Avaliações cardiovasculares e metabólicas produzidas pela dieta rica em carboidratos simples em ratos submetidos ao treinamento físico.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE NUTRIÇÃO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO

MARIANA ARAÚJO VIEIRA DO CARMO

AVALIAÇÕES CARDIOVASCULARES E METABÓLICAS PRODUZIDAS PELA DIETA RICA EM CARBOIDRATOS SIMPLES EM RATOS SUBMETIDOS AO

TREINAMENTO FÍSICO

OURO PRETO, MINAS GERAIS 2016

MARIANA ARAÚJO VIEIRA DO CARMO

AVALIAÇÕES CARDIOVASCULARES E METABÓLICAS PRODUZIDAS PELA DIETA RICA EM CARBOIDRATOS SIMPLES EM RATOS SUBMETIDOS AO

TREINAMENTO FÍSICO

Defesa de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição, como requisito para obtenção do título de Mestre em Saúde e Nutrição.

Área de Concentração: Bioquímica e

Fisiopatologia da Nutrição

Orientadora: Profa. Dra. Lenice Kappes Becker.

OURO PRETO, MINAS GERAIS 2016

Catalogação: www.sisbin.ufop.br C287a Carmo, Mariana Araújo Vieira do.

Avaliações cardiovasculares e metabólicas produzidas pela dieta rica em carboidratos simples em ratos submetidos ao treinamento físico [manuscrito] / Mariana Araújo Vieira do Carmo. - 2016.

70f.: il.: color.

Orientadora: Profa. Dra. Lenice Kappes Becker.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Nutrição. Saúde e Nutrição.

1. Carboidratos na nutrição humana. 2. Sacarose. 3. Sistema cardiovascular -Doenças . 4. Esportes - Aspectos fisiologicos . I. Becker, Lenice Kappes. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Titulo.

APOIO FINANCEIRO

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia do Exercício do Centro Desportivo da UFOP da Universidade Federal de Ouro Preto, com auxílio da CAPES

DEDICATÓRIA

A Deus pela oportunidade, coragem e força, Aos meus pais Luiz e Luciene e a minha irmã Luíza, pelo amor, companheirismo, apoio e exemplo

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A minha orientadora, Profª Drª Lenice Kappes Becker, por ter aceitado o meu pedido de orientação. Obrigada pela confiança e todos os ensinamentos transmitidos no decorrer dessa trajetória. Aprendizado que levarei por toda minha

AGRADECIMENTOS

A Deus, por guiar meus caminhos e por permitir a conclusão de mais uma etapa da minha vida com sucesso.

Aos meus pais Luiz e Luciene, pela oportunidade do estudo, apoio, amor e cumplicidade mesmo de tão longe.

A minha irmã Luíza pela amizade, amor e companheirismo à distância.

Ao meu namorado Douglas, pelo carinho, compreensão e pelos momentos de alegria e aconchego.

Aos Cracudos, Pri, Jaque, Kaka, Filipe e Victor, pela amizade verdadeira e encontros regados a cervejas, papo bom e boas risadas.

A minha pequena grande amiga, Priscila, pelos momentos de leveza, acrobacias e café com prosa.

Aos queridos Filipe e Victor, pelos sustos no laboratório, ensinamentos, dicas e boa vontade em ajudar.

A minha querida amiga Élida Raymond, pelos momentos de desespero e orações, pelas risadas e por toda ajuda.

A Angel, pelo compromisso, calma e por sempre me lembrar das coisas quando minha memória falhava.

A Nádia Totou, pela parceria, por me ensinar várias técnicas e pela boa vontade de sempre.

A Nayara, Jacus, Samara e todo o pessoal do LABFE, pela convivência em harmonia e bons momentos.

Ao Prof. Dr. Marcelo Eustáquio da Silva e ao LABNEX, pelo auxílio sempre que requisitado.

Ao Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso, por permitir a realização de análises e dosagens em seu laboratório (LIP).

Ao Prof. Dr. Wanderson Geraldo de Lima, pelo ensinamento de técnicas e disponibilidade em ajudar.

Ao funcionário Tiné, que sempre foi pau para toda obra.

Ao Laboratório LFEC e demais laboratórios do NUPEB.

Obrigada a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho. Vocês são especiais!

“Não há saber mais ou saber menos: Há saberes diferentes.”

Paulo Freire

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.”

RESUMO

Segundo a Organização Mundial de Saúde, no ano de 2012, 17,5 milhões de pessoas morreram no mundo, vítimas de doenças cardiovasculares. Dentre os principais fatores de risco para o seu desenvolvimento estão a hipertensão arterial e as dislipidemias, cada vez mais prevalentes em crianças e adolescentes. A hipertensão arterial é tradicionalmente associada à ingestão de dietas com alto teor de sódio, no entanto, o consumo de dietas ricas em açúcares adicionados, tem sido relacionado com o aumento da pressão arterial em jovens e adultos. A sacarose faz parte do grupo dos carboidratos conhecidos como açúcares simples ou dissacarídeos e é formada pela combinação de duas moléculas de monossacarídeos: a glicose e a frutose. Hábitos de vida saudáveis, tais como uma alimentação balanceada e a prática regular de atividade física são benéficos na prevenção de obesidade, hipertensão, diabetes, dislipidemia e doenças cardiovasculares. Este estudo tem como objetivo principal avaliar o efeito do treinamento físico sobre as alterações cardiometabólicas produzidas pela dieta rica em carboidratos simples em ratos recém desmamados, ao longo de 8 semanas. Durante oito semanas, estes, foram simultaneamente alimentados com dieta rica em açúcares e submetidos a um protocolo de treinamento físico com sobrecarga. Os animais foram divididos em quatro grupos: (1) ratos sedentários alimentados com dieta padrão (SDP), (2) ratos treinados alimentados com dieta padrão (TDP), (3) ratos sedentários alimentados com dieta rica em carboidratos simples (SCS), (4) ratos treinados alimentados com dieta rica em carboidratos simples (TCS). O peso corporal e ingestão alimentar foram acompanhados semanalmente. Ao final do experimento, a artéria femoral foi canulada para obtenção da pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD), foram coletados os coxins adiposos (índice de adiposidade corporal - IAC), sangue (dosagens plasmáticas), coração (histologia) e músculo sóleo (atividade citrato sintase). Os resultados mostraram que animais alimentados com dieta rica em carboidratos simples apresentaram menor peso corporal (p<0,01), no entanto SCS exibiram maior IAC (p = 0,0057), LDL (p = 0,0028) e colesterol (p = 0,0042). O grupo TDP mostrou menores níveis plasmáticos de VLDL (p = 0,0017) e triglicerídeos (p=0,0026). A atividade da citrato sintase foi

inferior no grupo SCS (p=0,021), e não houve diferença significativa nos valores de glicemia (p = 0,284) HDL (p = 0,245), CK-MB (p=0,208), PAS (p = 0,076), PAD (p = 0,9), infiltração de células inflamatórias (p = 0,41) e deposição de colágeno (p = 0,66) no coração. Apesar do treinamento físico ter sido eficiente em reverter ou minimizar algumas das alterações induzidas pela dieta, sugere-se que uma alimentação balanceada associada à prática regular de exercício físico, possui maiores efeitos benéficos e diminui os riscos de doenças do coração.

Palavras-chaves: Carboidratos simples, Sacarose, Doenças cardiovasculares, Treinamento físico, Ratos desmamados.

