Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia PPGBIOTEC
Dissertação
Caracterização de genes
talin e os efeitos do
silenciamento por RNAi
usando miR-190 em
Schistosoma mansoni
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Thales Henrique de Paiva
Caracterização de genes talin e os efeitos do silenciamento por RNAi usando miR-190 em Schistosoma mansoni
Thales Henrique de Paiva
Caracterização de genes talin e os efeitos do silenciamento por RNAi usando miR-190 em Schistosoma mansoni
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos integrantes para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia, área de concentração em genômica e proteômica.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Renata Guerra de Sá Cota
Paiva, Thales Henrique de .
PaiCaracterização de genes talin e os efeitos do silenciamento por RNAi usando miR-190 em Schistosoma mansoni. [manuscrito] / Thales Henrique de Paiva. - 2019.
Pai45 f.: il.: color., gráf..
PaiOrientadora: Profa. Dra. Renata Guerra de Sá Cota.
PaiDissertação (Mestrado Acadêmico). Universidade Federal de Ouro Preto. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Biotecnologia.
PaiÁrea de Concentração: Genômica e Proteômica.
Pai1. Schistosoma mansoni. 2. Proteínas. 3. Expressão gênica. I. Cota, Renata Guerra de Sá. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título. SISBIN - SISTEMA DE BIBLIOTECAS E INFORMAÇÃO
P149c
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível” Charles Chaplin
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela graça da vida em sua plenitude e beleza. Por sua misericórdia e bondade que todos os dias se demonstra pela natureza de suas obras.
À minha família, em especial aqueles que me ajudaram a permanecer de pé quando a saúde faltou.
À minha orientadora, Dra. Renata Guerra por todos os ensinamentos.
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da UFOP, em especial a Ester, Pollyana, Luiza, Luciene, Nathalia, Victor, France Anne, Daiane, Isabela, Yuri, Viviano, Regina e Mônica que me enriqueceram com seus ensinamentos e convivência.
À Dra. Andressa Barban do Patrocínio por sua paciência, apoio, amizade e ensinamentos. Aos amigos de fora do programa mas que representaram muito nessa caminhada em especial Diego Custódio, Beatriz Vilela, Lucke Garcia, Caio e Isabelle Melato, Iang Aquino, Arnon Mello, Petter Hawkings, Nauhara e Suianne por vários motivos distintos e individuais mas que somados representam boa parte do que sou.
À minha médica, Dra. Roberta Oliveira por sua atenção, cuidado, carinho e serviço prestado com excelência para que eu reestabelecesse minha saúde.
À toda equipe do Ambulatório Borges da Costa no HC –UFMG por sua contribuição em minha saúde.
À toda equipe do setor de transplante de medula óssea da Santa Casa de Belo Horizonte por seu trabalho impecável e excepcional que muito contribuiu para minha saúde.
Aos colegas e laboratórios do NUPEB. Aos funcionários do Biotério.
Aos animais, pelo sacrifício em prol da ciência.
A FAPEMIG, CNPq, CAPES e UFOP, pelo auxílio financeiro e infraestrutura oferecido. E a todos que de alguma forma contribuíram para a execução deste trabalho, o meu muito obrigado!
“A gratidão é o único tesouro dos humildes” William Shakespeare
SUMÁRIO
1 – INTRODUÇÃO ...11
1.1 - Esquistossomose Humana ………..11
1.2 - Ciclo biológico do S. mansoni ………12
1.3 – RNAi ………13
1.4 - Talina e suas funções ………...17
1.5 - O miR-190 ………18 2 – JUSTIFICATIVA ...20 3 – OBJETIVOS ...20 3.1 - Objetivos gerais ...20 3.2 - Objetivos específicos ...20 4 - MATERIAIS E MÉTODOS ...21 4.1 - Declaração Ética ………...21 4.2 – Parasitas ………..21
4.3 - Estrutura proteica, domínios funcionais e análise filogenética de genes talin de S. mansoni ...22
4.4 - Preparação e análise de expressão gênica do Talin por qRT-PCR ...23
4.5 - Silenciamento por miR-190 ………24
4.6 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ………24
4.7 - Análise Estatística ………...25
5 – RESULTADOS ………..………...26
5.1 - Talin 2: estrutura e conservação de Smp_142630 e Smp_167010...26
5.2 - Talina 2: perfil de expressão de Smp_142630 e Smp_167010 ………...30
5.3 - Efeitos ultraestruturais pós silenciamento gênico ...31
6 – DISCUSSÃO ………..33
7 – CONCLUSÃO ………...36
8 – PERSPECTIVAS ………..36
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Ciclo de vida do Schistosoma mansoni adaptado de LEWIS; TUCKER, 2014.
Figura 2: Três maneiras pelas quais a talina contribui para a função integrina.
Figura 3: Organização exon // intron do provável gene de talin Smp_142630 em S. mansoni. O miR-190 em questão está localizado entre os exons 7 e 8 (adaptado de GOMES et al., 2011) Figura 4: Perfil de expressão do miR-190 em Cercárias, Esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT) 3,5 horas e 24 horas S. mansoni (Pereira et al, dados não publicados). Figura 5: Representação gráfica das posições de domínios conservados na sequência do gene talin de S. mansoni (Smp_167010) usando análise PFAM.
Figura 6: Representação gráfica das posições de domínios conservados na sequência do gene talin de S. mansoni (Smp_142630) usando análise PFAM.
Figura 7 A e B. Comparação da estrutura terciária 3D da proteína predita pelo software virtual SWISS-MODEL. Em A, (Humano e Smp_142630) e em B, (Humano e Smp_167010).
Figura 8: Filogenia de Smp_142630, Smp_167010 e seus ortólogos através do método comparativo neighbor-joining com bootstrap de 1000 réplicas no software MEGA 7.
Figura 9: Smp_167010 e Smp_142630 são expressos diferencialmente ao longo do ciclo de vida de S. mansoni. Figura 10: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de parasitas machos de S. mansoni após 72 h de incubação.
Figura 11: Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de parasitas fêmeas de S. mansoni após 72 h de incubação.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Códigos de acesso e os pares de sequências de primers.
Tabela 2: identidade de sequência das estruturas terciárias preditas para S. Mansoni com base em modelos depositados no SWISS-MODEL.
