Preparo, caracterização e avaliação farmacológica de complexos de clonidina em hidroxipropil-beta-ciclodextrina para uso associado com bupivacaína

Universidade Estadual de Campinas

Instituto de Biologia

MARIO ANTONIO BRAGA

Preparo, caracterização e avaliação farmacológica de

complexos de clonidina em hidroxipropil-beta-ciclodextrina

para uso associado com bupivacaína

Campinas

2013

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“Tudo tem seu tempo e até certas

manifestações mais vigorosas e

originais entram em voga ou saem

de moda. Mas a sabedoria tem uma

vantagem: é eterna”

Baltasar Gracián

v

À minha mãe, que mesmo sem estudo,

me ensinou muito mais do que se aprende

em qualquer curso

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À Deus, que guia meus passos e não me desampara nunca, por permitir a concretização deste trabalho.

Aos meus pais, Edna e Décio, pelo amor, cuidado, educação, orações e por acreditarem em mim em todos os momentos.

À minha esposa Camila, amor da vida inteira, por, acima de tudo, ter sonhado meus sonhos desde o primeiro dia que nos conhecemos.

À minha irmã Marina pelo carinho e por torcer sinceramente pelas minhas conquistas. Ao carinho da minha sobrinha Isadora e das minhas afilhadas Ana e Luisa.

À minha querida tia Ivani, minha mãe de coração, por ter me apoiado em absolutamente tudo que fiz e ter zelado pela minha educação.

À Cassia, prima que tenho como irmã, pelo apoio e incentivo em seguir sempre em frente.

Aos meus tios, primos e sogros, que sempre me recebem com muito carinho quando “volto pra casa” e me incentivam a continuar na busca pelos meus ideais.

Aos meus amigos que torcem sinceramente pelas minhas conquistas.

Ao Biomembranas (Eneida, Cintia, Cleyton, Michele, Viviane Guilherme, Viviane Vieira, Viviane Queiroz, Camila, Ana Lais, Bruna, Raquel, Verônica, Cintia Matsumoto, Livia, Marina, Jaqueline, Andressa, Juliana, Márcio e Maribel) por todo apoio na realização deste trabalho. Aprendi muito com todos!

À Viviane e Dalton pela amizade e momentos de descontração e oração.

A Ana Lais pela amizade, ajuda com os espectros e tantas outras dúvidas. O doutorado está de pé! A Viviane Guilherme pela imensa ajuda com os ensaios in vivo, e à Cintia Cereda e Cintia Gomez pela disponibilidade de sempre.

Ao Dr. Fabiano Yokaichiya (Laboratório Nacional de Luz Síncroton), Dr. Luis Fernando Cabeça (Universidade Tecnológica do Paraná, campus Londrina), Prof. Dr. Tiago Venâncio e Lorena Mara Alexandre e Silva (UFSCAR) pela disponibilidade de uso do difratômetro de raios-X e espectrômetro de RMN.

À Dra. Giovana Tofoli e Dra. Michelle Franz-Montan pelas contribuições com este trabalho por ocasião da qualificação do projeto de pesquisa. Novamente à Dra. Giovana, que me acompanhou na qualificação final, à Dra. Angélica Braga e Dr. Marcelo Bispo de Jesus, que completaram a equipe de avaliadores, pelas colocações pertinentes que engradeceram esta dissertação. Agradeço ainda aos professores que participaram da banca de defesa, além de minha orientadora, Dra Eneida de Paula; Dra. Angélica Braga e Dr. Leonardo Fraceto, bem como a disponibilidade dos membros suplentes Dra. Cintia Cereda e Dra. Daniele Araújo.

À Libbs Farmacêutica, de maneira muito especial ao Dr. Miller Nunes de Freitas e ao Cassio Yamakawa, que permitiram que eu me ausentasse no início do mestrado para frequentar as aulas. À Medley Farmacêutica, que de igual maneira me apoiou na continuidade e conclusão do curso.

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À Unicamp pela excelência no ensino e por toda a estrutura disponível.

À FAPESP pelo auxílio financeiro ao Laboratório de Biomembranas, cuja disponibilidade de recursos possibilitou não só a execução do meu trabalho, mas de todos os demais.

Por fim, mas não menos importante, agradeço à Profa. Eneida de Paula pela oportunidade e por todos os ensinamentos. Sinto-me muito honrado de fazer parte do Biomembranas e tenho em você meu maior exemplo de profissional dedicada, competente e entusiasmada pelo ensino. Se não fosse a sua abertura e a oportunidade que me deu, o sonho jamais estaria realizado. Muito obrigado!!

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1. INTRODUÇÃO ... 01

1.1. Dor: aspectos fisiológicos e contribuição noradrenérgica como mecanismo de controle ... 01

1.1.1. Dor nociceptiva: aspectos periféricos e centrais ... 01

1.1.2. Dor neuropática ... 06

1.1.3.

1.2. Clonidina: da ação vasoconstritora à adjuvante na anestesia... 09

1.2.1. Propriedades físico-químicas da Clonidina... 12

1.2.2. Relação com anestésicos locais ... 12

1.3. Bupivacaína ... 13 1.4. Ciclodextrinas ... 14 2. OBJETIVOS ... 19 2.1. Objetivos gerais ... 19 2.2. Objetivos específicos ... 19 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 20 3.1. Materiais ... 20

3.1.1. Fármacos, sais e solventes ... 20

3.1.2. Equipamentos ... 20

3.1.3. Animais ... 20

3.2. Métodos ... 21

3.2.1. Caracterização físico-química da clonidina ... 21

3.2.1.1.

3.2.1.2. Determinação da absortividade do Cloridrato de Clonidina em diferentes meios ... 21

3.2.1.3. Determinação do comportamento óptico em meios de diferentes constantes dielétricas ... 22

3.2.1.4. Determinação da solubilidade do Cloridrato de Clonidina em diferentes meios ... 22

3.2.1.5. Determinação do pK do Cloridrato de Clonidina ... 22

3.2.1.6. Determinação do coeficiente de partição octanol-água ... 23

3.2.1.7. Determinação da partição em lipossomas ... 24

3.2.1.8.

3.2.2. Preparação do complexo ... 25

3.2.2.1. Determinação da estequiometria de complexação ... 25

3.2.2.2. Preparo do complexo de inclusão ... 27

ix

3.2.3.1. Calorimetria exploratória diferencial ... 27

3.2.3.2. Difração de Raios-X ... 28

3.2.3.3. Ressonância magnética nuclear ... 28

3.2.3.3.1. Coeficiente de difusão e determinação da constante de afinidade ... 29

3.2.3.4. Microscopia eletrônica de varredura ... 31

3.2.3.5. Ensaios de liberação in vitro ... 31

3.2.4. Avaliação farmacológica ... 31

3.2.4.1. Ensaios de toxicidade in vitro: cultura de células 3T3 ... 31

3.2.4.2. Ensaios in vivo: teste de Tail-flick ... 3.2.5. Avaliação e tratamento estatístico dos dados ... 32 34 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35

4.1. Caracterização físico-química do Cloridrato de Clonidina ... 35

4.1.1. Avaliação das propriedades ópticas e da solubilidade do Cloridrato de Clonidina ... 35

4.2. Determinação da estequiometria de complexação do Cloridrato de Clonidina ... 38

4.2.1. Determinação da estequiometria pelo método de Job ... 38

4.2.2. Determinação da estequiometria por Benesi-Hildebrand ... 40

4.3. Caracterização do complexo de inclusão ... 42

4.3.1. Caracterização do complexo por medidas de calorimetria: DSC e TG ... 42

4.3.2. Caracterização do complexo por difração de raios-X ... 44

4.3.3. Caracterização do complexo por MEV ... 45

4.3.4. Caracterização do complexo por RMN 1H ... 46

4.3.5. Caracterização do complexo por cinética de liberação ... 51

4.4. Avaliação farmacológica do complexo de inclusão e associação ao anestésico local Bupivacaína ... 52

4.4.1. Determinação da lipofilicidade por diferentes técnicas ... 53

4.4.2. Ensaios de toxicidade in vitro: cultura de células 3T3 ... 54

4.4.3. Ensaios in vivo: teste de Tail-flick ... 57

5. CONCLUSÕES ... 60

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 61

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mecanismos de transmissão e interpretação de impulsos dolorosos ... 03 Figura 2: Sequência de eventos que leva a sensibilização central dos neurônios ... 05 Figura 3: Estrutura química da Clonidina ou 2-[2,6-diclorofenilimino] imidazolidina (a) e

representação do tautômero imina (b). Conformações de mínima energia da forma básica (c) 10

