Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato seco de Cassia occidentalis L. (CASSIA VIRGÍNICA®)

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO SECO DE Cassia occidentalis L. (CASSIA VIRGÍNICA®).. Mirtes Gonçalves Barbosa da Silva. RECIFE 2009.

(2) MIRTES GONÇALVES BARBOSA DA SILVA. AVALIAÇÃO TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA DO EXTRATO SECO DE Cassia occidentalis L. (CASSIA VIRGÍNICA®).. Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde (CCS) da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Simone Sette Lopes Lafayette Co-orientador: Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley. RECIFE 2009.

(3) Silva, Mirtes Gonçalves Barbosa da Avaliação toxicológica pré-clínica do extrato seco de Cassia occidentalis L. (CASSIA VIRGÍNICA® ) / Mirtes Gonçalves Barbosa da Silva. – Recife : O Autor, 2009. XIII+67 folhas : fig., tab. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2009. Inclui bibliografia. 1. Cassia occidentalis. 2. Leguminosae. Toxicidade aguda. 4. Toxicidade subcrônica. Toxicidade reprodutiva I.Título.. 582.736 583.323. CDU (2.ed.) CDD (22.ed.). 3. 5.. UFPE CCS2009-131.

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(5) UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Reitor Amaro Henrique Pessoa Lins Vice-Reitor Gilson Edmar Gonçalves e Silva Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Anísio Brasileiro de Freitas Dourado Diretor do Centro de Ciências da Saúde José Thadeu Pinheiro Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Dalci José Brondani Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas Antônio Rodolfo de Faria Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Pedro José Rolim Neto Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Beate Saegesser Santos.

(6) Aos meus pais, quem me ensinaram o valor da vida e da natureza, a paixão pela ciência, o respeito pelo próximo, que me deram toda a base e força para enfrentar os desafios da vida; aos meus irmãos, que sempre confiaram em mim apoiando meus sonhos. Dedico..

(7) AGRADECIMENTOS. A Deus, por me dar coragem e fé, para lutar e vencer. Iluminando meus dias, ofertando-me saúde, mostrando o caminho certo a seguir.. Aos meus queridos pais Severino Barbosa da Silva e Laudiceia Gonçalves Barbosa da Silva, a razão da minha existência. Por estarem sempre juntos a mim, aconselhando e orientando, por todo amor, dedicação e apoio.. Aos meus irmãos Midiam Gonçalves Barbosa da Silva e Mesaque Gonçalves Barbosa da Silva pela paciência, carinho e por estarem sempre ajudando nesta minha importante conquista. Ela também é de vocês!. A Clayton Anderson de Azevedo Filho pela compreensão e dedicação durante todo tempo, pelo apoio fornecendo o material necessário para a execução dessa pesquisa. Muito obrigada!. A Profa. Dra. Simone Sette Lopes Lafayette, pela paciência, amizade, aprendizado e apoio em todos os momentos necessários.. Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley e a Profa. MSc. Maria do Carmo Corrêa de Araújo Fraga, pelo exemplo profissional, comprometimento e dedicação ao ensino e a pesquisa.. A Profa. Dra. Beate Saegesser Santos e a Profa. Dra. Adriana Fontes, pelo apoio técnico disponibilizando seus equipamentos para a execução dessa pesquisa, pela confiança, e principalmente pela amizade.. Ao Prof. Dr. Haroudo Sátiro Xavier, pela amizade e apoio em transmitir seus conhecimentos, bem como, a disponibilização de seus equipamentos.. A minha incansável amiga Edna Filgueira de Menezes, que compartilha comigo meus acertos e erros, dividindo bons momentos.. Aos colegas de laboratório: Bruno, Carlos Fernando, Cristiano, Germana, Giovanna, Hélida, Iggor, Jamilka, Juciene, Júlia, Larissa, Liliane, Luana, Mariani, Mário, Pablo, Rafaella,.

(8) Suziany, Ticiana, Vanessa e Viviane; pela amizade e colaboração.. A João Henrique da Costa Silva, pelo auxílio nos testes de contagem espermática e também pela amizade.. A Rejane de Sousa Silva, Zenira Cosme Xavier, Nielson Torres de Mello pela amizade e grande assistência técnica dada nos experimentos; e a Fredson José Soares (Seu Fredson) pela gentileza e alegria de sempre que contagia a todos.. Aos professores e funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia/CCB - UFPE, pela disponibilidade de seus laboratórios, pela calorosa acolhida e intensa colaboração.. A Coordenação, professores, funcionários e colegas do curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas/CCS – UFPE, pela convivência e troca de experiências.. Ao Laboratório Pernambucano Ltda (LAPERLI), pelo fornecimento do material para a pesquisa.. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de mestrado..

(9) AS FORMAS DO BARRO. Eu trago as formas do barro esculpidas em minhas mãos: o cheiro molhado de argila umedece as minhas palavras e o sol que vem do passado revela um segredo guardado. A mão cumpre o risco no ar e os dedos beneficiam a argila, mergulhando no gesto vertical. A esquerda recebe a dádiva e juntas compartilham o corpo medido em areia, argila e água. O verbo nas mãos se enconcha, se eleva, beija o ar em curva, e sobre o vazio da forma passa contra a madeira sem reclame. A direita alça o arco de arame e as aparas se despem da massa. Assim se repete a procura em novo bolo que se enforma: vira-se a forma sobre a mesa de trabalho do artesão, e feito o asseio de areia, dois poemas brotam no chão. De dois em dois, em soma de pares os montes de argila se multiplicam. E o oleiro, sem que se repare, contempla as paredes do futuro, que hoje, por certo, ainda abrigam os seus sonhos riscados num muro. Aleilton Fonseca.

(10) SUMÁRIO. LISTA DE FIGURAS. X. LISTA DE TABELAS. XI. RESUMO. XII. ABSTRACT. XIII. 1. INTRODUÇÃO. 1. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 5. 2.1. Importância de estudos toxicológicos de plantas medicinais. 6. 2.2. Análise toxicológica pré-clínica. 7. 2.2.1. Toxicidade Aguda. 8. 2.2.2. Toxicidade Subcrônica e crônica. 8. 2.2.3. Toxicologia da Reprodução. 8. 2.3. Cassia occidentalis L.. 10. 2.3.1. Botânica. 10. 2.3.2. Fitoquímica. 11. 2.3.3. Farmacologia. 12. 2.3.4. Toxicologia. 14. 3. OBJETIVOS. 16. 3.1. Geral. 17. 3.2. Específico. 17. 4. ARTIGO I: Acute and subacute toxicity of crude extract of Cassia occidentalis L.. 18. ABSTRACT. 19. INTRODUCTION. 20 VIII.

(11) MATERIALS AND METHODS. 21. RESULTS. 24. DISCUSSION. 25. REFERENCES. 28. 5. ARTIGO II: Effects of the Cassia occidentalis L. intake on male reproductive system. 38. ABSTRACT. 39. INTRODUCTION. 40. MATERIALS AND METHODS. 41. RESULTS. 44. DISCUSSION. 44. REFERENCES. 46. 6. CONCLUSÕES. 54. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 56. IX.

(12) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO DA LITERATURA Figura 1. Cassia occidentalis L., (a) flor, (b) vagem, (c e d) aspectos gerais. Fonte: 11 Missouri Botanical Garden (www.biologie.uni-amburg).. ARTIGO I Figura 1. Body weight gain curves of male rats treated orally with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route for 30 consecutive days. The values are expressed as mean ± S.E.M. (n10 animals/group).. 31. Figura 2. Body weight gain curves of female rats treated orally with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route for 30 consecutive days. The values are expressed as mean ± S.E.M. (n=10 animals/group).. 31. ARTIGO II Figura 1. Body weight gain curves of male rats treated orally with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route for 60 consecutive days. The values are expressed as mean ± S.E.M. (n=5 animals/group).. 50. X.