ABSTRACT

According to the World Health Organization, 17.5 million people died due to cardiovascular diseases in 2012. Among the main risk factors for the development of such diseases are high blood pressure and dyslipidemia, conditions which have been increasingly more prevalent in children and adolescents. Hypertension has been traditionally associated to ingestion of sodium rich diets. However, the consumption of diets rich in artificial sugars has also been associated with increased blood pressure in young adults. Sucrose is part of the group of simple carbohydrates or disaccharides and it is formed by combining two molecules of monosaccharides: glucose and fructose. Healthy living habits, such as a balanced diet and regular physical activity are beneficial to prevent obesity, hypertension, diabetes, dyslipidemia, and cardiovascular complications. The present study aims to evaluate the effect of exercise training on the cardiometabolic alterations produced by diet rich

in simple carbohydrates in young rats (21 days old). For eight weeks, they were

simultaneously treated with diets rich in sugars and underwent a physical training protocol with overload. The animals were assigned into four different groups: (1) sedentary rats treated with standard diet (SDP), (2) trained rats treated with standard diet (TDP), (3) sedentary rats treated with diets rich in simple carbohydrates (SCS), (4) trained rats treated with diets rich in simple carbohydrates (TCS). Body weight and food intake were monitored weekly. At the end of the experiment, the femoral artery was cannulated to obtain systolic (SBP) and diastolic (DBP) blood pressure. Fat pads were also collected (body adiposity index - IAC), as well as blood samples (plasma levels), heart samples (histology), and soleus muscle samples (citrate synthase activity). The results showed that animals treated with a diet rich in simple carbohydrates had lower body weights (p < 0.01). However, the SCS group exhibited higher IAC (p = 0.0057), LDL (p = 0.0028) and cholesterol levels (p = 0.0042). The TDP group showed lower VLDL (p = 0.0017) and triglycerides (p = 0.0026) plasma levels. Citrate synthase activity was lower in the SCS group (p = 0.021), and there was no significant difference in blood glucose levels (p = 0.284), as well as HDL (p = 0.245), CK- MB (p = 0.208), SBP (p = 0.076), DBP (p = 0.9) levels. Infiltration of inflammatory cells (p = 0.41) and collagen deposition (p = 0.66) in the heart were also not significantly different regarding this group. Although physical training was

effective in reversing or minimizing some of the alterations caused by each diet, it is suggested that a balanced diet accompanied by regular physical exercise has major benefits and ultimately reduces the risk of cardiovascular diseases.

Keywords: Simple carboihydrates, Sucrose, Cardiovascular diseases, Physical

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Delineamento experimental ... 33

Figura 2: Esquema de sobrecarga de treinamento ... 34

Figura 3: Evolução da massa corporal. ... 43

Figura 4: Ingestão alimentar. ... 44

Figura 5: Ingestão energética ... 45

Figura 6: (A) Índice de Lee e (B) Índice de adiposidade corporal. ... 46

Figura 7: Tecido adiposo retroperitoneal. ... 47

Figura 8: (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica e (C) Frequência Cardíaca. ... 50

Figura 9: Porcentagem da resposta máxima à fenilefrina. ... 51

Figura 10: Número de células inflamatórias/campo microscópico.. ... 52

Figura 11: Coração cortado transversalmente e corado com hematoxilina e eosina, para a análiseinfiltração de células inflamatórias no tecido cardíaco.. ... 53

Figura 12: Área de deposição de colágeno /campo microscópico ... 54

Figura 13: Coração cortado transversalmente e corado com Picrosirius Red, para análise de deposição de colágeno.. ... 55

Figura 14: Delta do tempo de exaustão. ... 56

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Constituição e composição nutricional das dietas padrão e rica em carboidratos simples ... 32 TABELA 2: Modo de preparo das soluções ... 41 TABELA 3: Efeito do exercício físico e dieta rica em carboidratos simples sobre os níveis plasmáticos de glicose, colesterol total, LDL, HDL, VLDL e Triglicerídeos. .... 49

LISTA DE ABREVIATURAS

IMC Índice de Massa Corporal

OMS Organização Mundial da Saúde

DCV Doenças Cardiovasculares

HDL Lipoproteína de alta densidade

LDL Lipoproteína de baixa densidade

VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade

SDP Sedentário Dieta Padrão

SCS Sedentário Dieta Rica em Carboidratos Simples

TDP Treinado Dieta Padrão

TCS Treinado Dieta Rica em Carboidratos Simples PAS Pressão Arterial Sistólica

PAD Pressão Arterial Diastólica

PAP Pressão Arterial Pulsátil

CNA Comprimento Nasoanal

PC Peso Corporal

TAE Tecido Adiposo Epididimal

TAR Tecido Adiposo Retroperitoneal

TAI Tecido Adiposo Inguinal

IAC Índice de Adiposidade Corporal

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 20

2 REVISÃO DE LITERATURA ... 21

2.1COMPORTAMENTOALIMENTARNAINFÂNCIA... 21

2.2DOENÇASCARDIOMETABÓLICASEALIMENTAÇÃO ... 22

2.3EXERCÍCIOFÍSICO,DIETAEALTERAÇÕESCARDIOMETABÓLICAS ... 26

3 JUSTIFICATIVA ... 29 4 OBJETIVOS ... 30 4.1GERAL ... 30 4.2ESTRATÉGIASMETODOLÓGICAS ... 30 5 MATERIAIS E MÉTODOS ... 31 5.1ANIMAISDEESTUDO ... 31 5.2DIETA ... 31 5.3DELINEAMENTOEXPERIMENTAL ... 33 5.4PROGRAMADETREINAMENTO ... 33

5.4.1 Teste de carga máxima ... 33

5.4.2 Protocolo de treinamento físico ... 34

5.5 CANULAÇÃODA ARTÉRIA FEMORAL E REGISTRODIRETO DA PRESSÃO ARTERIAL ... 34

5.6 REATIVIDADE VASCULAR DO LEITO ARTERIAL MESENTÉRICO ISOLADO ... 35

5.7EUTANÁSIAECOLETA ... 36

5.8ANÁLISESBIOQUÍMICASDOSANGUE ... 37

5.8.1 Triglicerídeos, Colesterol, LDL, HDL e VLDL ... 37

5.8.2 Glicemia de jejum ... 37

5.8.3 Creatina Quinase MB ... 37

5.9ÍNDICEDELEEEÍNDICEDEADIPOSIDADECORPORAL ... 39

5.10ANÁLISESHISTOLÓGICAS ... 39

5.12ANÁLISESESTATÍSTICAS ... 42

6 RESULTADOS ... 43

6.1EVOLUÇÃODAMASSACORPORAL ... 43

6.2INGESTÃOALIMENTAR ... 44

6.3INGESTÃOENERGÉTICA ... 45

6.4ÍNDICEDELEEEÍNDICEDEADIPOSIDADECORPORAL(IAC) ... 46

6.5TECIDOADIPOSORETROPERITONEAL(TAR) ... 47

6.6DOSAGENSPLASMÁTICAS ... 48

6.7PARÂMETROSCARDIOVASCULARES ... 50

6.7.1 Pressão arterial sistólica, diastólica e Frequência cardíaca ... 50

6.7.2 Influência do treinamento na curva de concentração-resposta à fenilefrina nas artérias mesentéricas ... 51

6.7.3 Lesão Cardíaca ... 51

6.7.4 Infiltração de Células Inflamatórias ... 52

6.7.5 Fibrose Cardíaca ... 54

6.8RENDIMENTOFÍSICO ... 56

6.8.1 Tempo total de exercício até exaustão ... 56

6.8.2 Atividade da Citrato Sintase ... 57

7 DISCUSSÃO ... 58

8 CONCLUSÃO ... 62

1 INTRODUÇÃO

A obesidade infantil, considerada um grave problema de saúde pública, atinge principalmente crianças que vivem em países em desenvolvimento e está fortemente associada com o surgimento de doenças crônicas não transmissíveis, tais como diabetes e doenças cardiovasculares (Daniels et al., 2005). As doenças do coração causaram a morte de 17,3 milhões de pessoas no ano de 2008; e para 2030, espera-se um aumento da mortalidade, pelas mesmas causas, superior a 33% (WHO | Cardiovascular diseases (CVDs), 2013).

Como consequência da urbanização, ocorreram mudanças no estilo de vida que refletiram na prática de exercício físico e no comportamento alimentar das crianças e adolescentes. Estes consomem cada vez mais, refeições ricas em gorduras, sal e açúcares e pobres em fibras, vitaminas e minerais (Raghuveer, 2010; Payab et al., 2014). Hábitos alimentares inadequados ao longo da vida, podem causar hiperlipidemia, obesidade, intolerância à glicose, resistência insulínica, hiperinsulinemia e aumento da pressão arterial (Mostarda et al., 2012). A hipertensão arterial, um fator de risco importante para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares é comumente associada ao consumo de alimentos com teor excessivo de sódio. No entanto, estudos têm mostrado uma relação cada vez mais estreita entre o aumento da pressão arterial e a ingestão de bebidas e alimentos ricos em açúcares simples, tais como frutose e sacarose (Sharma et al., 2007; Kell et al., 2014).