Figura 4: Estrutura química das ciclodextrinas naturais e representação do anel macrocíclico, em formato toroidal ... 15 Figura 5: Representação esquemática da partição de solutos em bicamadas lipídicas (a) e em superfície de membranas artificiais imobilizadas (b) e do cálculo de fator de capacidade em

colunas IAM ... 25 Figura 6: a – representação esquemática de inserção de agulha no espaço intervertebral

(L5-L6) para injeção intratecal em ratos; b – equipamento utilizado nos ensaios farmacológicos

(teste de Tail-flick) ... 34 Figura 7: Espectro de absorção UV/VIS da CND em água, 25°C ... 35 Figura 8: Espectro de absorção do cloridrato de clonidina (1mM) em suas formas protonada

(em água e tampão acetato pH 5,0), neutra (tampão carbonato, pH 12) e em pH fisiológico, 25°C ... 36 Figura 9: Determinação do pKa da CND por método potenciométrico de titulação com

soluções de HCl e NaOH, 25°C ... 36 Figura 10: Curvas de calibração para determinação da absortividade molar da CND em

diferentes pHs: a) 5,5 b) 7,4 c) 12,0 ... 37 Figura 11: Espectro de absorção da CND em excesso de HP-β-CD (a), varreduras em diferentes constantes dielétricas (b), espectro em constantes dielétricas extremas e em

excesso de HP-β-CD (c) ... 39 Figura 12: Gráfico de Job evidenciando estequiometria 1:1 CND:HP-β-CD ... 40 Figura 13: Variação da absorção da CND na presença de concentrações crescentes de

HP-β-CD (a). Aplicação da equação de Benesi-Hildebrand para estequiometria 1:1 CND:HP-β-HP-β-CD

xi

Figura 14: Curvas de DSC obtidas para clonidina (preto), HP-β-CD (verde), complexo (vermelho) e mistura física (azul), na razão molar de 1:1. Taxa de aquecimento de 10°C/min,

sob atmosfera inerte, em cadinho hermeticamente fechado ... 42

Figura 15: Curvas termogravimétricas para HP-β-CD (a), CND (b) e complexo CND:HP-β-CD (c) na razão molar 1:1 ... 44

Figura 16: Difratogramas de raios-X para CND; HP-β-CD, complexo e mistura física ... 44

Figura 17: Fotomicrografias da HP-β-CD (a), clonidina (b), mistura física (c) e complexo (d)... 45

Figura 18: Espectros RMN 1H para CND, HP-β-CD e complexo CND:HP- β-CD ... 47

Figura 19: Espectros pseudo-bidimensionais de 1H-RMN: experimentos de DOSY para clonidina (a), HP-β-CD (b), complexo CND:HP-β-CD (d) e mistura física (c), na razão molar 1:1 ... 49

Figura 20: Espectro de ROESY do complexo CND:HP-β-CD (a) e ampliação da região de 3,2 a 4ppm (b) para identificação de interações intra e intermoleculares envolvendo hidrogênios pertencentes à HP-β-CD ... 51

Figura 21: Perfil de liberação da CND e complexo CND:HP-β-CD em tampão Hepes pH 7,4; 25°C ... 52

Figura 22: Ensaios de viabilidade celular para determinação do IC50 para a CND em cultura de células 3T3 ... 55

Figura 23: Testes de viabilidade celular em fibroblastos 3T3, realizados em concentrações abaixo (A) e acima (B) do IC50 da CND, associada a BVC em concentração de 1,67mM ... 56

Figura 24: Avaliação do bloqueio sensorial do nervo caudal de ratos Wistar após administração intratecal dos fármacos clonidina (30g, livre ou complexada com HP--CD), bupivacaína (0,125 e 0,25 %) e associação de ambas... 58

xii

Tabela 1: Tipos de fibras sensitivas, sua mielinização e velocidade de condução de impulsos ... 02 Tabela 2: Gradiente de polaridade água-álcool utilizado para obtenção de soluções de

diferentes constantes dielétricas ... 22 Tabela 3: Concentrações de CND e HP--CD utilizadas no experimento de Job plot ...

26 Tabela 4: Grupos utilizados em ensaios de avaliação farmacológica in vivo ... 33 Tabela 5: Solubilidade e absortividade molar da CND em diferentes meios, 25°C ... 38 Tabela 6: Deslocamentos químicos (Δδ, em ppm) e atribuição de hidrogênios para as

amostras de CND, HP-β-CD e complexo CND:HP-β-CD ... 48 Tabela 7: Coeficientes de Difusão (D) da CND, HP-β-CD e do complexo CND:HP-β-CD,

fração molar do complexo e constantes de associação (Kas) da CND:HP-β-CD ... 50 Tabela 8: Tempo de recuperação (Trec) e área sob a curva em função do tempo (ASC

0-600) para o efeito anestésico medido para os fármacos clonidina e bupivacaina, mais associações, mostrados na figura 24 ... 59

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AL Anestésicos locais

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

AVC Acidente Vascular Cerebral

BVC Bupivacaína

CDME Corno dorsal da medula espinhal

CGRP peptídeo geneticamente relacionado com a calcitonina

CND Clonidina

DAG Diacilglicerol

DMEM Dubelcco's Modified Eagle Medium, Nutricell

DIN Dinorfinas

ENC Encefalinas

F.BRAS Farmacopéia Brasileira

Glu Glutamato

HP--CD 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina

HPLC Cromatografia a líquido de alta eficiência

IAM Membranas artificiais imobilizadas

IP3 Trifosfato de inositol

LC Leucotrieno

MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-brometo de difeniltetrazólio

NMDA Receptores N-metil-D-aspartato

NMR Núcleo magno da rafe

NOS Óxido nítrico

PAG Substância cinzenta periaquedutal

PC Fosfatidilcolina

PG Prostaglandina

PIP2 4,5-bifosfato de fosfatidilinositol

PKC Proteína cinase C

PLA2 Fosfolipase A2

PLC Fosfolipase C

RMN Ressonância Magnética Nuclear

RVM Medula ventromedial rostral

SNC Sistema Nervoso Central

SP Substância P

xiv

A clonidina (CND) é um composto imidazólico que foi sintetizado em 1960 e utilizado inicialmente como descongestionante nasal por sua ação vasoconstritora. Após o início do uso clínico deste fármaco, foram observados efeitos sistêmicos surpreendentes como hipotensão arterial, sedação e bradicardia. Como consequência de seu efeito hipotensor, este fármaco foi utilizado com eficácia no tratamento da hipertensão arterial durante 25 anos. Com a elucidação do seu mecanismo de ação, outras indicações foram sendo propostas na prática clínica e assim o fármaco ganhou expressivo interesse na anestesiologia, sendo utilizado como medicação pré-anestésica, adjuvante na anestesia geral, anestesia regional e pós-operatória, inclusive em pacientes pediátricos. Apesar da amplitude de indicações no tratamento da dor e anestesia, o fármaco apresenta reações adversas, tornando-se necessário manipular suas propriedades físico-químicas no intuito de aperfeiçoar seu efeito terapêutico e diminuir reações adversas. Neste trabalho objetivamos veicular a CND em hidroxipropil-beta-ciclodextrina (HP--CD), com o intuito de otimizar a ação do fármaco, reforçando seu uso na prática clínica como analgésico e adjuvante na anestesia infiltrativa. Para este fim complexos de inclusão da CND com o carreador proposto foram preparados e caracterizados; além disso, o efeito anestésico in vivo da CND livre e complexada, associada ao anestésico local bupivacaína, foi avaliado pelo teste de tail-flick, após injeção intratecal em ratos Wistar. Uma relação estequiométrica 1:1 (CND:HP--CD) foi determinada e o tempo de equilíbrio foi de 24 horas. O complexo foi caracterizado por medidas de calorimetria exploratória diferencial, difração de raios-X, microscopia eletrônica de varredura e cinética de liberação. Estes ensaios forneceram indícios da associação da CND com a HP--CD, haja visto a diferença entre os picos endotérmicos, padrões de difração, padrão de cristalinidade e retardo em liberação, respectivamente. Os ensaios de ressonância magnética nuclear de hidrogênios mostraram baixa afinidade entre a CND e a HP--CD (Ka = 20 L/M-1), porém foi possível evidenciar os detalhes moleculares da inserção do anel aromático na cavidade da HP--CD. Apesar disso, o efeito anestésico do complexo CND:HP--CD, avaliado em animais, foi pronunciadamente superior ao dos fármacos CND e bupivacaína, isoladamente, indicando a viabilidade desta formulação para uso associado a anestésicos locais, na anestesia operatória.

