados cl´ınicos, controlar as áreas administrativa e financeira e haver um planeamento.

2.4.1 CompuSyn

O software CompuSyn foi desenvolvido em 2005 por Chou e Martin, no seguimento de vários estudos realizados pelos cientistas no desenvolvimento de métodos sobre a intera¸cão de fármacos. Este software utiliza o princ´ıpio de efeito mediano da lei de massa-a¸cão (Chou, 2006; Chou and Talalay, 1977) e o seu método de ´ındice de combina¸cão (Chou and Talalay, 1984).

O CompuSyn é um programa para quantificar o sinergismo e antagonismo em combina¸cões de fármacos e na determina¸cão dos valores de IC50, ED50e LD50. Este

(57)

2.4. APLICAÇ ÕES INFORM ÁTICAS 31

Figura 2.16– Interface do software CalcuSyn (bio).

determina¸cão automática dos valores de CI e DRI, pode ser usado para casos de rácio constante e casos de rácio não constante, também se pode fazer um relatório com toda a informa¸cão, tabelas e gráficos acerca da análise da intera¸cão dos fármacos.

2.4.2 CalcuSyn

O CalcuSyn é um software desenvolvido pela Biosoft e permite analisar a dose-efeito para um ou múltiplos fármacos. Utiliza o método do efeito mediano de Chou e Talalay (Chou, 2006; Chou and Talalay, 1977).

Neste programa os dados podem ser introduzidos através do teclado ou pela importa¸cão de um ficheiro e podem ser processados para fármacos isolados ou combina¸cões com rácios constante ou não constante. O CalcuSyn gera automaticamente gráficos dos dados, como a dose-efeito, efeito mediano, isobolograma e CI-efeito (Figura 2.16) e um relatório com informa¸cão estat´ıstica dos dados, os valores de CI e EDX e os

(58)

Figura 2.17– Interface da aplica¸c˜ao Curve Fitting toolbox da MathWorks.

2.4.3 Curve Fitting toolbox

A MathWorks criou uma toolbox onde é poss´ıvel analisar que tipo de efeito existe, na combina¸cão de dois componentes, através da superf´ıcie de ajuste designada por Curve Fitting toolbox. Nesta toolbox é necessário introduzir uma matriz de doses e efeitos, com dados das doses isoladas e na combina¸cão para assim criar uma malha de pontos que vão ser dispostos tridimensionalmente. Também existem vários métodos poss´ıveis para se fazer o ajuste da superf´ıcie, como métodos de interpola¸cão, regressões lineares e não-lineares e suaviza¸cão (Figura 2.17), também é poss´ıvel fazer o ajuste da superf´ıcie através de uma equa¸cão determinada e introduzida pelo utilizador. Quando é feito o ajuste são apresentadas as informa¸cões da qualidade do ajuste como os valores de SSE (sum of squares due to error ), de R-quadrado, de R-quadrado ajustado e de RMSE (Root mean squared error ).

Esta aplica¸cão baseia-se no modelo de intera¸cão de Greco et al. (Greco et al.,1990), que se representa pela seguinte rela¸cão:

(59)

2.4. APLICAÇ ÕES INFORM ÁTICAS 33 E = Emax.( C′ A C50A + C′ B C50B + α. C′ A C50A + C′ B C50B) n ( CA′ C50A + C′ B C50B + α. C′ A C50A + C′ B C50B) n_{+ 1} (2.17)

onde Emax é o efeito máximo do fármaco A e do fármaco B, C50A e C50B são as

concentra¸cões individuais que produzem 50% do efeito máximo, n é o declive da curva de resposta de farmacodinâmica e α é o único parâmetro que caracteriza a natureza da intera¸cão entre dois fármacos para determinado efeito (Kern et al.,

(60)

(61)

3

Desenvolvimento da aplica¸c˜

ao

InterPharm

A proposta central deste trabalho versa sobre o desenvolvimento de uma ferramenta computacional a partir de trˆes outras: o MATLABR

(vers˜ao R2014a), o GUIDE e o Report Generator.

O programa InterPharm permite efetuar a análise do efeito da combina¸cão de dois fármacos bidimensional e tridimensionalmente, com rácios constantes e para componentes mutuamente exclusivos e não exclusivos, para vários n´ıveis de efeito. Neste cap´ıtulo apresentam-se as etapas necessárias para desenvolver a aplica¸cão InterPharm e os algoritmos utilizados.

