Engenharia Química
Dissertação de Mestrado
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas
Nanoemulsionados
Willyan Araújo da Costa
Natal – RN 2020
Willyan Araújo da Costa
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas
Nanoemulsionados
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo
Silvino dos Santos (PPGEQ – UFRN) e
coorientação do Prof. Dr. Márcio Ferrari
(PPGCF – UFRN).
Natal – RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Costa, Willyan Araújo da.
Uso de solventes eutéticos profundos na recuperação de bioativos obtidos a partir de rhodotorula mucilaginosa e aplicação em sistemas nanoemulsionados / Willyan Araújo da Costa. - 2020.
126f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Natal, 2020.
Orientador: Dr. Everaldo Silvino dos Santos. Coorientador: Dr. Márcio Ferrari.
1. Fracionamento - Dissertação. 2. Bioativos - Dissertação. 3. Rhodotorula mucilaginosa - Dissertação. 4. Solventes Eutéticos Profundos - Dissertação. 5. Nanoemulsão - Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Ferrari, Márcio. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 66.07
Eu gostaria de iniciar meus agradecimentos por Deus e o Mestre Jesus, sem os quais eu não teria forças para seguir em frente e caminhar por onde caminhei. A Eles, meu terno agradecimento SEMPRE!
Agradeço aos amigos espirituais que sempre me acompanham, orientam e guiam. Em ambos os planos o amor prevalece e de vocês eu sinto conforto e paz!
Também gostaria de agradecer à minha família por todo apoio, compreensão e ajuda nos momentos de desgaste físico e mental. Muito obrigado a papai (Robson Costa), mamãe (Ângela Costa), Wendel Costa, Jessicka Batista e Lídia Oliveira por todo amor de sempre. Amo vocês DEMAIS!
Não poderia deixar de registrar meu agradecimento aos novos amigos que a cidade de Natal me deu, em especial a: Mizael, Lívio, Franklin e Lucas, por nunca terem me deixado sentir sozinho nessa nova jornada. Muito obrigado MESMO e espero levar vocês no meu coração sempre!
Gostaria de Agradecer também a Carlos Henrique e Valdênio por terem compartilhado da moradia comigo durante meu primeiro ano em Natal. Foi a época de adaptação, a mais difícil. Sem vocês, eu não teria conseguido. Obrigado!
Os agradecimentos precisam ser estendidos a toda FAMÍLIA LEB, mas alguns nomes precisam ser destacados... Sendo eles: Prof. Dr. Everaldo Silvino, por toda orientação, humildade e acolhimento, Sinara, Julia, Vitor, Ana Laura, Waleska, Catherine, Carlos, Cleitiane, Stephanie e Bia por toda amizade e apoio!
Também é necessário registrar agradecimento aos membros do PPGEQ-UFRN, em especial para o Prof. Dr. Eduardo por sempre acolher muito bem os alunos que vêm de outra cidade, a Gustavo por ser zeloso em seu trabalho de manutenção da limpeza do LEB e a todos os demais servidores.
Ainda com respeito aos novos amigos encontrados na UFRN, gostaria de registrar meu afeto por Thaíse, Bia, Marina, Wilza e João por serem tão maravilhosos e por terem me divertido MUITO durante todo esse mestrado!
Também se faz necessário registrar meus agradecimentos aos laboratórios parceiros que colaboraram comigo durante a construção desse trabalho, sendo eles: NUPEG, LTT e NUPPRAR, sem vocês eu não teria conseguido fazer MUITA coisa... Essa é a lição de que a cooperação e a união fazem a força!
Agradeço à Família LaBio, da qual sou originário e sem a qual eu não seria/saberia 1/3 do que sou/sei hoje... Amo vocês MUIIIITO!
No mais, OBRIGADO À VIDA E AO UNIVERSO... Que venham as próximas etapas dessa jornada!
Nanoemulsionados. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Linha de Pesquisa: Processos Químicos, Catalíticos e Biotecnológicos, Nata/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Coorientador: Prof. Dr. Márcio Ferrari
Resumo: A presente dissertação teve como objetivo a obtenção de bioativos lipídicos por
meio de um bioprocesso utilizando-se Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 como catalisador e melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono, a recuperação das mesmas por meio de um processo verde utilizando solventes eutéticos profundos e a obtenção de um sistema nanoemulsionado para aplicação cosmética. Os resultados da primeira etapa mostraram que o uso de melaço (CM) na produção simultânea dos ativos pela levedura foi capaz de promover a obtenção de rendimentos em lipídeos totais e carotenoides totais (16,50 % ± 0,68% e 0,053 ± 0,001 mg.g-1, respectivamente) semelhantes ao obtido com o cultivo em meio sintético (S) (15,36 ± 1,36 % e 0,051 ± 0,001 mg.g-1). Com respeito à produção de ácidos graxos, o cultivo CM mostrou-se ser também se destacou uma vez que o mesmo apresentou uma composição rica em ácido oleico (74,05%). Com respeito à suplementação com extrato de levedura (CMEL), verificou-se que a mesma não foi capaz de melhorar os rendimentos em relação às outras condições. Na segunda parte da pesquisa, verificou-se que o uso de solventes eutéticos profundos à base de cloreto de colina foi capaz de promover o aumento da permeabilidade das células da levedura e uma correlata recuperação fracionada dos carotenoides. A maior recuperação de carotenoides totais (0,110 ± 0,005 mg.mL-1) se deu com o usos do solvente sintetizado com cloreto de colina e glicerol (ChGy). A análise do perfil de ácidos graxos dos óleos obtidos após cada um dos tratamentos revelou que não houve variação qualitativa nos óleos obtidos. A análise termogravimética da biomassa microbiana, antes e após os tratamentos realizados, revelou que a depender da espécie química utilizada na síntese do solvente, o mecanismo de interação do mesmo para com a parede celular muda completamente. Um planejamento experimental (2³) revelou a influência direta que a temperatura de processo, a adição de etanol no solvente e o tempo de processo exercem sobre toda operação de recuperação. Na última etapa desta pesquisa, constatou-se a forte atividade antioxidante do extrato obtido, a qual foi atribuída não só a presença de carotenoides (0,10 ± 0,02 mg.g-1) mas também dos diferentes açúcares redutores presentes em sua composição,
Após a determinação do valor de concentração de meia inibição (IC50) para a atividade
antioxidante do extrato (10,84 mg.mL-1), o mesmo foi adicionado a 2,5% em uma fase oleosa composta por triglicerídeos de ácido cáprico e caprílico e conservante. A fase foi então emulsionada com água destilada (fase aquosa) e Tween 20 (tensoativo), verificando-se então a formação de dois sistemas de escalas nanométricas, F1 (42,90 ± 8,17 nm) e F2 (118,85 ± 1,44 nm). Ambos sistemas obtidos foram caracterizados quanto ao seu pH, potencial zeta e índice de polidispersividade (PDI). Após os ensaios de estabilidade, constatou-se que os sistemas se apresentaram estáveis em relação ao ensaio de centrifugação e estáveis com relação ao comportamento cinético de acordo com as condições térmicas impostas, após 30 dias de estocagem. A análise reológica também foi realizada constatando-se que o comportamento dos mesmos variou de newtoniano (F1) para não-newtoniano (F2) em função da composição da fase oleosa no sistema final. Por fim, os resultados obtidos mostram a possibilidade de atrelar à produção de bioativos lipídicos por biocatálise à uma recuperação fracionada e possível aplicação na área dos cosméticos.
Palavras-chave: Fracionamento, Bioativos, Rhodotorula mucilaginosa, Solventes Eutéticos
Uso de Solventes Eutéticos Profundos na Recuperação de Bioativos Obtidos
A Partir de Rhodotorula mucilaginosa e Aplicação em Sistemas
Nanoemulsionados
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Química sob a orientação do Prof. Dr. Everaldo
Silvino dos Santos (PPGEQ – UFRN) e
coorientação do Prof. Dr. Márcio Ferrari
(PPGCF – UFRN).