xv

Clonidine (CND) is an imidazole compound synthesized in 1960 and originally used as a nasal decongestant for its vasoconstrictor action. After initial clinical use, unexpected systemic effects were observed as hypotension, bradycardia and sedation. As a consequence of its hypotensive effect, this drug has been successfully used in the treatment of hypertension for over 25 years. With the elucidation of its mechanism of action, other indications were proposed in clinical practice. CND has gained significant interest in anesthesiology, being used as an adjuvant to general and regional anesthesia, during surgery or in the postoperative period, even in children. Despite its breadth of indications in the treatment of pain and anesthesia, CND has adverse reactions, making it necessary to manipulate its physicochemical properties in order to improve the therapeutic efficacy and decrease adverse reactions. In this work we proposed to complex clonidine with hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP--CD) in order to optimize drug action enhancing its use as an analgesic adjuvant in infiltration anesthesia. For that, in addition to the preparation and characterization of a CND:HP--CD, inclusion complex, we evaluated the in vivo anesthetic effect of free and complexed CND, associated with the local anesthetic bupivacaine. A 1:1 stoichiometric ratio (CND:HP--CD) was determined after an equilibrium time of 24 hours. The complex was characterized by differential scanning calorimetry, X-ray diffraction, scanning electron microscopy and release kinetics. These trials provided evidences for the inclusion complexation of CND in HP--CD, considering the differences between endothermic peaks, diffraction patterns, standard crystallinity and sustained release, respectively. Nuclear magnetic resonance experiments revealed a low binding constant between clonidine and HP--CD (Ka = 20 L/M-1) but provided molecular details on the insertion of the aromatic ring inside the HP--CD macromolecular cavity. Despite that, the anesthetic effect of clonidine:HP--CD complex in animals was considerably higher than that evoked by clonidine and bupivacaine alone, pointing out the future use of this drug delivery formulation in association with local anesthetics, for surgical anesthesia procedures.

1

1.1. Dor: aspectos fisiológicos e contribuição noradrenérgica como mecanismo de controle

A dor é um fenômeno dinâmico. Das áreas periféricas ao cérebro, os sinais nociceptivos são modulados em todos os níveis pelo sistema nervoso central (SNC) (Marchand, 2008). A dor é o sintoma mais comum nas doenças humanas e é definida como uma sensação desagradável que pode, primariamente, estar associada ou não a lesão tecidual (Lampl, 2012). Apesar de incômoda, a dor desempenha uma função biológica essencial. É a resposta do organismo a um trauma real ou potencial. Porém, em algumas situações, o sofrimento doloroso perde sua função biológica e passa a ser uma consequência insuportável às desordens refratárias aos tratamentos (Stevens, 1992). Do ponto de vista do mecanismo fisiopatológico a dor pode ser classificada como nociceptiva ou neuropática (Schestatsky & Nascimento, 2009). Já em relação à duração pode ser classificada como aguda ou crônica (Vadivelu et

al., 2009).

1.1.1. Dor nociceptiva: aspectos periféricos e centrais

A transdução e transmissão de estímulos nocivos em tecidos periféricos ocorrem através de neurônios especializados que se projetam para o sistema nervoso central, onde este estímulo periférico é processado e transmitido para que haja a percepção da dor (Price & Geranton, 2009). Um impulso nociceptivo é conduzido através de um neurônio aferente primário que entra no tronco encefálico e faz sinapse com um neurônio de segunda ordem para ser transmitido ao tálamo. A fibra que carrega esse impulso aferente primário pode ser do tipo Aδ, mais grossa, ou C, mais fina (Patel, 2010). O corno dorsal da medula espinhal, local onde os neurônios fazem suas sinapses, é subdividido em camadas (lâminas) distintas de acordo com as características citológicas de seus neurônios. As fibras C não-mielinizadas terminam nas lâminas I, II e V do corno dorsal, enquanto as fibras mielinizadas Aδ terminam na lâminas I e II e também penetram mais profundamente nas lâminas V e X (Carvalho & Lemonica, 1998; Purves et

al., 2005). Embora haja também as fibras do tipo Aβ, apenas as fibras Aδ e C possuem capacidade para

transmitir estímulos nociceptivos (Belmonte & Cervero, 1996). A tabela 1 descreve os tipos de fibras sensitivas.

2

Tabela 1: Tipos de fibras sensitivas, sua mielinização e velocidade de condução de impulsos (Belmonte & Cervero, 1996; Marchand, 2008; Steeds, 2009).

Tipo Diâmetro Mielinização Velocidade de

condução

Aβ > 10 µm Grossa 30 – 100 m/s

Aδ 2 - 6 µm Fina 12 – 30 m/s

C 0,4 – 1,2 µm Ausente 0,5 – 2 m/s

A fibra Aδ é responsável pela condução do estímulo através do trato neoespinotalâmico, que é conduzido de forma rápida diretamente para o tálamo, sendo, portanto, responsável pela dor rápida (Marchand, 2008). Acredita-se que o glutamato (Glu), um dos neurotransmissores excitatórios mais utilizados no SNC, é o neurotransmissor secretado nas terminações destas fibras, tendo, geralmente, uma duração de ação de poucos milissegundos (Serpell, 2005). A fibra C faz sinapse com um neurônio nociceptivo específico que conduz o estímulo para os centros superiores através do trato paleoespinotalâmico, que, por sua vez, não ascende diretamente para o tálamo, passando pela formação reticular, onde pode sofrer influência de neurônios moduladores (Carvalho & Lemonica, 1998; Guyton & Hall, 2011). A substância P (SP) é o provável neurotransmissor secretado nas fibras do tipo C, envolvidas na dor crônica. Pesquisas sugerem que as porções terminais das fibras do tipo C secretam tanto Glu quanto SP (Guyton & Hall, 2011). O Glu age instantaneamente e a SP é liberada mais lentamente, tendo ação que dura de segundos a minutos. Acredita-se que a dupla sensação dolorosa, sentida com a picada de uma agulha, por exemplo, é resultado da ação rápida do glutamato enquanto a sensação “tardia” da dor seria provocada pela ação da substância P (Bernacchio et al., 2005; Guyton & Hall, 2011).

Após sofrer as influências de modulação do corno dorsal alguns impulsos nociceptivos passam diretamente ou através de interneurônios para as células do corno anterior e anterolateral onde estimulam neurônios somatomotores e pré-ganglionares simpáticos, provocando resposta nociceptiva segmentar autonômica reflexa. Outros impulsos nociceptivos são transmitidos para neurônios que fazem sinapse com neurônios do trato espinotalâmico e outros sistemas ascendentes que então convergem para o tronco encefálico e estruturas supraespinhais onde promovem respostas reflexas suprasegmentares e corticais (Marchand, 2008; Patel, 2010; Ossipov et al., 2010)

Diversos neurotransmissores, aminoácidos e neuropeptídios são liberados pelos terminais dos neurônios aferentes primários no corno dorsal da medula, onde exercem importante papel na modulação da transmissão nociceptiva. Entre tais substâncias destacam-se os aminoácidos excitatórios glutamato e aspartato e diversos outros neurotrasmissores e neuropeptídios, incluindo as taquicininas (substância P, neurocinina A e neurocinina B), peptídeo geneticamente relacionado com a calcitonina (CGRP), colecistocinina, somatostatina, óxido nítrico, prostaglandinas, galanina, encefalinas e endorfinas (Carvalho & Lemonica, 1998; Ossipov et al., 2010; Perl, 2011).