(13) LISTA DE TABELAS. ARTIGO I Tabela 1. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral 32 route on biochemical parameters in male Wistar rats treated for 30 consecutive days.. Tabela 2. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route on biochemical parameters in female Wistar rats treated for 30 consecutive days.. 33. Tabela 3. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route on hematological parameters in male Wistar rats treated for 30 consecutive days.. 34. Tabela 4. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route on hematological parameters in female Wistar rats treated for 30 consecutive days.. 35. Tabela 5. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 2.5 g/kg) by oral route on absolute (g) and relative (g/100g of animal) organ weight in male Wistar rats treated for 30 consecutive days.. 36. Tabela 6. Effects of Cassia occidentalis extract (CO - 2.5 g/kg) by oral route on absolute (g) and relative (g/100g of animal) organ weight in female Wistar rats treated for 30 consecutive days.. 37. ARTIGO II Tabela 1. Effects of the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route on absolute and relative organ weight (g/100 g of the animal) in male Wistar rats treated for 60 consecutive days.. 51. Tabela 2. Reproductive parameters of female rats and its offspring obtained after the mating with male Wistar rats treated with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) for 60 consecutive days.. 52. Tabela 3. Effects of the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route on testicular and cauda epididymal sperm count, testis daily sperm production and cauda epididymis transit time of male Wistar rats treated for 60 consecutive days.. 53. XI.

(14) RESUMO. Cassia occidentalis L. (Leguminosae) popularmente conhecida como fedegoso é geralmente encontrada em regiões de florestas e em outras áreas tropicais ao redor do mundo. Na medicina tradicional, raízes, folhas e caules são usados como laxante, antiinflamatório, analgésico, antipirético, diurético, hepatoprotetor, vermicida e abortivo. Baseado principalmente no largo uso popular, a Cassia occidentalis é comercializada por alguns laboratórios farmacêuticos entre eles o Laboratório Pernambucano Ltda. (LAPERLI) com o nome comercial de CASSIA VIRGÍNICA®. O fitoterápico CASSIA VIRGÍNICA®, preparado a partir de caules e folhas de Cassia occidentalis (CO), tem sido indicado para o tratamento de gripes, febres, úlceras varicosas e erisipelas. Apesar do amplo uso desta espécie, poucos são os trabalhos disponíveis na literatura sobre seu potencial toxicológico. A maioria dos estudos toxicológicos utilizando Cassia occidentalis, refere-se à toxicidade de suas sementes. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar a segurança da administração oral do extrato seco de caules e folhas de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®) em ratos Wistar de ambos os sexos. Para isto, foram realizados testes de toxicidade aguda nas doses de 0.625 a 5.0 g/kg, de toxicidade subcrônica e de toxicidade reprodutiva nas doses de 0.10, 0.50 e 2.5 g/kg/dia. Os resultados demonstraram que, nos estudos de toxicidade aguda, CO não produziu morte ou sinais de toxicidade em doses de até 5.0 g/kg. A administração por 30 dias de CO não alterou os parâmetros bioquímicos e hematológicos dos animais tratados, que se mantiveram dentro dos valores de referência para espécie. Entretanto, foi constatada uma discreta diarréia durante o período de tratamento. Não foram observadas alterações significativas na massa corporal nem no consumo de água e ração. Também não foram registradas alterações significativas nas massas, absoluta e relativa, e nem na morfologia macroscópica externa ou microscópica dos principais órgãos. Nos estudos que avaliaram a capacidade reprodutiva em machos, o tratamento durante 60 dias com CO não produziu efeitos tóxicos sobre os parâmetros reprodutivos ou sobre os conceptos. Além disso, não houve alteração significativa nas massas dos órgãos reprodutivos (epidídimo, vesícula seminal, ducto deferente, testículos, próstata) nem no número de espermatozóides. Desta forma, conclui-se que extrato seco de caules e folhas de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®) é seguro por via oral, uma vez que apresentou baixa toxicidade aguda e subcrônica e não interferiu na capacidade reprodutiva dos ratos Wistar.. Palavras-Chave: Cassia occidentalis, subcrônica, toxicidade reprodutiva.. Leguminosae,. toxicidade. aguda,. toxicidade. XII.

(15) ABSTRACT. Cassia occidentalis L. (Leguminosae) popular known as fedegoso is usually found in areas of forests and other tropical areas. In traditional medicine, roots, leaves and stems are used as laxative, anti-inflammatory, analgesic, antipyretic, diuretic, hepatoprotective, vermifuge and abortion. Based mainly on broad popular use, the Cassia occidentalis is marketed by some pharmaceutical laboratories between the Laboratory Pernambucano Ltda. (LAPERLI) under the commercial name of CASSIA VIRGÍNICA®, prepared from stems and leaves of Cassia occidentalis (CO) has been shown to treat flu, fevers, varicose ulcers and erysipelas. Despite the widespread use of this species, there are few studies available in the literature about its potential toxicity. Most toxicological studies using Cassia occidentalis refers to the toxicity of its seeds. Accordingly, the aimed of this study was to evaluate the safety of oral administration of dried extract of Cassia occidentalis (CASSIA VIRGINIA®) in Wistar rats of both sexes. For this, tests were carried out acute toxicity at doses from 0.625 to 5.0 g/kg, of subchronic toxicity and reproductive toxicity at doses of 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg/day. The results showed that, the studies of acute toxicity, CO did not produced deaths or signs of toxicity at doses of up to 5.0g/kg. The administration for 30 days of CO did not alter the biochemical and hematological parameters of treated animals, which remained within the reference values for the species. However, there was a mild diarrhea during the treatment period. There were no significant changes in body weight or in water consumption and diet. Also there were no significant changes in the absolute and relative weights and not in gross external morphology or microscopic of the principal organs. In studies that evaluated the reproductive capacity in males, treatment with CO for 60 days did not produced no toxic effects on reproductive parameters or on the concepts. Furthermore, there was no significant change in weights of reproductive organs (epididymis, seminal vesicle, vas deferens, testis, prostate) or the number of sperm. Thus, it is concluded that the dried extract of stems and leaves of Cassia occidentalis (CASSIA VIRGINIA®) is safe orally, as presented low acute and subchronic toxicity and did not affect the reproductive capacity of rats. Keywords: Cassia occidentalis, Leguminosae, CASSIA VIRGÍNICA®, acute toxicity, subacute toxicity, reproductive toxicity.. XIII.

(16) INTRODUÇÃO. 1.

(17) 1. INTRODUÇÃO. A utilização das plantas medicinais surgiu a partir do momento em que o homem descobriu a ação medicamentosa destas e passou a usá-las no combate as enfermidades diversas e como alternativa medicinal para prevenção de doenças, representando muitas vezes o único recurso terapêutico de várias comunidades e grupos étnicos (GOMES e GOMES, 2000). Não se sabe qual foi a primeira civilização a utilizar as plantas com fins medicinais, mas muitos foram os povos que contribuíram com o seu conhecimento sobre as plantas. A história do desenvolvimento das civilizações Oriental e Ocidental é rica em exemplos da utilização de recursos naturais na medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa, merecendo destaque a civilização Egípcia, Greco-romana e Chinesa (VIEGASJÚNIOR, BOLZANI e BARREIRO, 2006). Sabe-se que a medicina popular recebeu forte influência indígena (CAMPOS, 1984), portuguesa e africana (ALBURQUERQUE, 1997; VASCONCELOS et al., 2000) estando relacionada, quase sempre, à crença popular que atribui constantemente as atividades curativas a poderes mágicos presentes nas plantas e até mesmo a dádivas concedidas por deuses (ELDIN e DUNFORD, 2001). Assim o homem lançava-se de forma empírica às fontes vegetais em busca de soluções para seus males e, com o passar dos anos e com o avanço da ciência, muitos destes usos empíricos foram se confirmando. O resgate da sabedoria popular do uso terapêutico de plantas passou a oferecer um suporte para o desenvolvimento de novos medicamentos (GOMES e GOMES, 2000). O uso de ervas medicinais tem mantido a sua popularidade por razões históricas e culturais; em países em desenvolvimento, 65-80% da população depende exclusivamente das plantas medicinais para os cuidados primários de saúde (AGRA, FREITAS e BARBOSAFILHO, 2007). Atualmente,. os. produtos. naturais. desempenham. um. papel. dominante no. desenvolvimento de drogas para o tratamento de doenças humanas (NEWMAN e CRAGG, 2007). Butler (2008) demonstra que de um total de 13 drogas aprovadas para o mercado mundial no período de 2005 a 2007, 22% (em 2005), 9% (em 2006) e 24% (em 2007) foram originados ou derivados de produtos naturais. No Brasil, a pesquisa moderna em produtos naturais teve início em meados do século passado (PUPO, GALLO e VIEIRA, 2007). O uso de várias plantas medicinais na medicina convencional foi oficializado por inclusão na 1ª Edição da Farmacopéia Brasileira 2.