Aprovado (a) em 19 de fevereiro de 2020. Banca Examinadora:
obtained from Rhodotorula mucilaginosa and Application in Nanoemulsified systems. Dissertação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Linha de Pesquisa: Processos Químicos, Catalíticos e Biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.
Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Coorientador: Prof. Dr. Márcio Ferrari
Abstract: The present study aimed to obtain lipo-molecules by a bioprocess using
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 cells as catalyst and sugarcane molasses as carbon
source, evaluated a green extraction process of them using Deep Eutectic Solvents and lastly to obtain nanoemulsioned systems containing these biosubstances in view of a future application in the cosmetic industry. The results obtained in the first part of this work showed that the use of molasse (CM) in the bioactive simultaneous production by the yeast was able to produce the same content of total lipids and total carotenoids (16.50 % ± 0.68% e 0.053 ± 0.001 mg.g-1) as a synthetic medium (CS) (15.36 ± 1.36 % e 0.051 ± 0.001 mg.g-1). With
regards to the fatty acids production, the CM cultivation showed the most interesting profile once it present a great content of oleic acid (74,05%). The yeast extract supplementation (CMEL) did not provide an improvement in microbial oil-production once it redirected the yeast metabolism to others actives instead of secondary metabolites obtainment. In the second part of this research, the use of four choline chloride based Deep Eutectic Solvents was verified in relation to their ability in to improve the yeast cell permeability and total carotenoids recuperation. The best result for the total carotenoid recovery (0.110 ± 0.005 mg.mL-1) was achieved using the solvent synthetized with glycerol (ChGy). The results of the fatty acids analysis showed that DES treatments did not influence in the oil composition. The thermogravimetric analysis of the yeast cells, before and after the treatments, revealed that the solvent interaction with the cells were conditioned to the chemical specie used in DES synthesis. An experimental design (2³) evidenced the process dependence in relation to the temperature, etanol addition in the solvent and extraction time. In the last part of this research, it was found a strong antioxidant activity for the eutectic extract obtained from the
Rhodotorula cells and it was conclude that this characteristic was not only due the carotenoid
presence (0.10 ± 0.02 mg.g-1) but also because of the content of reducing sugars, such as: xylose (2.19 ± 0.02 mg.g-1), glucose (1.03 ± 0.00 mg.g-1) and arabinose (0.36 ± 0.00 mg. g-1). After the determination of the inhibitory concentration for oxidative species (IC50) (10.84
nm) and F2 (118.85 ± 1.44 nm). Both systems were characterized in relation to their pH, zeta potential and polydispersity index (PDI). After the stability tests, the systems showed to be stable in relation to the centrifugal action and variant in kinetic terms according to the storage temperature (30 days). The rheology of the nanoemulsions was also investigated and it revealed that the behavior in ration to a shear stress was conditioned to the oil content, which varied from Newtonian (F1) to non-Newtonian (F2) as a function of the oil phase content. At leats, the results present here were able to show that the bioproduction of oleaginous compounds can be attached to a fractional recovery and cosmetical application.
Key-Words: Fractionation, Bioactive, Rhodotorula mucilaginosa, Deep Eutectic Solvents,
“E quanto mais dor recebo, mais percebo que sou indestrutível...” (VITTAR, 2018).
1.Introdução ... 23
2. Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e Carotenoides por Rhodotorula mucilginosa CCT3892 Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar como Fonte de Carbono ... 27
2.1. Revisão Bibliográfica ... 27
2.1.1. Óleos-lipídeos e carotenoides: características bioquímicas, aplicações e obtenção por via biotecnológica ... 27
2.1.1.1. Lipídeos: aspectos bioquímicos e funcionais ... 27
2.1.1.2. Carotenoides: aspectos bioquímicos, funcionais e aplicações em cosméticos ... 30
2.1.1.3. Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por leveduras do gênero Rhodotorula como uma alternativa viável à indústria de bioativos ... 34
2.2. Objetivos ... 37
2.2.1. Objetivos gerais ... 37
2.2.2. Objetivos específicos ... 37
2.3. Materiais e métodos ... 38
2.3.1.Obtenção do melaço de cana-de-açúcar ... 38
2.3.2. Microrganismo e manutenção ... 39
2.3.3. Inóculo ... 39
2.3.4.Bioprodução dos ativos lipídicos ... 40
2.3.5.Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar ... 40
2.3.5.1 Determinação do teor de sólidos solúveis totais - ºBrix ... 40
2.3.5.2.Potencial hidrogeniônico (pH) ... 41
2.3.5.3.Proteínas totais ... 41
2.3.5.4.Açúcares Redutores ... 41
2.3.5.4. Quantificação dos açúcares redutores por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 41
2.3.6.Concentração celular (X) ... 41
2.3.9. Determinação do perfil de ácidos graxos ... 42
2.3.10. Obtenção dos parâmetros da cinética de crescimento e dos coeficientes estequiométricos de conversão ... 43
2.3.10.1. Produtividade celular (Px)... 43
2.3.10.2. Velocidade específica máxima de crescimento (µmáx) ... 43
2.3.10.3.Tempo de geração (Tg) ... 43
2.3.11. Análise Estatística ... 44
2.4. Resultados e Discussões ... 44
2.4.1. Caraterização do melaço de cana-de-açúcar... 44
2.4.2.Crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 no melaço de cana-de-açúcar ... 45
2.4.3. Avaliação da produção de ácidos graxos, óleos-lipídeos e carotenoides nas diferentes condições de cultivo ... 50
2.5. Considerações ... 54
3. Recuperação Fracionada de Bioativos Oleaginosos Produzidos por Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 Utilizando Solventes Eutéticos Profundos ... 57
3.1. Revisão Bibliográfica ... 57
3.1.1. Solventes Eutéticos Profundos como uma alternativa à extração de Bioativos ... 57
3.2. Objetivos ... 62 3.2.1. Objetivos gerais ... 62 3.2.2. Objetivos específicos ... 62 3.3. Materiais e métodos ... 63 3.3.1.Microrganismo e manutenção ... 63 3.3.2.Inóculo ... 63
3.3.3.Pro dução dos óleos-lipídeos e carotenoides pela levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ... 63
3.3.4.Avaliação do comportamento dos compostos oleaginosos produzidos pela levedura em relação ao estresse térmico ... 64
3.3.6.Determinação da viscosidade dos DES à base de cloreto de colina ... 64 3.3.7.Avaliação preliminar do efeito de diferentes tratamentos com DES na recuperação dos compostos oleaginosos de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ... 64 3.3.8.Quantificação do teor de lipídeos totais e carotenoides totais ... 65 3.3.9.Determinação do perfil de ácidos graxos ... 65 3.3.10.Avaliação da permeabilidade das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 por termogravimetria ... 65 3.3.11. Avaliação da temperatura, adição de etanol como adjuvante e do tempo de extração na habilidade de extração do DES ... 65 3.3.12.Análise estatística ... 66 3.4. Resultados e Discussões ... 66 3.4.1. Avalição da temperatura de secagem das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ... 66 3.4.2. Avaliação da habilidade dos DES de atuarem no processo de recuperação dos ativos oleaginosos ... 68 3.4.3.Avaliação do Efeito dos Tratamentos com DES Sob o Perfil de Ácidos Graxos da Levedura ... 71 3.4.4. Caracterização termogravimétrica das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 após os tratamentos avaliados ... 73 3.4.5.Influência da temperatura, adição de etanol no DES como adjuvante e do tempo de extração sob o aumento da permeabilidade das células de levedura e acúmulo de carotenoides na fase do solvente ... 74 3.5. Considerações ... 83 4. Obtenção de Nanoemulsões Para Uso Cosmético Contendo Extrato Antioxidante Obtido A Partir de Células de Rhodotorula mucilaginosa Pós Tratamento com Solventes Eutéticos
