Complexos organometálicos de Re e Tc com propriedades osteotrópicas para imagiologia e /ou terapia

FACULDADE DE C

DEPARTAMENTO DE Q

D o u t o r a m e n t o e

E s p e c i a l i d a d e Q u

Elisa Vaz Morga

Complexos Orga

com Proprieda

Imagiologia e/

E CIÊNCIAS

DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA

e m Q u í m i c a

Q u í m i c a I n o r g â n i c a

orgado de Palma

s Organometálicos de Re

riedades Osteotrópicas p

gia e/ou Terapia

t o r a I s a b e l R e g o d o s S a n t o s D o u t o r J o ã o D o m i n g o s G a l a m

de Re e Tc

icas para

2011

i O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no grupo de Ciências Radiofarmacêuticas do Instituto Tecnológico e Nuclear (ITN), sob a orientação da Doutora Isabel Rego dos Santos e co-orientação do Doutor João Domingos Galamba Correia.

Este trabalho foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia através da bolsa de doutoramento SFRH/BD/29527/2006 e do projecto PTDC/QUI-QUI/115712/2009.

iii À minha orientadora, a Doutora Isabel Rego dos Santos, agradeço o rigor científico como me orientou e a forma exemplar, disponível e cuidada como apoiou a realização deste trabalho, sendo para mim essencial e indispensável para o processo de aprendizagem. Ao meu co-orientador, o Doutor João Galamba Correia agradeço o apoio científico e a forma sempre disponível como me ajudou a esclarecer as diversas questões que surgiram ao longo deste trabalho. A ambos agradeço o bom exemplo e o entusiasmo científico contagiante que sempre manifestaram.

À Doutora Lurdes Gano agradeço o empenho na realização dos estudos farmacocinéticos, assim como todo o apoio prestado.

À Doutora Guilhermina Cantinho e ao Sr Vieira Marques agradeço pela disponibilidade e rigor com que efectuaram as imagens cintigráficas.

À Doutora Paula Campello e à Doutora Célia Fernandes quero exprimir a minha gratidão pelo apoio científico e técnico e em especial pela amizade demonstrada.

À Doutora Goreti Morais, ao mestre Bruno Oliveira e ao mestre Maurício Morais, agradeço o entusiasmo manifestado na discussão de diversas questões científicas e sobretudo o bom ambiente de trabalho, o apoio moral e amizade manifestados.

À Elisabete e ao Amadeu agradeço o apoio logístico, boa disposição e simpatia. A todos os outros elementos do Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas agradeço também o excelente ambiente de trabalho, colaboração e amizade.

Ao Doutor Joaquim Marçalo agradeço a realização dos espectros de massa apresentados neste trabalho, bem como as discussões científicas associadas.

À Doutora Isabel Cordeiro Santos agradeço todo o empenho na resolução das estruturas moleculares no estado sólido.

Ao Sr. António Soares agradeço a realização das análises elementares e o espírito bem disposto contagiante.

Ao Instituto Tecnológico e Nuclear agradeço o acolhimento e à Fundação para a Ciência e Tecnologia o financiamento deste trabalho.

Finalmente, agradeço à minha família pelo apoio e incentivo fundamentais à realização deste trabalho, e pela compreensão relativamente à minha falta de disponibilidade, em especial ao João e à Laura.

v Novos ligandos bifuncionais do tipo pirazolo diamina contendo grupos mono (L1 - L3) ou bisfosfonato (L4 - L6) foram sintetizados e caracterizados. Estes ligandos foram utilizados para preparar complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-L)]+ em que: L = L1,

M = Re (Re1), 99mTc (Tc1); L = L2, M = Re (Re2), 99mTc (Tc2); L= L4 - L6, M = Re (Re4-Re6), 99mTc (Tc4-Tc6). Os complexos radioactivos foram obtidos com rendimentos e pureza radioquímica elevados (≥ 95 %), tendo sido identificados por comparação dos seus cromatogramas de RP-HPLC com os dos respectivos complexos análogos de Re. Os estudos in vitro de ligação à hidroxiapatite revelaram que os complexos possuíam potencial osteotrópico e os estudos em ratinhos CD-1 confirmaram que todos eram resistentes à transmetalação, transquelatação e oxidação e que, principalmente os que continham a unidade bisfosfonato (Tc4-Tc6), se ligavam ao osso. Os complexos Tc5 e Tc6 foram os que apresentaram melhor perfil biológico em termos de fixação óssea, eliminação e razões osso/órgão não alvo pelo que foram escolhidos para prosseguir estudos noutra estirpe animal. Estudos de biodistribuição em ratinhos Balb-c e as imagens cintigráficas de Tc5 e Tc6 em ratos Sprague-Dawley confirmaram um excelente comportamento biológico para estes complexos, que verificámos ser comparável ou, em alguns casos, melhor do que o encontrado para o composto em utilização clínica 99mTc-MDP, que estudámos nas mesmas condições experimentais.

Para explorar a síntese de um complexo trifuncional, tentámos sintetizar um ligando pirazolo-diamina com um composto citostático (docetaxel) e com uma unidade bisfosfonato. Foram obtidos resultados animadores que terão que prosseguir.

vii New bifunctional ligands comprising a pyrazolyl-diamine backbone for metal stabilization, and a pendant mono (L1 - L3) or bisphosphonate (L4 - L6) group for bone targeting were synthesized. Those ligands allowed the prepararion of complexes of type fac-[M(CO)3(κ3-L)]+ where: L = L1, M = Re (Re1), 99mTc (Tc1); L = L2, M = Re (Re2), 99m

Tc (Tc2); L= L4 - L6, M = Re (Re4-Re6), 99mTc (Tc4-Tc6). The radioactive species were obtained in high yield and radiochemical purity (≥ 95%), being identified by comparison of their RP-HPLC chromatograms with the corresponding Re surrogates. In

vitro hydroxiapatite binding studies revealed that the complexes presented bone

seeking potential and the studies carried out in CD-1 mice showed that all complexes were resistant to transmetalation, transquelation and oxidation and, manly those containing a bisphosphonate unit (Tc4 - Tc6), bound to bone tissues. Tc5 and Tc6 showed the best pharmacokinetic profiles in terms of bone uptake, clearance and ratio bone/non targeting organ and for that reason they were chosen to proceed with further studies in another animal model. The biodistribution studies in Balb-c mice and the scintigraphic images of Tc5 and Tc6 in Sprague Dawley confirmed their excellent biological behaviour, comparable or, in some cases, better compared to the one observed for the compound in clinical use 99mTc-MDP, studied in the same experimental conditions.

To explore the synthesis of a trifunctional complex, we tried toprepare a pyrazolyl-diamine ligand with a cytostatic compound (docetaxel) and a bisphosphonate unit. The obtained results were encouraging and must be continued.

ix Bisfosfonatos

Docetaxel

Complexos de tricarbonilo de 99mTc/Re Cintigrafia óssea

Terapia paliativa de metástases ósseas

Keywords

Bisphosphonates Docetaxel

99m

Tc/Re tricarbonyl complexes Bone scintigraphy

xi Agradecimentos……….iii Resumo……….v Abstract………vii Palavras-chave………ix Índice Geral………..xi Índice de Figuras………xvi Índice de Tabelas………..xxi Índice de Esquemas………xxiii Abreviaturas………xxv Preâmbulo……….… 1 1. INTRODUÇÃO……….……….……….. 7 1.1. Medicina Nuclear……….……… 7