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Em resumo, há duas vias principais de condução do impulso doloroso chamados de sistemas da via do grupo lateral (trato neoespinotalâmico) e de via do grupo medial (trato paleoespinotalâmico) da dor. A via do grupo lateral é responsável pela comunicação dos componentes sensório-discriminativos da dor, e a via do grupo medial é responsável pelos componentes afetivo, motivacional e avaliativo do processo doloroso (Fernandes & Gomes, 2011). Observa-se estreita relação topográfica entre a área estimulada na periferia e as regiões talâmicas e corticais ativadas, ou seja, há somatotropia. Isto contribui para que o indivíduo saiba precisar com exatidão o ponto de origem da dor em um trauma (Bear et al., 1996). A figura 1 resume os mecanismos de transmissão e interpretação do estímulo doloroso.

Figura 1: Mecanismos de transmissão e interpretação de impulsos dolorosos

A medula, formada por complexa estrutura contendo grande variedade neuronal e arranjos sinápticos, permite não somente a recepção e transmissão dos impulsos sensoriais como também um elevado grau de modulação central, envolvendo abstração local, integração, seleção e dispersão apropriada dos impulsos sensoriais. Esta complexa forma de processamento medular é ativada através de fenômenos centrais de convergência e somação, bem como através de influências excitatórias e

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inibitórias, envolvendo vias neuronais periféricas, interneurônios locais, vias neuronais do tronco encefálico e supraespinhais e córtex cerebral (Carvalho & Lemonica, 1998; Marchand, 2008; Patel, 2010). Após estimulação repetida os nociceptores podem apresentar resposta aumentada a estímulos nocivos ou adquirir responsividade maior a quaisquer estímulos, incluindo os não nocivos, levando a redução do limiar de sensibilidade e hiperalgesia (Baranauskas & Nitri, 1998). Esta pode ser classificada como hiperalgesia primária e secundária. A hiperalgesia primária é conceituada como sendo o aumento da resposta ao estímulo doloroso no local da lesão, enquanto a hiperalgesia secundária é aquela que se estende para áreas adjacentes (Svendsen et al., 1997; Baranauskas & Nitri, 1998). Estes quadros envolvem tanto a sensibilização das terminações nervosas periféricas, quanto a sensibilização central. Além da hiperalgesia, os fenômenos de sensibilização mediam o processo de alodinia e reflexos do comportamento sensório-discriminativo da dor (Pedersen et al., 2006).

Sempre que há uma lesão tecidual provocada por um estímulo nóxico, os nociceptores modificam-se lentamente gerando dor prolongada em decorrência da alteração da estrutura subcelular e da funcionalidade do sistema nervoso periférico. São liberadas no meio extracelular substâncias algiogênicas que podem ativar os nociceptores através de receptores ionotrópicos que promovem diretamente a abertura de canais iônicos e a consequente despolarização da membrana dos nociceptores. É o caso, por exemplo, do glutamato (Davidson et al., 1997). Outras substâncias como as prostaglandinas ou a bradicinina, atuam sobre receptores que vão ativar sistemas de transdução intracelulares, levando a modificações na concentração de moléculas como o AMPcíclico, o diacilglicerol, o inositol trifosfato ou cálcio. Estas substâncias vão, por sua vez, modular o funcionamento de canais iônicos ou receptores, através da sua fosforilação por intermédio da ativação de enzimas intracelulares (Wood & Docherty, 1997; Rocha et al., 2007; Marchand, 2008).

Em resumo, a agressão tecidual resulta na acumulação de metabólitos do ácido araquidônico. A produção de prostaglandinas e de leucotrienos leva a desgranulação de mastócitos e a ativação direta de fibras nervosas, macrófagos e linfócitos. Há liberação de mediadores, como potássio, serotonina, substância P, histamina e cininas. Ocorrem alterações na permeabilidade vascular, no fluxo sanguíneo local e produção dos sinais clássicos inflamatórios de rubor, calor, dor, tumor e impotência funcional. Tem início o processo de sensibilização periférica com consequente exacerbação da resposta ao estímulo doloroso (Woolf, 1989; Rocha et al., 2007; Ossipov et al., 2010).

A estimulação persistente de nociceptores provoca dor espontânea, mesmo quando cessam a resposta inflamatória e a dor. Desta forma, a sensibilização periférica não é o único fenômeno responsável por essas mudanças, havendo envolvimento do sistema nervoso central neste processo (Marchand, 2008; Ossipov et al., 2010). A sensibilização central implica em alterações dos impulsos periféricos, com adaptações positivas ou negativas. Além de redução do limiar ou aumento da resposta aos impulsos aferentes, ocorrem descargas persistentes após estímulos repetidos e ampliação dos campos receptivos de neurônios do corno dorsal. Neste caso, os neurônios nociceptivos do corno dorsal da medula espinhal tem sua sensibilidade aumentada à estimulação sensorial (Rocha et al., 2007).

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A figura 2 resume a sequência de eventos responsáveis pela sensibilização neuronal no SNC. Observa-se que a ativação intensa de neurônios aferentes primários estimula a liberação de Glu e substância P (SP). O receptor NMDA, em função do papel do magnésio (Mg2+), é inicialmente não-responsivo ao Glu; mas seguindo a despolarização do receptor AMPA pelo Glu no receptor metabotrópico estimula a ativação de fosfolipase C (PLC) mediada pela proteína G, levando à hidrólise e transformação do 4,5-fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) em inositol trifosfato (IP3) e diacilglicerol. O diacilglicerol estimula a produção de proteína cinase C (PKC), a qual é ativada na presença de elevados níveis de cálcio (Ca2+) intracelular. IP3 estimula a liberação de cálcio intracelular de estoques intracelulares no retículo sarcoplasmático. PKC aumentada induz o aumento sustentado da permeabilidade da membrana e, em conjunção com o aumento do Ca2+ intracelular, leva a maior expressão de protoncogenes, como c-fos e c-jun. As proteínas produzidas por esses protoncogenes codificam neuropeptídeos como as encefalinas, dinorfinas e taquicininas. Esse aumento também leva a ativação de fosfolipase A2 (PLA2) e da síntese de óxido nítrico (NOS) por um mecanismo cálcio-calmodulina dependente. PLA2 catalisa a conversão de fosfatidilcolina (PC) em metabólitos do ácido araquidônico, como prostaglandina (PG), tromboxano (TX) (via cicloxigenase) e leucotrienos (LT) (via lipoxigenase). NOS catalisa a produção de proteína cinase e alterações na expressão gênica. NOS difunde-se do interior da célula para o terminal do aferente primário, onde aumenta a liberação de glutamato (Rocha et al., 2007).

Figura 2: Sequência de eventos que leva à sensibilização central dos neurônios (adaptado de Rocha et

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A dor neuropática, é definida como a dor iniciada por uma lesão ou disfunção do sistema somatossensorial, resultante da atividade anormal das vias centrais e periféricas (Schestatsky & Nascimento, 2009). Ela está entre as síndromes mais prevalentes como causa de dor crônica. Pacientes com dor de origem predominantemente neuropática apresentam idade mais avançada e dor mais grave e frequente que em outros tipos de dor crônica (Resende et al., 2010).

A dor neuropática tem etiologias muito diversas e é classificada, de acordo com a localização da lesão ou inflamação no sistema nervoso, em periférica ou central (Resende et al., 2010). Ela é uma síndrome complexa, com mecanismos biológicos pouco esclarecidos, envolvendo fenômenos inflamatórios e imunes (Kraycheti et al., 2008). Comum na prática clínica, a maior parte dos casos é oriunda de quatro classes principais (Baron, 2006):

 Lesão nervosa periférica e multifocal (traumática, isquêmica ou inflamatória)  Polineuropatias periféricas (metabólicas, tóxicas, hereditárias ou inflamatórias)

 Lesões no SNC (esclerose múltipla, lesões na coluna vertebral ou acidente vascular cerebral)

 Distúrbios neuropáticos

As principais queixas se dividem em dores espontâneas, que aparecem sem nenhum estímulo detectável, como as parestesias; e dores evocadas, que são respostas anormais ao estímulo, como a hiperalgesia e alodinia (Schestatsky, 2008).

Contribuindo para o desenvolvimento da dor neuropática, ocorrem alterações no sistema nervoso periférico e na medula espinhal, as quais incluem a formação de impulsos ectópicos que sensibilizam os neurônios (Roberts, 1999). As fibras Aβ, normalmente envolvidas na transmissão de impulsos não

nocivos, são as que apresentam maior quantidade de impulsos ectópicos na vigência de lesão em nervo periférico. Estas fibras enviam respostas exageradas para a medula espinhal e, associados à sensibilização central, contribuem para o desenvolvimento da dor espontânea, da hiperalgesia e da alodinia (Schaible & Richter, 2004). Estima-se que a sensibilização central seja responsável pela hiperalgesia secundária e pela alodinia tátil, comuns aos processos inflamatórios e neuropáticos (Resende et al., 2010).