Profundos ... 85 4.1. Revisão Bibliográfica ... 85 4.1.1. Sistemas Nanoemulsionados: Aplicações, Conceitos e Formação ... 85 4.1.2. Inserção de moléculas bioativas em sistemas nanoemulsioanodos e sua aplicabilidade na indústria de cosméticos ... 88
4.2.1. Objetivos gerais ... 92
4.2.2. Objetivos específicos ... 92
4.3. Materiais e métodos ... 93
4.3.1. Obtenção do Extrato Eutético de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 ... 93
4.3.2. Caracterização do Extrato Eutético ... 93
4.3.2.1.Teor de Açúcares Redutores e Açúcares Redutores Totais ... 93
4.3.2.2. Quantificação qualitativa dos Açúcares Redutores por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 94
4.3.2.3.Determinação do Teor de Proteínas Totais ... 94
4.3.2.4.Quantificação do teor de carotenoides totais ... 94
4.3.2. Avaliação in vitro da Ação Antioxidante do Extrato Eutético ... 94
4.3.3. Obtenção das Nanoemulsões contendo o Extrato Eutético da Levedura ... 95
4.3.4.Caracterização das Nanoemulsões ... 97
4.3.5.Avaliação da Estabilidade das Nanoemulsões Obtidas Frente à Ação de uma Força Centrífuga ... 98
4.3.6.Avaliação do Comportamento Reológico das Nanoemulsões Obtidas... 98
4.3.7.Avaliação da Estabilidade Cinética das Nanoemulsões ... 98
4.3.8.Análise estatística dos resultados ... 98
4.4. Resultados e Discussão ... 99
4.5. Considerações ... 113
5. Conclusões...114
- Capítulo 1 -
Figura 1.1 - Fluxograma geral dos processos estudados/desenvolvidos no presente estudo. Fonte: Autor. ... 25
- Capítulo 2 -
Figura 2.1 - Representação da estrutura de algumas moléculas de ácidos graxos. Fonte: Voet
e Voet (2013) (Adaptado pelo autor). ... 29
Figura 2.2 - Algumas moléculas de xantofilas (esquerda) e carotenoides (direita). Fonte:
Autor. ... 31
Figura 2.3 - Mecanismo simplificado da síntese de vitamina A e seus subsequentes produtos. Fonte: Nelson e Cox (2014). ... 32 Figura 2.4 - Aves com penas coloridas devido aos carotenoides contidos na sua cadeia
alimentar. Fonte: Nelson e Cox (2014). ... 32
Figura 2.5 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 2. Fonte: Autor. ... 38 Figura 2.6 - Aspecto do melaço de cana-de-açúcar utilizado nos bioprocessos avaliados. Fonte: Autor. ... 39 Figura 2.7 - Aspecto da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 crescida em placa de
Petri (a) e no inóculo após 24 h (b). Fonte: Autor. ... 40
Figura 2.8 - Células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 vistas por microscópio. Fonte:
Autor. ... 46
Figura 2.9 - Perfis de crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 (a) e de
consumo de açúcares redutores (b) para os cultivos CS (▪), CM (●) e CMEL (♦). Fonte: Autor. ... 47
Figura 2.10 – Resultados obtidos para os fatores de conversão de substrato em células (YX/S),
lipídeos (YL/S) e carotenoides (YC/S) nos cultivos CS, CM e CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes
letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). ... 48
Figura 2.11 - Resultados obtidos para a produtividade celular (PX), velocidade específica
máxima de crescimento (μmáx) e para o tempo de geração (Tg) para os cultivos CS, CM e
CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). ... 49
Figura 2.13 - Aspecto das biomassas microbianas obtidas após 96 h de crescimento da
levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 nos cultivos CS (1), CM (2) e CMEL (3).
Fonte: Autor. ... 51 Figura 2.14 - Percentual de lipídeos totais (a) e carotenoides totais (b) acumulados pela
levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 após 96 h de cultivo nas condições CS, CM e CMEL. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). ... 51
- Capítulo 3 –
Figura 3.1 - Típico diagrama de fases para uma mistura eutética. Fonte: Smith, Abbott e
Ryder (2014). Nota: mpA e mpB são os pontos onde os componentes A e B apresentam-se puros e ΔTf é a diferença de temperatura entre o sistema eutétio e a temperatura que sereia
apresentada caso o mesmo não se formasse. ... 59
Figura 3.2 - Espécies químicas utilizadas como aceptoras e doadores de ligação de
hidrogênio na síntese de DES. Fonte: Florindo et al. (2018) (Adaptado pelo autor). ... 61
Figura 3.3 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 3. Fonte: Autor. ... 63 Figura 3.4 - Efeito da temperatura de secagem na recuperação de bioativos lipídicos de
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892. Fonte: Autor. Nota: Todas as porcentagens de recuperação foram calculadas tomando o resultado à 60 ºC como referencial. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05) ... 67
Figura 3.5 - Aspectos do meio de cultivo (a) e das células de Rhodotorula mucilaginosa
CCT3892 obtidas após 96 h de cultivo (b). Fonte: Autor... 67
Figura 3.6 - Recuperação de lipídeos totais e carotenoides totais das células de Rhodotorula
mucilaginosa CCT3892 (a) e a concentração de carotenoides totais na fase dos DES (b) após todos os tratamentos avaliados. Fonte: Autor. *Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas entre as médias (p < 0,05). ... 69
Figura 3.7 - Análise termogravimétrica das células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892
após todos os tratamentos realizados (a) e suas respectivas curvas derivadas (b). Fonte: Autor. ... 73
nas células (b). Fonte: Autor. ... 76
Figura 3.9 - Aspecto dos extratos lipídicos obtidos das células de Rhodotorula mucilaginosa
CCT3892 após os diferentes tratamentos com o DES ChGy. Nota: Os termos “A” e “B” nas figuras referem-se ao fato de o frasco conter o obtido na primeira ou segunda replica de cada ensaio, respectivamente. Fonte: Autor... 78
Figura 3.10 - Aspecto do DES ChGy antes e após os diferentes ensaios de recuperação dos
carotenoides presentes nas células de Rhodotorula mucilaginosa CCT3892. Fonte: Autor. .. 79
Figura 3. 11 - Superfícies de resposta para o efeito da temperatura (T) e da concentração de
etanol (CE) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na fase do solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação gráfica, a variável t foi mantida em seu valor intermediário. ... 81
Figura 3. 12 - Superfícies de resposta para o efeito da temperatura (T) e do tempo de
processo (t) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na fase do solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação gráfica, a variável CE foi mantida em seu valor intermediário. ... 81
Figura 3. 13 - Superfícies de resposta para o efeito da concentração de etanol (CE) e do
tempo de processo (t) sob a liberação dos lipídeos totais (a) e o acúmulo de carotenoides na fase do solvente ChGy (b) após o tratamento. Fonte: Autor. Nota: Para a representação gráfica, a variável T foi mantida em seu valor intermediário. ... 82
Figura 3. 14 - Futuro processo integrativo de extração e aproveitamento dos lipo-compostos
obtidos a partir das células da levedura. Fonte: Autor... 82
- Capítulo 4 –
Figura 4.2 - Obtenção de uma nanoemulsão O/A a partir de uma emulsão A/O pelo método
da inversão de fase. Fonte: Komaiko e McClements (2018) (Adaptado pelo autor). ... 88
Figura 4. 3 - Fluxograma dos procedimentos experimentais realizados no presente capítulo. Fonte: Autor. ... 93 Figura 4.4 – Diagrama pseudoternário para o sistema água (A)- tween 20 (T)-Crodamol
GTCC (O). Fonte: Autor. ... 96
Figura 4.5 - Avaliação in vitro da ação antioxidante do extrato eutético de Rhodotorula
Autor. ... 102
Figura 4.7- Aspectos visuais das microemulsões (esquerda) e dos sistemas emulsionados
(direita) das formulações F1 (a), F2 (b), F3 (c) e F4 (d). Fonte: Autor. ... 103