(18) (BRANDÃO et al., 2008). Atualmente, a fitoterapia aparece como uma alternativa no tratamento para as mais variadas doenças (FOGLIO et al., 2006). França e colaboradores (2008) enfatizam o atual interesse brasileiro, governamental e profissional, em associar o avanço tecnológico ao conhecimento popular e ao desenvolvimento sustentável, visando a uma política de assistência em saúde eficaz, abrangente, humanizada e independente da tecnologia farmacêutica. De acordo com a legislação sanitária brasileira, fitoterápico é o medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais ativas e caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade (CARVALHO et al., 2008). Embora o uso de plantas com fins terapêuticos esteja sendo estimulado em todo o mundo, não se deve esquecer que muitas dessas plantas possuem substâncias que podem apresentar um potencial toxicológico elevado, podendo, portanto, serem nocivas ao homem. Este potencial toxicológico é definido pela capacidade que uma substância possui de causar dano grave ou morte a qualquer organismo (DRAIZE, WOODARD e CALVERY, 1944). Segundo Castro (1993), toda substância possui um potencial tóxico, isso apenas dependerá das condições de exposição, como a dose administrada ou absorvida, o tempo e a frequência de administração e a via de administração. Apesar do registro de 483 plantas com potentes propriedades bioativas no nordeste brasileiro, muitas destas espécies não são estudadas quanto aos seus constituintes químicos e/ou atividades biológicas, embora os seus usos populares tenham sido relatados (AGRA, FREITAS e BARBOSA-FILHO, 2007). Há ainda uma grande lacuna entre as atividades biológicas descritas e o uso popular, assim como uma carência de estudos quanto aos efeitos adversos, contra-indicações, toxicidade, validação da eficácia e segurança do uso do fitoterápico nativo (PUPO, GALLO e VIEIRA, 2007). No Brasil, a possibilidade de implementação da fitoterapia no sistema público de saúde vem sendo considerada desde 1988 e faz parte das diretrizes da I Conferência Nacional de Assistência Farmacêutica (BRASIL, 2003). Entretanto, para a utilização de um produto natural com a finalidade terapêutica em nível de saúde pública, é fundamental o estabelecimento de sua eficácia, segurança, e garantia de qualidade. Neste contexto, é de fundamental importância estudos pré-clínicos e estudos clínicos que avaliem o potencial terapêutico e toxicológico das plantas medicinais, a fim de garantir e promover o desenvolvimento de formulações fitoterápicas eficazes e seguras. Baseado principalmente no largo uso popular, Cassia occidentalis é comercializada 3.

(19) por alguns laboratórios farmacêuticos entre eles o Laboratório Pernambucano Ltda. (LAPERLI) com o nome comercial de CASSIA VIRGÍNICA®. Esse fitoterápico é preparado a partir de caules e folhas de Cassia occidentalis e indicado para o tratamento de gripes, febres, úlceras varicosas e erisipelas. Em nosso laboratório (Farmacologia e Toxicologia PréClínica de Produtos Bioativos - UFPE), o fitoterápico CASSIA VIRGÍNICA® vem sendo estudado com relação aos efeitos farmacológicos e toxicológicos, a fim de estabelecer sua eficácia e segurança. Assim, este trabalho tem por objetivo aprofundar os conhecimentos sobre o potencial toxicológico de Cassia occidentalis, por meio de estudos de toxicidade subcrônica e reprodutiva, em ratos Wistar.. 4.

(20) REVISÃO DA LITERATURA. 5.

(21) 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. IMPORTÂNCIA DE ESTUDOS TOXICOLÓGICOS DE PLANTAS MEDICINAIS. Apesar dos estudos sobre o uso popular de plantas medicinais, alguns equívocos e acidentes pela utilização incorreta podem ser observados, pois é comum o pensamento de que as plantas medicinais de uso tradicional já foram testadas e homologadas pelo uso prolongado na espécie humana. Por isso são considerados remédios eficazes e que não apresentam efeitos colaterais não necessitando de avaliação. A automedicação com plantas chega ao extremo de substituir terapias em doenças graves como, por exemplo, as de efeito hipoglicemiantes (LAPA et al., 1999), insuficiência cardíaca e leucemia (BACCHI, 1996). Entretanto, apesar dos avanços científicos mais recentes, o uso de espécies vegetais como recurso terapêutico, ainda encontra-se fundamentado predominantemente na cultura popular, carecendo de informações quanto à eficácia e segurança. Muitas plantas possuem substâncias potencialmente agressivas capazes de exercer ação tóxica sobre organismos vivos. Segundo algumas teorias, essas substâncias seriam formadas com a função de defender a espécie de seus predadores. Não é de surpreender que muitas delas acumulem substâncias de elevada toxicidade, como os glicosídeos cianogênicos, presentes na mandioca-brava; proteínas tóxicas como a ricina, presente na mamona; muitos alcalóides, como a coniina, presente na cicuta; e a estricnina, presente na noz-vômica. Cabe ressaltar que enquanto algumas plantas são completamente desconhecidas quanto ao potencial de causar intoxicações, outras, são reconhecidamente tóxicas, destacando-se em nosso meio, comigo-ninguém-pode, coroa-de-cristo, pinhão-de-purga ou pinhão-de-papagaio, aroeirabrava, mamona e cartucheira (SCHENKEL et al., 2000). Outros exemplos de efeitos tóxicos de substâncias presentes em plantas podem ser citados: os efeitos hepatotóxicos de apiol, safrol, lignanas e alcalóides pirrolizidínicos; a ação tóxica renal que pode ser causada por espécies vegetais que contém terpenos e saponinas e alguns tipos de dermatites, causadas por espécies ricas em lactonas sesquiterpênicas e produtos naturais do tipo furanocumarinas. Componentes tóxicos ou antinutricionais, como o ácido oxálico, nitrato e ácido erúcico estão presentes em muitas plantas de consumo comercial. Diversas substâncias isoladas de vegetais considerados medicinais possuem atividades citotóxica ou genotóxica e mostram relação com a incidência de tumores (VEIGAJÚNIOR, PINTO e MARCIEL, 2005). 6.

(22) Comparada com a dos medicamentos usados nos tratamentos convencionais, a toxicidade de plantas medicinais e de fitoterápicos pode parecer trivial. Isto, entretanto, não é verdade, a toxicidade de plantas medicinais é um problema sério de saúde pública. Os efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxicidade, bem como as ações sinérgicas, ocorrem comumente. As pesquisas realizadas para a avaliação do uso seguro de plantas medicinais e fitoterápicos no Brasil ainda são incipientes, assim como o controle da comercialização pelos órgãos oficiais em feiras livres, mercados públicos ou lojas de produtos naturais (VEIGA-JÚNIOR, PINTO e MARCIEL, 2005).. 2.2. ANÁLISE TOXICOLÓGICA PRÉ-CLÍNICA. Testes toxicológicos são realizados para se obter dados sobre as condições em que as substâncias químicas produzem efeitos tóxicos, sobre a natureza desses efeitos e sobre os níveis seguros de exposição (LOOMIS e HAYES, 1996). Diversos fatores como tempo, espaço, custo e principalmente fatores éticos, limitam os estudos toxicológicos em seres humanos, tornado imprescindível o uso de modelos animais para a avaliação de possíveis efeitos da exposição a determinados agentes químicos, ou seja, estudos toxicológicos préclínicos (BOELSTERLI, 2003; HOUCK e KAVLOCK, 2008).. Assim, a avaliação. toxicológica pré-clínica tem como objetivo a realização de uma seqüência de estudos a fim de avaliar a segurança terapêutica da substância ou medicamento estudado para administrá-lo pela primeira vez em humanos (ANVISA, 2004). Estes estudos devem ser planejados de maneira a obter o máximo de informações utilizando-se o menor número possível de animais. Segundo a Environmental Protection Agency (Agencia de proteção ambiental dos Estados Unidos - US EPA) estudos toxicológicos pré-clínicos são classificados como (EPA, 1996): - estudos de curtos períodos, para avaliação de toxicidade aguda ou tolerância local; - estudos de longos períodos, para avaliação de toxicidade subcrônica e crônica; - estudos especiais, para avaliação de toxicidade reprodutiva, mutagenicidade ou carcinogenicidade. No Brasil, o estudo toxicológico pré-clínico de fitoterápicos é regido pela Resolução n° 90, de 16 de março de 2004 da Agência de Vigilância Sanitária (ANVISA), que preconiza que os métodos realizados para os estudos toxicológicos pré-clínicos de plantas medicinais incluam estudos de toxicidade aguda e de toxicidade de doses repetidas (toxicidade subcrônica e crônica), bem como estudos especiais de genotoxicidade. 7.