1.1.1. Rádiofármacos: Conceitos Básicos……….. 7

1.1.2. Radiofármacos de 99mTc………..……….. 13

1.2. Oncologia e Metastização Óssea………..……….. 17

1.2.1. Cuidados Paliativos e Tratamento da Dor Relacionada com Metástases Ósseas………. 19

1.2.2. Bisfosfonatos: Mecanismo de Acção………..……….. 21

1.3. Complexos de 186/188Re e 99mTc para terapia ou diagnóstico de metástases ósseas………..……….………..……… ₂₄

1.3.1. Considerações Gerais………..……… 24

1.3.2. Complexos para Visualização e/ou Terapia de Metástases Ósseas………. 27

2. COMPLEXOS DE RE(I) E 99MTC(I) ESTABILIZADOS COM LIGANDOS BIFUNCIONAIS CONTENDO GRUPOS FOSFONATO………..………. 41

2.1. Considerações Gerais………..………. 41

2.2. Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato……….. 42

2.2.1. Síntese e Caracterização de Ligandos Pirazolo - Diamina Contendo um Grupo Monofosfonato (L1 - L3) ……….. ₄₂ 2.2.2. Síntese e Caracterização dos Complexos de Rénio Estabilizados por L1 47

xii

2.2.2.1. Caracterização do complexo Re1 por difracção de raios – X ………. 54

2.2.3. Síntese e Caracterização dos Complexos Tc1 e Tc2……… 56

2.2.4. Avaliação Biológica dos Complexos de 99mTc(I)……… 60

2.2.4.1. Estudos In Vitro………. 60

2.2.4.1.1. Estabilidade em Tampão Fosfato e em Soro Humano……….. 60

2.2.4.2. Estudos In Vivo………..……….………. 62

2.2.4.2.1. Estudos de Biodistribuição em Ratinhos CD-1……….. 62

2.2.4.2.2. Estabilidade In Vivo………..……….………….. 64

2.3. Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato……… 65

2.3.1. Síntese e Caracterização de Ligandos Pirazolo-Diamina Contendo Grupos Bisfosfonatos (L4 – L6) ……….………. 65

2.3.2. Síntese e Caracterização dos Complexos Re4 - Re6……….…………. 79

2.3.3. Síntese e Caracterização dos Complexos Tc4 -Tc6………. 89

2.3.4. Avaliação Biológica dos Complexos de 99mTc(I) ……….………. 92

2.3.4.1. Estudos In Vitro……….………. 92

2.3.4.1.1. Adsorsão à Hidroxiapatite (HA) ……….……… 92

2.3.4.2. Estudos In Vivo……….……….. 93

2.3.4.2.1. Biodistribuição e Estabilidade em Ratinhos CD-1……….. 93

2.3.4.2.2. Biodistribuição e Estabilidade em Ratinhos Balb-C……….. 95

2.3.4.2.3. Estabilidade de Tc5 e Tc6 em Ratinhos CD-1 e Balb-c………. 97

2.3.3. Comparação com o 99mTc-MDP……….……….. 98

2.4. Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos……….. 105

2.4.1. Considerações gerais……….. 105

2.4.2. Síntese e Caracterização de Compostos Trifuncionais Contendo Grupos Bisfosfonato………..…….109

2.4.3. Síntese e Caracterização do Complexo Tc7………..……125

2.4.4. Avaliação Biológica do Complexo Tc7………..……….127

2.4.4.1. Estudos In Vitro………..………. 127

2.4.4.1.1. Adsorção à hidroxiapatite (HA) ………..……… 127

2.4.4.1.2.Estabilidade em Cisteína e Histidina………..…………128

2.4.4.2.Estudos In Vivo………..………… 130

xiii

2.4.4.2.3.Estudos de Inibição da Fixação Renal……….………..132

3. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS……… 135

4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL……….. 153

4.1. Considerações Gerais……….……….153

4.2. Purificação de Solventes e Reagentes……….……….. 153

4.3. Técnicas de Purificação e Caracterização……… 154

4.4. Síntese de Compostos Potencialmente Úteis para Imagiologia Óssea………. 161

4.4.1. Síntese de Compostos Contendo o Grupo Éster fosfónico……….…………161

4.4.1.1. Procedimento Geral para a Síntese de (3-Bromopropil)Fosfonato de Dietilo (1) e de (2-Bromoetil)Fosfonato de Dietilo (2) ……….…………161

4.4.1.2. Síntese de t-butil 2-((3-(dietoxifosforil)propil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato (4) e t-butil 2-((2-(dietoxifosforil)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato (5) ………..… 162

4.4.1.3. Síntese de 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazolo-1-il)etil)amino)etilfosfonato de dietilo (L1) ………..……….. 163

4.4.2. Síntese de Compostos com um Grupo Ácido Fosfónico………164

4.4.2.1. Síntese de ácido 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilfosfónico (L2) e ácido 3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)propilfosfónico (L3) ………..………..164

4.4.3. Síntese de Compostos com o Grupo Bisfosfonato………..………….165

4.4.3.1. Síntese do Éster 1-aminometileno-1,1-bisfosfonato de tetraetilo (AMDP) ………..………… 165

4.4.3.2. Síntese de 7-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-13,13-dimetil-3,11-dioxo-12-oxa-2,7,10-triazatetradecano-1,1-diilbisfosfonato de tetraetilo (8) ₁₆₆ 4.4.3.3. Síntese de ácido (4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanamido)metilenobisfosfónico (L4) ……….………167

4.4.3.4. Síntese de Pamidronato (PAM) e Alendronato (ALN) ………..……..….168

4.4.3.5. Síntese de ácido 8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-16-hidroxi-2,2-dimetil-4,12-dioxo-3-oxa-5,8,13-triazahexadecane-16,16-diilbisfosfónico(10) 170 4.4.3.6. Síntese de ácido 3-(4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxipropane-1,1-diilbisfosfónico (L5)….………. 171 4.4.3.7. Síntese de ácido

xiv

il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxibutano-1,1-bisfosfónico (L6)……… 173 4.4.4 . Síntese de Derivados do Ácido Glutâmico e da β-alanina………. 174 4.4.4.1. Síntese de ácido 5-(benziloxi)-2-ftalimida-5-oxopentanóico (13)……….174 4.4.4.2. Síntese de 5,5-bis(dietoxifosforil)-4-ftalimida-5-hidroxipentanoato de

benzilo (16) ………..………175 4.4.4.3. Síntese de ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-bisfosfonopentanoico (18)………….. 177 4.4.4.4. Síntese de ácido

12-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-18,18-dimetil-3,8,16-trioxo-1-fenil-2,17-dioxo-7,12,15-triazanonadecano-6-carboxílico (21) 177 4.4.4.5. Síntese de 3-amino-1-hidroxypropano-1,1-diilbisfosfonato de tetrametilo

(Me-PAM) ……….…….. 178 4.4.4.6. Síntese de ácido

4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (24) ……….….………179 4.4.4.7. Síntese de ácido

4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (25) ……….…….181 4.4.4.8. Síntese de ácido

16-(terc-butoxicarbonilamino)-8-(2-(3,5-dimetil-1H-

pirazol-1-il)etil)-22-hidroxi-2,2-dimetil-4,13,17-trioxo-3-oxa-5,8,12,18-tetraazadocosano-22,22-diilbisfosfónico (27) ……….…..… 181 4.4.4.9. Síntese de ácido

4-(2-amino-5-(3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-

1-il)etil)amino)propilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (L7) ……….………..183 4.4.4.10. Síntese de ácido

4-(2-amino-5-(benziloxi)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (28) ……….………. 184 4.4.4.11. Síntese de 2’-sulfo-NHS-succinil-DTX (30) ……….………...185 4.4.4.12. Síntese de ALN-Glu-succinil-DTX (31) ……….………..186 4.4.4.13. Síntese de ácido

4-(2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)-5-t-butoxi-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutane-1,1-diilbisfosfónico (32) 187 4.4.4.14. Síntese ácido

4-(2-amino-5-t-butoxi-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (33) ………..……… 188 4.4.4.15. Síntese de ácido

4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (34) ………....………189 4.4.4.16. Síntese de ácido

4-((2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (35) ……….…………189 4.4.5. Síntese de Derivado do Composto Pirazolo-Diamina Funcionalizado na

xv

oxobutil)amino)etil)-3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)acetamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (36) ………..………….. 191

4.4.6. Síntese e Caracterização de Complexos de Re(I) ……….…….……. 193

4.4.6.1. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]+ (Re1) ……….……….… 193

4.4.6.2. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L2)]+ (Re2) ……….……….… 195

4.4.6.3. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L4)]+ (Re4) ……….…………. 195

4.4.6.4. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L5)]+ (Re5) ……….………. 199

4.4.6.5. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L6)]+ (Re6) ……….………. 201

