Síntese e atividade microbiana de nanopartículas metálicas

Gabriela Consolini

Síntese e atividade microbiana de

nanopartículas metálicas

Poços de Caldas / MG Novembro de 2015

Gabriela Consolini

Síntese e atividade microbiana de

nanopartículas metálicas

Trabalho de conclusão de curso apresentado à Universidade Federal de Alfenas como parte dos requisitos para a obtenção do título de Engenheira Química sob orientação da Profª. Drª. Tania Regina Giraldi.

Poços de Caldas / MG Novembro de 2015

FICHA CATALOGRÁFICA

C755s Consolini, Gabriela .

Síntese e atividade microbiana de nanopartículas metálicas. /Gabriela Consolini.

Orientação de Tania Regina Giraldi. Poços de Caldas: 2015.

21 fls.: il.; 30 cm.

Inclui bibliografias: fl. 20-21

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Engenharia Química) – Universidade Federal de Alfenas– Campus de Poços de Caldas, MG.

1. Nanopartículas. 2. Ácidos húmicos. 3. Nanotecnologia..

I . Giraldi, Tania Regina.(orient.).II. Universidade Federal de Alfenas – Unifal III. Título.

RESUMO

A nanociência consiste no estudo das propriedades, utilização e fenômenos de materiais que apresentam escala nanométrica, e possibilita o avanço de um campo que está crescendo e ganhando importância devido a sua variedade de aplicações, a nanotecnologia. A produção de nanopartículas (NPs) aumenta a cada dia e suas aplicações são inúmeras, porém seu impacto no ambiente e consequentemente na saúde da população deve ser tratado com certo cuidado. O objetivo deste trabalho foi estudar alguns métodos de síntese de NPs de prata e ouro, e utilizá-las em interação com as substâncias húmicas. Além disso, avaliou-se o comportamento de bactérias na presença destas NPs, a fim de simular seu descarte nomeio ambiente. Enfim, com este projeto, comprovou-se a eficácia do método de síntese de NPs de prata e de ouro, sendo ele de bottom up utilizando a redução química, estudou-se a interferência do ácido húmico no processo de aglomeração dessas NPs, além de sua toxicidade em bactérias.

Sumário

5.1.1. Nanopartículas de prata funcionalizadas com citrato de sódio... 11

5.1.2. Nanopartículas de prata funcionalizadas com ácido húmico ... 11

5.1.3. Nanopartículas de ouro funcionalizadas com citrato de sódio ... 11

5.1.4. Nanopartículas de ouro funcionalizadas com ácido húmico ... 12

5.2. Caracterização de nanopartículas de prata e ouro ... 12

5.2.1. Espectrofotometria de UV-visível ... 12

5.2.2. Espalhamento dinâmico de luz (DLS) ... 12

5.3. Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata ... 12

6. Resultados e Discussão ... 13

6.1. Formação e Estabilidade das nanopartículas metálicas ... 13

6.2. Interação entre as nanopartículas metálicas e ácido húmico com controle de pH e força iônica... 15

6.3. Influência das nanopartículas de prata no crescimento de bactérias ... 18

7. Conclusão ... 20

1. Introdução

O estudo de nanopartículas teve início há mais de cem anos, e ainda continua em ascensão. Faraday, em 1857, desenvolveu alguns experimentos com nanopartículas de ouro e, nos dias atuais, a tecnologia está evoluindo e levando as pesquisas para a escala nanométrica (BLACKMAN, 2008). Outro importante precursor da nanotecnologia foi Richard Feynman, ganhador do prêmio Nobel de Física em 1965, que propôs a manipulação de átomos individuais para fornecer um novo material com propriedades novas, prevendo o potencial tecnológico das nanoestruturas (ROZ; et. al., 2015).

A habilidade de manipular, criar e controlar materiais e objetos na escala nanométrica com o objetivo de produzir novos materiais que contém determinadas propriedades é chamada de nanotecnologia. Estudar esses procedimentos possibilita o alcance de um campo que está crescendo e ganhando importância devido a sua variedade de aplicações (BLACKMAN, 2008).

Nanopartículas (NPs) podem ser encontradas na natureza. Alguns exemplos são os óxidos de ferro, substâncias húmicas e também polissacarídeos e peptidoglicanos. Estas NPs naturais podem ser encontradas como um resultado do intemperismo mineral e também a atividade microbiana. Conhecer o impacto destas NPs no ambiente juntamente com suas propriedades químicas, facilita a compreensão de seu comportamento em várias vertentes, como, por exemplo, em efluentes, uma vez que elas estão em elevadas concentrações e podem causar efeitos prejudiciais ao ciclo biológico do corpo d’água onde são descartadas. Uma função das NPs naturais é fazer com que o transporte de contaminantes nas águas superficiais seja mais fácil e evitar a contaminação de determinada região. Porém, caso ocorra a agregação de partículas maiores, essas podem bloquear a ação das NPs, ocorrendo sedimentação das mesmas. (JU-NAM; LEAD, 2008).