3.1 Algoritmos do programa InterPharm

Os algoritmos utilizados no programa InterPharm para a análise da rea¸cão de dois fármacos em combina¸cão são o Princ´ıpio do Efeito Mediano de Chou e Talalay (1984) (Cap´ıtulo 2.2.3), o método do Isobolograma (Cap´ıtulo 2.2.4) e o método da Resposta em Superf´ıcie baseado no modelo de Greco et al. (1990) (Cap´ıtulo 2.2.5).

(62)

36 CAPÍTULO 3. DESENVOLVIMENTO DA APLICAÇ ÃO INTERPHARM

3.2 Metodologia utilizada

Uma vez encontrados os algoritmos pretendidos para implementar na aplica¸c˜ao, iniciou-se o desenvolvimento da interface em MATLABR

.

A interface gráfica da aplica¸cão desenvolvida foi realizada através de programa¸cão. Utiliza os algoritmos descritos nesta disserta¸cão bem como a interface propriamente dita. Quase tudo é transparente para o investigador que não é programador. A interface permite introduzir os dados das doses de fármaco, o tipo de combina¸cão e caracter´ısticas espec´ıficas e no final é poss´ıvel gerar um relatório em formato HTML/PDF/WORD com conslusões obtidas através de diferentes métodos.

O software InterPharm possibilita a implementa¸cão de um sistema de análise ajustado por inteligência computacional de maneira mais simplificada e interativa.

3.2.1 Figura 1 - InterPharm

Quando o utilizador executa a aplica¸cão InterPharm a primeira interface gráfica que é mostrada está representada na figura3.1.

Figura 3.1 – Interface do InterPharm - Primeira janela gerada pelo programa.

A ferramenta desenvolvida permite que o utilizador selecione se pretende realizar uma nova experiˆencia ou uma j´a efetuada (figura3.1).

(63)

3.2. METODOLOGIA UTILIZADA 37

3.2.2 Figura 2 - Nova experiˆ

encia

No caso do utilizador pretender realizar uma nova experiência é apresentada uma outa janela para ser preenchida com o nome da experiência, data, descri¸cão e os fármacos (figura 3.2).

Figura 3.2 – Interface do InterPharm - Janela principal da experiˆencia.

3.2.3 Figura 3 - Novo f´

armaco

Para a introdu¸cão de um novo fármaco aparece uma terceira janela onde o utilizador coloca as informa¸cões gerais do fármaco, como o nome, a abreviatura, as unidades, e as doses e respetivos efeitos (figura 3.3). Caso os dados introduzidos na tabela dose-efeito estejam incorretos, o utilizador tem a op¸cão de limpar a tabela e colocar novamente os dados, ou então ir à tabela e clicar sobre o valor incorreto e substitu´ı-lo. Também existe o botão de cancelar a cria¸cão do novo fármaco. Quando o utilizador pretender salvar os dados introduzidos e voltar à janela anterior, clica no botão ’Finished’.

(64)

Figura 3.3– Interface do InterPharm - Cria¸c˜ao de um f´armaco isolado.

3.2.4 Figura 4 - Nova combina¸c˜

ao de f´

armacos

Após o utilizador preencher a lista dos fármacos isolados com pelo menos dois fármacos, este pode fazer a combina¸cão de fármacos escolhendo quais os que pretende combinar (figura 3.4), através de dupla sele¸cão na lista apresentada com os nomes dos fármacos. Depois o utilizador tem de selecionar clicando no botão de rádio se os fármacos têm rácio constante ou não. Termina esta fase selecionando o botão ’Ok’. Caso queira voltar à janela anterior seleciona o botão ’Cancel’.

(65)

3.2.5 Figura 5 - Nova combina¸c˜

ao de f´

armacos

Nesta fase aparece uma nova janela onde o utilizador pode introduzir o nome da combina¸cão, a abreviatura, os valores de rácio de cada fármaco e as doses e efeitos correspondentes (figura 3.5). Para preencher a tabela dose-efeito basta apenas introduzir a dose de um dos fármacos ou a dose total e automaticamente são gerados e apresentados nos devidos locais os valores das outras duas doses, depois introduz-se o valor do efeito e ao fazer ’Enter’ os dados são colocados na tabela. Aqui também há a possibilidade de limpar os dados da tabela dose-efeito e cancelar a nova combina¸cão de fármacos. Para salvar pressiona-se o botão ’Finished’.

Figura 3.5 – Interface do InterPharm - Cria¸cão da combina¸cão de dois fármacos.