4.4.7. Síntese dos complexos de 99mTc(I) ………. 203

4.4.7.1. Preparação do complexo precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+……….. 203

4.4.7.2. Procedimento Geral para a Síntese dos Complexos Tc1 – Tc7………. 203

4.5. Estudos In Vitro………..………... 204

4.5.1. Determinação da Carga e da Lipofilía dos Complexos……….. 204

4.5.2. Estabilidade In Vitro………..……….…………..205

4.5.3. Ligação à Hidroxiapatite……….……….…………..206

4.6. Estudos In Vivo………..……….……….206

4.6.1. Ensaios de Biodistribuição e Estabilidade In Vivo………..……... 207

4.6.2. Cintigrafia em câmara-gama………..………… 211

Referências Bibliográficas……….………..…. 215

Anexo: Espectros bidimensionais de Ressonância Magnética Nuclear (1H - 1H COSY e 1H - 13C HSQC……….……….……….. 229

xvi

Figura 1.1 - (A) Câmara PET; (B) Princípio geral da técnica PET e obtenção de imagem... 10 Figura 1.2 - Imagem SPECT renal, em função do tempo, após injecção de

99m

Tc-MAG3... 12

Figura 1.3 - Imagem cerebral obtida por SPECT (em cima) e PET (em baixo),

após injecção de [99mTc]TRODAT e [18F]FDG, respectivamente…... 13 Figura 1.4 - Representação esquemática de um radiofármaco que contém um

elemento de transição ou pós-transição: (A) de perfusão e (B)

específico... 14 Figura 1.5 - Estruturas de ligandos utilizados para preparação de

radiofármacos de 99mTc desenvolvidos antes de 1980... 15 Figura 1.6 - Radiofármacos de perfusão em utilização clínica... 15 Figura 1.7 - Estruturas de dois radiofármacos específicos em utilização

clínica... 17 Figura 1.8 - Processo de metastização óssea. ... 18 Figura 1.9 - Terapia paliativa de metástases ósseas... 19 Figura 1.10 - Estruturas do EDTMP (ácido

etilenodiaminatetrametilenofosfóni-co) e respectivo complexo com 153Sm……….……… 21

Figura 1.11 - Estrutura geral dos bisfosfonatos e do ácido pirofosfórico... 21 Figura 1.12 - Estrutura química de bisfosfonatos.... 22 Figura 1.13 - Processo de renovação óssea promovido pela acção dos

osteoblastos e osteoclastos... 23 Figura 1.14 - Complexos com a unidade nitreto [M ≡ N]2+…... 25 Figura 1.15 - Complexos com a unidade [99mTc-HYNIC]. ... 26 Figura 1.16 - Exemplos de complexos de tricarbonilo de Tc(I) com ligandos

tridentados……... ₂₆ Figura 1.17 - Fracções do polímero [Tc(MDP)(OH)-]∞. (A) O ligando MDP

estabelecendo a ponte entre dois centros Tc; (B) O metal

estabelece a ligação entre dois ligandos de MDP... 28 Figura 1.18 - (A) Imagem de corpo inteiro de coelho, 1 h após a injecção do

complexo 99mTc-EC-1 e 99mTc-MDP; (B) Imagem de corpo inteiro de macaco, 2 h após a injecção do complexo 99mTc-EC-1 e de

99m

Tc-MDP………. 30

xvii (222 MBq/kg) (A) e Re-HEDP (55,5 MBq/kg) (B). As setas

indicam o local onde foram injectadas as células do cancro da

mama MRMT-1……….. 31

Figura 1.20 - Sondas osteotrópicas Pam78 e Pam800 para imagem óptica……… 34 Figura 1.21 - Imagem bimodal SPECT (a cores)/CT (cinzento) obtida após

injecção de 99mTc-MDP (A) e de 99mTc-dpa-ALN (B) em ratinhos

Balb-c……….. 37 Figura 2.1 - Ligando bifuncional e respectivo complexo de tricarbonilo de Re

ou 99mTc, com um grupo R com afinidade para o osso... 41 Figura 2.2 - Esquema representativo de complexos trifuncionais com o

quelato pirazolo-diamina, contendo um grupo com afinidade

para o osso (R1) e uma molécula citótoxica (R2). ... 42 Figura 2.3 - Espectros de RMN de 1H (A), 13C (B) e 31P (C) do composto L2 em

D2O………... 45

Figura 2.4 - Espectro de IV de L2 entre 1900 – 500 cm-1 (KBr)……… 46 Figura 2.5 - Espectros de IV do complexo [ReBr(CO)5] e de Re1 em KBr, entre

2300 – 500 cm-1... 48 Figura 2.6 - Espectros de 1H-RMN dos compostos L1 e Re1 em CD3OD... 50

Figura 2.7 - Espectro de 13C-RMN do composto Re1 em CD3OD... 51

Figura 2.8 - Espectros de RMN de 31P do complexo Re1, em CD3OD (A), do

composto L1, em CD3OD (B), do complexo Re2 na presença de

ligando livre L2, em D2O (C) e, do ligando L2, em D2O (D)………. 52

Figura 2.9 - Cromatogramas analíticos de RP-HPLC do composto L2 e do

complexo Re2.... 53 Figura 2.10 - Diagrama ORTEP do catião do complexo Re1. Os elipsóides

vibracionais foram desenhados com uma probabilidade de 30 %.. 54 Figura 2.11 - Caracterização do precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ por RP-HPLC

após a sua preparação a partir de [99mTcO4]-. Detecção γ... 57

Figura 2.12 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos durante a optimização da

preparação do complexo Tc1... 58 Figura 2.13 - Cromatogramas de RP-HPLC de Re1 (detecção UV) e Tc1

(detecção γ)………... 59 Figura 2.14 - Cromatograma de HPLC de Tc1 (detecção γ) antes (A) e após (B)

incubação em soro humano... 61 Figura 2.15 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1

e Tc2... 63 Figura 2.16 - Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc2 e amostras 64

xviii

Figura 2.17 - Unidade quelante pirazolo-diamina funcionalizada com um grupo carboxilato para conjugação a um bisfosfonato através de uma

função amida..... 66 Figura 2.18 - ESI-MS do composto L5: (A) modo negativo; (B) modo positivo... 78 Figura 2.19 - Espectros de IV do precursor [Re(CO)3 (H2O)3]Br e dos complexos

Re5 e Re6 em KBr, na região 2100 – 1500 cm-1... 87 Figura 2.20 - ESI-MS do complexo Re6: (A) modo negativo; (B) modo positivo... 88 Figura 2.21 - Cromatogramas de RP-HPLC dos complexos Re4, Re5 e Re6

(detecção UV, 254 nm), e os respectivos complexos análogos Tc4, Tc5 e Tc6 (detecção γ)... 90 Figura 2.22 - Distribuição de actividade na tira de electroforese para Tc6... 91 Figura 2.23 - Percentagem de ligação de Tc5 e Tc6 à HA (1 h de incubação, a 37

°C) (n = 3)………..…… 92

Figura 2.24 - Fixação de Tc4 - Tc6 nos órgãos mais representativos de ratinhos

CD-1……….. 94 Figura 2.25 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc5 e Tc6, em

ratinhos Balb-C……….………. 96 Figura 2.26 - Cromatogramas de RP-HPLC da preparação inicial de Tc4 e de

urina e soro de ratinho CD-1, recolhidos 1 h após injecção deste complexo (detecção γ)……….……… 98 Figura 2.27 - Radiocromatograma de 99mTc-MDP em (A) acetona e (B) NaCl 0,9

%... 99 Figura 2.28 - Percentagem de ligação de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP à HA. A) 1h, 37

°C e B) 20 mg HA, 37 °C (n = 3)………. 99

Figura 2.29 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc5 - Tc6 e 99mTc-MDP, em

ratinhos CD-1 (A) e Balb-C (B)……… 101 Figura 2.30 - Razões de actividade no órgão alvo (osso) vs órgão não alvo para

Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP: A) ratinhos CD-1; B) Balb-c……….……….. 102 Figura 2.31 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho CD-1

(n = 4)……….. 103 Figura 2.32 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho Balb-c (n =

4)……… 104

Figura 2.33 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após

injecção de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, obtidas em câmara γ... 104 Figura 2.34 - Estrutura química do docetaxel (taxotere) e do paclitaxel (taxol)… 107 Figura 2.35 - (A) Estrutura de raios-X do heterodímero de tubulina com um

xix cérebro (B-brain) e uma molécula de placlitaxel ou docetaxel……..