No tecido normal o sistema nervoso simpático não ativa fibras aferentes primárias. Em casos de lesão de nervo, porém, estas fibras aferentes tornam-se sensíveis a mediadores adrenérgicos (Schaible & Richter, 2004). Em casos de lesão, neurônios sensoriais apresentam aumento da responsividade à adrenalina circulante ou noradrenalina liberada das terminações simpáticas pós-ganglionares. Adrenoreceptores 1 e 2 participam deste mecanismo. A sensibilidade à noradrenalina é mediada pela expressão de receptores 1-adrenérgicos nas terminações de nervos lesados. Enquanto esta ativação está relacionada à nocicepção, a ativação dos receptores 2-adrenérgicos induz antinocicepção (Nam et

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Observa-se ainda que em nível pré-sináptico a liberação de glutamato é inibida por ativação de receptores gabaérgicos. A redução ou a falha da função desses receptores podem levar a hiperexcitabilidade neuronal do nervo lesado. Também pode haver aumento das subunidades de canais de cálcio tipo 2 no gânglio da raiz dorsal e na medula espinhal, fato que provoca a liberação de neurotransmissores excitatórios. A alteração fenotípica de fibras Aδ na dor neuropática causaria, de maneira semelhante, a liberação pré-sináptica de substância P facilitando a sensibilização do corno dorsal da medula espinal. Em relação às alterações pós-sinápticas a liberação de substância P e peptídeo relacionado com o gene da calcitonina além de outros neurotransmissores excitatórios (aspartato e glutamato) na fenda sináptica, causa ativação de receptores NMDA e AMPA com aumento da entrada de cálcio na célula, formação do complexo calmodulina, ativação da enzima cálcio-calmodulina cinase II e das vias neuronais do óxido nítrico sintetase, com formação de óxido nítrico. Isso promove ação específica de cinases e de fatores transcricionais que, ao serem fosforilados, se ligam a promotores de c-fos e de c-jun, resultando na síntese de produtos gênicos nucleares que facilitam a excitabilidade neuronal e alterações da neuroplasticidade no corno dorsal da medula espinal. Por outro lado, após a lesão do nervo, pode existir redução da expressão de receptores inibitórios e a sensibilização neuronal provavelmente será decorrente de mecanismos facilitadores (Schaible & Richter, 2004; Kraycheti et al., 2008).

A dor neuropática ainda é um desafio para os pesquisadores clínicos e experimentais. Os mecanismos, complexos e não completamente elucidados, desenvolvem-se dinamicamente com resultados, por vezes, contraditórios. Entender a neurobiologia da dor neuropática é um passo para melhoria dos resultados no tratamento dessa síndrome. Essa compreensão poderá resultar na elaboração de fármacos que visem a alvos específicos e que proporcionem respostas eficazes (Baron, 2006; Kraycheti et al., 2008; Schestatsky, 2008).

1.1.3. Controle da dor: modulação noradrenérgica e contribuição do sistema -2

Apesar de haver, desde o início do século, evidências sobre a existência de mecanismos supressores, foi com a apresentação da teoria de comporta, por Melzack e Wall, em 1965, que os sistemas modulatórios da dor passaram a ser reconhecidos (Carvalho, 1999). O conhecimento bioquímico destas vias inibitórias descendentes tem propiciado o surgimento de importantes fármacos, alguns já em uso e outros em fase de ensaios clínicos ou pré-clínicos (Carvalho & Lemonica, 1998).

Segundo Patel (2010), são conhecidos três mecanismos principais de controle endógeno da dor que são: a inibição segmental, o sistema opióide endógeno e a via descendente inibitória. O controle via inibição segmental baseia-se na essência da teoria de comporta, ou sistema portão. Nesta teoria propõe-se que a transmissão de informação através do ponto de contato (sinappropõe-se) entre a fibra Aδ e C e as células do corno dorsal da medula espinhal pode ser diminuída ou bloqueada (Patel, 2010). Está associada à esta questão a ativação de fibras Aβ, não nociceptivas, que induzem analgesia e diminuição

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da percepção da dor através do recrutamento de interneurônios na substância gelatinosa com liberação de encefalinas, que são neurotransmissores inibitórios; e inibição da liberação de substância P, havendo, assim, bloqueio na transmissão do sinal doloroso (Marchand, 2008).

O sistema opióide endógeno consiste de uma família de neuropeptídios e receptores opióides distribuídos no sistema nervoso central. Os opióides, embora de uso bastante antigo, tiveram seu mecanismo elucidado somente a partir de 1973 (Carvalho e Lemonica, 1998; Fields, 2004). Até o momento já foram descritos os seguintes receptores opióides: mu (μ), kappa (k), sigma (σ), delta (σ) e epsilon (ε) (Millan, 2002). Sabe-se atualmente que, no nível molecular, a ativação dos receptores μ e σ encontra-se associada à elevação na condutância ao potássio (abertura dos canais de K+), hiperpolarizando a célula. O receptor μ está funcionalmente acoplado à adenilciclase, um sistema efetor da proteína G. A ativação do receptor k induz redução na condutância do cálcio. Este efeito é devido ao fechamento dos canais de cálcio tipo N, também associados à proteína G. Acredita-se que o receptor σ esteja associado aos canais iônicos ativados pelo glutamato e pode contribuir para a disforia produzida por alguns opióides (Stacey & Watkins, 1994; Carvalho e Lemonica, 1998; Millan, 2002; Fiedls, 2004; Ren & Dubner, 2008).

Quanto ao sistema descendente inibitório da dor, é descrito haver quatro partes interligadas do SNC: a) sistemas corticais e diencefálicos; b) substância cinzenta periaquedutal e periventricular, que são ricas em encefalinas e receptores opióides e que podem ser ativadas tanto por estimulação elétrica como por microinjeções de pequenas quantidades de opióides; c) partes do bulbo rostroventral, especialmente o núcleo magno da rafe (NMR) e núcleos adjacentes, que recebem impulsos excitatórios da PAG, e que por sua vez, enviam fibras serotoninérgicas e noradrenégicas, via funículo dorsolateral, que se projetam para o corno dorsal da medula e bulbo; d) corno dorsal bulbar e medular que recebe terminais de axônios do NMR e núcleos adjacentes (Carvalho e Lemonica, 1998; Millan, 2002; Yoshimura & Furue, 2006; Ren & Dubner, 2008;). Estas fibras descendentes são serotoninérgicas e noradrenérgicas e terminam entre as células de transmissão nociceptiva nas lâminas I, II e V, onde inibem seletivamente neurônios nociceptivos, incluindo interneurônios e os tratos ascendentes que se projetam rostralmente, como os tratos espinotalâmico, espinorreticular e espinomesencefálico. Os neurônios noradrenérgicos, originários no locus ceruleus, representam outro importante grupo de fibras que contribuem para a formação do sistema endógeno da dor (Carvalho e Lemonica, 1998; Millan, 2002; Yoshimura & Furue, 2006).

A noradrenalina é biossintetizada a partir de tirosina. A tirosina é primariamente convertida em diiidroxifenilalanina (DOPA) pela tirosina-hidroxilase, que é, posteriormente, convertida em dopamina através de descarboxilação. A dopamina, por sua vez, é convertida em noradrenalina pela dopamina-β-hidroxilase (Pertovaara, 2006). No cérebro, os grupos de células noradrenérgicas são classificados de A1 – A7. O grupo A1 está localizado no nível da área postrema, A2 está distribuído por todo complexo vagal dorsal, A3 está na formação reticular medular e A4 circunda todo o quarto ventrículo. O grupo A5 está na ponte ventrolateral, A6, ou locus ceruleus, está localizado dorsalmente a ponte e A7 na parte lateral da ponte, próximo ao lemnisco lateral (Millan, 2002; Pertovaara, 2006). As principais vias ascendentes de projeção noradrenérgica no SNC são os feixes dorsal e ventral e o feixe

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periventricular (Cooper et al., 2003). As células do grupo A5-A7 tem projeções noradrenérgicas significativas para a medula espinhal. Na periferia, o sistema nervoso simpático é a principal fonte neural de noradrenalina (Cooper et al., 2003; Pertovaara, 2006).