Além do papel da alimentação na prevenção de doenças cardiovasculares, a prática regular de exercício físico também é reconhecida como forma de prevenir o surgimento destas enfermidades (Lee, Hsieh e Paffenbarger, 1995). Juntas, estas duas variáveis mostram melhores resultados na redução de índice de massa corporal (IMC), percentual de gordura corporal e níveis pressóricos (Pena et al., 1980). O exercício físico pode atenuar distúrbios metabólicos e melhorar alterações cardíacas induzidas por dietas ricas em açúcares (Sakr, 2013).

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 COMPORTAMENTO ALIMENTAR NA INFÂNCIA

Os hábitos alimentares formados na infância podem persistir até a vida adulta (Lien, Lytle e Klepp, 2001) e uma alimentação saudável nesta fase da vida melhora a capacidade de aprendizado, promove sensação de bem estar, além de prevenir e reduzir os riscos de desenvolvimento de doenças como diabetes, câncer, doenças cardiovasculares e obesidade, permitindo assim, um envelhecimento com qualidade de vida (Cuenca-Garcia et al., 2012; WHO | Children's diet, 2014).

O tipo de alimentação pós desmame tem extrema importância sobre o desenvolvimento infantil, formação e distribuição da gordura corporal (Ozanne et al., 2004). A ingestão de dietas ricas em carboidratos simples pós desmame pode resultar em uma futura hiperinsulinemia, doenças cardiovasculares e provocar efeitos adversos sobre a saúde e composição corporal de adultos jovens (Mcdevitt et al., 2001; Joslowski et al., 2012).

O consumo de carboidratos, nas últimas três décadas, aumentou 41% (Marriott, Cole e Lee, 2009) e dietas ricas em açúcares têm sido associadas com o desenvolvimento de síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus e resistência insulínica (Mellor et al., 2010). Como resultado da urbanização e de mudanças na alimentação dos pais nos últimos anos, as crianças têm consumido lanches cada vez menos nutritivos, em troca de alimentos ricos em gorduras, sal e açúcares (Payab et al., 2014). Embalagens atrativas e as propagandas utilizadas pelas empresas alimentícias são fatores que implicam ainda mais no aumento do consumo deste tipo de alimento (Hare et al., 2012). O alto consumo de bebidas adoçadas com açúcar, cereais açucarados e doces, mostrou uma redução da qualidade nutricional e da ingestão de micronutrientes, na dieta de crianças e adolescentes (Frary, Johnson e Wang, 2004). A dieta atual, em grande parte, é deficiente em alimentos frescos, frutas, verduras, proteínas magras, ômega 3, vitaminas e minerais (Raghuveer, 2010).

Em geral, crianças norte americanas são sedentárias e passam grande parte do dia jogando videogames, assistindo televisão ou em frente a computadores. A

maioria dos jovens não atende à recomendação diária mínima de atividade física. Nos Estados Unidos, a prevalência de sobrepeso infantil aumentou cerca de três vezes nas últimas décadas (Teran-Garcia, Rankinen e Bouchard, 2008). O tempo em frente à televisão e jogos eletrônicos mostrou associação consistente com o aumento do IMC em meninas e meninos de 9 a 16 anos (Falbe et al., 2013), com o alto consumo de bebidas e alimentos de baixa qualidade nutricional (doces, bebidas açucaradas e “fast foods”) e com a redução na ingestão de frutas e verduras (Falbe et al., 2014).

Crianças obesas e com sobrepeso tendem a ficar obesas na idade adulta e são mais propensas a desenvolver em uma idade cada vez mais precoce, doenças crônicas não transmissíveis, tais como diabetes e doenças cardiovasculares (Freedman et al., 2001; Daniels et al., 2005; Wijga et al., 2010; WHO | Childhood overweight and obesity, 2014; Honorio e Costa Monteiro Hadler, 2014). Estas, têm 2,5 a 3,7 vezes mais chances de desenvolver hipertensão, quando comparadas com aquelas não obesas (Rosner et al., 2000). A obesidade infantil é considerada um dos fatores de risco mais importantes para o desenvolvimento de doenças do coração (Han, Lawlor e Kimm, 2010). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), em 2013, o número de crianças menores de 5 anos com excesso de peso foi estimado em 42 milhões em todo mundo, sendo que aproximadamente 31 milhões delas, viviam em países em desenvolvimento (WHO | Childhood overweight and obesity, 2014).

2.2 DOENÇAS CARDIOMETABÓLICAS E ALIMENTAÇÃO

Em 2008, foi estimado que 17,3 milhões de pessoas adultas morreram vítimas de doenças do coração; e para 2030, espera-se que mais de 23 milhões de pessoas morram por ano, pelas mesmas causas. Os principais fatores de risco para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares (DCV) são o sedentarismo, dieta inadequada, uso de tabaco e consumo excessivo de álcool. A prevenção e o tratamento da hipertensão arterial, diabetes e altos níveis de lipídios circulantes no

sangue, podem reduzir os riscos das doenças cardiovasculares (WHO | Cardiovascular diseases (CVDs), 2013).

O ganho de peso é um importante fator de risco para a disfunção cardiovascular e pode ser associado ao aumento da incidência de hipertensão, acidente vascular encefálico, diabetes e doença arterial periférica (Kobayasi et al., 2010). O controle do fluxo e pressão sanguínea é influenciado pelo tônus vascular, que reflete no balanço entre alterações dilatadoras e constritoras (Barton, 2010). Dietas ricas em gorduras e frutose podem causar aumento do estresse oxidativo e inflamação, o que pode alterar a contração de vasos e prejudicar o relaxamento vascular, além de aumentar o risco de lesões aterogênicas (Fenton et al., 2004; Barton, 2010; Sweazea, Lekic e Walker, 2010).

Dietas ricas em carboidratos simples, como a sacarose (Malik et al., 2010) e hábitos alimentares inadequados, podem causar mudanças que incluem aumento da pressão arterial, hiperlipidemia, obesidade, hipertrigliceridemia, intolerância à glicose, resistência insulínica e hiperinsulinemia (Malik et al., 2010; Mostarda et al., 2012). A sacarose faz parte do grupo do grupo dos carboidratos conhecidos como açúcares simples ou dissacarídeos e é formada pela combinação de duas moléculas de monossacarídeos: a glicose e a frutose. Nos Estados Unidos, a sacarose é o dissacarídeo mais comumente encontrado na dieta e contribui com até 25% do total de energia ingerida (Mcardle, Katch & Katch, 1992). Em modelos animais, dietas ricas em sacarose, estão fortemente associadas com o desenvolvimento de síndrome metabólica, aumento do acúmulo de gordura visceral e altas concentrações plasmáticas de insulina e triglicerídeos (Diaz-Aguila et al., 2015).

As tendências alimentares atuais, enfatizam a importância da redução no consumo de dietas ricas em gorduras para a promoção da saúde, o que aumenta naturalmente a ingestão de carboidratos. A tão desejada diminuição nos níveis séricos de colesterol é frequentemente acompanhada por uma elevação nos níveis plasmáticos de triglicerídeos, já que dietas hiperglicídicas estão fortemente relacionadas à hipertrigliceridemia (Parks e Hellerstein, 2000). Animais recém desmamados, alimentados com dieta rica em carboidratos simples por períodos de 4, 8 e 12 semanas, apresentaram aumento significativo nos níveis séricos de triglicerídeos, quando comparados com o grupo controle (De Queiroz et al., 2014). Este aumento também foi observado em ratos que ingeriram dieta rica em frutose por duas semanas (Hwang et al., 1987).

A hipertensão arterial é tradicionalmente associada ao consumo de dietas com alto teor de sódio, no entanto, o consumo de dietas ricas em açúcares que não ocorrem naturalmente nos alimentos, tem sido relacionado com o aumento da pressão arterial em jovens e adultos (Kell et al., 2014). As principais fontes de alimentos contendo açúcares adicionados, consumidas por crianças e adolescentes americanos são as sobremesas lácteas, doces, cereais açucarados e bebidas adoçadas com açúcar (Reedy e Krebs-Smith, 2010).