Figura 4.8 – Aspectos macroscópicos das formulações F1 (a), F2 (b), F3 (c) e F4 (d) 24h
após suas obtenções. Fonte: Autor... 104
Figura 4.9 - Aspectos macroscópicos das formulações F1 e F2 antes e após a ação do campo
centrífugo. Fonte: Autor. ... 105
Figura 4.10 - Diâmetro hidrodinâmico médio (Dp) e Potencial Zeta (ξ) (a), Índice de
Polidispersão (PDI) e pH (b) das nanoemulsões F1 e F2 antes e após o ensaio de estabilidade em relação à ação de um campo centrífugo. Fonte: Autor. ... 106
Figura 4.11 - Distribuição do tamanho de gotículas para as nanoemulsões F1 (a) e F2 (c)
antes e depois ((b) e (d), respectivamente) dos testes de resistência a ação de uma força centrífuga. Fonte: Autor... 106
Figura 4.12 - Comportamento reológico da nanoemulsão F1 em relação à taxa de
cisalhamento (a) e a sua viscosidade (b). Fonte: Autor. ... 108
Figura 4.13 - Comportamento reológico da nanoemulsão F2 em relação à taxa de
cisalhamento (a) e a sua viscosidade (b). Fonte: Autor. ... 108
Figura 4.14 – Resultados da cinética de estabilidade da nanoemulsão F1 em relação ao
tamanho hidrodinâmico médio (Dp) (a), índice de polidispersão (PDI) (b); pH (c) e ao potencial zeta (d) durante 30 dias de estocagem a 4, 25 e 45 ºC. Fonte: Autor. ... 109
Figura 4.15 - Resultados da cinética de estabilidade da nanoemulsão F2 tamanho
hidrodinâmico médio (Dp) (a), índice de polidispersão (PDI) (b); pH (c) e ao potencial zeta (d) durante 30 dias de estocagem a 4, 25 e 45 ºC. Fonte: Autor... 110
Figura 4.16 - Aspectos apresentados pela nanoemulsão F1 em T0 (a) e em T30 a 4 ºC (b), 25
ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. ... 112
Figura 4.17 - Aspectos apresentados pela nanoemulsão F2 em T0 (a) e em T30 a 4 ºC (b), 25
ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. ... 112
Figura 4.18 - Curvas monomodal de distribuição de Dp para a nanoemulsão F1 em T0 (a) e
T30 a 4 ºC (b), 25 ºC (c) e 45 ºC (d). Fonte: Autor. ... 112
Figura 4.19 - Curvas monomodal de distribuição de Dp para a nanoemulsão F1 em T0 (a) e
- Capítulo 2-
Tabela 2.1 - Ácidos graxos biológicos mais comuns: nomenclatura, estrutura e solubilidade
em água. ... 29
Tabela 2.2 - Produtos cosméticos enriquecidos com carotenoides... 33 Tabela 2.3 - Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por diferentes microrganismos
empregando-se diferentes substratos. ... 36
Tabela 2.4 - Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar. ... 45 Tabela 2.5 - Perfil de ácidos graxos obtidos para cada condição de cultivo. ... 54
- Capítulo 3-
Tabela 3.1 - Configurações e composições de Solventes Eutéticos Profundos Naturais
(NADES) já reportados na literatura. ... 60
Tabela 3.2 - Viscosidades dos DES utilizados no estudo. ... 68 Tabela 3.3 - Perfis de ácidos graxos obtidos para extratos oleosos de Rhodotorula
mucilaginosa CCT3892 após os tratamentos com DES e ácido sulfúrico. ... 72
Tabela 3. 4 – Conjunto de tratamentos realizado durante a execução do planejamento
experimental e os respectivos resultados experimentais. ... 75
Tabela 3.5 - Tabela da ANOVA para o modelo que correlaciona as variáveis independentes
com o teor de lipídeos que remanesceram nas células após os tratamentos com o DES ChGy. ... 77
Tabela 3.6 - Tabela da ANOVA para o modelo que correlaciona as variáveis independentes
com o teor de carotenoides que migraram para a fase do DES ChGy após o tratamento. ... 78
-Capítulo 4-
Tabela 4.1 - Propriedades apresentadas pelos diferentes tipos de sistemas emulsionados. .... 86 Tabela 4.2 - Caracterização do tipo de sistema emulsionado com base no seu aspecto visual e
no efeito de espalhamento da luz. ... 87
Tabela 4.3 - Pesquisas sobre a obtenção de extratos ricos em bioativos com aplicação
cosmética. ... 89
Tabela 4.4 - Uso de diferentes microalgas e cianobactérias como produtoras de bioativos de
avaliadas. ... 97
Tabela 4.7 - Caracterização Bioquímica do Extrato Eutético de Rhodotorula mucilaginosa
CCT3892. ... 99
Tabela 4.8 - Modelos matemáticos, parâmetros reológicos e ajustes obtidos para as
Capítulo 1:
Introdução
23
1. Introdução
Nas últimas décadas vem sendo observada uma tendência global em se explorar tecnologias e processos baseados no conceito de química verde (COSTA et al., 2013). Nesse contexto ainda pode-se destacar, como razão para tais modificações, as inúmeras cobranças por parte da sociedade e das entidades competentes quanto às questões da sustentabilidade (SILVA, 2016).
Dentro deste cenários, os processos biotecnológicos vêm se destacando cada vez mais como uma solução a essas questões, uma vez que os mesmos são capazes de oferecer rotas alternativas para a obtenção de insumos e produtos, que assumem cada vez mais uma conotação ecologicamente correta (SILVA et al., 2017).
Com relação a este cenário competitivo, o Brasil não tem se destacado quando comparado com as grandes potências pois, conforme destacado por Costa et al. (2013), para cada US$10,00 gerados pelo ramo da biotecnologia, US$9,00 são arrecadados por indústrias americanas.
Ainda sobre a atuação dos processos biotecnológicos, sabe-se que estes englobam inúmeros setores da cadeia industrial global como, por exemplo, a indústria de alimentos e novos materiais, mas é na indústria farmacêutica que a biotecnologia vem galgando elevados patamares de destaque (MATOS, 2016).
É através de bioprocessos que novos fármacos menos agressivos ao sistema biológico do ser humano vêm sendo obtidas, assim como bioativos e moléculas de alto valor agregado. Tal fenômeno tem levado ao surgimento de interligações econômicas entre grandes conglomerados farmacêuticos e pequenas empresas produtoras de insumos biotecnológicos com o intuito de assim potencializar as capacidades produtivas deste setor em expansão (MATOS, 2016; BRASIL, 2017).
Dentre o vasto leque de biomoléculas atrativas ao mercado farmacêutico, e a outros setores industriais, destaca-se a categoria dos lipídeos, em especial as classes dos compostos lipídicos. Tais compostos possuem relevante atividade hidratante e antioxidante. Ambos bioativos podem ser sintetizados por microrganismos que utilizam resíduos agroindustriais como substratos precursores de açúcares redutores e que convertem essas moléculas em produtos de interesse da sociedade (SILVA et al., 2015).
Um dos ramos com alta rotatividade tecnológica e que demanda por novos produtos com propriedades antioxidantes e umectantes, dentro do contexto farmacêutico, é a indústria
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dos cosméticos. A cosmetologia é ciência que estuda o desenvolvimento e a funcionalidade dos produtos cosméticos, sendo um ramo em expansão e que só tem mostrado rentabilidade e crescimento de mercado, mesmo em períodos de crise econômica (DINO, 2016). Neste setor industrial é evidente a existência de um interesse constante por inovação, buscando-se à formulação de produtos multifuncionais que apresentem segurança tanto no cenário da aplicação quanto do ponto de vista ambiental.
Dentro desta temática, o estudo de novos processos extrativos tem sido bastante enfatizado. Uma classe de solventes que tem surgido como uma alternativa aos agentes convencionais, é a dos Solventes Eutéticos Profundos (do inglês Deep Eutectic Solvents), a qual surgiu na literatura de forma mais enfática devido aos estudos realizados por Abbott et al. (2004).
Nesse contexto, a presente dissertação objetivou produzir óleos-lipídeos e carotenoides, por síntese bioquímica usando a levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 cultivada em melaço de cana-de-açúcar, bem como estudar a recuperação dos mesmos utilizando-se solventes eutéticos profundos como agentes de recuperação. Por fim, a obtenção de sistemas nanoemulsionados contendo o extrato obtido também foi alvo de estudo.