LISTA DE ABREVIATURAS
S. mansoni (Schistosoma mansoni) S. japonicum (Schistosoma japonicum) S. haematobium (Schistosoma
haematobium)
S. intercalatum (Schistosoma S. guineenses (Schistosoma S. mekongi (Schistosoma
EMT (Esquistossômulo Mecanicamente transformado)
MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura)
qRT-PCR (Reação em cadeia da polimerase quantitativo)
WHO (World Health Organization tradução: Organização mundial da saúde/OMS)
tln (Talina)
siRNA (small interfering RNA) miRNA (micro RNA)
RNAi (RNA de interferência) mRNA (RNA mensageiro)
cDNA (DNA complementar)
UTR (UnTranslated Region tradução: região não traduzida)
Smp (Schistosoma mansoni proteina) VBS (Vinculin Binding Site Tradução: região de conexão com a vinculina) IRS (Insulin Receptor Substrate Tradução: substrato receptor da insulina)
RESUMO
A esquistossomose é uma doença parasitária de grande importância econômica e social afetando aproximadamente 200mi/ano de pessoas no mundo. Causada pelo nematódeo do gênero Schistosoma (especificamente neste estudo o S. mansoni por ser o de maior prevalência no Brasil), continua sendo um desafio para a comunidade científica sua compreensão ampla e descoberta de novas tecnologias diagnósticas e terapêuticas. Este estudo realizado trata da caracterização in vitro e in silico da proteína talin bem como avaliar os efeitos ultraestruturais após silenciamento in vitro por seu microRNA intrônico miR-190 em vermes adultos. As proteínas Talinas são uma família de proteínas grandes adaptadoras que conectam uma família de moléculas de adesão celular chamadas integrinas aos filamentos de F-actina do citoesqueleto. Há dois tipos de genes Talin em vertebrados. Talin 1 é essencial para o processo de adesão celular mediado por integrinas enquanto o papel do Talin 2 é desconhecido. Duas entradas da proteína talina previamente anotadas no genoma do S. mansoni, identificadas como Smp_167010 e Smp_142630 foram objeto desse estudo. Análises de predição estrutural in silico foram feitas e observado um padrão diferencial de domínios funcionais (PFAM), bem como alto grau de similaridade e identidade com seus ortólogos (SWISS-MODEL) e os dados indicam que as duas entradas não são oriundas de splicing alternativo e sim de diferenciação e especiação com valores de bootstrap próximo ou atingindo 100 (filogenia). Amostras de vermes adultos machos e fêmeas, cercárias, esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT-3,5h – EMT-24h) e ovos de S. mansoni foram utilizados para traçar o perfil de expressão gênica por qRT-PCR usando o gene constitutivo EIF4E como controle endógeno. A expressão gênica relativa foi determinada pelo método 2 –ΔCq. A análise estatística foi realizada utilizando o teste one-way ANOVA (Tukey) com P<0,01. Foi observado um perfil de expressão gênica diferencial em Smp_167010 e Smp_142630 tanto entre as fases de vida do verme quanto entre os dois genes. Foi ainda observado alterações ultraestruturais significativas em vermes adultos machos expostos ao miR-190 em comparação ao controle com a presença de descamação, bolhas e fissuras enquanto nenhuma alteração em fêmeas foi identificado. Em conclusão vimos que o S. mansoni possui dois genes talin que indicam ter grande importância em sua biologia e que há retroregulação do gene talin por seu microRNA intrônico miR-190 que quando ofertado em meio livre interfere em processos biológicos e causa danos estruturais visíveis.
ABSTRACT
Schistosomiasis is a parasitic disease of great economic and social importance, affecting approximately 200 million people per year worldwide. Caused by the genus nematode Schistosoma (S. mansoni is the genus in this work for having the highest prevalence in Brazil), its wide understanding and discovery of new diagnostic and therapeutic technologies remains a major challenge for the scientific community. This study deals with the in vitro and in silico characterization of the talin protein as well as assessing the ultrastructural effects after in vitro silencing by its miR-190 intronic microRNA in coupled adult worms. Talin proteins are a family of large adaptor proteins that connects a family of cell-binding molecules called integrins to the cytoskeleton F-actin filaments. There are two types of Talin genes in vertebrates. Talin1 is essential for the cell adhesion process mediated by integrins while the role of Talin2 is unknown. Two entries of the talin protein registered in the S. mansoni genome identified as Smp_167010 and Smp_142630 were the object of this study. Structural prediction analyzes in silico were performed and observed as a differential pattern of functional domains (PFAM), as well as a high degree of similarity and identity with its orthologs (SWISS-MODEL) and the data observed as two inputs are not derived from alternative splicing and rather, differentiation and specification with bootstrap values close to or reaching 100 (phylogeny). Samples of adult worms, male and female, cercariae, mechanically transformed schistosomula (EMT-3.5h - EMT-24h) and S. mansoni eggs were used to trace the gene expression profile by qRT-PCR using the constitutive gene EIF4E as endogenous control. Relative gene expression was determined by the 2 –ΔCq method. A statistical analysis was performed using the one-way ANOVA test (Tukey) with P <0.01. A differential expression profile was observed in Smp_167010 and Smp_142630 both between the phases of the worm's life and between the two genes. It was also observed ultrastructural changes applied in adult worms, exposed to miR-190, compared to the control with the presence of flaking, bubbles and cracks, while the following changes were used. In conclusion that S. mansoni has two important genes that detect great importance in its biology and that there is a genetic regression of its gene by its miR-190 intronic microRNA, which when activated in the free medium interferes with clinical processes and causes visible damage.
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Esquistossomose Humana
A esquistossomose humana é uma grande ameaça à saúde pública mundial. Atualmente, 78 países reportaram casos de esquistossomose tendo como uso terápico principal a droga praziquantel. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS do inglês WHO) aproximadamente 229 milhões de pessoas necessitaram de tratamento preventivo em 2018 em todo o mundo (WHO, 2018). Os dados indicaram um total 118,5 milhões de crianças em idade escolar sob risco. Um total de 34 países tratou a doença em 2015, correspondendo a uma cobertura de 65.4%, sendo que o tratamento foi dado a 50.1 milhões de crianças na idade escolar o que corresponde a 42.2% da taxa mundial da doença (WHO, 2016). Segundo a OMS, o maior número de casos de esquistossomose está na África, cerca de 90% dos casos reportados no mundo. No entanto, dos 41 países africanos onde o tratamento preventivo é necessário, somente 30 países relataram seus dados para a OMS em 2016, destes, 12 países atingiram 75% de cobertura do tratamento com a droga praziquantel. Em 2016, dos 95,2 milhões de adultos em áreas de risco, foram tratados preventivamente 18,3 milhões em 2016, em 23 países. No mundo, o último dado mostra que 66,5 milhões de pessoas foram tratadas em 2015 e 65,7 milhões em 2014. No Brasil, a área endêmica abrange 19 estados em que ocorre a esquistossomose mansoni, principalmente nas regiões norte e nordeste, sendo que as regiões centro-oeste, sudeste e sul são de baixa prevalência, exceto em Minas Gerais. O Brasil apresenta aproximadamente 25 milhões de habitantes expostos ao risco com cerca de 6 milhões de indivíduos infectados pelo parasito Schistosoma mansoni, tendo o maior número de casos entre os países da América Latina e Caribe (GAZZINELLI, 2017).