Modelos experimentais alimentados com uma dieta rica em frutose, apresentaram níveis da pressão arterial sistólica mais altos e desenvolveram hipertensão, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia e resistência insulínica, quando comparados com os animais que ingeriram somente dieta padrão. Ambas as rações, continham quantidades razoavelmente comparáveis de sódio (Hwang et al., 1987). O consumo de dieta rica em frutose por ratos hipertensos, aumentou a mortalidade e a espessura da parede do ventrículo esquerdo, com diminuição da sua função contrátil, quando comparado com a ingestão de rações ricas em gorduras, carboidratos complexos e ração rica em gorduras e frutose. (Sharma et al., 2007).

Em modelos animais recém-desmamados, a ingestão de sacarose durante 5 semanas, induziu um aumento na atividade simpática e elevou a pressão arterial (Bunag, Tomita e Sasaki, 1983). Outros estudos mostraram aumento da pressão arterial em animais alimentados com dieta rica em frutose e gorduras (Sharma et al., 2007). Ratos normotensos e espontaneamente hipertensos apresentaram aumento da pressão arterial quando as fontes principais de carboidratos das rações eram glicose, sacarose ou amido (Fournier et al., 1986).

A ingestão de dietas ricas em frutose, sacarose e gorduras por ratos hipertensos, mostrou que após 6 semanas de dieta, a pressão arterial sistólica aumentou significativamente e esse aumento foi mais expressivo nos animais que receberam dietas acrescidas de sal. Constatou-se que a mortalidade do grupo alimentado com dieta rica em sacarose (44%), foi muito superior quando comparada com todos os grupos alimentados com ração rica em gordura, frutose e amido (12-18%). A expressão de microRNA’s para a citrato sintase, enzima biomarcadora do metabolismo oxidativo, foi significativamente menor no miocárdio de ratos alimentados com dieta rica em sacarose, quando comparados com aqueles que ingeriram ração rica em gorduras. (Sharma et al., 2008).

O consumo crônico de dietas ricas em açúcares e gorduras saturadas tem sido associado com o aumento do risco de doenças cardiovasculares, por meio do aumento do peso corporal, hipertensão, hipertrofia ventricular esquerda, aumento das concentrações plasmáticas de lipídios, intolerância à glicose, fibrose e infiltração de células inflamatórias no coração (Alam, Kauter e Brown, 2013). Qin et al. (2012), também demonstraram que animais alimentados com dieta rica em gorduras e açúcares desenvolveram progressiva hipertrofia do ventrículo esquerdo, disfunção diastólica, resistência à insulina, fibrose cardíaca, com aumento do estresse oxidativo e da massa total do coração.

Camundongos da linhagem BALB/c foram alimentados com dieta rica em carboidratos refinados por 1 e 3 dias, 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 semanas. Os animais não apresentaram diferença na evolução do ganho de peso, no entanto, aqueles que consumiram a ração experimental exibiram um aumento considerável da adiposidade visceral já no primeiro dia após a introdução da dieta. A adiposidade foi associada com marcadores de disfunção metabólica, tais como: aumento dos níveis plasmáticos de colesterol e triglicerídeos, resistência insulínica, intolerância à glicose e com o aumento do número de células inflamatórias no tecido adiposo (Oliveira et al., 2013).

Um estudo transversal, realizado com crianças de vários lugares do mundo, mostrou que a ingestão de alimentos com adição de açúcares e níveis plasmáticos de triglicerídeos, foram positivamente associados com a pressão sanguínea diastólica, sugerindo que o alto consumo destes alimentos pode comprometer a saúde cardiovascular (Kell et al., 2014). Crianças que desenvolvem hipertensão arterial tem grande probabilidade de se tornarem adultos hipertensos (Chen e Wang, 2008).

Ratos alimentados por duas semanas com dieta rica em carboidratos simples não mostraram alterações significativas na massa corporal e níveis plasmáticos de insulina, triglicerídeos, glicose e ácidos graxos livres. No entanto, com oito semanas de experimento, os animais desenvolveram um grau variável de obesidade e exibiram altos níveis séricos de triglicerídeos, insulina, glicose e ácidos graxos livres, proporcionais ao ganho de peso, quando comparados ao grupo controle (Harrold et al., 2000).

Um novo modelo experimental tem sido desenvolvido através da administração de 30% de sacarose diluída na água ingerida pelos animais. Trabalhos realizados

durante períodos de 12 e 24 semanas, com animais de 21 dias, mostraram que estes, apresentaram altos níveis plasmáticos de triglicerídeos e maior acúmulo de tecido adiposo quando comparados com o grupo controle (Castellanos Jankiewicz et al., 2015; Diaz-Aguila et al., 2015).

2.3 EXERCÍCIO FÍSICO, DIETA E ALTERAÇÕES CARDIOMETABÓLICAS

A prática regular de atividade física é associada à sensação de bem estar e melhoria da saúde, além de ser reconhecida como uma forma de prevenir o desenvolvimento de doenças crônicas e reduzir o risco de mortalidade (Lee, Hsieh e Paffenbarger, 1995). Independentemente da idade em que é praticada, a atividade física mostra associação com o menor risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares, já que exerce efeitos favoráveis sobre níveis séricos de colesterol, triglicerídeos, pressão arterial e controle glicêmico (FAFF, 2004). Quando praticado de maneira regular, o exercício físico aeróbico promove adaptações no sistema cardiovascular e dentre os principais parâmetros que sofrem alterações, estão a frequência cardíaca e a pressão arterial (Negrao et al., 1992).

Para crianças e adolescentes, a atividade física inclui a prática de esportes, educação física, recreação e exercícios planejados, no contexto familiar, escolar ou da comunidade. Com a finalidade de melhorar a capacidade cardiorrespiratória e muscular, aqueles com idade entre 5 e 17 anos, devem praticar no mínimo 60 minutos de atividade física por dia. Sua prática regular é importante para o desenvolvimento saudável do tecido musculoesquelético, sistema cardiovascular, coordenação motora e manutenção do peso corporal, além dos benefícios psicológicos, como por exemplo, o melhor controle de sintomas como a ansiedade e a depressão. Crianças e jovens ativos conseguem se expressar melhor, interagir socialmente e demonstrar melhor desempenho na escola (WHO | Physical Activity and Young People, 2014).

Um estudo constatou que crianças obesas apresentavam maior IMC, pressão arterial, gordura abdominal e menores níveis de atividade física e de lipoproteínas de alta densidade (HDL) circulante no sangue, quando comparadas com aquelas eutróficas. Um programa de treinamento de 180 minutos de atividade física por

semana, durante três meses, revelou uma redução significativa nos níveis pressóricos, no IMC e na adiposidade abdominal, com consequente melhora na capacidade cardiorrespiratória (Farpour-Lambert et al., 2009). Crianças com obesidade e submetidas a dieta e programa de treinamento físico, apresentaram uma maior redução no percentual de gordura corporal, quando comparadas com aquelas que não praticaram exercícios (Pena et al., 1980).

Um programa de treinamento, com natação por três semanas, melhorou a resistência do miocárdio de ratos à isquemia, no entanto a suplementação com grandes quantidades de carboidratos (50 g/L de sacarose adicionados à água), aparentemente, neutralizou este efeito (Margonato et al., 2000).

Mostarda et al. (2012), investigaram se a prática de exercício físico por 10 semanas, em ratos alimentados com dieta rica em frutose, seria capaz de prevenir possíveis alterações metabólicas e cardiovasculares. Os resultados mostraram que animais sedentários e alimentados com a dieta experimental, apresentaram pressão arterial sistólica significativamente maior que aqueles do grupo controle e dos animais que também receberam dieta rica em frutose, mas que foram submetidos ao protocolo de treinamento. Disfunção diastólica do ventrículo esquerdo foi observada nos ratos sedentários que consumiram água adicionada de frutose e o treinamento neutralizou esta alteração. O estudo mostrou que o exercício físico foi capaz de atenuar alterações cardíacas e morfológicas induzidas pela dieta rica em frutose.