Figura 2.36 - Estratégias para a síntese de ligandos trifuncionais a partir do

ácido glutâmico………. 110

Figura 2.37 - Unidades para a funcionalização do ácido glutâmico……… 111

Figura 2.38 - Espectros de RMN de 31P em CDCl3, dos compostos 16 e 17………… 113

Figura 2.39 - ESI-MS (-) dos compostos 18, 19 e 20………. 114

Figura 2.40 - Espectro de massa no modo negativo do composto 31 (impuro), obtido com ionização por electrospray……… 121

Figura 2.41 - Espectro de RMN de 1H do composto 33 em D2O……… 123

Figura 2.42 - ESI-MS (+) do composto 33……….. 124

Figura 2.43 - Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc7 (detecção γ)………… 126

Figura 2.44 - Estrutura química da cisteína e da histidina………. 128

Figura 2.45 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos após injecção do complexo Tc7, na presença de A) cisteína e B) histidina (detecção γ)………….. 129

Figura 2.46 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos após injecção do complexo Tc7, em amostras de urina de ratinho CD-1 (detecção γ)……….. 131

Figura 3.1 - Estrutura de raios - X do catião do complexo Re1 e ângulos e distâncias de ligação………. 138

Figura 3.2 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1 e Tc2………. 140

Figura 3.3 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc4 - Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinhos CD-1……….. 141

Figura 3.4 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após injecção de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, obtidas em câmara γ……… 144

Figura 3.5 - Representação das duas estratégias utilizadas para a síntese de complexos trifuncionais……….. 145

Figura 3.6 - Síntese do composto L7 (η = 10 %)……….. 145

Figura 3.7 - Estrutura química do intermediário ALN-Glu-succinil-DTX………. 146

Figura 3.8 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc7 em ratinhos CD-1……….. 147

Figura 3.9 - Perspectiva para a funcionalização do ácido glutâmico……….. 148

Figura 3.10 - Alternativa para a funcionalização do ácido glutâmico……….. 148

Figura 3.11 - Síntese de um complexo trifuncional a partir de pz4-COOH 149 Figura A.1 - Ampliação do espectro de 1H - 1H COSY de L5, na zona δ 4,4 - 1,6 (D2O)………. 229

xx

Figura A.4 - Ampliação do espectro de H - H COSY de Re5 na zona δ 4,5 - 1,7. 232 Figura A.5 - Espectro de 1H – 13C HSQC de Re5 (D2O)………. 233

xxi Tabela 1.1 - Tipo de partículas, características físicas e aplicação terapêutica... 9 Tabela 1.2 - Tumores primários com incidência de metástases ósseas ... 18 Tabela 1.3 - Características físicas dos radionuclídeos utilizados para terapia e

eficácia dos respectivos radiofármacos... 20 Tabela 2.1 - Comprimentos (Å) e ângulos (°) de ligação mais significativos para o

catião do complexo Re1……….. 55

Tabela 2.2 - Rendimentos e condições experimentais na síntese de Tc1…... 58 Tabela 2.3 - Tempos de retenção (min) obtidos nos cromatogramas de HPLC e

valores de Log D……….………… 60

Tabela 2.4 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (%

A.I.) para os complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea... 62 Tabela 2.5 - Condições experimentais estudadas para a síntese de 10 e 11 e

rendimentos das reacções………. 71

Tabela 2.6 - Dados de RMN dos compostos 8 e L4 em CDCl3 e D2O,

respectivamente………... 74 Tabela 2.7 - Dados de RMN dos compostos 10 e L5 em D2O………... 75

Tabela 2.8 - Dados de RMN dos compostos 11 e L6 em D2O... 76

Tabela 2.9 - Dados de RMN dos compostos [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ e Re4 em

D2O... 83

Tabela 2.10 - Dados de RMN dos compostos Re5 e Re6 em D2O……… 84

Tabela 2.11 - Dados de RMN de 31P de L4 - L6 e Re4 - Re6………. 86 Tabela 2.12 - Percentagem de ligação a 20 mg de HA, determinada para Tc5 e Tc6,

em função do tempo de incubação a 37 °C... 93 Tabela 2.13 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (%

A.I.) para os complexos Tc4 - Tc6 em ratinhos CD-1... 94 Tabela 2.14 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) para os

complexos Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-c…………... 96 Tabela 2.15 - Fármacos conjugados a uma unidade bisfosfonato e correspondente

indicação terapêutica………... 106 Tabela 2.16 - Percentagem de ligação à hidroxiapatite determinada a 37 °C para o

complexo Tc7, em função da massa de HA, e do tempo de

incubação……….……….………. ₁₂₇

xxii

Tabela 2.18 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) de Tc7, com e sem injecção de probenecide em ratinhos CD-1……….………… 132 Tabela 3.1 - Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho

CD-1……….………… 142

Tabela 3.2- Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho

Balb-c………..………..………… 143 Tabela 4.1- Dados cristalográficos do composto fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]Cl (Re1)……. 192

Tabela 4.2- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea………. 205 Tabela 4.3- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos

complexos Tc4, Tc5 e Tc6 em ratinhos CD-1……….. 206 Tabela 4.4- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos

complexos Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-c……….………. 206 Tabela 4.5- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do

complexo Tc7 em ratinhos CD-1……….……… 207 Tabela 4.6- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do

complexo 99mTc-MDP em ratinhos CD-1 e Balb-C……… 207 Tabela 4.7- Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) após administração

xxiii Esquema 1.1 - Síntese de oxo-complexos de 186Re, 99mTc e Re... 29

Esquema 1.2 - Síntese do complexo 99mTc-HYNIC-HP (η = 39 %)... 32 Esquema 1.3 - Síntese dos complexos Pam-M-800 (M = Re, 99mTc)... 33 Esquema 1.4 - Síntese dos complexos M-CpTR-Gly-PAM (M = Re, η = 21 %,

186

Re, η = 8 %)... 35 Esquema 1.5 - Síntese dos complexos M-dpa-ALN (M = 99mTc, 188Re, Re)... 37 Esquema 2.1 - Síntese dos compostos com grupos éster e ácido

monofosfónico... 43

Esquema 2.2 - Síntese dos complexos Re1 e Re2... 47 Esquema 2.3 - Síntese do precursor organometálico fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+... 56 Esquema 2.4 - Síntese dos complexos Tc1 e Tc2... 57 Esquema 2.5 - Síntese de aminobisfosfonatos: (A) AMDP; (B) PAM e ALN……….. 66 Esquema 2.6 - Síntese dos conjugados com bisfosfonatos L4 – L7……….…… 68 Esquema 2.7 - Síntese dos intermediários 10 e 11………. 69 Esquema 2.8 - Vias de síntese dos complexos Re4 - Re6……… 79 Esquema 2.9 - Síntese dos complexos Tc4 - Tc6……….. 89 Esquema 2.10 - Síntese do ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-difosfonopentanoico

(18)………. 111

Esquema 2.11 - Síntese do intermediário 21 e tentativas de síntese dos

compostos a - d……….……… 115

Esquema 2.12 - Síntese do Me-PAM……… 116 Esquema 2.13 - Tentativa de síntese do composto d………..………. 117 Esquema 2.14 - Síntese do composto L7……… 118 Esquema 2.15 - Síntese do intermediário 31 e estratégias para a síntese dos

compostos f - g que não foram testadas………. 120

Esquema 2.16 - Síntese dos compostos 33 e 35 e estratégia para a síntese do

composto j………. 122

Esquema 2.17 - Síntese do composto 36………. 125 Esquema 2.18 - Síntese do complexo Tc7………. 126 Esquema 3.1 - Síntese dos ligandos bifuncionais L1 - L6………. 136 Esquema 3.2 - Síntese dos complexos Re1, Re2, Tc1 e Tc2 com a unidade

monofosfonato………..…… 137

Esquema 3.3 - Síntese de Re4 - Re6 com unidades bisfosfonato……….. 137 Esquema 3.4 - Síntese dos complexos Tc1, Tc2, Tc4 - Tc6……….………. 139

xxv

ADN Ácido desoxiribonucleico

A.I./g Actividade injectada por grama de órgão

ALN Alendronato

BF Bisfosfonato

BM Biomolécula ou molécula biologicamente activa

Boc terc-butoxicarbonilo Bq Becquerel d Dupleto DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida DCU N,N’-diciclohexilureia DIPEA Diisopropiletilamina DMAP 4-(dimetilamino)piridina DMF N,N-dimetilformamida