No nordeste de Minas Gerais foi realizado um estudo com 506 crianças entre 6 e 15 anos que haviam tido esquistossomose mansoni. As mesmas foram monitoradas um ano após terem sido tratadas com sucesso com a droga praziquantel. Destas, 111 foram reinfectadas. Mostrando que na região estudada, os principais fatores de risco foram os níveis socioeconômico e educacional (GAZZINELLI, 2017).
Dessa maneira, é importante salientar a importância do estudo de drogas que possam impedir a reinfecção. A doença humana pode ser causada por seis espécies de esquistossomos, sendo as mais importantes o S. mansoni e S. japonicum, que causam principalmente esquistossomose intestinal, e S. haematobium, causando a esquistossomose do trato urinário. Muito menos comuns são as espécies S. intercalatum, S. guineensis e S. mekongi, que têm como alvo preferencialmente tecidos intestinais (Davis, 2009). Em todas as espécies, a infecção ocorre principalmente por contato direto com cercárias de água doce. A esquistossomose está entre as doenças parasitárias mais importantes, com impacto socioeconômico significativo, principalmente nos trópicos e subtrópicos (King et al., 2005). Embora raramente fatal, a esquistossomose é uma doença de longa duração com morbidade crônica significativa devido a exposições repetidas e reinfecções, principalmente em regiões endêmicas (Enk et al., 2010).
1.2 - Ciclo biológico do S. mansoni
O S. mansoni possui um complexo ciclo de vida em que começa pelo depósito de ovos secretados pelo hospedeiro mamífero definitivo em ambiente adequado, aquático lêntico e tropical que conte com a presença do caramujo Biomphalaria glabrata. Estes ovos em condições ambientais ideais liberam o miracídio que é o estádio infectante do hospedeiro invertebrado intermediário que por sua vez ao ser infectado proporciona a transformação do miracídio em cercária, que é o estádio liberado pelo caramujo e infectante para o hospedeiro definitivo humano e mamífero, é um estádio de vida livre, natante que infecta a vítima através da pele geralmente até a altura dos joelhos. Uma vez dentro do hospedeiro definitivo, as cercárias perdem as caudas e se transformam em esquistossômulos que migram através do sistema circulatório, passando pelos pulmões, coração até atingir a veia porta do fígado e se desenvolverem em vermes adultos machos e fêmeas, acasalam-se e produzem ovos que se depositam em diversos tecidos e também atingem a luz intestinal sendo liberados pelas fezes fechando o ciclo conforme figura 1 (adaptação) a seguir (LEWIS; TUCKER, 2014).
1.3 - RNAi
Em Outubro de 2003, o lançamento e conclusão de dois projetos transcriptomas para as espécies S. mansoni e S. japonicum revolucionaram e ampliaram de maneira significativa as perspectivas para a pesquisa científica neste parasito (Verjovski-almeida et al, 2003). Posteriormente, Berriman e seus colaboradores (2009) disponibilizaram uma versão mais ampliada do genoma do S. mansoni. Atualmente, com a disponibilidade de quase 200.000 ESTs, somando-se os dois organismos sequenciados, aliado ao projeto genoma do S. mansoni, em fase final de conclusão, o Schistosoma integra-se à categoria dos organismos com os quais pode-se utilizar técnicas modernas para identificação de genes estádio-específicos, avaliação global dos efeitos causados por drogas sobre o metabolismo do parasito, dentre outros (LV et al., 2015).
As evidências experimentais acumuladas nos últimos trinta anos reforçam a hipótese de que o parasito dispõe de mecanismos moleculares capazes de regular o seu desenvolvimento em situações diversas, sem, no entanto, comprometer o sucesso no estabelecimento da infecção. As alterações observadas quanto ao tamanho e fecundidade simplesmente refletem a plasticidade do parasito em se adaptar a condições adversas e, portanto, representam novos desafios para a pesquisa básica na biologia do Schistosoma. Diante destas considerações, torna-se estorna-sencial a compreensão dos inúmeros processos celulares que ocorrem durante uma infecção natural, particularmente aqueles associados com a transição de cercária a esquistossômulos.
Neste sentido, podemos incluir a interferência do RNA (RNAi), o processo da degradação do mRNA que é induzido por uma molécula de RNA de fita dupla em uma maneira sequência-específica. Este fenômeno também é denominado de silenciamento gênico, uma modificação epigenética na expressão gênica. Até os anos de 1980, somente modificações na estrutura da cromatina ou de proteínas eram classificadas como epigenéticas, entretanto, nos anos 90 um grande número de fenômenos de silenciamento gênico que ocorriam ao nível pós-transcricional e pós-traducional foram descritos em plantas, fungos, animais e protozoários e culminaram, na introdução do conceito do silenciamento mediado por RNA (DA’DARA; SKELLY, 2014).
O RNA de fita dupla é o componente unificador dos diferentes processos de silenciamento mediado por RNA. Desta forma, a presença deste tipo de molécula induz a degradação de mRNAs homólogos, um processo conhecido como silenciamento gênico pós-transcricional em plantas (PTGS) e RNA interferente (RNAi) em animais. Os componentes das maquinarias de PTGS e RNAi também estão envolvidos no processamento e funcionamento dos microRNAs, uma classe de pequenos RNAs com função regulatória, que foram originalmente identificados como responsáveis pela repressão da tradução em Caenorhabditis elegans (DA’DARA; SKELLY, 2014).
Vários grupos independentes demonstraram que o S. mansoni pode captar e processar pequenos RNAs e silenciar genes específicos, entretanto, ainda permanece por se determinar os mecanismos envolvidos neste processo e questões como o papel direto de miRNA no parasito. O efeito da administração destes miRNAs em camundongos infectados sobre a carga parasitária ainda permanece por ser determinado (ZHU; LIU; CHENG, 2014)
De uma forma resumida, quando um RNA de fita dupla é introduzido em uma célula, ele é processado por uma família de endonucleases denominadas DICERs. Este processo produz dsRNAs conhecidos como small interfering RNAs (siRNAs) com aproximadamente 21 nucleotídeos de comprimento. A seguir estes siRNAs são então incorporados no complexo efetor denominado de RNA induced silencing complex (RISC). O siRNA direciona RISC para seu alvo natural, utilizando um mecanismo dependente de pareamento de bases. Uma das vias de RNAi melhor entendidas até o momento é a utilizada na tecnologia do knockdown, que resulta na degradação mediada por uma endonuclease específica de um RNA alvo. Esta endonuclease foi apelidada de slicer (KRISTENSEN et al., 2019).