(23) 2.2.1. Toxicidade aguda. Estudos de toxicidade oral aguda são realizados para servir de base para posteriores ensaios de dose repetida e fornecer as primeiras sugestões para possíveis órgãos-alvo (UKELIS et al., 2008). A toxicidade aguda avalia efeitos tóxicos após a administração de um agente em dose única ou fracionada em 24 horas e também seus efeitos durante 14 dias após o tratamento. Nesse período devem ser avaliados sintomas como: alteração da locomoção, freqüência respiratória, piloereção, diarréia, sialorréia, alteração do tônus muscular, hipnose, convulsões, hiperexcitabilidade do sistema nervoso central, contorções abdominais, número de animais mortos com possível causa de morte e respectivos exames histopatológicos (ANVISA, 2004; OECD 423, 2001).. 2.2.2. Toxicidade subcrônica e crônica. Estudos toxicológicos subcrônicos e crônicos avaliam a toxicidade de um produto a partir da administração de doses repetidas, diárias, durante um período mínimo de 28 dias podendo alcançar 1 ano ou mais de duração (ANVISA, 2004; OECD 452, 2008). Os testes têm por objetivo determinar os níveis nos quais efeitos tóxicos são observados e identificar os órgãos mais afetados pela substância química, bem como o grau de comprometimento dos mesmos (FAUSTMAN et al., 1994). A via oral é a principal via de administração nesse tipo de estudo. Deve-se utilizar animais de ambos os sexos, adultos jovens, em número de 10 animais por sexo e por dose e no mínimo 3 doses devem ser testadas (ANVISA, 2004). Os parâmetros a serem observados diariamente, durante o período de tratamento são: modificações na atividade motora e comportamento, no consumo de água e ração, no peso dos animais, na cor e textura dos pêlos e na freqüência cardiorespiratória. Ao final do ensaio, os animais devem ter o sangue coletado para as dosagens bioquímicas e hematológicas e, após a eutanásia, exames morfológicos macro e microscópicos dos principais órgãos (BARNES e DOURSON, 1988; ANVISA, 2004).. 2.2.3. Toxicologia da reprodução. A toxicidade reprodutiva refere-se a algum tipo de interferência na capacidade reprodutiva de macho e/ou fêmeas, incluindo o desenvolvimento pré-natal, provocada por um 8.

(24) agente tóxico (NEWBERT e CHAHOUD, 1995). Testes de toxicologia reprodutiva são realizados para determinar os efeitos diretos do agente tóxico sobre o processo de reprodução de mamíferos. Estes testes fornecem informações referentes aos efeitos das substâncias testadas sobre a integridade e a performance do sistema reprodutivo de machos e fêmeas incluindo a função gonadal, ciclo estral, comportamento sexual, concepção, gestação, parto, lactação e desmame, bem como crescimento e desenvolvimento dos conceptos. Os testes também podem fornecer informações sobre os índices de morbidade e mortalidade além de avaliar a toxicidade produzida por agentes potencialmente tóxicos durante o período pré e pós-natal. Adicionalmente, estes testes podem determinar a toxicidade de substâncias sobre a 2ª geração da prole (OECD 421, 1995; EPA, 1996; OECD 414, 2001; OECD 416, 2001). Para os testes de toxicidade reprodutiva, convencionalmente utiliza-se ratos (Rattus norvergicus) e, freqüentemente, da linhagem Wistar. Os machos atingem a maturidade sexual entre 60 e 75 dias de vida e a linhagem espermática tem duração de 56 a 70 dias (ALMEIDA et al., 2000). Sua fertilidade máxima é por volta de 100 e 300 dias e a sua senescência reprodutiva se dá aos 360 dias de idade. Já nas fêmeas a maturidade sexual é atingida entre 60 e 75 dias de vida, a fertilidade máxima é atingida entre 90 e 120 dias e a sua senescência reprodutiva se dá aos 360 dias de idade. O ciclo estral é regular com ciclos de 4 a 5 dias. O estro dura de 0 a 20 horas, com ovulação espontânea. O período de gestação tem duração de 20 a 22 dias e tamanho da prole varia entre 5 e 15 filhotes (COBEA, 1996). Já está bem estabelecido o conceito de que a exposição de fêmeas a substâncias tóxicas durante a gestação ou lactação pode produzir morte, anomalias estruturais e alterações no crescimento ou deficiências funcionais nos conceptos. Entretanto, são poucas as evidências que atestam o aparecimento de efeitos tóxicos em conceptos, mediados pelo tratamento unicamente paternal (DAVIS et al., 1992; COLIE, 1993; SAVITZ SONNENFELD e OLSHAN, 1994; QUI, HALES e ROBAIRE, 1995). Efeitos deletérios decorrentes da exposição de machos a agentes tóxicos incluem perdas pré e pós-implantação, mudanças no crescimento e comportamento da prole e malformações fetais. Geralmente estes efeitos tóxicos decorrem de atividade genotóxica transmitidas por meio de alterações nos genes paternos (QUI, HALES e ROBAIRE, 1995). Entretanto, outros mecanismos podem estar relacionados a efeitos tóxicos paternalmente mediados, como a presença de agentes tóxicos no sêmen ou ligados aos espematozóides que penetram no trato genital feminino e alteram a fertilidade e o desenvolvimento dos fetos (EPA, 1996).. 9.

(25) Nos testes de toxicidade reprodutiva os principais parâmetros analisados são massa corporal, massa absoluta e relativa dos órgãos reprodutores masculinos (testículos, epidídimos, vesículas seminais, próstata e ductos deferentes), histopatologia dos órgãos reprodutores, avaliação espermática (número de esperma, qualidade, morfologia e motilidade) e níveis hormonais (hormônio luteinizante, hormônio folículo estimulante, testosterona, estrógeno, prolactina) (EPA, 1996).. 2.3. Cassia occidentalis L.. 2.3.1. Botânica. A espécie Cassia occidentalis também conhecida como Senna occidentalis, pertence à família Leguminosae, que compreende cerca de 13.000 espécies, distribuídas em mais de 600 gêneros e divididas em pelo menos três subfamílias: Mimosoideae, Caesalpinioideae e Faboideae (Papilionoideae). A subfamília Caesalpinioideae possui cerca de 150 gêneros, dos quais, o que apresenta maior número de espécies, é o gênero Cassia (CAMARGO, 1985; JOLY, 2002). Cassia occidentalis, conhecida popularmente como fedegoso ou manjerioba (Figura 1), é de grande ocorrência em regiões tropicais incluindo a região da Amazônia brasileira, sendo encontrada principalmente em terrenos abertos, taperas, subúrbios de povoações e margens de estradas (CORRÊA, 1984). É uma planta perene, subarbustiva, lenhosa, ramificada medindo de 1-2 metros de altura, com reprodução por sementes. As folhas são alternadas, compostas, com 4-6 folíolos de 6-7 cm de comprimento. As inflorescências são axilares e terminais, com flores de coloração amarelo-ouro. Os frutos são formados de vagens achatadas, mais ou menos retas, de coloração marrom, com 10-14 cm de comprimento. Floresce no período de setembro a outubro e frutifica no período de fevereiro a abril (LORENZI, 1991).. 10.

(26) a. b. c. d. Figura 1 – Cassia occidentalis L., (a) flor, (b) vagem (c e d) aspectos gerais. Fonte: Missouri Botanical Garden (www.biologie.uni-amburg).. 2.3.2. Fitoquímica Diferentes partes de Cassia occidentalis têm sido amplamente utilizadas na medicina tradicional de vários países, principalmente dos países em desenvolvimento. É uma planta relativamente bem estudada do ponto de vista químico. Espécies do gênero Cassia revelaram uma grande diversidade de substâncias inéditas e bioativas, com padrões moleculares variados. A literatura relata o isolamento de mais de 350 metabólitos secundários em espécies deste gênero. Estes estudos evidenciam a ocorrência de substâncias de várias classes, sendo as antraquinonas, flavonóides e outros compostos fenólicos os constituintes mais freqüentes na maioria das espécies (VIEGAS-JÚNIOR et al., 2006). 11.