DMSA Ácido dimercapto-succínico

DMSO Dimetilsulfóxido

DOTP Ácido 1,4,7,10–tetraazaciclododecano-1,4,7,10–tetrafosfónico

DTPA Ácido dietilenotriaminopentaacético

DTX Docetaxel

ECD Dímero de etilcisteína

EDC N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida cloridratada

EDTMP Ácido etilenodiaminatetrametilenofosfónico

ESI-MS Espetrometria de massa com ionização por electrospray

Et Etilo

fac Facial

[18F]FDG [18F]-2-fluoro-2-deoxi-D-glicose

Fmoc 9-Fluorenylmetoxicarbonilo

g gramas

Glu Ácido glutâmico

h Hora

HA Hidroxiapatite

HATU Hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiurónio

xxvi

HEDP Ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico ou etidronato HMDP Ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico

HMPAO Hexametilopropilenoamino oxima

HOBt Hidroxibenzotriazolo

His Histidina

HYNIC Ácido hidrazinonicotínico

Hz Hertz

ITLC Cromatografia em camada fina instantânea

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento (em Hertz) entre dois núcleos

L Ligando

Log D logaritmo do coeficiente de partição octanol-água

LET Transferência linear de energia

m Multipleto

MAG3 Mercaptoacetiltriglicina

MAMA Monoaminamonoamida

MAS3 S-acetilmercaptotriserina

MDP Ácido metilenodifosfónico ou medronato

Me Metilo

MeOH Metanol

min Minuto

MRI Imagiologia por ressonância magnética

NEt3 Trietilamina

NHS N-hidroxisuccinimida

NHS-sulfo N-hidroxi-3-sulfo-succinimida

NMM N-metilmorfolina

PAM Pamidronato

PBS Tampão fosfato salino

PET Tomografia de emissão de positrões

PFF Pentafluorofenol

Ph Grupo fenilo

p.i. Após injecção (post-injection)

Po/w Coeficiente de partição octanol/água

xxvii

RMN Ressonância magnética nuclear

RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa

rpm Rotações por minuto

s Singuleto

SPECT Tomografia computorizada de fotão único

t Tripleto

t.a. Temperatura ambiente

t1/2 Periodo de semi-desintegração

TFA Ácido trifluoroacético

TFF Tetrafluorofenol

THF Tetrahidrofurano

TLC Cromatografia em camada fina

tR Tempo de retenção

TSTU tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio

UV Ultravioleta Å _Angstron α α α α Alfa °C Graus centigrados δ δ δ δ Desvio químico γγγγ Gama η η η η Rendimento kn Hapticidade de um ligando ν ν ν ν Frequência de vibração

1

PREÂMBULO

O equilíbrio dinâmico entre a reabsorção e a formação óssea mediada pelos osteoclastos e pelos osteoblastos, respectivamente, é a base fisiológica da remodelação do osso, que é regulada por um sistema complexo de factores locais e sistémicos [1-3]. A perturbação deste equilíbrio origina patologias metabólicas benignas e malignas osteo-articulares, como por exemplo a osteoporose, a doença de Paget, o tumor ósseo e outras doenças associadas à destruição do osso [1, 2, 4].

A osteoporose, patologia caracterizada pela perda de massa óssea e pela fragilização do osso, é considerada um problema grave de saúde pública e afecta milhões de pessoas em todo o mundo. Devido ao aumento da esperança de vida esta patologia está a aumentar, principalmente nas mulheres.

No domínio da oncologia, os avanços terapêuticos têm também contribuído para o aumento da esperança média de vida, pelo que melhorar a qualidade da mesma tornou-se um desafio. Neste contexto, as metástases ósseas provocadas pelas doenças oncológicas têm merecido especial atenção visto que provocam complicações severas tais como dor óssea, fracturas patológicas, hipercalcémia e compressão da medula espinal. As metástases ósseas ocorrem em quase todos os tumores primários, sendo o tumor da próstata e o da mama os que mais metastizam (65 a 75 %) [5, 6]. Tendo em conta a elevada frequência com que ocorre a metastização e a diminuição da qualidade de vida daí decorrente, as metástases ósseas constituem também um problema de saúde pública de grande relevância.

Durante os últimos 30 anos, os bisfosfonatos (BFs) estabeleceram-se como uma nova e eficaz classe de fármacos para o tratamento de patologias metabólicas benignas ou malignas do sistema osteo-articular. Com o objectivo de aumentar a potência dos BFs, como agentes de anti-reabsorção óssea, várias alterações na estrutura química destes compostos foram realizadas. Os aminobisfosfonatos (e.g. pamidronato e alendronato, figura 1) que, tal como o seu nome indica, possuem uma função amina para além da unidade BF, têm demonstrado uma potência

anti-2

reabsortiva muito superior á dos BFs de primeira geração, como por exemplo o medronato (MDP) que só contém a função BF (figura 1). Devido à sua acção, estes compostos são reconhecidos como drogas efectivas na prevenção e na atenuação do aparecimento de fracturas ósseas, na compressão da medula espinal e na atenuação da dor associada ao aparecimento de metástases ósseas [7-11].

Figura 1

A acção in vivo destas moléculas deve-se à sua forte afinidade para ligação à hidroxiapatite (HA), nomeadamente para a apatite biológica cristalizada (Ca10(PO4)6(OH2)2, Ca / P = 1,66), que é o principal componente da matriz inorgânica do

osso (69 %). Essa elevada afinidade é explicada pela possibilidade que têm para se coordenar aos iões Ca2+, através dos oxigénios desprotonados das unidades fosfonato. A ligação dos BFs ao osso previne o crescimento de cristais e também a dissolução da HA (modelos in vitro e in vivo), à semelhança do que já tinha sido observado para os pirofosfatos [7, 8, 12]. Para além destes efeitos, as propriedades anti-reabsortivas dos BFs têm sido correlacionadas com efeitos celulares nos osteoclastos.

O sucesso clínico dos BFs está também associado à sua utilização como radiofármacos, que são compostos que têm na sua composição um elemento radioactivo e são utilizados para o diagnóstico ou terapia de certas patologias. No caso específico dos BFs, quando marcados com 99mTc foram utilizados na clínica para o diagnóstico de metástases ósseas. As imagens do osso são obtidas devido à presença do radionúclideo 99mTc, que no seu processo de desintegração emite radiação γ. Assim, após injecção intravenosa dos BFs marcados com 99mTc eles localizam-se no osso e a radiação emitida pelo radionuclídeo atravessa os tecidos e é detectada no exterior do corpo do paciente. Esta técnica nuclear, designada por Tomografia Computorizada de

3 Fotão Único (SPECT), permite a obtenção de imagens designadas por cintigrafia óssea [13].

Os BFs para cintigrafia começaram a ser estudados, no início dos anos 70, por Subramanian, Perez, Yano e colaboradores. Estes investigadores sintetizaram e avaliaram in vivo vários compostos contendo grupos fosfonato, nomeadamente 99m Tc-HEDP (Tc-HEDP: ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico), 99mTc-MDP (MDP: ácido metilenodifosfónico) e 99mTc-HDP (HDP: ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico) [14-17]. Alguns destes compostos foram aprovados nessa altura para utilização clínica, mas actualmente só o 99mTc-MDP e o 99mTc-HDP continuam a ser utilizados para obtenção de cintigrafias ósseas. Estes exames são normalmente recomendados para a detecção de metástases ósseas mas também para o estadiamento de tumores ou para a detecção de infecções ou de outras lesões traumáticas do osso [18]. Uma vantagem importante da utilização destes compostos é a elevada sensibilidade da técnica de imagem SPECT. A introdução nessa época destes radiofármacos sob a forma de kits contribuiu também para a sua popularidade. Os centros Medicina Nuclear recebiam uma mistura de reagentes liofilizados (kits) à qual adicionavam uma solução de [99mTcO4]- e a formação do complexo final ocorria quando o metal se coordenava ao

bisfosfonato. Embora a verdadeira estrutura química destes compostos não seja conhecida, pensa-se que, após adição do [99mTcO4]-, se forma uma mistura de espécies

[19, 20]. A fixação ao osso tem sido explicada considerando que após ligação do BF ao

99m

Tc ainda restam alguns grupos BFs livres para ligação aos iões Ca2+, que se encontram expostos na superfície da HA. Esta fixação é mais significativa em zonas metabolicamente activas da matriz óssea o que permite a visualização de locais de elevada remodelação óssea [21].