Duas proteínas têm um papel chave no processamento do RNAi, a DICER que trabalha no estágio inicial do processamento, produzindo siRNA ou miRNA e a argonauta, componente do RISC que interage diretamente com os si ou miRNA, transportando-os até que encontrem os seus ligantes naturais. Em Drosophila melanogaster, uma série de complexos RISC distintos foram identificados e envolvidos diretamente com o transporte tanto de siRNA como miRNA (KAYA-ÇOPUR; SCHNORRER, 2016).
Além da argonauta, a DICER tem um papel central nos fenômenos de silenciamento gênico mediado por RNA. As endonucleases da família DICER de proteínas apresentam três domínios característicos: um domínio de ligação ao RNA de fita dupla; um domínio de ribonuclease III e um helicase (tipo caixa DEXH).
Vale a pena ressaltar que a ribonuclease III representa uma família de endonucleases específicas para dsRNA e possui um papel importante no processamento do RNA e no controle pos-trancricional da expressão gênica (Gan et al, 2006). Além disso, esta família pode ser dividida em quatro classes: RNAse III bacteriana, cujo protótipo é a Ec- RNAse III (Escherichia coli), composta por um domínio endonuclease (endoND), seguido por um domínio de ligação de dsRNA, denominado de dsRBP, (Blaszczyk, 2004); a Rnt1p, de Sacharomyces cerevisae que além dos domínios descritos contém uma extensão amino-terminal de 200 resíduos (CATALA et al., 2004); a DROSHA que apresenta uma extensão N-terminal de aproximadamente 900 resíduos, seguido por dois domínios endoND e um domínio dsRBD (Filippov et al., 2000) e a DICER que possui dois domínios endoND, um domínio dsRBD e uma extensão N-terminal com 1500 resíduos de aminoácidos que inclui um domínio RNA helicase e um PAZ (Berstein et al, 2001).
Resultados do nosso laboratório mostram que o S. mansoni possui 13 genes relacionados com a maquinaria de silenciamento gênico pós-transcricional mediado por miRNA. Também foram avaliados os níveis de expressão de mRNA para SmDicer1 e SmAgo 2, 3 e 4 por qRT-PCR nos estádios de cercárias, vermes adultos, ovos e esquistossômulos cultivados in vitro por 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 e 72 horas. Estes resultados demonstraram que, os dois genes são diferencialmente expressos através do período de diferenciação cercária-esquistossômulo, tendo níveis similares em ovos e vermes adultos. Em cercarias, SmDicer1 tem baixa expressão. Estes resultados sugerem que esta via é um importante mecanismo de regulação da expressão gênica neste parasito (GOMES et al., 2009).
1.4 - Talina e suas funções
Talinas são proteínas grandes adaptadoras envolvidas na ativação de proteínas transmenbranares da família das integrinas (Lowell et al., 2011). Com isso, tem papel importante em vários processos celulares, como adesão focal celular, comunicação celular e na determinação do formato da célula, ou seja, a talina contribui para a comunicação entre a matriz extracelular e o citoesqueleto, sendo essencial para a sobrevivência e eficiência celular (Ellis et al., 2014; Das et al., 2014; Calderwood, 2004).
As integrinas são proteínas transmembranares heterodiméricas α / β, presentes em várias células e organismos diferentes, onde participam de muitas vias de sinalização e estão envolvidas em vários processos fisiológicos que precisam de comunicação célula a célula e/ou extra a intracelular (Gardner, 2014). Existem dois tipos de genes talin, talin1 e talin2, que codificam para as proteínas tln1 e tln2 respectivamente (Debrand et al., 2009).
A estrutura da proteína talina possui duas porções principais estruturalmente chamadas de cabeça (head) e corpo (Rod), estas regiões podem apresentar domínios funcionais conservados e essenciais bem como outros domínios com finalidades específicas e diferenciais.
Domínios funcionais são sítios/regiões ativos(as) que atribuem funções específicas as proteínas, o conhecimento destas regiões é importante, uma vez que é possível buscar a compreenção do papel desempenhado pela proteína na biologia do organismo. A figura 02 a seguir ilustra os principais papeis da proteína talina no contexto celular.
Figura 2: Três maneiras pelas quais a talina contribui para a função integrina. (a) conexões diretas para actina. Talina é um homodímero antiparalelo que consiste em duas subunidades ~ 270K. Cada subunidade possui uma cabeça globular amino-terminal, que contém o principal local de ligação à integrina, e uma haste carboxiterminal, que contém locais de ligação à actina. Através da ligação às caudas da integrina β e à actina, a talina liga as integrinas ao citoesqueleto da actina e pode contribuir para o agrupamento da integrina. (b) Estimulação da produção de PtsInsP2. A talina se liga e ativa a PIPKIγ, resultando em aumento da produção de PtdInsP2. O PtsInsP2 regula talina, vinculina e outras proteínas de adesão focal, que podem resultar na ativação da integrina, reforço das ligações citoesqueléticas, sinalização e formação de adesão focal. (c) Regulação da afinidade pela integrina. A ligação de talina às caudas da integrina β induz alterações conformacionais nos domínios extracelulares, aumentando sua afinidade pelos ligantes. A natureza das mudanças conformacionais permanece controversa, no entanto, e o modelo mostrado representa apenas um dos vários mecanismos em potencial. (adaptado de CALDERWOOD, 2003).
1.5 - O miR-190
MicroRNAs (miRNA’s) são pequenas moléculas de RNA não codificantes (aproximadamente 22 nucleotideos de fita simples em sua forma madura) que tem função regulatória da expressão gênica. Essas moléculas possuem sequência complementar a um mRNA alvo e tem dois momentos de processamento, no primeiro com o objetivo de maturação passando pela DROSHA/DICER e a segunda de execução funcional onde através do complexo RISC se conjulga com o mRNA alvo para o retardamento ou inibição da síntese proteica.
Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa e de outros mostraram que o parasita do gênero Schistosoma possui um conjunto de miRNA conservados (GOMES et al., 2011). Embora a maioria dos miRNAs sejam codificadas em regiões intergênicas ou em locais exônicos, aproximadamente um terço dos genes para microRNA em S. mansoni estão localizados em regiões intrônicas dos genes que codificam proteínas (GOMES et al., 2011). Por exemplo, o miR-190 foi encontrado anteriormente na região intrônica do gene talin em Homo sapiens, Lottiagigantea, Branchiostomafloridae, Nematostellavectensis e Monosigabrevicollis (Campo-Paysaa et al., 2011), a literatura demonstra atuação do miR-190 em diversos processos biológicos como apoptose, proliferação celular, metástase, dentre outros. Em S. mansoni, nossa análise indica que Sma-miR-190 está localizado dentro da estrutura do gene talin. O Sma-miR-190 exibiu 90% de identidade de sequência com seu precursor e 100% com a sequência de miRNA maduro de S. japonicum.
Figura 3: Organização exon // intron do provável gene de talin Smp_142630 em S. mansoni. O miR-190 em questão está localizado entre os exons 7 e 8 (adaptado de GOMES et al., 2011)
Resultados anteriores de nosso laboratório também demonstraram que o miR-190 em S. mansoni é expresso em cercárias, esquistossômulos jovens, vermes adultos e ovos em quantidades equivalentes, o que levanta a hipótese da importância do miR-190 para a biologia do parasito.
Figura 4: Perfil de expressão do miR-190 em Cercárias, Esquistossômulos mecanicamente transformados (EMT) 3,5 horas e 24 horas S. mansoni (Pereira et al, dados não publicados).
2 - JUSTIFICATIVA
Em 1993 foi descoberto o primeiro microRNA no nematódeo Caenorhabiditis elegans. Desde então, nosso conhecimento sobre a biogênese e função dos RNAs não-codificantes mudou a compreensão dos mecanismos de regulação da expressão gênica em eucariotos. Hoje, pode-se afirmar que já foram descobertos mais de 200 tipos de RNAs não codificantes e até o momento. Os mais estudados incluem os microRNAs (miRNA) e os pequenos RNAs de interferência (siRNA). Desde 2005 nosso laboratório estuda a função de microRNAs em S. mansoni, utilizando abordagens genômicas e de bioinformática vem validando candidatos a microRNAs, estágio-específico e espécie específica que podem ser utilizados como biomarcadores da esquistossomose tanto murina como humana. A biogênese dos microRNAs ainda não é bem compreendida em S. mansoni, especialmente os de origem intrônica. Considerando ainda todo o conhecimento prévio acerca da função que a proteína talina exerce, como a comunicação entre os meios extra e intracelular e conexão com o citoesqueleto dentre outros demonstrados em trabalhos envolvendo outros tipos de células e espécies. Sendo assim esse estudo se justifica e pretende avançar e contribuir ao entendimento de genes hospedeiros de microRNAs e o fenótipo em vermes adultos ao serem expostos a esse microRNA usado como silenciador.
3 - OBJETIVOS 3.1 - Objetivos gerais
Caracterizar o gene que codifica para a proteína talina e que hospeda o miR-190 como microRNA intrônico em S. mansoni.
3.2 - Objetivos específicos
Caracterizar a nível estrutural e filogenético o gene talin, previamente anotados como Smp_142630 e Smp_167010;
Avaliar o perfil de expressão do gene talin nos estádios evolutivos de S. mansoni; Avaliar o efeito do silenciamento por miR-190 no tegumento de vermes adultos machos
4 - MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 - Declaração Ética
Todos os experimentos foram autorizados pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP), sob registro número: 195/2015, e todas as práticas e técnicas estão de acordo com as legislações nacionais e internacionais aceitas para o uso e cuidado de animais em laboratórios de pesquisa.
4.2 - Parasitas
Vermes de S. mansoni da cepa LE foram mantidas sob protocolo de rotina, utilizando a passagem pelo caramujo Biomphalaria glabrata camundongos BALB/c. Inicialmente, ovos sob exposição à luz por 2 horas e cobertas e sedimentadas em gelo para liberar os miracídeos, em seguida, caramujos foram infectados por miracídios para induzir a produção de cercárias. Vermes adultos foram obtidos através da perfusão de figado de camundongos infectados previamente há 50 dias. Esquistossômulos mecanicamente transformados foram preparados conforme descrito por Harrop and Wilson (1993). De forma breve, cercárias foram lavadas com meio RPMI 1640 (Invitrogen), previamente homogeneizadas com auxílio de um vortex, em velocidade máxima por 90 segundos e imediatamente encubadas durante 3.5h a 37°C, 5% CO2. Então os esquistossômulos foram lavados com meio RPMI 1640 até não serem mais detectadas caudas cercarianas. Para experimentos posteriores, os parasitas foram mantidos em meio M169 suplementado com 10% Soro Fetal Bovino(FBS), penicilina e estreptomicina (100 μg/mL) e 5% de meio Schneider (Basch and DiConza, 1977) a 37°C com 5% CO2 durante 3,5 e 24 hours.
4.3 - Estrutura proteica, domínios funcionais e análise filogenética de genes talin de S. mansoni
As duas anotações do gene talin estudadas neste trabalho foram obtidas do genoma do S. mansoni disponível na plataforma online do banco de dados GeneDB (genedb.org/genedb/smansoni/). Os genes de outras espécies utilizadas como referência que codificam proteínas homólogas a talina de S. mansoni foram obtidas do banco de dados de referência online: National Center for Biotechnology Information (NCBI) para criar um conjunto comparativo para fins de análise de filogenia. A análise estrutural das entradas Smp_142630 e Smp_167010 foi executada utilizando o banco de dados de domínios de proteínas PFAM que utiliza o algorítimo do BLASTp para detectar e comparar as sequências e predizer os domínios funcionais a partir da sequência de aminoácidos incluídas para análise. Fizemos uma análise comparativa das sequencias completas dos genes estudados utilizando o alinhamento de múltiplas sequências através do software Clustal X 2.1 em configuração padrão (Larkin et al., 2007). Em seguida, fizemos análise filogenética através da produção de árvore filogenética para criar a história evolutiva através da análise por homologia utilizando o método comparativo neighbor-joining com bootstrap de 1000 réplicas no software MEGA 7 (Tamura et al., 2011).
Adiante, fizemos uma modelagem por homologia das sequências das proteínas estudadas utilizando a plataforma SWISS-MODEL disponível online via servidor ExPASy incluindo as sequências para análise em configuração padrão (Biasini et al., 2014) com a finalidade de observar a estrutura terciária presente em nossas sequências em comparação com os dados de cristalografia de proteínas humanas.