Um trabalho realizado durante 15 semanas mostrou que a prática de natação no último mês antes do término do experimento, reduziu distúrbios metabólicos e dislipidemia em ratos alimentados com ração rica em colesterol e frutose. Como consequência da dieta, houve um aumento nos níveis plasmáticos de triglicerídeos e enzimas biomarcadoras de lesão cardíaca, no entanto, o exercício físico foi capaz de reduzir significativamente essas alterações. Animais do grupo experimental também apresentaram deposição lipídica e alterações nas estruturas celulares, evidenciadas pela histologia do coração e microscopia eletrônica e mais uma vez o treinamento foi eficaz em reverter ou diminuir estes prejuízos (Sakr, 2013).

Os efeitos do treinamento físico em esteira foram avaliados em ratos adultos alimentados com dieta rica em frutose e submetidos ao protocolo de exercício, simultaneamente, por 10 semanas. Animais sedentários que ingeriram solução de frutose a 10%, apresentaram pressão arterial sistólica, diastólica e média, significativamente maiores que o grupo controle. Este aumento também foi

observado no índice de Lee, glicemia e peso corporal. No entanto, o treinamento físico foi capaz de reverter este quadro, a valores semelhantes ao grupo controle (Castro et al., 2015).

3 JUSTIFICATIVA

Fatores como alimentação inadequada e sedentarismo, tem sido um alvo de preocupação com a saúde cardiovascular de crianças e adolescentes e com o aparecimento de doenças crônicas não transmissíveis (WHO | Childhood overweight and obesity, 2014). Uma dieta balanceada e a prática regular de exercício físico têm grande relevância na prevenção da obesidade e de doenças do coração e conforme os motivos expostos, justifica-se o desenvolvimento de estudos que avaliem se os efeitos benéficos do treinamento físico regular na infância, se sobrepõem aos possíveis efeitos deletérios do consumo de uma dieta rica em carboidratos simples.

4 OBJETIVOS

4.1 GERAL

 Avaliar o efeito do treinamento físico sobre as alterações cardiometabólicas produzidas pela dieta rica em carboidratos simples.

4.2 ESTRATÉGIAS METODOLÓGICAS

 Analisar o efeito do treinamento físico sobre a capacidade máxima de esforço em ratos tratados ou não com dieta rica em carboidratos simples;

 Verificar o resultado do treinamento físico sobre o comportamento da pressão arterial e dos níveis plasmáticos de triglicerídeos, glicose e colesterol de animais alimentados com dieta rica em carboidratos simples;

 Avaliar o efeito do treinamento físico sobre as alterações morfológicas do coração de ratos tratados com a dieta.

5 MATERIAIS E MÉTODOS

5.1 ANIMAIS DE ESTUDO

No estudo foram utilizados 40 ratos jovens, da linhagem Wistar, com 21 dias de vida, obtidos do Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram mantidos em caixas de polietileno, em uma sala com temperatura

(24.0 ± 2.0 °C) e ciclo claro/escuro de 12 horas (07:00hs às 19:00hs) controlados. Os ratos tiveram livre acesso à água e ração comercial ou experimental. Foram considerados 4 dias de adaptação ao ambiente entre a retirada dos animais e o início dos experimentos. Antes do início do treinamento, os animais foram divididos aleatoriamente entre os seguintes grupos: (1) ratos sedentários alimentados com dieta padrão (SDP; N = 10), (2) ratos treinados alimentados com dieta padrão (TDP; N = 10), (3) ratos sedentários alimentados com dieta rica em carboidratos simples (SCS; N = 10), (4) ratos treinados alimentados com dieta rica em carboidratos simples (TCS; N = 10). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Ouro Preto, processo de número 2013/25.

5.2 DIETA

Os animais dos grupos SCS e TCS foram alimentados por período de 8 semanas com dieta rica em carboidratos simples (sacarose), composta por 33% de ração comercial padrão, 33% de leite condensado, 27% de água e 7% de sacarose. O leite condensado, o açúcar e a água foram misturados e a ração moída foi adicionada à mistura, lentamente. A massa foi modelada em pellets, que foram secos em estufa a 60 ºC por 24 horas (adaptado De Queiroz et al., 2012). Os grupos controle (SDP e TDP) foram aqueles que receberam a dieta padrão (ração NUVILAB – CR). A constituição e composição nutricional das dietas estão dispostas na Tabela 1.

TABELA 1: Constituição e composição nutricional das dietas padrão e rica em carboidratos simples

Nutriente

Dietas (g/Kg)

Dieta padrão Dieta rica em

carboidratos simples Carboidratos 575 680 Proteína 220 95,7 Lipídios 40 57,8 Cinzas 90 29,7 Fibras 70 23,1 Carboidrato (% energia) 57,5 68 Proteína (% energia) 30 16 Lipídios (% energia) Kcal/100 g 12,5 354 16 362,3

Micronutrientes (g/kg de dieta) das dietas padrão e rica em carboidratos simples, respectivamente: Cálcio: 12; 960,9; Fósforo: 0,008; 2,64; Vitamina A: 0,0026; 0,001; Vitamina B1: 0,005; 0,02; Vitamina B2: 0,006; 0,02; Vitamina B12: 2,2x10-5_{; 0,007; Niacina: 0,06; 0,02; Ácido fólico: 0,001; 3,3x10}-4_;

Biotina: 5x10-5_{; 1,65x10}-5_{; Colina: 1,9; 0,627; Ferro: 0,05; 0,0165; Sódio: 2,7; 1,188; Magnésio: 6x10}-8_;

1,98 x10-8_{; Zinco: 0,06; 0,0198; Cobre: 0,01; 0,003; Selênio: 5x10}-5 _1,65x10-5_.

Fonte: (De Queiroz et al., 2012)

O consumo da ração em gramas, a energia consumida e a massa corporal dos animais foram mensurados uma vez por semana durante o período experimental. A ingestão de ração foi calculada como a diferença entre a quantidade colocada e a quantidade restante, dividida pelo número de dias e animais por caixa. O cálculo da energia ingerida foi feito com base nos componentes da dieta consumidos separadamente e multiplicados pelo seus respectivos conteúdos calóricos.

5.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

A figura abaixo (Figura 1) representa a sequência de procedimentos realizados ao longo das oito semanas de experimento.

5.4 PROGRAMA DE TREINAMENTO

5.4.1 Teste de carga máxima

O teste de carga máxima foi realizado antes do início e após o término do treinamento, para avaliar a performance e condicionamento aeróbio dos animais. Estes foram colocados para nadar em tanques com água à 31 ± 1 ºC e profundidade de 35 centímetros, com uma sobrecarga fixa na cauda de 6% do peso corporal, até que chegassem à exaustão. Esta foi determinada pela imersão e pelo não retorno do rato à superfície no tempo de dez segundos (Botezelli et al., 2010; De Moura et al., 2013).

5.4.2 Protocolo de treinamento físico

O treinamento foi realizado durante 8 semanas. No período de adaptação os ratos nadaram sem sobrecarga por 15 minutos no primeiro dia, 30 minutos no segundo, 45 minutos no terceiro e 60 minutos no último dia de adaptação. Após esse período, os animais foram submetidos a 1 hora por dia de exercício de natação, em tanques coletivos, contendo água a 31 ± 1°C, durante 5 dias consecutivos da semana. As cargas foram confeccionadas com fio de solda e foram adicionadas à cauda do animal para realização do exercício. Abaixo é apresentado o esquema de sobrecarga de treinamento (Figura 1). A intensidade de treinamento correspondeu a intensidade submáxima (Botezelli et al., 2010; De Moura et al., 2013).

Grupo

Natação (TDP e TCS)

Incremento de peso na cauda (%)

S e ma na 1ª - 2ª - 3ª 2 4ª 2 5ª 3 6ª 3 7ª 3 8ª 3

Figura 2: Esquema de sobrecarga de treinamento

5.5 CANULAÇÃO DA ARTÉRIA FEMORAL E REGISTRO DIRETO DA PRESSÃO ARTERIAL

Ao final do protocolo experimental, os animais que receberam a dieta rica em carboidratos simples, foram anestesiados com cetamina/xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg respectivamente, intraperitoneal) e cânulas de polietileno (PE – 10/50

Intramedic, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, Estados Unidos) foram preenchidas com solução salina heparinizada (125 UI/mL) para evitar a formação de trombos e a oclusão das mesmas. Foi realizada uma pequena incisão na região inguinal esquerda, para identificação e separação da artéria femoral da veia e do nervo. Após a inserção e fixação da cânula na artéria, esta foi passada pelo tecido subcutâneo do animal, com o auxílio de um trocáter, até a sua exteriorização na região interescapular. Terminado o procedimento, os locais de incisão foram suturados e os animais receberam injeções intramusculares de antibiótico (Pentabiótico Veterinário - Fort Dodge, São Paulo, Brasil) para evitar infecções e complicações pós-operatórias.