A utilização de BFs como transportadores de radiação β

também foi aplicada com sucesso na preparação de radiofármacos para tratamento paliativo da dor óssea. Encontram-se actualmente em utilização clínica alguns compostos, como por exemplo o 153Sm-EDTMP (EDTMP: ácido etilenodiaminatetrametilenofosfónico), o 186Re-HEDP e o 188Re-HEDP [22-25].

4

Recentemente, os BFs têm também sido considerados bons veículos para diferentes tipos de fármacos que, após conjugação à unidade bisfosfonato, têm sido utilizados para tratamento específico de patologias osteo-articulares, como a osteoporose, a osteoartrite, infecções crónicas e tumor ósseo [26, 27].

O trabalho apresentado nesta tese tinha como principal objectivo explorar a química, radioquímica e o comportamento biológico, incluindo a afinidade para o osso, de novos complexos de 99mTc contendo BFs. Pretendíamos explorar complexos deste metal com estrutura química bem definida e os que apresentassem boa afinidade para o osso deveriam ser ligados a moléculas citotóxicas. A síntese dos complexos análogos de 188Re ou de 186Re era também um dos objectivos. Assim, os novos complexos seriam constituídos por uma unidade BF, que conferia afinidade para o osso, uma molécula com acção citotóxica e um elemento radioactivo emissor de radiação ionizante (β) com capacidade para destruir células cancerígenas. Esperávamos que a utilização destes complexos multifuncionais pudesse apresentar vantagens sobre a utilização das actuais terapias múltiplas: quimioterapia seguida de radioterapia sistémica com um radiofármaco.

No capítulo 1 apresenta-se uma introdução geral sobre medicina nuclear, oncologia e metastização óssea. Faz-se também uma breve referência ao tratamento paliativo da dor óssea e apresentamos os complexos de 186/188Re e 99mTc explorados até ao momento para terapia e diagnóstico de metástases ósseas.

No capítulo 2 descreve-se a síntese, caracterização e avaliação biológica dos novos complexos de Re e 99mTc contendo uma unidade monofosfonato ou bisfosfonato. Descrevemos ainda as vias de síntese exploradas para a obtenção de compostos contendo uma unidade citotóxica, um grupo bisfosfonato e um radionuclídeo emissor de radiação β.

No capítulo 3 apresentam-se as conclusões finais e as perspectivas para continuar este trabalho.

5

Nova secção

7

1 - Introdução

1.1 – MEDICINA NUCLEAR

1.1.1 – Radiofármacos: Conceitos Básicos

A medicina nuclear é uma especialidade da medicina que recorre à administração de radiofármacos para diagnóstico ou terapia de certas patologias. Os radiofármacos são compostos sem acção farmacológica que contêm na sua composição um radionuclídeo emissor de radiação electromagnética e/ou partículas ionizantes.

De um modo geral, os compostos concebidos para aplicação radiofarmacêutica deverão possuir determinadas propriedades, tais como: serem adequados para a administração em pacientes, serem estáveis in vivo e, idealmente, serem selectivos para o órgão alvo. Estes compostos são geralmente preparados sob a forma de uma solução injectável e a estabilidade é avaliada face à hidrólise, oxidação, redução, transquelatação e transmetalação. A selectividade e a farmacocinética dos compostos são avaliadas através de estudos de biodistribuição in vivo. No que diz respeito à farmacocinética, ela depende de vários factores, nomeadamente, solubilidade/lipofilía, carga ou peso molecular [28-31].

A selecção do radionuclídeo, em função das suas características nucleares, é fundamental pois determina a aplicabilidade do radiofármaco em diagnóstico ou terapia.

Os radionuclídeos são nuclídeos instáveis que se transformam noutros elementos emitindo radiação γ e/ou partículas α, β-_{, β}+

ou electrões Auger. A selecção de um radionuclídeo para diagnóstico ou terapia depende de diferentes parâmetros, tais como a natureza da radiação e/ou partículas emitidas, a sua energia, o período de semi-desintegração, o modo de produção, a pureza radionuclídica com que podem ser obtidos e o seu custo/disponibilidade. O período de semi-desintegração (t1/2) é o

8

tempo necessário para que o número de átomos radioactivos existentes num dado instante se reduza a metade [28, 32].

Os compostos radioactivos para terapia deverão possuir na sua composição um radionuclídeo emissor de partículas α, β- ou electrões Auger, pois este tipo de partículas é ionizante e permite a destruição dos tecidos alvo. O radionuclídeo deve possuir um período de semi-desintegração adequado à duração do tratamento e as partículas emitidas devem ter uma energia adequada às dimensões do tumor e à farmacocinética do radiofármaco. Os emissores β

têm sido os mais explorados, até ao momento, para a aplicações terapêuticas, sendo alguns exemplos o 32P (t1/2 = 14,3

dias; Eβ-(max) = 1,71 MeV), 90Y (t1/2 = 2,7 dias; Eβ-(max) = 2,27 MeV), 131I (t1/2 = 8,0 dias; Eβ -(max) = 0,81 MeV), 153Sm (t1/2 = 1,9 dias; Eβ-(max) = 0,8 MeV), 166Ho (t1/2 = 1,12 dias; Eβ-(max)

= 1,86 MeV) e 177Lu (t1/2 = 6,7 dias;Eβ-(max) = 0,5 MeV).

A emissão de raios γ pode acompanhar a emissão de partículas, como acontece por exemplo com o 131I, 153Sm, 166Ho e 177Lu, mas não contribui para a eficácia da terapia, aumentando apenas a dose de radiação para o paciente. No entanto, sempre que essa radiação γ tenha energia adequada para a obtenção de imagem pode tornar-se vantajosa pois permite acompanhar in vivo a biodistribuição do radiofármaco e seguir a sua acção terapêutica [25, 33].

A investigação de radiofármacos com radionuclídeos emissores de partículas α ou electrões Auger encontra-se ainda numa fase inicial de investigação. No que diz respeito aos radionuclídeos emissores de partículas α, a maioria tem períodos de semi-desintegração demasiado longos para serem compatíveis com a sua aplicação terapêutica. Por outro lado, a sua produção em larga escala e com pureza aceitável é ainda difícil, pelo que apenas o 211At (t1/2 = 7,2 h, Eα(média) = 6,8 MeV) e o 212Bi (t1/2 = 1

h, E_α(média) = 7,8 MeV) têm sido considerados para terapia.

Os emissores de electrões Auger, tais como o 125I (t1/2 = 60,5 d, 20

electrões/decaimento), 111In (t1/2 = 67,9 h, 15 electrões/decaimento), 195mPt (t1/2 = 4 d,

36 electrões/decaimento) e 99mTc (t1/2 = 6,02 h, 4 electrões/decaimento), têm vindo a

9 Auger, devido ao curto alcance destas partículas, têm que ser concebidos por forma a entrarem no núcleo das células tumorais e interactuarem com o ADN [34].

Como podemos observar através dos dados da tabela 1.1, a cada tipo de partícula (α, β

ou electrões Auger) está associado um determinado valor de transferência linear de energia (LET) e, consequentemente, um determinado alcance médio nos tecidos. Por esta razão, o tipo de partículas a seleccionar deverá depender das características do tumor. As partículas α ou os electrões Auger são mais adequados para o tratamento de pequenos aglomerados de células tumorais, enquanto as partículas β serão apropriadas para massas tumorais de maior dimensão.