(27) Vários constituintes de Cassia occidentalis já foram identificados em diversas partes da planta. Foram isolados das sementes de Cassia occidentalis ácidos cáprico, mirístico, palmítico, esteárico e oléico (TEWARI e GUPTA, 1953; MIRALLES e GAYDOU, 1986; DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002), triglicerídeos, ácidos monoenóico, dienóico e trienóico (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002), além do ácido graxo cet(Z)-7-oxo-11-octadecenóico (DAULATABAD, BHAT e JAMKHANDI, 1996). Também foram detectados derivados antraquinônicos (LAL e GUPTA, 1973 e 1974; RAI e SHOK, 1983) e o conteúdo de óleo, carotenóides e tocoferóis foi avaliado durante o desenvolvimento das sementes (DI STASI e HIRUMA-LIMA, 2002). Da raiz de Cassia occidentalis foram isolados pinselina, 1,7dihidroxi-3-metilxantona, 1,8- dihidroxiantraquinona (WADER e KUDAV, 1987), bis (tetrahidro) antraceno, occidentalo-1, occidentalol-2, crisofanol, emodina, pinselina, questina, germicrisona, metilgermitorosona e singueanol-1 (KITANAKA e TAKIDO, 1989). Das folhas de Cassia occidentalis foram isolados hidrocarbonetos (MAJUMDAR et al., 1987) e vários derivados antraquinônicos (TIWARI e SINGH, 1977; COSTA, 1986; CHAUHAN et al., 2001). A concentração de compostos fenólicos totais foi estimada em folhas e caules de Cassia occidentalis em diferentes estágios de desenvolvimento (AMBASTA et al., 1990). Recentemente, estudos com extrato metanólico de Cassia occidentalis (raiz, caule e folha), utilizando técnica de cromatografia em camada delgada, demonstraram a presença de flavonóide, triterpeno e antraquinona. Não foram identificados alcalóides e apenas uma pequena quantidade de saponina foi encontrada (ARAGÃO, 2008).. 2.3.3. Farmacologia. As plantas do gênero Cassia são largamente utilizadas na medicina tradicional em todo o mundo para uma ampla variedade de propósitos, sendo algumas espécies usadas, desde a antiguidade, como potente purgativo e laxativo, devido à presença na sua composição química de glicosídeos antraquinônicos (AKOMOLAFE et al., 2003). No Peru, as raízes da Cassia occidentalis são empregadas como diurético e sua decocção é usada para tratar a febre (SOUKUR, 1970). As sementes são fermentadas em uma bebida e usadas no tratamento da asma enquanto uma infusão da flor é usada no tratamento da bronquite. Os índios da Nicarágua usam a decocção de folhas frescas para dor geral, dor uterina menstrual e constipação intestinal (GUPTA et al., 1979). No Panamá, um chá de folhas é usado para cólicas estomacais e as folhas esmagadas são usadas para preparação de um cataplasma 12.

(28) empregado como antiinflamatório (NAGARAJU e RAO, 1990). Em vários países as folhas secas de fedegoso são esmagadas ou fermentadas em um chá e aplicadas externamente para o tratamento de doenças da pele, feridas, fungos, abscessos e como um analgésico e antiinflamatório (RAINTREE NUTRITION, 2006). A raiz, fortemente amarga, é usada como antídoto de vários venenos e como abortivo (CORRÊA, 1984). No Brasil, raízes, folhas e caule além de serem empregados como antipirético, laxante, diurético e colagogo, também são amplamente utilizados para o tratamento da tuberculose, gonorréia, dismenorréia, anemia, gripes, dores de barriga e de cabeça e também no tratamento de doenças hepáticas e do trato urinário (EMPERAIRE, 1982; GAVILANES et al., 1982; GRANDI et al., 1982; COIMBRA, 1994; CRUZ, 1995). Na região amazônica a infusão das folhas é usada no tratamento da malária (BARBOSA-FERREIRA et al., 2005). Baseado principalmente no largo uso popular, a Cassia occidentalis é comercializada por alguns laboratórios farmacêuticos (TROPILAB® INC, RAIN-TREE NUTRITION INC). No Brasil, o Laboratório Pernambucano Ltda. (LAPERLI) comercializa o extrato de caules e folhas de Cassia occidentalis indicado para o tratamento de influenza, febre, erisipela e como diurético; com o nome comercial de CASSIA VIRGÍNICA®. Entretanto, apesar de ser amplamente utilizada na medicina popular, muitos dos efeitos de Cassia occidentalis ainda não foram comprovados. Desde a década de 70, vários grupos de pesquisa em todo o mundo têm se dedicado ao estudo desta espécie. Por meio de ensaios in vitro as propriedades antibacteriana, antiviral, antifúngica, antiparasitária, antimalária e inseticida do fedegoso estão sendo pesquisadas (FENG et al., 1962; SAMA et al., 1976; CÁCERES et al., 1991; HUSSAIN e DEENI, 1991; SCHMEDA-HIRSCHMANN e ARIAS, 1992; GASQUET et al., 1993). Em estudos com animais de laboratório, algumas propriedades farmacológicas vêm sendo estudadas como as atividades: antiinflamatória, hepatoprotetora, antiulcerogênica, laxativa, relaxante muscular e hipotensiva (FENG et al., 1962; SADIQUE et al., 1987; ELUJOBA, AJULO e IWEIBO, 1989; SARAF et al., 1994; JAFRI et al., 1999; AJAGBONNA, MOJIMINIYI e SOFOLA, 2001; LIRA, SANTOS e SILVA, 2005). Recentemente, estudos realizados no Laboratório de Farmacologia e Toxicologia préClínica de Produtos Bioativos (UFPE), indicaram que o extrato seco de Cassia occidentalis possui atividades antiedematogênica, analgésica e antipirética com a vantagem de não apresentar propriedade irritante de mucosa gástrica, pelo contrário, possuir um efeito gastroprotetor (ARAGÃO, 2008). 13.

(29) 2.3.4. Toxicologia. Apesar do amplo uso desta espécie na medicina popular, poucos são os trabalhos disponíveis na literatura sobre seu potencial toxicológico. A maioria dos artigos toxicológicos utilizando Cassia occidentalis refere-se à toxicidade de suas sementes. Essa espécie foi assinalada como invasora de culturas de algodão, café, cana-de-açúcar, citros, áreas de pastagens, milho, soja e sorgo (BLANCO, 1978; COLVIN et al., 1986), sendo freqüente a observação de morte de animais de pastagem como vacas, cavalos, porcos e cabras intoxicados pelo consumo de Cassia occidentalis. (TASAKA et al., 2000). Estudos com roedores têm demonstrado que a ingestão de grandes quantidades de sementes produz sintomas como ataxia, apatia, diarréia, dispnéia, anorexia e morte com degeneração dos músculos esqueléticos e cardíacos (BARBOSA-FERREIRA et al., 2005). Em relação aos parâmetros hematológicos, estudos realizados com porcos alimentados com ração contendo sementes de Cassia occidentalis, demonstraram a existência de hemograma normal (COLVIN et al., 1986) e resultados negativos quanto à presença de mioglobina e/ou hemoglobina na urina (RODRIGUES, RIET-CORREA e MORES, 1993). Uma substância encontrada nas sementes de espécies do gênero Cassia e identificada como diantrona (derivada de glicosídeos antraquinônicos), tem sido relacionada aos efeitos tóxicos observados, característicos de miopatia mitocondrial (HARAGUCHI et al., 1996; BARBOSA-FERREIRA et al., 2005). Entretanto, Medoua e Mbofung (2003 e 2007) observaram que a bebida preparada com as sementes de Cassia occidentalis não apresenta nenhum risco de toxicidade para o consumo. Isso ocorre devido ao processo tradicionalmente usado pela população de torrar as sementes. Estudos realizados em camundongos com as raízes de Cassia occidentalis, demonstraram ausência de efeitos tóxicos com doses de até 500mg/kg por via intraperitoneal e 1000mg/kg por via oral (LIRA, SANTOS e SILVA, 2005). Além disso, estudos de toxicologia reprodutiva, realizados em nosso laboratório, com o extrato seco de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®), demonstraram ausência de efeitos tóxicos em parâmetros reprodutivos, porém constataram a presença de fetos mortos com as doses de 250 mg/kg (2.2%) e 500mg/kg (4.0%), sugerindo que mais estudos precisam ser realizados para esclarecer o preciso potencial toxicológico reprodutivo da espécie e que seu uso não deve ser recomendado para mulheres gestantes (ARAGÃO et al., 2009).. 14.

(30) Embora a toxicidade das sementes de Cassia occidentalis esteja bem determinada, o potencial toxicológico das demais partes da planta ainda não foi adequadamente avaliado, sendo necessários mais estudos para determinar a segurança de uso desta espécie.. 15.

(31) OBJETIVOS. 16.