Os receptores adrenérgicos α2 desempenham um importante papel na modulação da dor, especialmente nos casos de dor neuropática (Macpherson, 2000). A estimulação elétrica da região cinzenta periaquedutal do mesencéfalo e da medula ventromedial rostral para induzir a antinocicepção, aumenta os níveis mensuráveis de norepinefrina no fluido cefalorraquidiano. Este achado sugere uma forte contribuição da noradrenalina na antinocicepção associada com inibição descendente. Embora nem a região cinzenta periaquedutal do mesencéfalo nem a medula ventromedial rostral contenham neurônios noradrenérgicos, ambas as regiões comunicam-se com sítios noradrenérgicos importantes para a modulação da dor, incluindo o locus ceruleus e o núcleo de Kolliker-Fuse, que são as principais fontes de projeções noradrenérgicas para a medula espinhal, e, provavelmente, podem servir para inibir a resposta pré-sináptica e pós-sináptica da dor nos neurônios espinhais. Numerosos estudos tem demonstrado que a ativação de receptores α2-adrenérgicos na medula exerce forte efeito antinociceptivo (Millan, 2002; Yoshimura & Furue, 2006; Ossipov et al., 2010). Uma série de teorias têm sido propostas para explicar esse efeito, que inclui o aumento da ativação da via descendente inibitória através do locus coeruleos, um efeito inibitório direto sobre a ativação neuronal em sítios receptores da substância gelatinosa e uma redução na liberação de substância P (Macpherson, 2000). A ativação de receptores α2-adrenérgicos causa inibição da transmissão nociceptiva ao nível da medula espinhal através de atividade pré-sináptica, inibindo a liberação de neurotransmissores excitatórios a partir de terminais aferentes primários, bem como através de sítios pós-sinápticos (Ossipov et al., 2010).

1.2. Clonidina: da ação vasoconstritora à adjuvante na anestesia

O primeiro não-opióide e analgésico a ser extensivamente estudado e aprovado para administração epidural foi o agonista dos receptores adrenérgicos CND (Crews, 2000). A CND (Figura 3) é uma imidazolidina com ação anti-hipertensiva, que ativa receptores α adrenérgicos, especificamente os receptores α2. Como efeito da ativação destes receptores, tem-se redução do tônus simpático, resultando em queda na pressão sistólica e diastólica e da frequência cardíaca (Martindale, 2011).

Sintetizada em 1960 com indicação terapêutica de descongestionante nasal devido à ação vasoconstritora (Simonetti et al., 1997), a CND foi, posteriormente, introduzida na terapia anti-hipertensiva, quadro para o qual permanece em mercado (Martindale, 2011), para casos refratários. Com a elucidação do mecanismo de ação e observação da ocorrência do efeito sedativo, o fármaco ganhou expressivo interesse em anestesiologia, com indicação também para uma variedade de quadros de dor crônica e neuropática (Lauretti et al., 2002; MacCartney et al., 2007; Feng et al 2009).

O receptor α2 adrenérgico consiste de uma cadeia polipeptídica e pertence à família dos receptores de membrana de 7 hélices transmembranares. Na face citoplasmática da membrana existem os pontos

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de contato para a proteína G, e a resposta elucidada via AMPc inclui efluxo de K+ e supressão do influxo de Ca+2, através de seus respectivos canais (Pertovaara, 2006).

Devido a densa participação da noradrenalina na via descendente inibitória da dor, sabe-se que a CND, por ser um agonista dos receptores α2, mimetiza a ação da noradrenalina nesses receptores (Simonetti et al., 1997). Uma outra propriedade da CND é sua ação anestésica local própria, que ensejou sua utilização em combinação com anestésicos locais para bloqueio de nervos periféricos. Esta ação foi confirmada por pesquisadores que observaram que além de inibir (Singelyn et al 1992), a CND diminui a velocidade de condução de impulsos nas fibras C (Buttner et al 1992). Soma-se a isso o mecanismo de vasoconstrição mediado pelos receptores α2 pós-sinápticos, que reduz a absorção e permite maior tempo de contato de anestésicos locais com o tecido neural (Rhee et al., 2003; Neves et al., 2006).

A CND tem sido utilizada no tratamento profilático da enxaqueca e em associação com opióides no tratamento da dor oriunda de câncer (Martindale, 2011). No manejo da dor do câncer, pode ser administrada com opióides por infusão peridural contínua, em dose de 30 microgramas/hora (Martindale, 2011). Os principais efeitos adversos da CND referem-se ao sistema nervoso central: sedação, boca seca, desânimo e perda de concentração são frequentes e mais intensos no início do tratamento. Com o tratamento mais prolongado, ginecomastia, galactorréia, pesadelos, impotência sexual e hipotensão postural já foram relatados. A CND pode causar aumento exagerado da pressão arterial (efeito rebote), quando da interrupção abrupta do tratamento. O uso concomitante com antidepressivos tricíclicos pode diminuir o efeito hipotensor da CND (Tavares & Plavnik, 1998).

(a) (b) (c)

Figura 3: Estrutura química da CND ou 2-[2,6-diclorofenilimino] imidazolidina (a) e representação do tautômero imina (b). Conformações de mínima energia da forma básica (c), de acordo com Remko et al (2001).

Este fármaco tem sido também usado sozinho ou em associação com anestésicos gerais, locais ou opióides. A administração epidural em dose de 0,5 – 2,0µg/kg/h por infusão contínua produz analgesia pós-operatória dose dependente, sem maiores efeitos colaterais (Crews, 2000). Na prática anestésica, a CND mostrou reduzir os níveis requeridos de anestésicos para anestesia geral e também é usada na

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prevenção de tremores, após a anestesia geral ou local (Macpherson, 2000). Uma vez que produz sedação e reduz a ansiedade sem associação à depressão respiratória, seu uso também é destacado como medicação analgésica em procedimentos pós-operatórios para controle da dor. No entanto, sua duração de ação é relativamente curta, quando comparada com a potencial duração da dor, exigindo várias aplicações para manutenção dos níveis plasmáticos (Nunes et al., 2005).

A CND adicionada aos anestésicos locais promove efeitos benéficos (Columb & Ramsaran, 2010) como: a) redução significativa do tempo de latência para instalação do bloqueio; b) prolongamento da duração e intensificação do bloqueio sensitivo, possivelmente por ação anestésica local própria nas fibras C e Aδ ; c) sedação devido à absorção sistêmica (uma propriedade desejável como medicação pré-anestésica) (Simonetti et al., 1997; Dahmani et al., 2010; Singh et al 2011). A qualidade da analgesia pós-operatória em mulheres submetidas à cesariana foi avaliada pela associação da CND (15 e 30µg) à bupivacaína hiperbárica (12,5mg) e morfina (100µg), onde observou-se que a adição do agonista adrenérgico α2 melhorou a qualidade da analgesia, sendo a dose mínima recomendada deste fármaco igual a 15µg (Neves et al., 2006). Resultados semelhantes foram relatados por Tuijl e colaboradores (2006), porém em dose de 75µg de CND associada à bupivacaína 0,5%. Apesar disso, é relatado que esta dose (75µg) leva à maior ocorrência de hipotensão arterial quando comparada a menores doses (ex.: 45 µg), havendo mesmo efeito anestésico e analgésico para ambas as doses (Braz et al., 2003), fato que reforça a necessidade de menores doses do agonista α2 com o intuito de evitar os efeitos hemodinâmicos indesejados. Doses de 25µg e 75µg de CND foram empregadas associadas à morfina (250µg) para analgesia pós-operatória de artroplastia total de joelho, tendo sido observada diminuição no consumo de morfina, apesar da maior incidência de hipotensão nos grupos tratados com CND (Sites et

al., 2003).