Tabela 1.1 – Tipo de partículas, características físicas e aplicação terapêutica [34, 35].

Tipo de partículas Alcance médio nos tecidos Transferência linear de energia Tipo de tratamentos ββββ 1 – 12 mm

(>50 diâmetros celulares) 0,2 KeV/µm Massas tumorais α

α α

α 40 – 100 µm

(algumas células)

80 keV/µm _{individuais ou} Células clusters Electrões Auger <1 µm (núcleo celular) 4 keV/µm Células individuais

Os radiofármacos utilizados para diagnóstico têm na sua composição radionuclídeos emissores de radiação γ ou de partículas β+

. Idealmente, esses radionuclídeos devem ter periodos de semi-desintegração relativamente curtos, para minimizar a dose de radiação para o paciente, mas suficientemente longos para permitirem a preparação, administração, distribuição e acumulação do radiofármaco nos órgãos ou tecidos alvo e para permitir a aquisição da imagem [28].

10

Em medicina nuclear existem duas técnicas para obtenção de imagem: a Tomografia de Emissão de Positrões (PET – Positron Emission Tomography) e a Tomografia Computorizada de Fotão Único (SPECT – Single Photon Emission

Computerized Tomography). A técnica PET utiliza radiofármacos emissores de

positrões (β+_{) e a SPECT utiliza radiofármacos emissores de radiação γ.}

Na técnica PET, a detecção simultânea de dois fotões γ de 511 KeV emitidos em direcções opostas, e que resultam de uma reacção de aniquilação entre o positrão emitido pelo radiofármaco e os electrões dos tecidos circundantes, permite a localização in vivo do radiofármao. Usando múltiplos detectores dispostos de um modo circular é possível adquirir imagens tridimensionais (figura 1.1).

Figura 1.1 –(A) Câmara PET; (B) Princípio geral da técnica PET e obtenção de imagem.

Os radionuclídeos usados em PET são na sua maioria produzidos por ciclotrão, sendo os mais utilizados o 18F (t1/2 = 110 min; Eβ+(max) = 0,64 MeV), 15O (t1/2 = 2 min;

Eβ+(max) = 1,72 MeV), 13N (t1/2 = 10 min; Eβ+(max) = 1,19 MeV), e 11C (t1/2 = 20 min; Eβ+(max)

= 0,96 MeV). Todos estes radionuclídeos apresentam um período de semi-desintegração curto, o que é uma desvantagem, especialmente para os centros de medicina nuclear que não possuam um ciclotrão [28, 36, 37]. O aparecimento recente de geradores de radionuclídeos emissores de positrões, tal como o gerador 68Ge/68Ga, aumenta a possibilidade de utilização da técnica PET. O 68Ge, a partir do qual se obtém

11 o 68Ga, possui um período de semi-desintegração de 270,8 dias o que permite a manufactura de sistemas de geradores de longa duração (entre 1 a 2 anos) [38-40].

A técnica SPECT utiliza radiofármacos que têm na sua composição radionuclídeos emissores γ como o 99m

Tc (t1/2 = 6,02 h, Eγ (89 %)= 140 KeV), 111In (t1/2 =

67,9 h, Eγ (90 %)= 245 KeV), 123I (t1/2 = 13,20 h, Eγ (84 %) = 159 KeV), 67Ga (t1/2 = 78,26 h,

Eγ = 92 KeV (64 %), 180 KeV (24 %), 300 KeV (22 %)), e 201Tl (t1/2 = 72 h, Eγ = 167 KeV (10

%), 135 KeV (3 %)). A energia da radiação γ emitida por estes radionuclídeos está compreendida entre 80 e 300 KeV, valores que são adequados para que sejam detectados com eficiência pela câmara SPECT actualmente em utilização [41-43].

As técnicas PET e SPECT, quando comparadas com outras técnicas convencionais de imagem, nomeadamente com a tomografia computorizada (CT) e a imagiologia por ressonância magnética (MRI), possuem uma sensibilidade superior. Além disso, uma vantagem fundamental associada às técnicas nucleares relaciona-se também com a possibilidade de, simultaneamente, se poder obter informação morfológica e funcional dos órgãos e tecidos alvo em estudo. Por exemplo, a função cardíaca pode ser avaliada após administração de um dado radiofármaco e a aquisição de imagem pode ser realizada em situação de repouso ou de esforço físico. Outro exemplo consiste na avaliação da função renal, após administração de um radiofármaco e aquisição de imagens ao longo do tempo [28]. Como exemplo, apresentam-se na figura 1.2 imagens renais e um renograma, obtidos após administração de 99mTc-MAG3, que é um radiofármaco de perfusão utilizado para

estudar a morfologia e a função renal. A avaliação das imagens, em conjugação com o renograma, permite concluir que o rim esquerdo apresenta uma anomalia de funcionamento.

12

Figura 1.2 - Imagem SPECT renal, em função do tempo, após injecção de 99mTc-MAG3 [44].

Qualquer uma destas técnicas, SPECT e PET, permite também obter informação

in vivo, ao nível molecular, podendo quantificar a sobre-expressão de receptores,

enzimas ou outros alvos moleculares [45]. Na figura 1.3, podem observar-se as imagens obtidas por SPECT e PET, após injecção de [99mTc]TRODAT e [18F]FDG, emissores γ e β+, respectivamente. O [99mTc]TRODAT possui especificidade para os transportadores da dopamina, permitindo detectar a sub-expressão destes alvos moleculares nos pacientes com a doença de Parkinson. A [18F]FDG permite a detecção de determinadas patologias onde o metabolismo da glucose é alterado relativamente ao normal. Como se mostra na figura 1.3, apesar deste composto não ser específico para nenhum receptor ou alvo molecular, permite a detecção da doença de Alzheimer pelo facto do metabolismo da glucose estar diminuído.

Rim Esquerdo Rim Direito minutos Contagens/min

2 - 3 minutos - Captação 19 - 20 minutos - Excreção

Rim Direito Rim Direito Rim Esquerdo Rim Esquerdo

13

Figura 1.3 - Imagem cerebral obtida por SPECT (em cima) e PET (em baixo), após injecção de

[99mTc]TRODAT e [18F]FDG, respectivamente [46, 47].

1.1.2 - Radiofármacos de 99mTc

O tecnécio – 99m é o radioisótopo mais utilizado em exames de diagnóstico, o que se deve essencialmente às propriedades nucleares acima referidas (t1/2, Eγ(max)), à

sua disponibilidade a baixo custo, ao modo de fornecimento (gerador de 99

Mo/99mTc) e à sua química variada.

Os radiofármacos que têm este elemento na sua composição, podem ser classificados genericamente de acordo com as suas características de biodistribuição como agentes de perfusão (figura 1.4, A) ou como agentes específicos (figura 1.4, B). Os radiofármacos de perfusão são compostos cujas propriedades físico-químicas, nomeadamente o tamanho, carga e lipofilia, determinam a sua biodistribuição. Os radiofármacos específicos são compostos cuja biodistribuição depende das suas propriedades físico-químicas, mas também da natureza da biomolécula que existe na sua composição. Quando um radiofármaco específico contém na sua composição um elemento de transição ou de pós-transição é normal que este seja estabilizado por um ligando bifuncional. O ligando bifuncional é um composto orgânico que

PACIENTE COM PARKINSON INDIVÍDUO SAUDÁVEL SPECT: [99mTc]Trodat PET: [18F]FDG PACIENTE COM ALZHEIMER INDIVÍDUO SAUDÁVEL

14

simultaneamente estabiliza o elemento de transição ou pós-transição, ao qual se coordena, mas também estabelece a ligação desse elemento a uma biomolécula que pode ser, por exemplo, um péptido, um anticorpo monoclonal ou uma pequena molécula com especificidade para um dado alvo [43].

(

(AA)) Radiofármaco de perfusão

(

(BB)) Radiofármaco específico

Figura 1.4 - Representação esquemática de um radiofármaco que contém um elemento de transição ou pós-transição: (A) de perfusão e (B) específico.