A presente dissertação está escrita em cinco capítulos. No capítulo 2, após uma breve introdução e uma revisão bibliográfica, apresenta-se os resultados referentes à produção simultânea dos compostos oleaginosos pela levedura em questão. No capítulo 3 apresenta-se uma abordagem acerca do uso de solventes eutéticos profundos na recuperação das biomoléculas alvo, uma sugestão acerca do seu modo de interação com as células e variáveis de processo chaves. No capítulo 4, é apresentado o estudo acerca da atividade antioxidante e possibilidade de nanoemulsionamento dos bioativos obtidos. Por fim, no capítulo 5 apresenta-se as conclusões finais do trabalho.
A Figura 1.1 apresenta um fluxograma geral a respeito de todo estudo realizado bem como da conexão existente entre as etapas apresentas em cada um dos capítulos reportados acima.
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Figura 1.1 - Fluxograma geral dos processos estudados/desenvolvidos no presente estudo. Fonte: Autor.
Capítulo 2:
Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e
Carotenoides por Rhodotorula mucilaginosa
CCT3892 Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar
como Fonte de Carbono
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2. Produção Simultânea de Óleos-lipídeos e
Carotenoides por Rhodotorula mucilginosa CCT3892
Utilizando Melaço de Cana-de-açúcar como Fonte de
Carbono
Este capítulo apresenta os resultados concernentes à avaliação da produção de óleos-lipídeos, ácidos graxos essenciais e carotenoides pela levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 por cultivo submerso utilizando melaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono. Foram avaliadas três condições de cultivo das quais duas foram elaboradas empregando-se o melaço com (CMEL) e sem a suplementação de extrato de levedura (CM). Uma terceira condição foi elaborada como um padrão para fins de comparação, a mesma consistiu de um meio sintético no qual foi utilizado glicose e outros macro/micronutrientes (CS). Os resultados aqui registrados foram organizados na forma do artigo intitulado “Oil-lipids,
Carotenoids and Fatty Acids Simultaneous Production by Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 Using Sugarcane Molasses as Carbon Source”, o qual foi submetido e encontra-se
aceito para publicação pelo periódico Brazilian Journal of Food Technology (Qualis CAPES: B2).
2.1. Revisão Bibliográfica
2.1.1. Óleos-lipídeos e carotenoides: características bioquímicas, aplicações e obtenção por via biotecnológica
2.1.1.1. Lipídeos: aspectos bioquímicos e funcionais
O termo “lipídeos” vem do grego lipos, que significa gordura. As moléculas pertencentes a essa classe são conhecidas por serem substâncias que se mostram solúveis em solventes como hexano e clorofórmio e insolúveis, ou pouco solúveis, em água. Na natureza existem muitos exemplos de compostos lipídicos como as gorduras, os óleos, certas vitaminas e hormônios e a maioria dos componentes não-proteicos das membranas biológicas (VOET e VOET, 2013).
Nelson e Cox (2014) evidenciam a importância das moléculas lipídicas ao mencionarem as várias funções biológicas exercidas pelas mesmas, como por exemplo, o fato das gorduras e óleos serem uma das principais formas de armazenamento de energia para vários tipos de organismos. Essa classe de compostos também desempenha o papel, embora
28
que em menor quantidade, de atuarem como cofatores enzimáticos, transportadores de elétrons, âncoras hidrofóbicas para várias proteínas, agentes tensoativos associados ao trato intestinal, mensageiros intracelulares e pigmentos fotossensíveis (NELSON e COX, 2014).
Quanto aos lipídeos associados aos processos de armazenamento energético vale ressaltar que os mesmos são em sua maioria derivados de ácidos graxos (NELSON e COX, 2014). Os ácidos graxos são compostos orgânicos, constituídos majoritariamente por átomos de carbono, e que apresentam em sua estrutura química um grupo funcional carboxila (-COOH).
Na natureza, são raramente encontrados na forma livre, pois em geral estão ligados a outros agrupamentos moleculares em sua forma esterificada. São os principais constituintes estruturais dos vários lipídeos encontrados nos sistemas biológicos (VOET e VOET, 2013).
Do ponto de vista de sua origem, os ácidos graxos são derivados de hidrocarbonetos com baixo estado de oxidação. Em sua estruturação, apresentam uma cadeia hidrocarbônica que varia de comprimento de acordo com o tipo de ácido graxo, podendo conter de quatro (C4) até trinta e seis (C36) carbonos. Essas cadeias orgânicas podem estar na forma saturada ou
insaturada e esses diferentes graus de insaturação são responsáveis por configurarem as propriedades físico-químicas dos mesmos (NELSON e COX, 2014).
De um modo geral, os ácidos graxos possuem um número par de átomos de carbono em sua estrutura molecular, pois são oriundos de reações envolvendo unidade C2 (acetatos),
os exemplos mais comuns apresentam de doze a vinte e quatro carbonos estruturais. Outro padrão comum às estruturas dessas biomoléculas refere-se à disposição das suas duplas ligações.
Ainda sobre a insaturação apresentada pelos mesmos, quando o composto é monoinsaturado verifica-se que insaturação se faz presente entre o nono carbono da cadeia (9) e o décimo (10). Para as espécies poli-insaturadas a posição mais comum é entre o C-12 e o C-15. (NELSON e COX, 2014; VOET e VOET, 2013). A Figura 2.1 ilustra a estrutura molecular dos ácidos esteárico, oleico, linoleico e α-linolênico, exemplos de moléculas lipídicas.
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Figura 2.1 - Representação da estrutura de algumas moléculas de ácidos graxos. Fonte: Voet e Voet (2013) (Adaptado pelo autor).
A cadeia hidrocarbonada, que configura a estrutura desses bioativos é responsável pela baixa solubilidade em água que estes apresentam (NELSON e COX, 2014). Essa característica traço é tão marcante para os mesmos que quanto maior o número de grupamentos acilas e menor número de duplas ligações, mais hidrofóbico é o composto. No caso das estruturas de cadeia curta, a presença do grupo ácido carboxílico possibilita um processo de solubilização em água (NELSON e COX, 2014). A Tabela 2.1 apresenta os ácidos graxos que são encontrados com maior frequência na natureza.
Tabela 2.1 - Ácidos graxos biológicos mais comuns: nomenclatura, estrutura e solubilidade
em água.
Representação simbólica*
Estrutura Nome sistemático**
Nome comum Solubilidade em H2O (mg.g-1 de H 2O) 12:0 CH3(CH2)10COOH Ácido dodecanóico Ácido láurico 0,063 14:0 CH3(CH2)12COOH Ácido n-tetradecanóico Ácido mirístico 0,024 16:0 CH3(CH2)14COOH Ácido n-hexadecanóico Ácido palmítico 0,0083 18:0 CH3(CH2)16COOH Ácido n-octadecanóico Ácido esteárico 0,0034 20:0 CH3(CH2)18COOH Ácido n-eicosanóico Ácido araquídico - 22:0 CH3(CH2)20COOH Ácido docosanóico Ácido beênico - 24:0 CH3(CH2)22COOH Ácido n-tetracosanóico Ácido lignocérico - 16:1 (C-9) CH3(CH2)5CH=C H(CH2)7COOH Ácido cis-9-hexadecenoico Ácido palmitoleico -
30 18:1 (C-9) CH3(CH2)7CH=C H(CH2)7COOH Ácido cis-9-octadecenoico Ácido oleico - 18:2 (C-9 e 12) CH3(CH2)4CH=C HCH2CH=CH(CH 2)7COOH Ácido cis-,cis- 9,12-octadecadienoico Ácido linoleico - 18:3 (C-9,12 e 15) CH3CH2CH=CHC H2CH=CHCH2CH =CH(CH2)7COOH Ácido cis-,cis-,cis- 9,12,15-octadecatrienoico Ácido α-linolênico -
*Número de átomos de carbono: número de duplas ligações. (C-n) indica a posição da dupla ligação; **O prefixo “n-” indica que a estrutura é “normal”, ou seja, não ramificada.