4.4 - Preparação e análise de expressão gênica do Talin por qRT-PCR
RNA total de vermes adultos machos e fêmeas, ovos, cercárias e esquistossômulos 3,5 e 24 horas foram obtidos utilizando uma combinação de Trizol (GIBCO-BRL) e clorofórmio para extração e então foram purificados em coluna utilizando o kit “SV Total RNA Isolation System” (Promega). As preparações foram tratadas com DNAse livre de RNAse por 3 vezes em banho Maria reduzindo a concentração da enzima em cada uma (RQ1 DNase; Promega, Belo Horizonte, Brasil). As moléculas de RNA foram quantificadas utilizando espectrofotômetro. Foram produzidos 5µg de cDNA transcrito de forma reversa utilizando primers específicos. A eficiência do tratamento por DNAse I foi avaliada por amplificação por PCR do mix de reação de cDNA sem a adição das enzimas Thermoscript. Primers para as possíveis sequências preditas de genes talin Smp_167010 e Smp_142630 (S. mansoni, GeneDB) foram criadas utilizando GeneRunner® contendo as sequências da tabela 1. Todos os produtos de PCR foram sequenciados no sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems) utilizando o Dye terminator kit para confirmar a especificidade dos primers. Amostras reversamente transcritas de cDNA foram usadas como template para amplificação por PCR usando SYBR Green Master Mix (Invitrogen) e 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Primers específicos para S. mansoni EIF4E foram utilizados como controle endógeno (Liu et al,. 2012). A eficiência para cada par de primers foi avaliado de acordo com o protocolo desenvolvido pela Applied Biosystems application (as diluições de cDNA foram 1:4, 1:16, 1:64, 1:256 e 1:1024). Para os transcritos estudados foram feitos 3 réplicas biológicas e suas expressões gênicas foram normalizadas contra transcritos de α-tubulina de acordo com o método 2−ΔCt (Livak and Schmittgen, 2001) utilizando o software Applied Biosystems 7300.
Tabela 1: Códigos de acesso e os pares de sequências de primers
GENES CÓDIGO DE ACESSO SEQUÊNCIAS DE PRIMERS
Talin 2 Smp_167010 F: 5´- TTGGCAATGAACCTCCTG -3´ R: 5´- CTAATTCGTTCGCCTCCATG -3´ Talin 2 Smp_142630 F: 5´- GAAGAAACTGCTCAGACTGC -3´ R: 5´- AACTTGCAGGTGGACTGC -3´ EIF4E Smp_001500 F: 5´- TGTTCCAACCACGGTCTCG -3´ R: 5´- TCGCCTTCCAATGCTTAGG -3´
4.5 - Silenciamento por miR-190
Para verificar as alterações ultraestruturais causadas pelo silenciamento gênico utilizando o miR190, 108 casais de parasitas adultos foram previamente encubados em placas de 24 poços por 24 horas, e em seguida, por mais 72 horas separados em três grupos: 12 casais como controle negativo apenas em meio RPMI (1mL), 12 casais como controle positivo em meio RPMI (995 μL) suplementado com 50nmoles(5μl) de SNORA e o terceiro grupo contendo 12 casais em meio RPMI (995 μl) contendo 50nmoles(5μl) miR-190. Após a incubação, os machos e fêmeas dos casais de S. mansoni foram manualmente separados após a incubação com miR-190 e posteriormente, foram lavados 3 vezes com solução fosfato e fixados em solução contendo 2.5% glutaraldeído-fosfato (0.2 M em pH 7.4) em temperatura ambiente por 2 horas para posterior análise de microscopia.
4.6 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Para análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV), os casais de vermes foram pós fixados em solução de fosfato contendo 1% tetróxido de ósmio (Sigma-Aldrich) em temperatura ambiente por 1 hora. Subsequentemente, os vermes foram individualmente dehidratados em etanol 100% e secos em CO2. Os parasitas machos e fêmeas foram montados separadamente em suporte metálico revestido com uma fina camada de ouro e examinados com o equipamento Joel JSM-5200 operando a 25KV. Todas as medições foram feitas em micrômetros (μm). Para este experimento foram utilizados casais de parasitos de diferentes grupos estudados, 10 machos e 10 fêmeas foram analizadas.
4.7 - Análise Estatística
As análises estatísticas foram feitas por meio do software GraphPad Prism versão 7.0 (Irvine, CA, USA). Após a normalidade dos dados ter sido estabelecida através da análise kolmogorov foi realizada a análise de variância one-way ANOVA. O pós teste de Tukey foi utilizado para investigar a significância da expressão diferencial do gene Talin através dos estádios evolutivos do organismo investigado. As diferenças foram consideradas significantes quando valor de p foi <0.05.
5 - RESULTADOS
5.1 - Talin 2: estrutura e conservação de Smp_142630 e Smp_167010
Dados obtidos por meio de análises in silico de duas supostas sequências da proteína talina anotadas no genoma de S. mansoni atribuídas à talina 2, utilizando o banco de dados de domínios proteicos PFAM para avaliar a estrutura da proteína e os domínios conservados, a fim de confirmar se as sequências poderiam realmente ser atribuídas à família de proteínas talina.
Figura 5: Representação gráfica das posições de domínios conservados na sequência do gene talin de S. mansoni (Smp_167010) usando análise PFAM.
Para ambas as entradas observamos os domínios FERM, Talin médio e I_LWEQ conservados, que são as principais regiões que qualificam uma proteína como pertencente a tal família, uma vez que o domínio FERM é, por exemplo, a região que se liga à cauda intracelular da proteína integrina para ativá-la. Além disso, também observamos que os domínios FERM são mais conservados que o domínio médio da talina, quando comparados aos ortólogos humanos, como apresentados pelas Figuras 5 e 6.
Figura 6: Representação gráfica das posições de domínios conservados na sequência do gene talin de S. mansoni (Smp_142630) usando análise PFAM.
Realizamos a modelagem de estruturas terciárias preditas com base em dados cristalográficos depositados no SWISS-MODEL, a fim de analisar a conservação das estruturas terciárias predita a partir das sequências de aminoácidos da proteína talina em estudo. A modelagem criada, nos permite comparar a similaridade das estruturas terciárias preditas das proteínas, baseada na análise cristalográfica da contraparte humana. Os modelos obtidos para a talina foram estruturalmente semelhantes a talina-2 humana, compartilhando 59,24% (Smp_167010) e 67,77% (Smp_142630) de identidade em nível estrutural (tabela 2).
As análises 3D demonstraram que, embora as sequências de aminoácidos de ambas as entradas fossem diferentes, as estruturas terciárias não foram afetadas e possivelmente a função também não seria diferente (Figura 7 A e B).