No caso de pacientes não-responsivos aos tratamentos convencionais para dor neuropática, que inclui o uso de antiinflamatórios não-esteroidais, antidepressivos, fisioterapia e opióides, a associação de 90 μg/dia de CND com lidocaína 1%, resultou em ação antinociceptiva (Lauretti et al., 2002). Quando administrada por via espinhal, a CND foi eficaz para a alodinia e para a dor crônica neoplásica refratária à morfina, particularmente do tipo neuropática, em que os pacientes receberam infusão contínua de CND 30μg/h (Lauretti et al., 2002). Feng et al (2009) demonstraram, em modelos animais com dor neuropática induzida por ligação parcial do nervo ciático, que a administração intratecal de CND tem efeito antialodínico por inibição direta de citocinas pró-inflamatórias. Braga et al (2012) avaliaram a associação de diferentes adjuvantes à bupivacaína hiperbárica em raquianestesia para cesariana e observaram que a dose de 75µg foi adequada para anestesia e analgesia pós-operatória. Braga et al (2013) avaliaram ainda a associação de CND (75µg) e morfina (100µg) à bupivacaína em doses de 8 e 10mg, observando anestesia adequada mesmo nos grupos tratados com menor dose do anestésico. McCartney e col. (2007) revisaram estudos clínicos do uso da associação entre CND e anestésicos locais (lidocaína, mepivacaína, ropivacaína, levobupivacaína e bupivacaína) e concluíram pela maior aplicabilidade da associação para anestésicos de ação intermediária (menos lipofílicos, como lidocaína e mepivacaína), com aumento do tempo de anestesia sem modificação da latência. A revisão indicou ainda que doses

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moderadas de CND, i.e., abaixo daquelas capazes de induzir hipotensão, são as mais indicadas para prolongamento do efeito anestésico. De fato outra revisão do uso da CND (Elia et al., 2008), recomenda sua associação aos anestésicos locais.

Desde os relatos iniciais da eficácia analgésica da CND, outras investigações demonstraram seu uso em uma variedade de estados de dor crônica e neuropática. Devido à alta densidade de receptores α2 na medula espinhal, é difundido o uso da CND por administração epidural. No tratamento da dor aguda, resultados utilizando este método são animadores, com uma série de estudos mostrando redução na necessidade de opióides (Macpherson, 2000). A CND, que vem ocupando uma posição única na anestesiologia, promete se firmar no terreno da analgesia pós-operatória por não apresentar os efeitos colaterais dos opióides. Em contrapartida, essa onipresença da CND na anestesiologia não se faz sentir efetivamente no terreno dos bloqueios de nervos periféricos, embora ela seja importante neste particular. Em razão disto, urge a retomada da valorização da CND como adjuvante nesta modalidade de técnica regional (Simonetti et al., 1997).

1.2.1. Propriedades físico-químicas da Clonidina

A CND ou 2-[2,6-diclorofenil)imino] imidazolidina (C9H9Cl2N3, massa molecular de 230,1g/mol), é descrita como um fármaco lipofílico (log P octanol/água = 1,59), característica que seria responsável pela sua fácil penetração e ação no SNC (Remko et al., 2001).

Remko e colaboradores (2001), por estudos de modelagem molecular, demonstraram que a forma básica da CND assume uma geometria em que seus anéis fenil e imidazolínico são praticamente perpendiculares um ao outro (Figura 3c), sendo esta não coplanaridade um requisito para a interação da CND com os receptores adrenérgicos, para exercer seu efeito biológico. Além disso, a CND prefere a forma tautomérica de imina, com uma dupla ligação exocíclica ([rN=C(NHR)R'], o que a torna uma Base de Shiff, representada na figura 3b, como demonstraram experimentos teóricos (Remko et al., 2001) e medidas de RMN (Jackman & Jen, 1975). Cálculos de modelagem molecular indicaram que os sítios primários de protonação da CND estão no grupo imidazolínico (Remko et al., 2001). O pKa da CND é 8,3 (Remko et al., 2006), tal que em pH fisiológico a CND está 80% protonada. Ela é comercializada na forma de cloridrato, e se apresenta como um pó cristalino esbranquiçado, solúvel em água e etanol absoluto (Martindale, 2011; Merck Index,2001).

1.2.2. Relação com anestésicos locais

Assim como para os anestésicos locais (AL), acredita-se que a forma neutra da CND é a responsável pela penetração através das membranas, permitindo que o fármaco atinja o sítio de ação, havendo indicações de que a forma protonada seria a responsável pela interação com os receptores  -adrenérgicos, i.e., a forma ativa (Remko et al., 2001). A correlação entre hidrofobicidade do composto e

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sua habilidade de penetrar domínios hidrofóbicos da membrana celular também é reivindicada para a CND, assim como para os AL (de Paula & Schreier, 1996; de Araújo et al., 2008).

Os anestésicos locais de uso clínico são moléculas que consistem numa parte aromática ligada a uma cadeia lateral básica por uma ligação éster ou amida. São, em geral, bases fracas (de Paula & Schreier, 1996), por possuírem grupo amina ionizável em pH entre 7,6 e 8,9 (de Araújo et al 2008), razão pela qual encontram-se em grande parte ionizados em pH fisiológico. Este aspecto é importante no que concerne à sua capacidade de penetrar na bainha dos nervos e na membrana axônica (Schulman & Strichartz, 2009), sendo necessárias as formas protonada (mais solúvel em água) e neutra (mais lipofílica) para bloquear a condução do impulso nervoso. Os AL podem prover analgesia em várias partes do corpo através de aplicação tópica, injeção nas vizinhanças das terminações nervosas periféricas e troncos nervosos maiores, ou instilação dentro dos espaços peridurais ou subaracnóideos (Strichartz & Covino, 1990). As características desejáveis para uma molécula anestésica são: a longa duração de ação, baixa toxicidade local e/ou sistêmica e seletividade para o bloqueio sensorial em relação ao bloqueio motor (Strichartz & Covino, 1990; de Araujo et al., 2003). Os principais efeitos adversos dos anestésicos locais afetam o SNC e o sistema cardiovascular. Podem ser observados tremores, agitação, vasodilatação e redução da contratilidade miocárdica (Rang et al 2012). Devido a tais eventos, principalmente àqueles que levam às alterações hemodinâmicas, a associação dos AL com fármacos que levem à diminuição da dose requerida deste último para anestesia efetiva, é racionalmente bem-vinda. A CND é um fármaco conhecido por prolongar os efeitos dos anestésicos locais, reduzindo a dose requerida para anestesia, sem maiores eventos adversos (Rhee et al., 2003; Neves et al., 2006; Tuijl et

al., 2006; Elia et al., 2008). Devido a tais fatos, a associação entre a CND e o anestésico local

bupivacaína, será avaliada no presente trabalho.

1.3. Bupivacaina

A bupivacaína (BVC) é o anestésico local, pertencente à classe das amino-amidas, mais utilizado em procedimentos cirúrgicos, principalmente para bloqueios regionais prolongados. Este fármaco foi o primeiro anestésico que combinou propriedades como início de ação moderada, longa duração, bloqueio da condução e separação significante entre bloqueio sensorial e motor (Malamed, 2001; de Araujo, 2002). A duração da anestesia com BVC é tal que, para a maioria das indicações, uma dose única é suficiente. É encontrada comercialmente em doses que variam de 0,1 a 0,75% (McLure & Rubin, 2005). Na prática clínica, emprega-se doses de 0,25% e 0,5% (Martindale, 2011).

Nas doses recomendadas, a bupivacaína produz completo bloqueio sensitivo, mas o efeito na função motora difere entre as concentrações mais usuais na clínica:

 0,25%: quando usada para bloqueio caudal, peridural ou do nervo periférico, produz bloqueio motor incompleto. Deve ser usada em cirurgias em que o relaxamento muscular não é importante, ou quando outro meio de produzir relaxamento muscular for usado simultaneamente. O início da ação pode ser mais lento do que com as concentrações de 0,5% e 0,75% (Martindale, 2011).

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 0,5%: promove bloqueio motor para bloqueio caudal, peridural ou nervoso, mas o relaxamento muscular pode ser inadequado para cirurgias em que o relaxamento muscular é essencial (Martindale, 2011).

 0,75%: produz completo bloqueio motor. Mais útil para bloqueio peridural em operações abdominais que necessitam de completo relaxamento muscular e para anestesia retrobulbar (Martindale, 2011).

Em relação às propriedades físico-químicas, apresenta-se como pó cristalino branco, com fórmula molecular C18H28N2O.HCl. A solubilidade em água é de aproximadamente 100mg/mL a 20°C (como cloridrato), e possui pK de 8,09 (Merck Index, 2001).