Fonte: Nelson e Cox (2014); Voet e Voet (2013).
Do ponto de vista dermatológico, os lipídeos são compreendidos como constituintes essenciais à manutenção da saúde da pele humana uma vez que os mesmos fazem parte de sua barreira natural. O estrato córneo é a camada mais superficial da epiderme, a mesma pode ser compreendida pelo modelo brick & mortar (tijolo e cimento). Segundo essa abordagem, o estrato córneo é constituído por unidades bases (corneócitos) que estão aderidos uns aos outros por uma “argamassa” lipídica (ADDOR e AOKI, 2010).
De acordo com Addor e Aoki (2010), o grau de hidratação cutânea e o nível de perda de água transepidérmica são funções desta camada lipídica. Quando a mesma está defasada por alguma razão, há um aumento substancial das chances de aparecimento das dermatites de contatos e outras inflamações.
Assim, a indústria de cosméticos e fármacos está em constante procura pelo desenvolvimento de formulações emolientes (ricas em óleos-lipídeos) e umectantes, uma vez que estas são capazes de manter a elasticidade, maciez e flexibilidade da pele (MONTENEGRO et al., 2016).
O conhecimento da estruturação lipídica da pele tem conduzido às pesquisas que visam ao desenvolvimento de produtos nanotecnológicos nos quais seja possível dispersar importantes ativos lipídicos em sistemas hidrofílicos e com considerável área superficial de contato para, assim, potencializar a penetração destes no estrato córneo.
2.1.1.2. Carotenoides: aspectos bioquímicos, funcionais e aplicações em cosméticos
Os carotenoides são pigmentos lipossolúveis, em geral, divididos entre o grupo das xantofilas e o dos carotenos, isso de acordo com a presença de átomos de oxigênio (xantofilas) ou não (carotenos) em sua estrutura (CHENG e YANG, 2016). Quimicamente, a fórmula molecular geral dos carotenoides é C40H56On, sendo n = 0 para os carotenos e n > 0
pró-31
vitamina A e por apresentar boa estabilidade quanto a diferentes condições de pH e aquecimento (DESMARCHELIER e BOREL, 2017).
Sobre tais biocompostos, pode-se destacar ainda que o mesmo é o segundo agrupamento de agentes colorantes mais abundantes nos sistemas vivos, ficando atrás apenas das clorofilas (ESTEBAN et al., 2015). Mais de 750 moléculas deste nicho já foram catalogadas sendo essas responsáveis por promover coloração, na faixa do amarelo para o vermelho, a todos os meios nos quais estejam dispersas (KACZOR, BARANSKA e CZAMARA, 2016).
Uma informação relevante é que os animais superiores são incapazes de sintetizar carotenoides, porém os mesmos precisam ingeri-los pois estes são essenciais à manutenção da saúde de todo seu sistema biológico (KACZOR, BARANSKA e CZAMARA, 2016).
Do ponto de vista nutricional, estudos demonstram, por exemplo, que uma dieta rica em tais biomoléculas promove a manutenção da saúde de fetos atrelados a uma gravidez de risco e isso se deve ao fato das mesmas serem precursores da vitamina A, uma adjunta fundamental à manutenção da visão e das atividades do sistema imunológico (THORNE-LYMAN e FAWZI, 2012).
Figura 2.2 - Algumas moléculas de xantofilas (esquerda) e carotenoides (direita). Fonte: Autor.
Ainda sobre a vitamina A, sabe-se que sua biossíntese é um processo natural e comum aos seres vivos e que se dá por meio de uma cadeia de reações que se inicia com a clivagem de uma molécula de β-caroteno, tal etapa gera duas moléculas de vitamina A, também chamada de retinol. Em seguida, a oxidação ocorrida no carbono 15 converte o retinol em aldeído (retinal) e esse ao ser oxidado produz o ácido retinóico, espécie ligada ao processo de renovação das células da pele (NELSON e COX, 2014).
32
Porém, segundo Nelson e Cox (2014), quando excitado pela luz visível, o retinal segue outra rota e se transforma na sua configuração trans, essa por sua vez está associada à tradução de sinais neurais ligados à visão dos seres humanos e outros animais. A Figura 2.3 ilustra, de forma simplificada todo mecanismo envolvido nestas etapas bioquímicas.
Uma das características fundamentais dos carotenoides é o fato dos mesmos apresentarem em sua estruturação um arranjo alternado de duplas ligações, tal fato fundamenta sua capacidade pigmentante e ação antioxidante (IRAZUSTA et al., 2013).
Figura 2.3 - Mecanismo simplificado da síntese de vitamina A e seus subsequentes produtos. Fonte: Nelson e Cox (2014).
Alguns seres vivos expressam o teor de carotenoides, obtidos por meio de sua alimentação, através de uma coloração externa e visível, como no caso de algumas aves e algas de tonalidade vermelho-amarelado (Figura 2.4). Outros organismos apresentam a capacidade de sintetizar esses bioativos e os mesmos são responsáveis por produzirem ~108 toneladas destes lipopigmentos por ano (ESTEBAN et al., 2015).
Figura 2.4 - Aves com penas coloridas devido aos carotenoides contidos na sua cadeia
33
Destaca-se que nos seres unicelulares, esses lipídeos pigmentantes, por meio de sua ação antioxidante, são responsáveis por manterem a membrana celular intacta dos danos causados por radicais livres. Essa propriedade tem sido amplamente aproveitada na indústria e a suplementação de alimentos e fármacos com essas moléculas possuindo um mercado global amplo e com arrecadação média de US$ 935 milhões (MAROVA et al., 2012).
Pesquisas vêm mostrando que o poder antioxidante dos carotenoides tem forte atividade na prevenção à diabetes, doenças cardiovasculares, degeneração visual e várias doenças imunológicas e neurais (FIERDO e BURDA, 2014). Além disso, esse poder de combate às espécies reativas de oxigênio (agentes oxidantes) tem sido amplamente utilizado pela indústria de produtos cosméticos em produtos do tipo antienvelhecimento (MESQUITA, TEIXEIRA e SERVULO, 2017).
A Tabela 2.2 apresenta alguns produtos comerciais que são suplementados com carotenoides.
Tabela 2.2 - Produtos cosméticos enriquecidos com carotenoides.
Carotenoide Produto Marca/ Fabricante
Aplicação e/ou função
β-caroteno Beta caroteno Sundown
Naturals
Nutricosmético β-caroteno e
licopeno
Inneov Solar Nestlé e L’oréal Nutricosmético
Luteína Linha Profuse Ensolei Aché Dermocosmético
Licopeno Lycopene Sundown
Naturals
Nutricosmético
Luteína Ionzyme® C Quence
creme
Skinlumina Dermocosmético
Fonte: Mesquita, Teixeira e Servulo (2017).
Com o exposto acima, fica evidente a razão de haver uma grande demanda industrial por processos que possam trazer bons rendimentos de obtenção destas biomoléculas. Assim, além de poder potencializar os lucros das grandes marcas envolvidas, tais processos atenderiam às expectativas de um público consumidor cada vez mais exigente.
34
2.1.1.3. Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por leveduras do gênero
Rhodotorula como uma alternativa viável à indústria de bioativos
Dentre as rotas alternativas para a obtenção de moléculas de alto valor agregado, como os óleos-lipídeos e os carotenoides, pode-se destacar os processos bioquímicos como sendo uma das melhores soluções para a adequação ao conceito de sustentabilidade.
Em geral, óleos-lipídeos são obtidos industrialmente por meio de processos extrativos que usam vegetais como principal fonte destes, já os carotenoides podem ser obtidos tanto por extração ou por síntese química. Devido à demanda de mercado, a rota oriunda das atividades agrárias não é viável, pois está condicionada à sazonalidade e variabilidade geográfica. Quanto à obtenção por rota química, esta vem recebendo severas críticas devido à toxicidade dos reagentes utilizados e subprodutos gerados (MATA-GOMÉZ et al., 2014).