(32) 3. OBJETIVOS. 3.1. Geral. Avaliar a toxicidade pré-clínica por via oral do extrato seco (caule e folhas) de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®) em ratos Wistar.. 3.2. Específicos •. Estimar toxicidade aguda, por via oral, do extrato seco de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®) em ratos Wistar;. •. Investigar o efeito da administração oral subcrônica do extrato seco de Cassia occidentalis. (CASSIA. VIRGÍNICA®) sobre. os. parâmetros. bioquímicos. e. hematológicos de ratos Wistar, machos e fêmeas; •. Averiguar o efeito do tratamento subcrônico do extrato seco de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®), por via oral, sobre a massa (absoluta e relativa), morfologia macroscópica externa e microscopia de órgãos e tecidos dos sistemas nervoso, digestivo e reprodutivo de ratos Wistar;. •. Avaliar o efeito da administração subcrônica do extrato seco de Cassia occidentalis (CASSIA VIRGÍNICA®) sobre a performance reprodutiva de ratos Wistar.. 17.

(33) ARTIGO I Artigo submetido ao Journal of Ethnopharmacology. 18.

(34) Acute and subacute toxicity of crude extract of Cassia occidentalis L. M. G. B. Silvaa, T. P. Aragãoa, C. F. B. Vasconcelosa, P. A. Ferreirab, B. A. Andradeb, I. M. A. Costab, A. G. Wanderleya,b, S. S. L. Lafayettea,b* a. Department of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pernambuco, Recife, 50740521, Brazil. b Department of Physiology and Pharmacology, Federal University of Pernambuco, Recife, 50760-901, Brazil.. *. Corresponding author. Simone Sette Lopes Lafayette, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP: 50670-901- Cidade Universitária, Recife, PE, Brasil – Tel: 55-81-2126-8530, fax: 5581-2126-8976. Email address: simonesette@terra.com.br Abstract Ethnopharmacological relevance: Cassia occidentalis L. (Leguminosae) has long been used as natural medicine in rainforests and other tropical regions for the treatment of inflammation, fever, liver disorders, constipation, worms, fungal infections, ulcers, respiratory infections, snakebite and as a potent abortifacient. Aim of the study: Cassia occidentalis dried extract was evaluated for its acute and subacute toxicity (30 days) by the oral route in male and female Wistar rats. Materials and methods: In the acute toxicity test, four groups of rats were orally treated with doses of 0.625, 1.25, 2.5 or 5.0 g/kg of body weight (n=5/group/sex) and general behavior, adverse effects and mortality were determined for up to 14 days. In the subacute test, animals received Cassia occidentalis by gavage at the doses of 0.10, 0.50 or 2.5 g/kg/day (n=10/group/sex), for 30 consecutive days and biochemical and hematological parameters were determined. Results: Cassia occidentalis did not produce any hazardous symptoms (e.g. salivation, piloerection, locomotory activity variation, behavior changes) or deaths in the acute toxicity test. The subacute treatment with Cassia occidentalis failed to change body weight gain, food and water consumption. The presence of wet faeces during the period of treatment was an indication of laxation. Hematological and biochemical analysis showed no significant differences in any of the parameters examined. In addition, the results revealed no differences between the control and treated group (2.5 g/kg/day) in terms of the macroscopical and microscopical aspect, in any of the organs examined. Conclusions: Acute and subacute administration of Cassia occidentalis did not produce toxic effects in male and female Wistar rats. Keywords: Cassia occidentalis L.; Leguminosae; acute toxicity; subacute toxicity. 19.

(35) 1. Introduction. Cassia occidentalis L. (Leguminosae), found in many tropical areas of South America including the Brazilian Amazon region, is widely used as a medicinal plant in several countries. Its popular name is Fedegoso or Manjerioba. In traditional medicine, various parts of this plant (roots, leaves and stems) have been widely used as a laxative, analgesic, febrifuge, diuretic, hepatoprotective, vermifuge and colagogo as well as for the treatment of tuberculosis, gonorrhea, dysmenorrhea, anemia, flu and liver and urinary tract diseases (Coimbra, 1994; Di Stasi and Hiruma-Lima, 2002). In Brazil, the Pharmaceutical Laboratory (LAPERLI) the extract of Cassia occidentalis stems and leaves has been marketed under the commercial name of Cassia Virgínica® for the treatment of flu, fever, erysipelas and as a diuretic. Toxicological studies have shown the potent toxic effects of Cassia occidentalis seeds. Cassia occidentalis is one of the most important toxic plants of veterinary interest as regards contamination of animal rations (Tasaka et al., 2000). Signs of Cassia occidentalis poisoning in general include, independently of animal species, ataxia, muscle weakness, stubbing, and body weight loss, eventually leading to death. Skeletal muscle degeneration is the predominant lesion found in the majority of animals intoxicated with Cassia occidentalis (O'Hara et al., 1969; Calore et al., 1997; Haraguchi et al., 2003). The mechanism of Cassia occidentalis toxicity has been described as being due to impairment of mitochondrial function (O'Hara and Pierce, 1974; Calore et al., 1997), including swelling, loss of mitochondrial matrix, fragmented mitochondrial cristae and glycogen depletion. Haraguchi and collaborators (1996) identified dianthrone, an antharquinone-derived compound, in Cassia occidentalis seeds and proved that this substance could cause the characteristic mitochondrial myopathy produced by this plant. Although well characterized the toxic effects of the seeds of Cassia occidentalis, the toxicity of other parts of the plant is not well determined. Recently studies in our laboratory demonstrated that the treatment during pregnancy with Cassia occidentalis dried extract of stems and leaves did not produce any significant changes in the reproductive parameters, except due to the presence of dead fetuses, observed with doses of 250 and 500 mg/kg/day (Aragão et al., 2009). Therefore, the aim of the present study was to assess the toxicity of a dried extract of Cassia occidentalis stems and leaves in rodents. 20.

(36) 2. Materials and methods. 2.1. Plant material. The plant samples for identification were collected (June, 2007) in the town of Limoeiro, in the state of Pernambuco, Brazil. A voucher specimen authenticated by the Department of Botany of the Federal University of Pernambuco (UFPE), was deposited at Geraldo Mariz Herbarium, with the recorded number of 45936.. 2.2. Extraction. The hydroalcoholic extract of stems and leaves of Cassia occidentalis used in the present study was supplied by LAPERLI (Pharmaceutical Laboratory) – Pernambuco, Brazil (lot number 003/2007). Extraction was performed by macerating air-dried, powdered Cassia occidentalis (700g) with 70% ethanol (15 L) at room temperature for 7 days, and was occasionally shaken. In the laboratory, the crude ethanolic extract was filtered and concentrated under reduced pressure and lyophilized by Tecnape (Technology in dehydration Ltda - Ribeirão Preto, Brazil) to yield 119 g from 700g of stems and leaves, which was stored at 4o C, and, at the time of use, was resuspended in distilled water.. 2.3. Chromatographic analysis. The methods of Harborne (1984) and Wagner and Bladt (1996) were used to screen the Cassia occidentalis extract for the chemical constituents (flavonoids, saponins, alkaloids, triterpenoids, iridoids and anthraquinone). The phytochemical profile was performed by thinlayer chromatography (TLC) in silica gel plates (Merck® art. 105553, UV 250-366nm) using the appropriate mobile phase, reagents and standards (Aragão, 2008).. 2.4. Animals. Adult male and female Wistar rats (Rattus norvegicus var. albinus), aged 2 and 3 months, weighing 250-320g and 120-180g, respectively, were obtained from the Department 21.

(37) of Physiology and Pharmacology at the Federal University of Pernambuco (UFPE), Brazil. The animals were maintained in standard environmental conditions (22-24º C; 12:12 h dark/light cycle). Water and industrialized dry food (Labina®, Purina, Brazil) were available ad libitum. The experimental protocol was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Biological Science Center of UFPE (Process n° 23076.006893/2008-84), in accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. 2.5. Acute toxicity. Healthy albino rats, regardless of sex, fasted overnight, but with access to water ad libitum, and were randomly divided into five groups (n=5/sex). The first group (control group) received distilled water orally. Groups 2-5 were orally treated with Cassia occidentalis with doses of 0.625, 1.25, 2.5 or 5.0 g/kg of body weight. Animals were observed for general behavioral and body weight changes, hazardous symptoms and mortality for a period of 14 days after treatment.. 2.6. Subacute toxicity. The method was performed according to the Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD) Test Guidelines 452: Chronic Toxicity Studies, with slight modifications (OECD, 2008). Healthy male and female rats were randomly divided into four groups by sex (n=10/group). Animals received water vehicle orally (control group) or Cassia occidentalis with doses of 0.10, 0.50 or 2.5 g/kg/day for 30 consecutive days. Body weight was recorded weekly and food consumption and water intake were monitored daily. Animals were observed for signs of abnormalities during the treatment period. At the end of the treatment, animals were fasted overnight, but allowed access to water ad libitum. They were then anesthetized with Nembutal® (0.035 g/kg, i.p.), and blood samples were obtained by retro-orbital puncture (Waynforth, 1980), using capillary tubes for hematological and biochemical studies, with and without anticoagulant ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), respectively.. 22.