Figura 7 A e B. Comparação da estrutura terciária 3D da proteína predita pelo software virtual SWISS-MODEL. Em A, (Humano e Smp_142630) e em B, (Humano e Smp_167010).
A
A Figura 08 apresenta os resultados da análise filogenética. Pode-se observar que as duas entradas ficaram posicionadas no clado protostômios e com ortólogos conservados em organismos com simetria bilateral e mamíferos.
Figura 8: Filogenia de Smp_142630, Smp_167010 e seus ortólogos através do método comparativo neighbor-joining com bootstrap de 1000 réplicas no software MEGA 7.
Os dados apresentam as duas entradas estudadas, ramificadas em clados distintos porém compartilhado com seu ortólogo mais próximo (talina de S. haematobium), com alto grau de similaridade (bootstrap de 100 ou muito próximo), o que sugere que a proteína talina prevista de S. mansoni pode ter função semelhante em qualquer estádio, quando presente.
5.2 - Talina 2: perfil de expressão de Smp_142630 e Smp_167010
A figura 9 apresenta a expressão gênica de Smp_142630 e Smp_167010 onde apresentam perfil de expressão diferencial ao longo do ciclo de vida de S. mansoni. O perfil de expressão dos genes foi determinado por qRT-PCR de Ovos, Cercárias, Esquistossômulos Mecanicamente Transformados 3,5h (EMT-3,5h), Esquistossômulos Mecanicamente Transformados 24h (EMT-24h), verme adulto macho (macho VA) e Verme adulto fêmea (fêmea VA).
Posteriormente, os dados apresentam uma regulação positiva do Smp_167010 em ovos, cercárias e EMT-3,5h apesar da regulação negativa do mesmo gene em EMT-24h, AW masculino e AW feminino, sendo o estádio de Cercária o mais expresso. Além disso, o Smp_142630 é mais expresso em cercárias e menos abundante nos outros estágios da vida do parasito, no entanto, pode ser notada a diferença de cinco vezes entre os vermes adultos macho e fêmea.
Figura 9: Smp_167010 e Smp_142630 são expressos diferencialmente ao longo do ciclo de vida de S. mansoni. Foram considerados dados de três repetições para cada uma dos estádios de S. mansoni: Ovos, Cercárias, Esquistossômulos Mecanicamente Transformada (EMT) 3,5h e 24h, Vermes adultos Machos e Fêmeas usando qRT-PCR. Os níveis de expressão foram calibrados de acordo com o método comparativo de 2-ΔCt usando o SmEIF4E expresso constitutivamente como um controle endógeno (ANOVA seguido do pós teste de tukey p <0,01). * Difere de ovos ** Difere de cercária *** Difere de EMT-3,5h **** Difere de macho VA # sem diferença estatisticamente significante.
5.3 - Efeitos ultraestruturais pós silenciamento gênico por RNAi utilizando Mir-190
As alterações morfológicas em S. mansoni após o silenciamento por siRNA usando mir190 em comparação ao controle negativo e positivo são apresentados nas figuras 10 (verme adulto macho) e 11 (verme adulto fêmea). Os dados apresentados na figura 10 são em relação ao controle e mostram que nos vermes adultos machos tratados com Snora (controle positivo), o tegumento (T), ventosas orais e ventrais (VO e VV) apresentaram retração sem grandes alterações. Enquanto os tratados com mir190 apresentaram formação de bolhas no tegumento; o canal ginecóforo (CG) apresentou pelotização (P), fissuras internas (FI) e bolhas; as ventosas orais e ventrais estavam normais.
Figura 10- Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de parasitas machos após 72 h de incubação: casais de S. mansoni emparelhados foram incubados em meio RPMI 1640 (controle negativo). Após a incubação, o casal não foi pareado e preparado para a análise do MEV. Como mostrado acima, o controle negativo não apresentou alterações morfológicas em seu tegumento (T), canal ginecóforo (CG) e nas ventosas orais (VO) e ventral (VV). O tegumento permaneceu com grande número de tubérculos e espículas típicas. O tratamento com Snora (2ul) causou: rugas do canal ginecóforo, ventosas orais e ventrais e formação de bolhas no tegumento em comparação ao controle negativo. O siRNA 190 causou a formação de bolhas no tegumento; o canal ginecóforo apresentava pelotização (P), fissuras internas (FI) e bolhas; as ventosas orais e ventrais estavam normais em comparação com os controles negativos.
A figura 11 apresenta o efeito do silenciamento por miR-190 em vermes adultos fêmeas tratadas com Snora (controle positivo) e mir190 (silenciamento de siRNA), onde o tegumento (T), as ventosas oral e ventral (VO e VV) não apresentaram alterações visuais em comparação ao controle negativo.
Figura 11 - Microscopia eletrônica de varredura (MEV) de parasitas fêmeas após 72 h de incubação: casais de S. mansoni emparelhados foram incubados em meio RPMI 1640 (controle negativo). Após a incubação, o casal foi separado e preparado para a análise do MEV. Como mostrado acima, todas as amostras analisadas não apresentaram alterações morfológicas, apresentando suas ultraestruturas usuais como tegumento (T), ventosa oral (VO) e ventral (VV), como apresentadas no controle negativo.
6 - DISCUSSÃO
A esquistossomose, em especial a mansoni, a qual é tratada neste trabalho, é uma patogenia de grande relevância tanto geopolítica quanto cientificamente. Conhecida há várias décadas por cientistas e profissionais da saúde, ainda carece de dados científicos que são necessários para pavimentar um caminho para a criação de novos e mais eficientes tratamentos. Já se estuda exaustivamente em outras doenças, técnicas moleculares com potencial terapêutico porém, a literatura trata o S. mansoni com escassez de dados nesse sentido.
Neste trabalho apresentamos a caracterização estrutural, molecular e funcional da proteína talina (Smp_142630 e Smp_167010) bem como analisamos os efeitos ultraestruturais em vermes adultos de seu microRNA intrônico miR-190 no silenciamento de seus alvos in vitro.
Talinas ativam as integrinas ao se ligar através da porção globular N-terminal à cauda intracelular da proteína transmembranar das beta-integrinas (Yan et al., 2014; Ellis et al., 2014). Também vincula as integrinas ao citoesqueleto intracelular (Mccann & Craig 1999).
Encontramos dois genes talin no genoma de S. mansoni (geneDB) e fizemos análise de domínios funcionais proteicos, como resultado, o banco de dados atribui as entradas fornecidas (Smp_142630 e Smp_167010) como pertencentes a família de proteínas talinas 2, a literatura carece de dados robustos sobre a diferença entre talina 1 e 2 dizendo apenas que a segunda possui mais afinidade com a porção intracelular da integrina beta. E não há dados prévios atribuídos ao S. mansoni.