Os ratos foram mantidos em caixas de polietileno individuais contendo água e ração e foram aquecidos até a que o efeito da anestesia passasse, para evitar quadros de hipotermia. 24 horas após a cirurgia, a cânula inserida na artéria femoral dos ratos foi conectada a um transdutor, ligado a um sistema de aquisição de dados PowerLab 4/20 (ADInstruments Pty Ltd, Austrália), que possibilitou o registro da pressão arterial pulsátil (PAP). Após a estabilização dos parâmetros cardiovasculares do animal, foi feito um registro de 30 minutos. Os dados foram analisados pelo software LabChart 7 for Windows e a partir da PAP, foi possível calcular a pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e frequência cardíaca (FC).

5.6 REATIVIDADE VASCULAR DO LEITO ARTERIAL MESENTÉRICO ISOLADO

Antes da eutanásia, e após o registro da pressão arterial, os animais foram anestesiados com cetamina/xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg respectivamente, intraperitoneal) e foram submetidos à laparotomia mediana para a exposição da arcada mesentérica. Os ramos pancreático-duodenal, íleo-cólico e cólico direito da artéria mesentérica superior foram ligados. O intestino delgado foi ligado e seccionado na altura do jejuno proximal e íleo distal. A artéria mesentérica superior foi isolada e canulada com tubo de polietileno PE–50 (3,5 cm) (Intramedic, Becton Dickinson and Company, Sparks, MD, Estados Unidos), contendo solução de Krebs

[em mM (NaCl 120; KCl 4,7; KH2PO4 1,17; MgCl2 1,43; NaHCO3 25; Glicose 11; EDTA 0,03; CaCl2 3,0)]. Em seguida, os animais foram sacrificados com a retirada do coração, e o intestino delgado foi separado do leito vascular e lavado com solução de Krebs cuidadosamente para a separação do leito arterial mesentérico. Após seu isolamento, este foi conectado a um sistema de perfusão contendo solução de Krebs a um fluxo constante de 4 mL/min, a 37º C, com aeração de mistura gasosa carbogênica (95% O2 e 5% CO2). O sistema de pressão foi conectado a um transdutor de pressão e a um sistema de aquisição de dados para o registro contínuo da pressão de perfusão mesentérica (PowerLab 4/20 ADInstruments Pty Ltd, Austrália) (De Moraes et al., 2008; Pereira e Passaglia, 2014).

Após a estabilização do registro, foram perfundidas seis concentrações crescentes (10-6 _{a 10}-1 _{M) de fenilefrina (1, 3, 9, 27, 81 e 241 nmol) gerando uma} curva dose resposta, para avaliar a resposta vasoconstritora da artéria mesentérica. As doses foram administradas com intervalos de aproximadamente 5 minutos entre uma e outra, após o retorno da pressão de perfusão basal. As curvas de concentração-efeito foram apresentadas em porcentagem da resposta máxima (Moura et al., 2003).

5.7 EUTANÁSIA E COLETA

Os animais foram sacrificados 48 horas após o término do protocolo de treinamento, com a retirada dos corações. Foram retirados também os coxins adiposos, sangue e o músculo sóleo. Este, foi coletado em nitrogênio líquido e armazenado à -80ºC, para posterior análise da atividade da enzima citrato sintase. O sangue coletado em tubos sem anticoagulante foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos para separação do soro, o qual foi mantido a -20ºC.

5.8 ANÁLISES BIOQUÍMICAS DO SANGUE

5.8.1 Triglicerídeos, Colesterol, LDL, HDL e VLDL

As concentrações plasmáticas de triglicerídeos, colesterol, LDL, HDL e VLDL foram determinadas por espectrofotometria automática no analisador clínico Randon Acess Clinical Analyser, Wiener Lab, modelo CM-200 (WIENER LAB, Rosario, Argentina) pelo método enzimático-colorimétrico por meio de kits específicos disponíveis comercialmente (Bioclin®, Quibasa). As análises foram feitas pelo técnico responsável do Laboratório Piloto de Análises Clínicas (LAPAC) da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP).

5.8.2 Glicemia de jejum

Ao final das oito semanas de experimento e após serem mantidos por 12 de horas em jejum, uma gota de sangue dos animais dos grupos que receberam a dieta rica em carboidratos simples, foi coletada da cauda para determinação da glicemia, por meio do glicosímetro Accu-Chek Performa (Roche Diagnostics, Germany) (Coope et al., 2006).

5.8.3 Creatina Quinase MB

Para a avaliação de possível lesão cardíaca, foi utilizado o método para determinação quantitativa da atividade da isoenzima MB da Creatina Quinase (CK-MB) no soro dos animais. Antes de tal procedimento, foi necessário quantificar a cretina quinase total. Para o preparo das soluções de trabalho, foi utilizada uma proporção de 4 volumes do reagente 1 para um volume do reagente 2. A

reconstituição do calibrador foi feita de acordo com o protocolo do kit (CK-NAC LABTEST). As amostras foram plotadas em duplicata em placa 96 poços, juntamente com os reagentes, para registro da absorbância nos tempo de 2 (A1) e 4 (A2) minutos, em leitor de ELISA () a 340 nm e 37º C. Para calcular a atividade da CK total, foram utilizadas as fórmulas a seguir:

∆A/minuto Teste = A2 - A1 ∆A/minuto Calibrador = A2 - A1

2 2

Atividade da CK-TOTAL (U/L) = ∆A/min Teste x CCal ∆A/min Calibrador

CCal: Concentração do Calibrador = 268 (U/L)

O mesmo procedimento foi utilizado para quantificar a atividade da CK-MB, no entanto foram utilizadas as absorbâncias nos tempos inicial (A1) e 5 minutos (A2) para o cálculo. Quando a atividade da CK total foi maior que 2000 U/L, as amostras foram diluídas 1:2 com NaCl 150 mmol/L (0,85%), antes do início da medição da CK-MB, de acordo com o protocolo (CK-MB LIQUIFORM). Os resultados obtidos foram multiplicados por 2 ao final da análise.

Cálculos da atividade da CK-MB:

∆A Teste = A2 - A1 ∆ Calibrador = A2 - A1

Atividade da CK-MB (U/L) = ∆A Teste x CCal ∆ Calibrador

5.9 ÍNDICE DE LEE E ÍNDICE DE ADIPOSIDADE CORPORAL

A obesidade nos animais pode ser mensurada através do cálculo do índice de Lee, método que se assemelha ao índice de massa corporal, utilizado em humanos (Bernardis e Patterson, 1968). Além disso, o cálculo índice de adiposidade corporal (IAC) permite analisar os depósitos de gordura corporal de maneira consistente (Carroll, Zenebe e Strange, 2006).