Nesse contexto, as rotas biotecnológicas vêm se mostrando bastante vantajosas uma vez que há um maior controle do processo como um todo, já que estas não estão limitadas por intempéries ambientais, especificidades de solo, necessidade de largo espaço para cultivo e por restrições quanto ao posicionamento geográfico (RIBEIRO et al., 2017a).
A principal vantagem atrelada à produção de lipídeos via catálise microbiana está no fato desses processos poderem ser conduzidos utilizando-se diferentes resíduos agrícolas, ou industriais, como substratos majoritários. A escolha da fonte de carbono/nitrogênio apropriada tem sido um dos principais parâmetros estudados para fins de otimização (MATA-GÓMEZ et
al., 2014).
Um subproduto da indústria da cana-de-açúcar e que apresenta relevante aplicabilidade como fonte majoritária de carbono em bioprocessos é o melaço. Os estudos de Banzatto, Freita e Mutton (2013) apontaram, por exemplo, que de fato há uma forte correlação entre os altos rendimentos em moléculas lipídicas e o uso deste resíduo como fonte de nutrientes uma vez que a maior produção celular (15,0 g.L-1), para um cultivo submerso de
Rhodotorula rubra, foi alcançada utilizando-se este insumo. Consequentemente, a maior
produtividade de carotenoides (2,74 mg.L-1) se deu também nesta mesma condição.
Outro estudo que corrobora com a ideia de que o uso de substratos alternativos apresenta potencial para a produção de lipídeos, em especial para os pigmentantes, foi realizado por Kanzy et al. (2015). Neste estudo os autores verificaram que a maior concentração de biomassa de Rhodotorula mucilaginosa (9,02 g.L-1) ocorreu após 120 h de cultivo, com uma concentração volumétrica de carotenoides totais equivalente a 5,04 mg.L-1. Os mesmos utilizaram soro de queijo salgado como principal fonte de nutrientes.
35
Lian, Chen e Garci-Perez (2013) avaliaram a aplicabilidade de levoglucosanos não hidrolisados como fonte de carbono para um cultivo de Rhodotorula glutinis e obtiveram uma produção celular de 6,8 g.L-1, com uma correlata produção lipídica de 2,7 g.L-1.
Karatay e Donmez (2010) também observaram um aumento na produção de lipídeos, por três leveduras diferentes (Candida lipolytica, Candida tropicalis e Rhodotorula
mucilaginosa), ao empregarem melaço como principal nutriente do cultivo, sendo seu maior
resultado equivalente a 69,5 % para o cultivo submerso com a Rhodotorula mucilaginosa. Ainda sobre o exposto acima, é notório observar que vários gêneros de microrganismos são capazes de sintetizar, via ação metabólica, óleos-lipídeos e carotenoides. Porém, o gênero Rhodotorula é o que mais se destaca dentre estes (KOT et al., 2016).
Até pouco tempo as leveduras desse gênero eram unicamente conhecidas devido aos seus sucessivos casos de contaminação de alimentos. Porém, vários estudos vêm reportando que elas constituem um grupo de seres unicelulares dotados de várias características de interesse industrial (KOT et al., 2016).
Um membro deste agrupamento de leveduras, que já foi mencionado e vem sendo descrito com ênfase nas literaturas especializadas em bioprocessos, é a Rhodotorula
mucilaginosa. Esta classe de microrganismos pertence à família Sporidiobolaceae do filo basidiomycota e apresentam morfologia que pode variar de esférica para elipsoidal. Outra
característica dos mesmos é que estes podem ser encontrados em várias partes do mundo, desde os ambientes aquáticos ou terrestres até a superfície das membranas mucosas de vários animais, inclusive dos humanos (TSIODRAS et al., 2014).
A Tabela 2.3 apresenta estudos recentes nos quais foram utilizados diferentes substratos alternativos em bioprocessos que objetivaram a produção de biomoléculas lipídicas.
Do ponto de vista da bioquímica celular, Garay, Boundy-Mills e German (2014) concluem que a produção de compostos lipídicos por leveduras oleaginosas pode ser compreendida por meio de quatro etapas principais. Na primeira etapa o microrganismo direciona seu metabolismo para a produção de Acetilcoenzima A (Ac-CoA), assim também como NADPH, a qual é a força motriz responsável pelo direcionamento da rota de síntese dos ácidos graxos microbianos. No segundo estágio de ação metabólica, a Ac-CoA sofre carboxilação para então produzir malonil coenzima A (Mal-CoA), transferido para a enzima transportadora do acilo (ACP), para em seguida gerar acil ACP.
No terceiro passo, a cadeia acila pode terminar gerando um agrupamento específico de lipídeos, como componentes lipídicos da membrana ou poder ser eventualmente convertida
36
em um núcleo de gotículas lipídicas neutras. A localização, a dinâmica e a natureza desse estágio podem variar conforme o microrganismo em questão. Por fim, o quarto estágio envolve a produção de gotículas intracelulares de lipídeos (GL), acúmulo este que está diretamente ligado às condições ambientais como disponibilidade e assimilação de nutrientes majoritários, como carbono e nitrogênio (GARAY, BOUNDY-MILLS e GERMAN, 2014).
Tabela 2.3 - Produção de óleos-lipídeos e carotenoides por diferentes microrganismos
empregando-se diferentes substratos.
Microrganismo Fonte de carbono Fonte de nitrogênio Biomoléculas produzidas Autores Rhodotorula glutinis ATCC 204091 Água residual de uma destilaria de tequila - Óleos-lipídeos Gonzalez-Garcia et al. (2013) Rhodotorula mucilaginosa BCRC 23454 Restos de comida (melaço, ketchup e suco detox) Extrato de levedura Carotenoides (β-caroteno) Cheng e Yang (2016) Chlorella protothecoides ATCC 30411 Soro de queijo do tipo scotta
Nitrato de sódio Carotenoides Ribeiro et al. (2017)b Rhodotorula glutinis BCRC 22360 Hidrolisado de biomassa lignocelulósica Extrato de levedura e sulfato de amônia
Óleos-lipídeos Yen e Chang (2015) Rhodotorula mucilaginosa Meio BDA* + pesticida orgânico - Óleos-lipídeos, carotenoides e hemoproteínas Pacia et al. (2016) Sporobolomyces ruberrimus H110 Glicerol Sulfato de amônio, peptona e extrato de levedura
Carotenoides Cardoso et al. (2016)
Rhodotorula mucilaginosa
Glicerol** Sulfato de amônia e extrato de levedura**
Óleos-lipídios Yen, Liao e Liu (2016)
*Meio Batata-Dextrose-Ágar; **Meio diluído em água do mar ao invés de água destilada ou comum.
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2.2. Objetivos
2.2.1. Objetivos gerais
Avaliar a produção de óleos-lipídeos, ácidos graxos e carotenoides por Rhodotorula
mucilaginosa CCT3892 utilizando o melaço de cana-de-açúcar como substrato.
2.2.2. Objetivos específicos
✓ 1222Realizar a caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar;
✓ Avaliar o crescimento da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em meio sintético e em meio contendo melaço como fonte de carbono;
✓ Avaliar o potencial do melaço de cana-de-açúcar como fonte majoritária de carbono na síntese biotecnológica de ativos lipídicos;
✓ Avaliar o sinergismo entre a fonte de carbono e a fonte de nitrogênio (extrato de levedura) nos rendimentos e no perfil de ácidos graxos produzidos pela levedura.
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2.3. Materiais e métodos
A Figura 2.5 apresenta um fluxograma geral dos procedimentos experimentais que foram realizados durante o desenvolvimento do presente capítulo.
Figura 2.5 - Fluxograma geral dos procedimentos experimentais realizados no capítulo 2. Fonte: Autor.