3.2.6 Figura 6 - Salvar Experiˆ

encia

Após introduzida toda a informa¸cão é aconselhável que o utilizador salve a experiência, selecionando o botão ’Save Experiment’. Depois será apresentada uma janela (figura

3.6) onde o utilizador poderá selecionar onde quer salvar a experiência e com que nome (este deverá ser sem espa¸cos), preferencialmente deve-se salvar na pasta que é apresentada (cujo nome é InterPharm). Depois de ser salva a experiência o software cria uma pasta com o nome da mesma onde colocará toda a informa¸cão gerada acerca desta.

(66)

Figura 3.6 – Interface do InterPharm - Sele¸c˜ao da pasta onde se salva a experiˆencia.

3.2.7 Figura 7 - Calcular Parˆ

ametros

Após se salvar a experiência o utilizador seleciona o botão ’Recall Experiment’ na janela da figura 3.1 e a janela correspondente à figura 3.2 será preenchida com os dados. Nesta fase o utilizador pode pretender mais ou menos informa¸cão, no caso de pretender menos informa¸cão acerca da intera¸cão da combina¸cão dos fármacos, seleciona o botão ’Calculate Parameters’. Nesta seçcão é apresentada a dose média, Dm, para cada fármaco e combina¸cão, o ´ındice de combina¸cão, CI, e o ´ındice de redu¸cão da dose, DRI, para cada fármaco, pré-definido para 50% do efeito (figura

(67)

Figura 3.7– Interface do InterPharm - C´alculo de Dm, CI e DRI para determinado valor de Fa.

3.2.8 Figura 8 - Gerar o Relat´

orio

Quando o utilizador pretende uma informa¸cão mais detalhada, este pressiona o botão ’Generate Report’. Primariamente seleciona quais os fármacos que pretende colocar no relatório (máximo dois) e clica ’Ok’, de seguida é apresentada uma nova janela onde seleciona qual a combina¸cão de fármacos pretendida (máximo uma) e clica em ’Ok’. Nesta fase são poss´ıveis as seguintes combina¸cões: apenas um fármaco, a combina¸cão dos dois fármacos, ou os fármacos intervenientes e a combina¸cão (figura

3.8). Após escolher os dados que pretende, selecciona qual a informa¸cão que necessita para a sua análise, que são as seguintes:

• Dose Effect Table • Dose Effect Plot • Median Effect Plot • CI Table

(68)

42 CAPÍTULO 3. DESENVOLVIMENTO DA APLICAÇ ÃO INTERPHARM • Fa-CI Plot • Fa-Log(CI) Plot • DRI Table • Fa-DRI Plot • Fa-Log(DRI) Plot • Isobologram • Surface Fit

Figura 3.8 – Interface do InterPharm - Escolha dos fármacos, combina¸cões e informa¸cão presente no relatório.

3.2.9 Figura 9 - Superf´ıcie de Ajuste

No caso de ser selecionado o tópico Suface Fit aparece uma janela onde o utilizador introduzirá os vários valores de efeitos para as doses indicadas e assim será produzida uma matriz de pontos necessária para gerar a superf´ıcie de ajuste da resposta (figura

(69)

Figura 3.9– Interface do InterPharm - Introdu¸c˜ao da matriz de dados para gerar a superf´ıcie.

3.2.10 Figura 10 - Isobolograma

Para desenhar o isobolograma são necessários três n´ıveis de efeito, por defeito estão os valores de 0.5, 0.75 e 0.9 mas o utilizador pode alterar estes valores pelos que pretender, numa janela que aparecerá após selecionar o ´ıtem Isobologram (figura

3.10).

(70)

3.2.11 Figura 11 - Relat´

orio

No final é gerado e apresentado um relatório em HTML com tabelas e gráficos pretendidos pelo utilizador (figura3.11). Esta informa¸cão gerada, figuras e relatórios em HTML e Word, é guardada na pasta criada aquando do salvamento da experiência.

(71)

4

Apresenta¸c˜

ao e discuss˜

ao dos

resultados

No sentido de validar a aplica¸cão desenvolvida foram realizados alguns testes com fármacos isolados e em combina¸cão que já foram implementados em outros softwares. Os resultados e discussões de cada um destes casos de estudo são tratados neste cap´ıtulo a seguir.

4.1 Caso de estudo I- Rotenone e Pyrethrins

Neste primeiro caso de estudo pretendeu-se verificar o efeito existente numa experiência in vivo com a combina¸cão de dois fármacos anti-moscas. Os dados utilizados para o caso de estudo apresentam-se na Tabela 4.1.

Estes dados foram compilados na aplica¸cão InterPharm e no software CompuSyn e os resultados obtidos dos parâmetros dose-efeito, CI e DRI estão presentes na tabela 4.2. Pode-se verificar que os valores obtidos na aplica¸cão desenvolvida são semelhantes aos do CompuSyn.