(38) 2.7. Hematological and biochemical analysis. Hematological analysis was performed using an automatic hematological analyzer (Coulter STKS, Beckman). Parameters included: red blood cell (RBC) count, white blood cell (WBC) count, hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct), mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), red cell distribution width (RDW), platelets count and mean platelet volume (MPV). The differential leukocyte count was performed with an optical microscopy after staining and, in each case, 100 cells were counted. For biochemical analysis, blood was centrifuged at 1500 g for 10 min to obtain serum, which was stored at -20°C the following parameters were determined: glucose; blood urea nitrogen (BUN); creatinine; aspartate aminotransferase (AST); alanine aminotransferase (ALT); total cholesterol; triglycerides; alkaline phosphatase (ALP); total protein; albumin; total and direct bilirubin; chloride; potassium and sodium. Dosages were made using Architect (Abott®) automation with Boehringer Ingelheim® biochemical kits (Silva et al., 2007; Costa-Silva et al., 2008).. 2.8. Morphological study. Mascroscopic and microscopic features of the organs of male and female rats were compared in the control and 2.5 g/kg treated groups. After the animals were euthanized with an excess of Nembutal® (0.140 g/kg, i.p.), necropsy was performed (n=5/group/sex) to analyze the macroscopic external features of the heart, liver, spleen, lungs, kidney, adrenal gland, esophagus, stomach, small intestine (fragment of 6-7 cm), hypophysis, hypothalamus, brain and reproductive organs (uterus and ovary or testicle, prostate, epididymis, seminal vesicle and vas deferens). These organs were carefully removed and weighed individually. Organ weights were expressed in absolute and relative terms (g and g/100g of body weight, respectively). Histological examination was performed in five animals per group/sex. Animals were anesthetized with Nembutal® (0.035 g/kg, i.p.), perfused with saline solution (for removal of blood) followed by buffered formalin solution (10%) for 10 minutes and the same organs were removed and fixed in Bouin solution for 48 h at room temperature. Tissue slices were processed according to the method described by Lison (1960) and stained with hematoxylin/eosin.. 23.

(39) 2.9. Statistical analysis. Values are expressed as mean value ± standard error of mean (SEM). Variance in data for body weights, food and water consumption, hematology, serum biochemistry and organ weights (both absolute and relative weights) was checked for homogeneity by Bartlett’s procedure. If the variance was homogeneous, the data were assessed by a one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Tukey test. If not, the Kruskal-Wallis test was applied and when statistically significant differences were indicated, the Dunn test was employed for comparison between the control and treatment groups. A probability level of less than 5% (p < 0.05) was considered significant. Statistical analyses were performed with the aid of the computer program software GraphPad Prism 5®.. 3. Results. 3.1. Chromatographic analysis. The results obtained by TLC demonstrated the presence of flavonoids, anthraquinones, triterpenes, small amount of saponins and the absence of detectable concentrations of iridoids and alkaloids.. 3.2. Acute toxicity. No deaths or hazardous signs were recorded in rats during 14 days of observation with Cassia occidentalis acute treatment via oral route at doses up to 5.0 g/kg.. 3.3. Subacute toxicity. No toxicity signs (such as piloerection, alteration in the locomotor activity or food and water consumption) or deaths were recorded during the 30 consecutive days of treatment via oral route with Cassia occidentalis at doses of 0.10, 0.50 or 2.5 g/kg. A similar absence of significant difference was found between the initial and final body weight of the rats treated with Cassia occidentalis and control rats (Figures 1 and 2). However, the rats suffered mild. 24.

(40) diarrhea with all the applied doses. The presence of wet faeces during the period of treatment was an indication of laxation.. 3.4. Hematological and biochemical parameters. The hematological and biochemical profiles of the treated and control groups are presented in Tables 1 to 4. There were no statistically significant differences in all of the parameters analyzed and all values remained within the reference range.. 3.5. Morphological parameters. The absolute and relative tissue weights were not altered by Cassia occidentalis treatment (Tables 5 and 6). The macroscopic analysis of the target organs of the treated animals did not show significant changes in color and texture when compared with the control group. In addition, the microscopical analysis did not suggest histological alterations in any of the organs examined (data not presented).. 4. Discussion. Medicinal plants and their derivates have been used as an alternative to allopathic medicines in many countries. Despite the widespread use, few scientific studies have been undertaken to ascertain the safety and efficacy of traditional remedies (Graça et al., 2007). Cassia occidentalis, found in many tropical areas around the world, has been used as a medicinal plant for hundreds of years (Di Stasi and Hiruma-Lima, 2002). In Brazil, the species is cultivated and commercialized with anti-inflammatory, laxative, analgesic, febrifuge and diuretic. Considering the large medicinal use of Cassia occidentalis worldwide, our laboratory has been systematically evaluating the toxicity of its extract. Therefore, this study was designed to evaluate the acute and subacute toxicity of Cassia occidentalis by oral route in Wistar rats. Cassia occidentalis is commonly used as a decoction of the root or bark and/or leaf infusion. The dosage is reported to be one cup of leaf infusion daily (10 g in 200 ml) as a purgative; one cup of root decoction once or twice daily (4 g in 200 ml) as a febrifuge and diuretic or vermifuge (3 g in 300ml). These doses vary between 38 and 125 mg/kg/day if we 25.

(41) consider an adult male weighing 80 kg (Balbach, 1986). In the case of the herbal product Cassia Virgínica®, the recommended dosage for flu and fever is 25 mg/kg/day. In this study, we have used doses 4 times (0.10 g/kg), 20 times (0.50 g/kg) and 100 times (2.5 g/kg) higher than the therapeutic doses. Despite toxicological studies have shown the potent toxic effects of Cassia occidentalis seeds, in this study, Cassia occidentalis via oral route with the doses up to 5.0 g/kg did not produce any sign of toxicity or death in rats, suggesting a LD50 above 5.0 g/kg via oral route. According to Kennedy and collaborators (1986), substances that present LD50 higher than 5.0 g/kg via oral route may be considered practically non-toxic. Therefore, it may be suggested that acute toxicity of the Cassia occidentalis is practically null via oral route. Lira and collaborators (2005), using roots of Cassia occidentalis, showed no toxic effects in mice at doses up to 500 mg/kg by intraperitoneal route and 1000 mg/kg orally. In previous studies, it was demonstrated that the oral treatment of pregnant rats with Cassia occidentalis at doses from 250 to 500 mg/kg did not change the body weight gain, the food and water intake or the locomotor activity and no occurrences of piloerection or death were registered. The lack of effects on treated pregnant rats suggests that the Cassia occidentalis did not induce systemic toxicity at the doses tested. Likewise, the treatment with Cassia occidentalis during pregnancy did not produce any significant changes in the reproductive parameters, except due to the presence of dead fetuses, observed with doses of 250 and 500 mg/kg, respectively 2.2 and 4.0% of dead fetuses (Aragão et al., 2009). Daily oral administration of Cassia occidentalis in male and female rats for 30 days at doses of 0.10, 0.50 e 2.5 g/kg/day failed to produce signs of toxicity, as showed by the lack of changes in the body weight gain. Diarrhea was observed in rats during all periods of treatment with Cassia occidentalis. This result is in agreement with data from the literature that describes the laxative effects of the Cassia species (Elujoba et al., 1999). Anthraquinone derivates have been identified as the chemical constituents of the Cassia species responsible for laxative and purgative activities (Akomolafe et al., 2003). The most well known species of Cassia used as a purgative and strong laxative is Cassia acutifolia (Senna). Cassia occidentalis contains small amounts of anthraquinone and, in a rat study, has demonstrated only a mild laxative effect (Elujoba et al., 1989), as in the present study. In present study, all hematological and biochemical parameters remained under the reference range for the species (Harkness and Wagner, 1993) and no statistical significant 26.