Outro resultado da análise por PFAM foram as predições dos domínios funcionais encontrados nas duas entradas. A estrutura proteica apresenta vários domínios importantes que atribuem funções específicas à talina de acordo com sua presença, alguns desses domínios são bastante conservados evolutivamente, como os domínios FERM e I / LWEQ.
O domínio (complexo funcional) FERM presente na estrutura da talina é responsável por esse reconhecimento e ligação dessas duas proteínas (Haining & Lieberthal, 2016; Tanentzapf & Brown, 2016). A principal diferença entre os dois tipos de talina é, na verdade, a maior afinidade da tln2 com a cauda intracelular da proteína transmembrana da integrina, portanto o domínio FERM é a região mais envolvida nesse papel (Debrand et al., 2009). Devido à sua importância, o alto nível de conservação desse domínio deve ser observado e nossos dados corroboram essa afirmação.
A análise de qRT-PCR das entradas Smp_142630 e Smp_167010 se analisadas em conjunto com as análises do PFAM apresentam dados relevantes para a construção da compreensão do papel da proteína talina no contexto biológico do organismo. Em primeiro lugar os dados apresentam uma expressão diferencial ao longo do ciclo de vida tanto entre os estádios estudados quanto em comparação das duas entradas, que conduz a aceitação de que são, de fato, duas proteínas distintas sendo expressas no mesmo organismo (o que até então era predição in silico).
O sítio de ligação da vinculina (domínio VBS) encontrado apenas na estrutura Smp_142630 também pode estar na estrutura da proteína talina e é responsável pela interação com a vinculina, permitindo o envolvimento da integrina no citoesqueleto (Atherton et al., 2015) e também com a função de estabilizar a célula. Na matriz conjunta (Fillinghan et al., 2005; Golji et al., 2011), o perfil de expressão diferencial desse gene entre os estádios evolutivos do parasito pode ser entendido pela biologia do organismo, que é totalmente abrangente pelo fato de a proteína que contém o domínio VBS ser mais expressa em cercárias e vermes adultos machos. As cercárias possuem uma estrutura móvel chamada cauda a qual é muito importante no processo infeccioso do hospedeiro. Assim, o citoesqueleto apresenta grande importância nesse cenário para desempenhar tal papel de contração e mobilidade da estrutura. Além disso, o papel do VBS nos vermes adultos do sexo masculino provavelmente poderia ser explicado pelo papel de acoplamento do verme macho relacionado à fêmea e pela estrutura epitelial multicamada.
O sítio de resposta à insulina (domínio IRS) encontrado apenas na estrutura da entrada Smp_167010 e é um domínio encontrado em diversas proteínas e organismos em que desempenha um papel importante em processos como migração celular, diferenciação e agrupamento de sinalização quando conectado às integrinas (Xi et al., 2016) Sua expressão mais elevada em alguns estádios evolutivos do ciclo de vida de S. mansoni, conforme os experimentos (PFAM) revelaram quantidades expressivas em ovos, cercárias e esquistossômulos mecanicamente transformados (3,5h), podem ser abrangentes porque esses estádios são momentos de intensa transformação e diferenciação em relação à infecção e maturação do verme.
O domínio I / LWEQ é um grupo de quatro blocos de aminoácidos conservados e seu nome é composto pela inicial do aminoácido de cada bloco (Franco et al., 2006). Esse domínio atua na ligação da actina com a proteina talina, sendo importante para a ligação da integrina ao citoesqueleto por sua presença no talin (Lee & Jeon, 2014). Também pode ser encontrado produzindo dímeros de talina e podem aparecer em posições diferentes e mais de uma vez na mesma proteína (Golji & Mofrad, 2014).
Vale lembrar que os dados de PCR em tempo real são de expressão do gene e não da proteína em sí, portanto aqui encontramos um ponto fraco no trabalho mas que não invalida o raciocínio e fomenta a necessidade de novos dados e estudos.
Após vários alinhamentos usando Clustal X 2.0, BLAST e a partir da filogenia apresentada, os dados indicam na figura 8 que as entradas estudadas não possuem características que indique se tratar de isoformas ou produtos de splicing alternativo, uma vez que estão localizadas em genes distintos e em diferentes cromossomos de S. mansoni além de estarem em clados distintos compartilhados com ortólogos de espécies distintas e semelhantes, ainda somado ao fato de possuírem domínios funcionais distintos há fortes indícios de que as entradas estudadas se tratam de produto de diferenciação e/ou especiação.
As análises de microscopia dos efeitos ultraestruturais causados pelo silenciamento do gene Smp_142630 por miR-190 são importantes por apresentarem modificações no tegumento do verme que se comparam ao verme susceptível ao praziquantel em exposição a droga como apresentado por Pinto-Almeida e colaboradores (2016) o que nos leva a crer que a proteína talina apresenta potencial a ser explorado como alvo terapêutico, entretanto, não houve colapso suficiente para causar a morte do verme nem a separação do casal, entretanto o estudo não avaliou a resposta sob diferentes concentrações o que nos gera uma lacuna de conhecimento e abre espaço para novos estudos.
7 - CONCLUSÃO
Podemos concluir que os dois genes que codificam a proteína talina em S. mansoni, são diferencialmente expressos entre os estádios de desenvolvimento do parasito e, consequentemente, esta proteína se relaciona de modo dinâmico ao longo da vida do parasito aparentemente exercendo papel fundamental em sua fisiologia e em seu equilíbrio celular. Os dados robustos e precisos a partir de ferramentas confiáveis apresentados neste trabalho formam base sólida para dizer e reforçar que o gene talin possui fundamental destaque dentro do genoma S. mansoni.
8 - PERSPECTIVAS
A partir dos dados gerados neste estudo podemos observar a importância e o valor que o gene talin possui dentro do conhecimento sobre Schistosoma mansoni e consequentemente da esquistossomose mansoni, abrindo um caminho pavimentado para a compreensão do mecanismo estudado e apresentando-se portanto como um excelente objeto para estudos e investigações adicionais, podendo ser promissores os futuros resultados e suas aplicabilidades em esquemas terapêuticos envolvendo o silenciamento do gene talin por RNAi. Para seguir em direção a uma avaliação mais completa destes genes se faz necessário uma análise com concentrações diferentes da molécula silenciadora e uma avaliação comparativa entre a expressão gênica e a proteica através de qRT-PCR, além de Western Blot comparativo entre as concentrações estudadas.
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