O pertecnetato de sódio (Na[99mTcO4]) foi o primeiro composto de tecnécio a

ser administrado a doentes para visualização da tiróide, onde se fixava devido ao facto de ter uma carga idêntica à do ião iodeto, que também se acumula preferencialmente nesta glândula [48].

De seguida, surgiram outros radiofármacos de perfusão de 99mTc, onde o metal, num estado de oxidação reduzido, era estabilizado por ligandos com estruturas conhecidas (figura 1.5). Por exemplo, os complexos 99mTc-gluconato, 99m Tc-glucoheptonato, 99mTc-DMSA e 99mTc-DTPA localizavam-se nos rins e serviam para o estudo da função renal. Os complexos 99mTc-MDP, 99mTc-HMDP e 99mTc-HEDP surgiram também nessa época para o estudo do osso [49].

15

Figura 1.5 – Estruturas de ligandos utilizados para preparação de radiofármacos de 99mTc desenvolvidos antes de 1980. (DMSA, ácido dimercapto-succínico, DTPA, ácido dietilenotriaminapentaacético, MDP, ácido metilenodifosfónico ou medronato,

HMDP, ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico e HEDP, ácido

1-hidroxietano-1,1-difosfónico ou etidronato).

Quando surgiram estes radiofármacos a química básica do tecnécio não estava muito desenvolvida e a caracterização estrutural dos novos complexos não era um requisito indispensável para a sua aprovação clínica.

Na década de 80 do século passado, outros radiofármacos de perfusão com estrutura bem definida foram introduzidos no mercado. Por exemplo, os complexos neutros e lipofílicos 99mTc-ECD e 99mTc-HMPAO são agentes de perfusão cerebral, os complexos catiónicos e lipofílicos 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosmina são agentes de perfusão do miocárdio e o 99mTc-MAG3 aniónico é um agente de perfusão renal (figura

1.6) [49].

Figura 1.6 – Radiofármacos de perfusão em utilização clínica.

99m Tc-ECD (Neurolite®) Uso clínico: perfusão cerebral 99m Tc-HMPAO (Ceretec®) Uso clínico: perfusão cerebral 99m Tc-MAG3 (Technescan® MAG3) Uso clínico: imagem renal 99m Tc-Tetrofosmina (Myoview®) Uso clínico: perfusão do miocárdio 99m Tc-Sestamibi (Cardiolite®) Uso clínico: perfusão do miocárdio; tumor da mama Tc C C C C C C N N N N N N R R R R R R OMe R =

16

Mais recentemente, tem-se desenvolvido uma investigação intensa no sentido de encontrar radiofármacos específicos. Os avanços científicos conseguidos devem-se em parte à intensa investigação em biologia molecular e, consequentemente, à identificação e compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pelo aparecimento de determinadas patologias. De toda esta temática surgiu o conceito de imagiologia molecular que consiste na visualização, caracterização e medição in vivo e em tempo real de processos biológicos que decorrem ao nível celular ou molecular. Comparativamente a outras técnicas convencionais, a Imagiologia Molecular pode permitir um diagnóstico precoce de certas patologias, visto que as alterações a nível molecular precedem as alterações anatómicas. [38, 50-57].

Na figura 1.7 apresentam-se as estruturas químicas de dois exemplos de radiofámacos específicos de 99mTc, nomeadamente o 99mTc-Depreotide (NeoTect®) e o

99m

Tc-Apcitide (Acutect®) [32]. O 99mTc-Depreotide é um oxo-complexo de 99mTc(V) estabilizado por um ligando tetradentado ligado a um péptido análogo da somatostatina. Este radiofármaco permite a localização de tumores pulmonares porque reconhece os receptores da somatostatina, que estão sobreexpressos neste tipo de tumores.

O 99mTc-Apcitide é um oxo-complexo monoaniónico de 99mTc(V) estabilizado por um ligando tetradentado ligado a um péptido sintético que permite a visualização de tromboses venosas agudas nas extremidades inferiores. A especificidade deste radiofármaco advém da sua interacção específica com os receptores GPIIb/IIIa que estão sobreexpressos nas plaquetas activadas, componente principal na formação activa de trombos.

17

Figura 1.7 - Estruturas de dois radiofármacos específicos em utilização clínica.

1.2 - ONCOLOGIA E METASTIZAÇÃO ÓSSEA

A diferença essencial entre tumores benignos e malignos reside no facto dos primeiros serem facilmente controláveis e não cancerígenos, enquanto os segundos têm a capacidade de metastizar ou invadir outros tecidos. A probabilidade de formação de metástases ósseas, após o aparecimento de um tumor primário maligno, depende do tipo de tumor diagnosticado. Na tabela 1.2 apresentam-se alguns tumores primários bem como a sua probabilidade de metastização óssea. Por exemplo, a percentagem de incidência de metástases ósseas encontra-se entre 65 e 75 % nos pacientes com cancro de mama ou próstata e entre 70 e 95 % nos pacientes com mieloma. Outros tumores primários estão também associados ao aparecimento de metástases ósseas embora com menor incidência, nomeadamente o tumor da tiróide (60 %), do pulmão (30 – 40 %), do rim (20 – 25 %), melanoma (14 - 45 %) e da bexiga (40 %) [58].

99m

Tc-Depreotide (NeoTect®) 99m

18

Como esquematizado na figura 1.8, a metastização óssea ocorre quando as células tumorais conseguem separar-se de um tumor primário (A), seguindo-se a angiogénese, isto é, a formação de novos vasos sanguíneos que facultam o fornecimento de nutrientes e oxigénio às células do tumor (B), a invasão de células malignas através da circulação sanguínea (C), embolismo (D), retenção das células malignas seguida da adesão em capilares do tecido ósseo distante (E e F), extravasão (G) e a proliferação no microambiente ósseo.

Figura 1.8– Processo de metastização óssea. Adaptado de [59].

Tabela 1.2 – Tumores primários com incidência de metástases ósseas.

Tumor primário Incidência

Metastização Óssea (%) Mieloma 70 - 95 Mama 65 - 75 Próstata 65 - 75 Tiróide 60 Pulmão 30 - 40 Rim 20 - 25 Melanoma 14 - 45 bexiga 40

A. Tumor primário B. Formação de novos vasos sanguíneos C. Invasão de tecidos

adjacentes D. Embolismo E. Retenção em capilares de tecidos ósseos distantes F. Adesão G. Extravasão do caplilar sanguíneo

A metastização ósse um conjunto de patologi compressão da medula espin

Frequentemente, a do seguem as fracturas, a lib ocorrer a compressão da m com que ocorrem e a diminu metástases ósseas constitue

1.2.1 - Cuidados Paliativos e

A terapia das metásta fracturas patológicas e sobrevivência. De acordo co local, através de cirurgia analgésicos, hormonoterap (figura 1.9) [6, 22, 60].

Figura 1.9 – Terapia paliativa d

LOCAL

Radiotera Externa

Cirurgi

ssea provoca o enfraquecimento sucessivo do logias, tais como dor óssea, fracturas, hip espinal.

a dor óssea é o primeiro sinal de metastizaçã libertação de cálcio (hipercalcémia) e final a medula espinal [58]. Tendo em conta a eleva minuição da qualidade de vida que provocam no

ituem um problema de saúde pública de grande

os e Tratamento da Dor Relacionada com Metá

tástases ósseas tem como objectivo aliviar a do conservar a actividade e mobilidade, a o com a avaliação clínica do paciente o tratam gia e radioterapia externa, ou sistémico, isto erapia, quimioterapia, radiofármacos ou bisfo

iva de metástases ósseas. Adaptado de [61].

TRATAMENTO PALIATIVO DE METÁSTASES ÓSSEAS terapia terna urgia SISTÉMICO Analgésicos Hormonotera Quimioterap Bisfosfonato Radiofármac 19 do osso e origina hipercalcémia e ização, ao qual se inalmente poderá elevada frequência nos pacientes, as nde relevância. etástases Ósseas dor, prevenir as , aumentando a tamento pode ser isto é utilizando bisfosfonatos (BF) sicos terapia erapia natos macos