(42) change was observed. The analysis of blood parameters is relevant for risk evaluation, as any changes in the hematological and biochemical systems have a higher predictive value for human toxicity, when data are translated from animal studies (Olson et al., 2000). Since there was no effect on the levels of transaminases (ALT, AST) and creatinine, which are good indicators of liver and kidney functions, respectively, it is reasonable to deduce that the Cassia occidentalis extract did not induce any damage to the liver and the kidneys. This is further confirmed by the histological assessment of these organs, and the fact that there was no effect on plasma cholesterol levels, the latter being an indirect indicator of liver function (Hilaly et al., 2004). Mascroscopic and microscopic examination of organs recovered from animals treated with the highest dose and control animals, showed normal architecture (data not presented), suggesting no detrimental changes and morphological disturbances were caused by the daily oral administration of the Cassia occidentalis for 30 days. Since the oral dose of 2.5 g/kg/day of Cassia occidentalis administered for 30 consecutives days did not induce any biochemical, hematological, anatomical and histopathological signs of toxicity, it can be defined as the no-observed-adverse-effect level (NOAEL) for Wistar rats of both sexes under the experimental conditions used. However, it should be emphasized that this NOAEL was derived from acute and subacute study only. For a more reliable safety evaluation performed on the basis of the acceptable daily intake concept, data on the chronic toxicity, genotoxicity and carcinogenicity of Cassia occidentalis would also be required. Taken together, the data suggest that the oral administration of Cassia occidentalis dried extract did not induce any toxic effects, which could stand as an assurance for the medicinal use of this plant in folk medicine.. Acknowledgements The authors thank Rejane de Souza Silva for excellent technical assistance and CAPES and CNPq for financial support. To Laboratory Pernambucano Ltda (LAPERLI) for providing the dried extract of Cassia occidentalis L.. 27.

(43) References. Akomolafe, R.O., Adeoshun, I.O., Elujoba, A.A., Iwalewa, E.O., Ayoka, A.O., 2003. Effects of Cassia sieberiena leaf extracts on the intestinal motility of rat. African Journal of Biomedical Research 6, 141-145. Aragão, T.P., 2008. Cassia Virgínica® (Cassia Occidentalis L.): Abordagem Farmacológica e Toxicológica. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, p. 90.. Aragão, T.P., Lyra, M.M.A., Silva, M.G.B., Andrade, B.A., Ferreira, P.A., Ortega, L.F., da Silva, S.D., da Silva, J.C.P., Fraga, M.C.C.A., Wanderley, A.G., Lafayette, S.S.L., 2009. Toxicological reproductive study of Cassia occidentalis L. in female Wistar rats. Journal of Ethnopharmacology 123, 163-166.. Balbach, A., 1986. Flora nacional na medicina doméstica. Editora A edificação do lar, São Paulo, pp.170-171.. Calore, E.E., Cavaliere, M.J., Haraguchi, M., Górniak, S.L., Dagli, M.L.Z., Raspantini, P.C.F., Calore, N.M.P., 1997. Experimental mitochondrial myopathy induced by chronic intoxication by Senna occidentalis seeds. Journal of Neurological Sciences 146, 1-6.. Coimbra, R., 1994. Manual de Fitoterapia. Editora CEJUP, Belém, p.26.. Costa-Silva, J.H., Lima, C.R., Silva, J.R., Araújo, A.V., Fraga, M.C.C.A., Ribeiro, A. R., Arruda, A.C., Lafayette, S.S.L., Wanderley, A.G., 2008. Acute and subacute toxicity of the Carapa guianensis Aublet (Meliaceae) seed oil. Journal of Ethnopharmacology 116, 495–500.. Di Stasi, L.C., Hiruma-Lima, C.A., 2002. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. Editora UNESP, São Paulo, p. 604.. 28.

(44) Elujoba, A.A., Ajulo, O.O., Iweibo, G.O., 1989. Chemical and biological analyses of Nigerian Cassia species for laxative activity. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 7, 1453-1457.. Elujoba, A.A., Abere, A.T., Adelusi, S.A., 1999. Laxative activities of Cassia pods source from Nigeria. Nigerian Journal of Natural Products and Medicine 3, 51-53.. Graça, C., Freitas, C.S., Baggio, C.H., Dalsenter, P.R., Marques, M.C., 2007. Mikania laevigata syrup does not induce side effects on reproductive system of male Wistar rats. Journal of Ethnopharmacology 72, 215-219.. Haraguchi, M., Górniak, S.L., Dagli, M.L.Z., Raspantini, P.C.F., 1996. Determinação dos constituintes químicos das frações tóxicas de fedegoso (Senna occidentalis L.). Anais da Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Poços de Caldas 19.. Haraguchi, M., Dagli, M.L.Z., Raspantini, P.C.F., Górniak, S.L., 2003. The effects of low doses of Senna occidentalis seeds on broiler chickens. Veterinary Research Communications 27, 321–328.. Harbone, J.B. 1984. Phytochemical methods. 2ª edition. London: Chapman & Hall.. Harkness, S.E., Wagner, J.E., 1993. Biologia e clínica de coelhos roedores. Livraria Roca, São Paulo, Brasil, pp. 48-55.. Hilaly, J.E., Israili, Z.H., Lyoussi, B., 2004. Acute and chronic toxicological studies of Ajuga iva in experimental animals. Journal of Ethnopharmacology 91, 43-50.. Kennedy, G.L., Ferenz, R.L., Burgess, B.A., 1986. Estimation of acute oral toxicity in rats by determination of the approximate lethal dose rather than the LD50. Journal of Applied Toxicology 6, 145-148.. Lira, E.C., Santos, V.L., Silva, J.A., 2005. Avaliação da atividade antiulcerogênica do extrato bruto da raiz Cassia occidentalis L. (Mangerioba). Revista Brasileira de Farmácia 86, 5329.

(45) 56.. Lison, L., 1960. Histochimie et Cytochimie Animales. Gauthiers-Villars, Paris, pp. 842.. O'Hara, P.J., Pierce, K.R., Read, W.K., 1969. Degenerative myopathy associated with the ingestion of Cassia occidentalis L. Clinical and pathologic features of the experimental disease. American Journal of Veterinary Research 30, 2173-2180.. O'Hara, P.J. and Pierce, K.R., 1974. A toxic cardiomyopathy caused by Cassia occidentalis. I. Morphological studies in poisoned rabbits.Veterinary Pathology 11, 97-109.. Olson, H., Betton, G., Robinson, D., Thomas, K., Monro, A., Kolaja, G., Lilly, P., Sanders, J., Sipes, G., Bracken, W., Dorato, M., Deun, K.V., Smith, P., Berger, B., Heller, A., 2000. Concordance of toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology 32, 56–67.. Organisation for Economic Cooperation and Development (OECD), 2008. Draft OECD guideline for the testing of chemicals - Test Guidelines 452: Chronic Toxicity Studies, v.8.. Silva, E.J.R., Gonçalves, E.S., Aguiar, F.J.S., Evencio, L.B., Lyra, M.M.A., Coelho, M.C.O.C., Fraga, M.C.C.A., Wanderley, A.G., 2007. Toxicological studies on hydroalcohol extract of Calendula officinalis L. Phytotherapy Research 21, 332–336.. Tasaka, A.C., Weg, R., Calore, E.E., Sinhorini, I.L., Dagli, M.L Z., Haraguchi, M., Gorniak, S.L., 2000. Toxicity testing of Senna occidentalis seed in rabbits. Veterinary Research Communications 24, 573-582. Wagner, H.; Bladt, S. 1996. Plant drug analysis. 2a ed. New York, Springer.. Waynforth, B.H., 1980. Injection Techniques: Experimental and Surgical Techniques in the Rat. Academic Press, London, pp. 3-61. 30.

(46) Body weigth gain (g). 70. CONTROL. 60. CO 0.10 g/kg. 50. CO 0.50 g/kg. 40. CO 2.5 g/kg. 30 20 10 0 0. 10. 20. 30. Day Figure 1: Body weight gain curves of male rats treated orally with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route for 30 consecutive days. The values are. Body weigth gain (g). expressed as mean ± S.E.M. (n=10 animals/group).. 60. CONTROL. 50. CO 0.10 g/kg. 40. CO 0.50 g/kg. 30. CO 2.5 g/kg. 20 10 0 0. 10. 20. 30. Day Figure 2: Body weight gain curves of female rats treated orally with the Cassia occidentalis extract (CO - 0.10, 0.50 and 2.5 g/kg) by oral route for 30 consecutive days. The values are expressed as mean ± S.E.M. (n=10 animals/group).. 31.