No dia do sacrifício, a massa corporal (MC) dos animais foi mensurada assim como comprimento nasoanal (CNA), para cálculo do índice de Lee, através da fórmula (Bernardis e Patterson, 1968):

³√MC (g) CNA (cm)

Os coxins adiposos epididimal (TAE), inguinal (TAI) e retroperitoneal (TAR) foram retirados e pesados para determinação do IAC, através da seguinte equação (Oliveira et al., 2013):

IAC= TAE x TAI xTAR x 100 MC (g)

5.10 ANÁLISES HISTOLÓGICAS

Os corações foram cortados transversalmente e tiveram seu ápice e base descartados, foram armazenados em cassetes histológicos, fixados em solução de formaldeído tamponado (4%), desidratados, diafanizados, embebidos e inseridos em parafina. Secções parafinadas de aproximadamente quatro micrômetros de espessura foram obtidas por técnicas de microtomia, fixadas em lâminas de vidro. Para o método Hematoxilina/Eosina (H/E), as lâminas foram desparafinadas por 30 minutos em xilol 1 e 30 minutos em xilol 2. Para a hidratação, as mesmas foram mantidas por 5 minutos em álcool absoluto 1, álcool absoluto 2, álcool 90%, álcool

80%, álcool 70% e água, respectivamente. Para a coloração, as lâminas foram mantidas em recipiente contendo hematoxilina por um minuto e meio. O excesso foi retirado por imersão em água corrente por trinta minutos. Após este processo, as lâminas foram mantidas em eosina durante um minuto e trinta segundos e o excesso foi retirado por imersão em água por 10 segundos. O processo de secagem durou 24 horas e após este período, lamínulas foram aplicadas com Entelan para finalização da confecção das lâminas. Para o método de coloração Picro Sirius Red (1%), as lâminas foram submetidas ao mesmo processamento da H/E até o momento de hidratação. Em seguida, as lâminas foram colocadas sobre a bancada para adição do corante sirius red (1%) sobre o corte, por uma hora. O excesso foi retirado por imersão em água, para em seguida, ser realizado o processo de secagem e colocação das lamínulas. As colorações Hematoxilina/Eosina (HE) e Sirius red 1% permitem análise da presença de células inflamatórias e formação de colágeno, respectivamente.

Imagens digitais das lâminas foram capturadas de 20 campos diferentes, aleatoriamente, através de um sistema de videocâmera (Leica DFC 300 FX) acoplado a um microscópio ótico, associado ao software de captura de imagens Leica Application Suite. As imagens foram posteriormente analisadas pelo software Leica Qwin V.3.2.1 (Leica Switzerland).

5.11 ATIVIDADE DA CITRATO SINTASE

A enzima citrato sintase, biomarcadora do metabolismo oxidativo no tecido do músculo sóleo, foi mensurada utilizando o kit Citrate Synthase Assay (Sigma-Aldrich). Amostras do tecido foram homogeneizadas em 500 µl de solução tampão (50 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, e 0,1 mM fenilmetilsulfonilflúor; pH 7,4) com o homogeneizador Polytron, em rotação máxima, por 30 segundos. Em seguida, o material foi centrifugado a 10000 rpm, por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para tubos refrigerados para a dosagem do conteúdo de proteínas.

Para medir a atividade da citrato sintase em placa de 96 poços (ELISA), o leitor da placa foi configurado a 412 nm:

- Duração: 1 minuto e 30 segundos - Intervalo: 10 segundos

As soluções do ensaio foram aquecidas à temperatura de 25ºC e bem homogeneizadas antes do início da reação. Os componentes foram preparados de acordo com a Tabela 2.

TABELA 2: Modo de preparo das soluções

Descrição Amostra 1x buffer 30 mM

Acetyl coA 10 mM DTNB 10 mM OAA Amostra x (2-8 L) 186 – x L 2 L 2 L 10 L Controle Positivo (CS) x (1-2 L) 186 – x L 2 L 2 L 10 L

A solução da reação foi preparada contendo 1x Assay Buffer, 30 mM Acetyl

CoA Solution, 10 Mm DTNB solution e 190 L da mistura foram plaqueados em

triplicata. As soluções foram preparadas de acordo com os procedimentos descritos no manual kit. A absorbância da mistura de reação foi acompanhada por um minuto e meio para medir os valores basais. 10 L de 10 mM OAA solution foram adicionados através de uma pipeta multicanal, para iniciar a reação em todos os poços simultaneamente. A placa foi agitada delicadamente por 10 segundos antes da leitura da absorbância.

Para calcular e determinar a atividade da citrato sintase, os valores da absorbância (A412) foram plotados, versus o tempo para cada reação. As mudanças na absorbância (∆A412)/ minuto foram medidas numa faixa linear do gráfico para a atividade endógena e para a atividade total, logo após a adição de OAA. A atividade da citrato sintase foi calculada subtraindo a (∆A412)/ minuto da atividade da amostra pela (∆A412)/ minuto da atividade endógena. Os valores encontrados foram utilizados para o cálculo da atividade da citrato sintase pela fórmula:

Unidades (mole/ mL/ min) = [(A412)/ min x V (mL) x dil]/ [mM x L (cm) x Venz (mL)]

Onde:

V (mL): volume da reação (1 mL para ensaios realizados em cuvetas de 1 mL) Dil: fator de diluição da amostra original

mM _(mM-1 _cm-1_{): 13,6 (coeficiente de extinção do TNB a 412 nm) [14,15 (coeficiente} de extinção do TNB a 405 nm)]

L (cm): 1 cm (comprimento de onda para medida da absorbância na cuveta de 1 mL) (0,552 cm – comprimento de onda para medida da absorbância na placa de 96-well) Venz (mL): o volume da enzima na amostra em mL (2 – 10 L).

A atividade da enzima foi calculada como forma de avaliar a capacidade oxidativa e a efetividade do treinamento, após o término do protocolo.

5.12 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

As análises estatísticas foram feitas pelo pacote estatístico Graph Pad Prism (versão 5.0). O teste Kolmogorov Smirnov foi utilizado para verificar a normalidade dos dados, os quais foram expressos como média ± erro padrão. Para dados que não seguiram distribuição normal, foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis e pós teste de Dunns. O t – teste foi usado para comparar diferenças entre dois grupos. Para comparação entre três ou mais grupos, foi empregada a análise de variância (ANOVA), segundo os efeitos dos fatores testados (one way ou two way). Quando a ANOVA revelou a existência de significância, utilizou-se o pós teste de Bonferroni, a fim de identificar quais grupos diferiram entre si. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

6 RESULTADOS

6.1 EVOLUÇÃO DA MASSA CORPORAL

A figura abaixo representa a evolução da massa corporal durante as semanas de experimento. Os grupos que receberam dieta padrão (SDP e TDP) apresentaram massa corporal significativamente maior em relação aos grupos que ingeriram dieta rica em carboidrato simples (SCS e TCS) (Figura 3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 50 100 150 200 250 300 350 400 SDP SCS TDP TCS Semanas M a s sa c o rp o ra l (g )

Figura 3: Evolução da massa corporal. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=9); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=7); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=10). (*) indica diferença entre os grupos SDP e SCS a partir da quinta semana (p<0,001); (**) indica diferença entre os grupos SDP e TCS a partir da quarta semana (p<0,01); (†) indica diferença entre TDP e SCS a partir da quarta semana (p<0,01) e (††) indica diferença entre TDP e TCS a partir da terceira semana de experimento até a última (p<0,05). Os dados estão expressos como média ± SEM e foram analisados pela ANOVA two-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni.

*

**

†

††

6.2 INGESTÃO ALIMENTAR

A Figura 4 exibe a quantidade de ração individual ingerida por dia, durante as oito semanas de experimento. Apesar dos grupos TCS e SCS apresentarem comportamento a menor ingestão alimentar apenas na sexta semana, o grupo SCS consumiu uma quantidade significativamente inferior de dieta quando comparado com os grupos SDP e TDP. 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 SDP SCS TDP TCS Semanas In g e s tã o i n d iv id u a l (g /d ia )

Figura 4: Ingestão alimentar. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=9); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=7); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=10). (*) indica diferença entre SCS vs. SDP e (†) diferença entre SCS e TDP na sexta semana de experimento (p<0,05). Os dados estão expressos como média ± SEM e foram analisados pela ANOVA two-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni.

6.3 INGESTÃO ENERGÉTICA

A figura abaixo representa a ingestão energética individual diária durante o período de experimentação. Não houve diferença significativa entre os grupos em nenhum dos momentos (Figura 5).

1 2 3 4 5 6 7 8 0 20 40 60 80 100 120 SDP SCS TDP TCS Semanas In g e s tã o e n e rg é tic a i n d iv id u a l (k c a l/d ia )

Figura 5: Ingestão energética. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=9); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=7); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=10). Não houve diferença significativa entre os grupos. Os dados estão expressos como média ± SEM e foram analisados pela ANOVA two-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni.

6.4 ÍNDICE DE LEE E ÍNDICE DE ADIPOSIDADE CORPORAL (IAC)

Não houve diferença significativa no índice de Lee (p = 0,156) dos animais ao longo de 8 semanas de experimento. No entanto os animais que receberam dieta rica em carboidrato simples e não executaram o exercício físico apresentaram IAC maior (p = 0,0057) em relação ao TDP (Figura 6).