A presença de um carbono assimétrico em sua molécula permite a existência de dois estereoisômeros: a dextrobupivacaína (R+) e a levobupivacaína (S-). O advento das pesquisas sobre estereosseletividade possibilitou a modificação das proporções dos estereoisômeros R(+) e S(-) da bupivacaína e a síntese de nova formulação anestésica local, contendo 25% do isômero R (+)-bupivacaína e 75% do isômero S(-)-(+)-bupivacaína, melhorando o perfil anestésico do fármaco em relação à levobupivacaína e aumentando sua margem de segurança (de Araújo, 2005).

1.4. Ciclodextrinas

As ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos formados por, pelo menos 6 unidades de glicopiranose. São obtidas a partir do amido por ação da enzima ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) de microorganismos, um tipo de amilase que provoca a clivagem da estrutura do amido, originando uma mistura de dextrinas cíclicas e lineares que contém 6 a 12 unidades de glicose (Fernandes & Veiga, 1999a; Loftsson & Duchene, 2007). As ciclodextrinas naturais que se obtém em maiores percentagens são: α–ciclodextrina (6 unidades de glicopiranose), β-ciclodextrina (7 unidades) e a γ-ciclodextrina (8 unidades); sendo que as suas quantidades relativas dependem do tipo de microrganismo que produz a enzima e das condições de reação (Fernandes & Veiga, 1999 (b); Al Omari

et al., 2006).

Devido a conformação em cadeira da glicopiranose, as ciclodextrinas assumem um formato de cone truncado, ou toroidal, ao invés de um cilindro perfeito (Brewster & Loftsson, 2007). Análises de raios-X revelaram que os grupos hidroxila secundários (C2 e C3) estão localizados nas proximidades da borda maior (cabeça) deste cone truncado, enquanto os grupos hidroxila primários (C6) estão na ponta (cauda) desta estrutura. Além disso, os hidrogênios dos carbonos apolares C3 e C5 e os oxigênios tipo éter estão voltados para o interior destas moléculas de formato toroidal (Figura 4). Isto resulta num arranjo macromolecular com exterior hidrofílico, solúvel em água, e uma cavidade apolar, fornecendo uma matriz hidrofóbica, descrita como um microambiente heterogêneo (de Paula et al 2010a).

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Figura 4: Estrutura química das ciclodextrinas naturais e representação do anel macrocíclico, em formato toroidal (de Paula et al 2010 (a)).

A habilidade das ciclodextrinas de formarem complexos de inclusão depende essencialmente da compatibilidade estérica e da polaridade com o fármaco convidado (“guest”). Além disso, as forças que governam a complexação têm sido atribuídas à alta energia de repulsão da água existente na cavidade das ciclodextrinas, às interações de Van-der-Waals, ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas, já que a cavidade interna das ciclodextrinas naturais tem diâmetros de 5 a 9,5 Å sendo, no caso da β-ciclodextrina (7,8 Å), grande o bastante para acomodar um hexanel aromático (Loftsson & Brewster, 1997; de Araújo et al., 2003; de Paula et al., 2010). As moléculas complexadas permanecem, normalmente, orientadas em posição onde há o máximo contato entre sua porção hidrofóbica e a cavidade apolar do anel macrocíclico, estando sua porção hidrofílica em contato com os grupos hidroxil da ciclodextrina (de Araújo et al., 2003).

As ciclodextrinas sofrem biotransformação no cólon, comparável à do amido, porém com velocidade mais lenta, o que se explica pelo fato de as ciclodextrinas (que são produtos cíclicos) não serem hidrolisadas pelas β-amilases, mas somente pelas α-amilases, que promovem hidrólise muito lenta. A velocidade de degradação diminui na sequência γ>β>α, a tal ponto que a α-ciclodextrina é excretada praticamente inalterada pelas fezes (Korolkovas, 1992).

A administração oral de ciclodextrinas naturais não resulta em toxicidade aguda, porém na administração parenteral não se observa o mesmo. Se administradas por via infiltrativa, a excreção é renal, resultando em nefrotoxicidade e eventos hemolíticos (Duchene & Wouessidjewe, 1990a; Loftsson

et al., 2005). A atividade hemolítica das ciclodextrinas é devida à ruptura de membranas, causada pela

remoção de componentes da mesma, como os fosfolipídeos e colesterol que se complexam com o anel macrocíclico. A administração intramuscular pode levar a ulcerações (Duchene & Wouessidjewe, 1990b). As características das ciclodextrinas naturais têm limitado a sua aplicação enquanto carreadores de fármacos, quer devido à sua relativa baixa solubilidade aquosa e em solventes orgânicos, quer devido à toxicidade que apresentam quando utilizadas em preparações parenterais (Brewster & Loftsson, 2007).

Para garantir maior segurança de uso, as ciclodextrinas tem sido modificadas para uso parenteral, preferencialmente nas hidroxilas dos carbonos nas posições 2, 3 ou 6, que são os mais reativos. Os

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derivados das ciclodextrinas podem ser obtidos pela substituição de grupos metila, etila, carboximetila, hidroxietila, hidroxipropila, sacarídeos ou através de polimerização. As ciclodextrinas sintéticas de maior representatividade em tecnologia farmacêutica são as ciclodextrinas hidrofílicas (metiladas, hidroxialquiladas e ramificadas), hidrófobas (etiladas) e ionizáveis (Fernandes & Veiga, 1999a). Apenas a hidroxipropil-β-ciclodextrina (HP-β-CD), sulfobutil-β-ciclodextrina e γ-ciclodextrina possuem respaldo toxicológico para uso parenteral como carreadores de fármacos (Szejtli, 1998; Loftsson & Duchene, 2007). A HP-β-CD é muito mais solúvel que a β-ciclodextrina natural; é considerada não tóxica e pode ser encontrada numa série de formulações farmacêuticas disponíveis no mercado, com doses orais de até 8g HP-β-CD/dia e parenterais de até 16g HP-β-CD/dia (Sporanox® – Janssen). É bem tolerada em humanos, tendo como efeitos adversos principais a ocorrência de fezes moles e diarréia (em doses de 16-24g HP-β-CD/dia por 14 dias). O tempo de meia vida é de aproximadamente 1,7 horas e o volume aparente de distribuição 0,2 L/kg. Após administração intravenosa é quase que completamente eliminada pelos rins, via filtração glomerular (Brewster & Loftsson, 2007).

Durante as últimas décadas, as ciclodextrinas e seus derivados têm sido cada vez mais investigados na área farmacêutica devido a sua habilidade de acomodar inteiramente, ou pelo menos parcialmente, moléculas de tamanho e polaridade apropriados em suas cavidades (Dollo et al., 1996; Davis & Brewster, 2004). Uma ou duas moléculas-hóspede podem ser complexadas com uma, duas ou três ciclodextrinas (de Paula et al., 2010b). Através desta propriedade, produtos líquidos, como óleos essenciais, podem ser transformados em pó; produtos que são oxidáveis, voláteis ou instáveis na presença de ar, luz ou calor podem ser estabilizados e, em alguns casos, o mesmo resultado pode ser observado para produtos que são susceptíveis a hidrólise (Duchene & Wouessidjewe, 1990). Estes efeitos levam a modificações úteis nas propriedades físicas e químicas da molécula-hóspede (Dollo et al., 1996), permitindo otimização da estabilidade, aumento da solubilidade e taxa de dissolução em água, permeabilidade à membranas e da biodisponibilidade (Dollo et al., 1996; Fraceto et al., 2007a; de Paula et al., 2010).

As moléculas do fármaco livre estão em equilíbrio com as moléculas ligadas à cavidade das ciclodextrinas. A determinação da constante de equilíbrio ou estabilidade do complexo fármaco-ciclodextrina é importante, uma vez que este é um indicador de mudanças nas propriedades físico-químicas do fármaco, no complexo de inclusão (Loftsson, 1996). Em consequência da dissolução dos complexos, um equilíbrio é estabelecido entre as espécies dissociadas e associadas e este fato é expresso pela constante de estabilidade do complexo (Ka). A associação da ciclodextrina e da molécula-hóspede e a dissociação do complexo formado são governadas por um equilíbrio termodinâmico (Szejtli, 1998), descrito por:

]

].[

[

]

.

[

D

CD

D

CD

K

CD.D

D

CD







onde CD = ciclodextrina, D = fármaco e CD.D = complexo, na estequiometria de 1:1.

O método mais usado para a detecção da formação de complexos em solução é o método da solubilidade de fases, descrito por Higuchi e Connors (1965), porém métodos de titulação como o