2.3.1. Obtenção do melaço de cana-de-açúcar
O melaço de cana-de-açúcar foi fornecido pela usina Japungu Agroindustrial de sua planta de produção de etanol que fica situada no município de Santa Rita, Paraíba, Brasil (6º59’17’’S 35º01’24’’W). Antes de ser utilizado como substrato, o melaço foi hidrolisado de acordo com a metodologia de Banzato et al. (2013) no intuito de aumentar seu teor de açucares redutores. A Figura 2.6 apresenta o aspecto do melaço utilizado no presente estudo.
39
Figura 2.6 - Aspecto do melaço de cana-de-açúcar utilizado nos bioprocessos avaliados. Fonte: Autor.
2.3.2. Microrganismo e manutenção
O microrganismo utilizado foi a levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892, a qual foi fornecida pela Função André Tosselo – Coleção de Culturas Tropicais (Campinas – Brazil). De acordo com a fundação, a levedura é classificada como segura pra o meio ambiente e seres humanos (Biossegurança I). A mesma foi mantida em câmara climática (CONTINENTAL, RCCT440) a 4 ºC em placas de vidro contendo meio Y. M. A., o qual consiste de (g.L-1): glicose (40,0), extrato de levedura (3,0), peptona (5,0) e ágar (2,0).
2.3.3. Inóculo
O inóculo foi preparado através da adição de 5,0 mL de água destilada sobre uma placa de Petri contendo as células de levedura. A suspensão foi então transferida para um Erlenmeyer contendo 200 mL do meio proposto por Frengova et al. (1964), o qual apresentava a seguinte composição em (g.L-1): glicose (40,0), KH
2PO4 (8,0), MgSO4.7H2O
(0,5) e extrato de levedura (3,0). O crescimento celular foi então conduzido em incubador rotatório (New Brunswick – C25K) a 30 ºC e 200 rpm por 24h. Por fim, 50,0 mL do caldo fermentado foi centrifugado (Solab, SL-706) a 2500 rpm por 10 minutos e as células recuperadas foram ressupensas em 5,0 mL de água destilada estéril para então serem transferidos para os meios de cultivo em volume adequado para que os mesmos apresentassem uma concentração celular inicial de ~107 células.mL-1, a qual foi padronizada em câmara de Neubauer (Figura 2.8) .
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2.3.4. Bioprodução dos ativos lipídicos
Para avaliar a capacidade de produção de óleos-lipídeos e carotenoides pela levedura
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em meio contendo melaço de cana-de-açúcar, três
condições de processo foram realizadas. A primeira foi conduzida utilizando o meio composto por Frengova et al. (1964), a segunda foi formulada utilizando apenas melaço invertido a uma concentração de açúcares redutores (AR) de 40,0 g.L-1. Por fim, a terceira condição foi conduzida com a mesma concentração de AR das demais, porém suplementada com 3,0 g.L-1 de extrato de levedura. Destaca-se que todos os ensaios foram conduzidos em frascos do tipo Erlenmeyer (250 mL), contendo 125 mL de meio de cultivo, em incubador rotatório e nas mesmas condições do inóculo da seção 2.3.3. A Figura 2.7 apresenta o aspecto da levedura
Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 em placa e o aspecto do inóculo após 24 h de
crescimento.
Figura 2.7 - Aspecto da levedura Rhodotorula mucilaginosa CCT3892 crescida em placa de
Petri (a) e no inóculo após 24 h (b). Fonte: Autor.
2.3.5. Caracterização físico-química do melaço de cana-de-açúcar
2.3.5.1. Determinação do teor de sólidos solúveis totais - ºBrix
O teor de sólidos solúveis foi determinado por meio da aferição do ºBrix, de uma diluição 1:10 do mesmo, em um refratômetro digital (Smart-1/Atago/nº 3150).
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2.3.5.2. Potencial hidrogeniônico (pH)
O pH do melaço foi determinado de acordo com a metodologia utilizada por Zenebon, Sadocco e Tiglea (2008). Sendo assim, foi preparada uma diluição do mesmo em água destilada na proporção de 1:10 (m.v-1) e o seu pH foi então medido em pHmetro (MS TECPON – LUCA 210). A análise foi realizada em triplicata.
2.3.5.3. Proteínas totais
A quantificação do teor de proteínas totais foi feita pelo método colorimétrico proposto por Bradford (1976). A leitura espectrofotométrica foi feita a 595 nm(ThermoSpectronic – GENESYS 10uV) para então ser convertida em concentração de proteínas totais (mg.L-1) por meio de uma curva de calibração previamente construída utilizando-se albumina de soro bovino - BSA (Sigma-aldrich) como padrão, compreendo uma amplitude de concentração variando de 0,1 a 1,0 mg.mL-1. As análises foram conduzidas em triplicata.
2.3.5.4. Açúcares Redutores
A quantificação do teor de açúcares redutores foi realizada pelo método espectrofotométrico proposto por Miller (1959). A leitura da análise foi feita a 540 nm e a mesma foi então convertida em concentração de açúcares redutores (g.L-1) por meio de uma curva de calibração construída utilizando-se glicose (Labsynth) como padrão, dentro de uma faixa de concentração de 0,1 a 1,0 g.L-1. Esta mesma metodologia também foi aplicada na quantificação do teor de açúcares residuais ao longo dos cultivos conduzidos de acordo com exposto no item 2.3.4.
2.3.5.4. Quantificação dos açúcares redutores por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
A quantificação dos açúcares redutores específicos foi realizada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) utilizando uma plataforma ACELA (Thermo scientific) equipada com uma coluna Shim-Pack (Shimadzu Co., Japão). A temperatura de operação foi 65 ºC e a fase móvel utilizada foi uma solução de H2SO4 (5,0 mM) a uma vazão de 0,6
mL.min-1. A análise foi realizada em triplicata (NOGUEIRA et al., 2019).
2.3.6. Concentração celular (X)
Para a quantificação da concentração celular (g.L-1) ao longo dos bioprocessos, realizados de acordo com o item 2.3.4, foi efetuada a coleta em triplicata de 1,0 mL de meio
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nos tempos 0, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72, 92 e após 120 h de cultivo. As alíquotas foram então diluídas e suas absorbâncias foram lidas a 600 nm para em seguida serem convertidas em concentração de células secas (g.L-1) por meio de uma curva de calibração construída ao final de cada cultivo (CARDOSO et al., 2016; RIBEIRO et al., 2017a).
2.3.7. Quantificação do teor de lipídeos totais
Para extrair e quantificar os lipídeos produzidos, as células da levedura foram secas e maceradas para, em seguida, serem tratadas de acordo com processo proposto por Manirakiza, Covaci e Schepens (2001). Os resultados foram expressos em percentual de lipídeos totais por grama de células (g.g-1) de acordo com a Equação (1). A quantificação foi realizada em triplicata para o ponto de máxima concentração celular.
𝑇𝑒𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑙𝑖𝑝í𝑑𝑒𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠 (%) = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 ó𝑙𝑒𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑑𝑜
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑥 100 (1)
2.3.8. Quantificação da concentração de carotenoides totais
A determinação da concentração de carotenoides totais produzidos foi realizada ressuspendendo-se o óleo obtido no item 2.3.7 em clorofórmio para então mensurar sua absorbância a 450 nm. O resultado obtido em espectrofotômetro foi então convertido em concentração (µg.g-1células) por meio da Equação (2) (KANZY et al., 2015; CHENG e YANG,
2016).
[𝐶𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠𝑇𝑜𝑡𝑎𝑖𝑠] =
𝐴×𝑉×104
𝑎×𝑚 (2)
Na Equação 2, o termo A se refere à absorbância obtida, V é o volume de solvente utilizado (mL) na ressuspensão, a é a absortividade molar dos carotenoides (2592) e m é a massa de células (g) utilizada na operação de extração.
2.3.9. Determinação do perfil de ácidos graxos
O óleo ressuspenso no item 3.5.4 foi transesterificado de acordo com o método padrão da IUPAC (1987). Em seguida, o perfil graxo das amostras foi caracterizado por cromatografia gasosa (CG) acoplada a um detector de massa (Shimadzu – GCMS – QP2010, Japão) e equipado com uma coluna Durabound DB-23 (30 cm x 0,25 mm x 0,25 µm). A