SDP SCS TDP TCS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 ín d ic e d e L e e SDP SCS TDP TCS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 IA C (% )

Figura 6: (A) Índice de Lee e (B) Índice de adiposidade corporal. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=6); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=6); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=8). (A) Índice de Lee. Não houve diferença significativa entre os grupos. (B) Índice de adiposidade corporal. (*) Indica diferença entre SCS quando comparado com TDP. Os dados do índice de Lee estão expressos como média ± SEM e foram analisados pelo ANOVA one-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni e os dados do IAC foram expressos como mediana e percentil e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós teste de Dunns.

*

6.5 TECIDO ADIPOSO RETROPERITONEAL (TAR)

Para avaliar o risco do desenvolvimento de doenças cardiovasculares, o tecido adiposo retroperitoneal foi pesado separadamente dos demais coxins. Não houve diferença significativa entre os grupos (p = 0,08) (Figura 7).

SDP SCS TDP TCS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 T A R ( g )

Figura 7: Tecido adiposo retroperitoneal. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=6); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=6); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=8). Os dados foram expressos como mediana e percentil e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós teste de Dunns.

6.6 DOSAGENS PLASMÁTICAS

A tabela abaixo (Tabela 3) mostra o efeito do exercício físico sobre os níveis plasmáticos de glicose, colesterol total, HDL, LDL, VLDL e triglicerídeos. Não houve diferença estatística entre os grupos nos níveis de glicose (p = 0,284) e HDL (p = 0,245). O grupo SCS apresentou maior colesterol (p = 0,0042) quando comparado com o grupo TDP e maiores níveis de LDL (p = 0,0028) em relação a todos os outros grupos. Os animais que receberam dieta padrão e que foram submetidos ao protocolo de treinamento físico (TDP) mostraram menores níveis de VLDL (p = 0,0017) quando comprados com os demais grupos, e menores valores de triglicerídeos (p=0,0026) em relação aos animais que ingeriram dieta rica em carboidratos simples (SCS e TCS).

TABELA 3: Efeito do exercício físico e dieta rica em carboidratos simples sobre os níveis plasmáticos de glicose, colesterol total, LDL, HDL, VLDL e Triglicerídeos.

SDP SCS TDP TCS Glicose (mg/dl) - 102,1 ± 4,7 - 92,14 ± 2,12 Colesterol total (mg/dl) 80,86 ± 4,15 104,2 ± 8,27c _{67,14 ± 7,24 95,5 ± 7,36} LDL (mg/dl) 42,75 ± 3,94 64,03 ± 5,66acd _{37,15 ± 5,08 42,43 ± 5,37} HDL (mg/dl) 23,48 ± 1,74 31,32 ± 3,46 22,35 ± 1,87 29,51 ± 3,2 VLDL (mg/dl) 15,43 ± 2,12d 18,98 ± 2,22 7,52 ± 1,35abd _{15,62 ± 1,46} Triglicerídeos (mg/dl) 77,16 ± 10,62 94,91 ± 11,12 38,54 ± 6,77bd _{81,06 ± 8,62}

Os dados de colesterol, LDL, triglicerídeos e VLDL foram analisados pelo teste ANOVA (one-way) seguido pelo pós teste de Bonferroni. Para análise da glicemia, foi feito o teste-t e para HDL e CK-MB, teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós teste de Dunns. Os dados foram expressos como média ± SEM e valores de p<0,05 foram considerados significativos. a: p<0,05 vs. SDP; b: p<0,05 vs. SCS; c: p<0,05 vs. TDP; d: p<0,05 vs. TCS.

6.7 PARÂMETROS CARDIOVASCULARES

6.7.1 Pressão arterial sistólica, diastólica e Frequência cardíaca

Não houve diferença estatisticamente significativa nos valores de pressão arterial sistólica (p = 0,076), pressão arterial diastólica (p = 0,9) e frequência cardíaca (p = 0,219) (Figura 8). Ambos os grupos mantiveram-se normotensos após o término do experimento. SCS TCS 0 25 50 75 100 125 150 m m H g SCS TCS 0 25 50 75 100 125 150 m m H g SCS TCS 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 bpm

Figura 8: (A) Pressão arterial sistólica, (B) Pressão arterial diastólica e (C) Frequência Cardíaca. SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=8); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=8). (A) Pressão arterial sistólica. Não houve diferença entre a pressão arterial sistólica entre os grupos. (B) Pressão arterial diastólica. Os grupos não mostraram diferença entre si na pressão arterial diastólica. (C) Sem alterações significativas na frequência cardíaca. Os dados estão expressos como média ± SEM e foram analisados pelo test-t.

A

B

6.7.2 Influência do treinamento na curva de concentração-resposta à fenilefrina nas artérias mesentéricas

Houve aumento dose-dependente na resposta à fenilefrina, no entanto, os resultados não mostraram diferença significativa entre os grupos (Figura 9).

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 20 40 60 80 100 SCS TCS Log M [Fenilefrina] % R e s p o s ta m á x im a

Figura 9: Porcentagem da resposta máxima à fenilefrina. SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=3); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=7). Não houve diferença significativa entre os grupos. Os dados estão expressos como média ± SEM e foram analisados pela ANOVA two-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni.

6.7.3 Lesão Cardíaca

Para avaliar se a dieta causou lesão cardíaca, foi feita a dosagem plasmática da enzima Creatina Quinase (MB), que não apresentou níveis significativamente diferentes entres os grupos (p=0,208) (SDP (n=11): 189,4 ± 52,58; SCS (n=9): 527,5 ± 213,8; TDP (n=9): 248,7 ± 163,3 e TCS (n=8): 417,5 ± 154,5).

6.7.4 Infiltração de Células Inflamatórias

O coração dos animais tratados por oito semanas não apresentou aumento na infiltração de células inflamatórias (p = 0,41) (Figura 10). Pelas imagens de coração corado com hematoxilina e eosina é possível observar quantidades semelhantes de células inflamatórias nos quatro grupos experimentais (Figura 11).

SDP SCS TDP TCS 0 50 100 150 200 N ú m e ro c é lu la s / ca mp o micro sc ó p ic o

Figura 10: Número de células inflamatórias/campo microscópico. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=8); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=5); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=5). Não houve diferença entre o número de células entre os grupos. Os dados da infiltração celular de células inflamatórias estão expressos como média ± SEM e foram analisados pelo ANOVA one-way seguido pelo pós-teste de Bonferroni.

Figura 11: Coração cortado transversalmente e corado com hematoxilina e eosina, para a análiseinfiltração de células inflamatórias no tecido cardíaco. Não houve diferença significativa entre os grupos. a: Sedentário Dieta Padrão (SDP); b: Sedentário Dieta rica em carboidratos simples (SCS); c: Treinado Dieta Padrão (TDP); d: Treinado Dieta Rica em Carboidratos simples (TCS).

6.7.5 Fibrose Cardíaca

Não foi observada diferença significativa na deposição de colágeno (p = 0,66) no tecido cardíaco dos animais (Figura 12). Através da coloração com Picrosirius Red e imagem com luz polarizada, é possível observar áreas semelhantes de formação de fibrose em todos os grupos (Figura 13).

SDP

SCS

TDP

TCS

Figura 12: Área de deposição de colágeno /campo microscópico. SDP: Grupo sedentário dieta padrão (n=7); SCS: Grupo sedentário dieta rica em carboidratos simples (n=8); TDP: Grupo treinado dieta padrão (n=5); TCS: Grupo treinado dieta rica em carboidrato simples (n=5). Não houve diferença entre os grupos. Os dados da deposição de colágeno tipo II foram expressos como mediana e percentil e foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis seguido pelo pós teste de Dunns

Figura 13: Coração cortado transversalmente e corado com Picrosirius Red, para análise de deposição de colágeno. Não houve diferença significativa entre os grupos. a: Sedentário Dieta Padrão (SDP); b: Sedentário Dieta rica em carboidratos simples (SCS); c: Treinado Dieta Padrão (TDP); d: Treinado Dieta Rica em Carboidratos simples (TCS).