As NPs também podem ser sintetizadas em laboratório, o que possibilita obter materiais com tamanhos e formas controlados, gerando modificações das propriedades físicas e químicas do material em relação a sua escala micrométrica. Estas NPs têm muitas aplicações, tais como em ciências biológicas, medicina, indústria farmacêutica, cosméticos e eletrônicos e está sendo expandido cada vez mais para satisfazer os interesses das indústrias, dos cientistas e do governo (JU-NAM; LEAD, 2008).

2. Revisão bibliográfica

Quando em escala nanométrica, os materiais têm propriedades e características diferentes daquelas em tamanho usual. Isto ocorre devido ao número de átomos na superfície que causa diferentes efeitos deste material quando submetido a determinadas condições (JU-NAM; LEAD, 2008).

A nanotecnologia abrange várias áreas como a mecânica, a óptica, a medicina, a eletrônica, entre outras, sendo considerada uma área multidisciplinar. Novas estruturas de NPs vêm sendo estudadas e desenvolvidas para poder obter novas propriedades e aplicações desses nanomateriais. As propriedades das NPs são diferentes das partículas em escala maior, pois materiais brutos se comportam de acordo com a mecânica clássica, mas quando em nano escala as partículas têm um comportamento individual e são regidas pela mecânica quântica. Um exemplo é o de alguns materiais cerâmicos frágeis que, quando apresentam partículas reduzidas a escala nanométrica, apresentam características como maleabilidade e maior deformação (GARCIA, 2011).

Além de NPs cerâmicas, NPs metálicas vêm sendo alvo de estudos, como por exemplo, de prata e ouro. Dentre uma variada gama de materiais, NPs de prata têm sido bastante estudadas, por apresentarem uma ampla variedade de aplicações. Assim como todos os materiais nanométricos, descargas de NPs de prata devem ser controladas e mantidas em um limite para evitar danos aos seres vivos e ao meio ambiente. O perigo que apresenta essas NPs é a capacidade delas em interferir na força motriz de prótons, na geração de ATP, na permeabilidade da membrana e em muitas outras funções nas células (CUMBERLAND; LEAD, 2009).

Um estudo feito por Agnihotri et al mostrou que ao introduzir NPs de prata em soluções contendo bactérias do tipo E. coli e também B. subtilis houve um impacto no crescimento desses microorganismos. O crescimento bacteriano diminuiu de acordo com o aumento da concentração de NPs (AGNIHOTRI; et al., 2014).

Outro tipo de NPs sintéticas que vêm atraindo a atenção dos pesquisadores são as NPs de ouro. Isto porque apresentam propriedades e aplicações em diversas áreas, entre elas, catálise, óptica e eletrônicos. São também parte de compósitos, quando adicionados aos polímeros e podem ser aplicadas em recipientes plásticos, roupas e sapatos (DIEGOLI; et. al., 2008). Lin et. al mostraram como NPs de ouro podem ser utilizadas na detecção de doenças infecciosas. A técnica utilizada foi de mudança de cor em que observou-se a olho nu a

presença de antígenos e ácidos nucleicos na amostra sem a necessidade de utilizar equipamentos muito complexos (LIN; et al., 2013).

Estudos indicam que o tamanho e forma de NPs influenciam a sua toxicidade, especialmente se houver agregação de partículas com o passar do tempo. A fim de compreender seus efeitos e evitar a contaminação, há necessidade de estudar a estrutura e o comportamento destas sob condições ambientalmente controladores de pH, força iônica e verificar os seus efeitos sobre o crescimento de bactérias (FABREGA; et. al., 2009).

Há vários métodos de síntese de NPs, porém estes são divididos em métodos físicos e métodos químicos. Nos métodos físicos, chamados top down (no português, de cima para baixo), para se obter as NPs utilizam-se de processos físicos, como moagem, têmpera e a fotolitografia, a decomposição térmica, a irradiação, a difusão, entre outras. Os métodos químicos são denominados bottom up (no português, de baixo para cima) e envolvem espécies moleculares em reações químicas para gerar o crescimento dos aglomerados síntese eletroquímica ou uso de elementos biológicos para essa síntese (JU-NAM; LEAD, 2008), (CARVALHO, 2013).

Figura 1 - Esquema dos métodos top down e bottom up de síntese de NPs.

Um método que vem sendo muito utilizado é o de redução química. Neste método, ocorre a redução dos cátions metálicos para sua forma elementar, em escala nanométrica, na presença de agentes redutores como, por exemplo, o boridreto de sódio. Outro agente necessário neste tipo de reação é um agente estabilizante que pode ser o próprio agente redutor, ou outro composto químico, por exemplo, ácidos húmicos, no qual sua proporção molar em relação ao agente redutor é geralmente 2:1. Esta proporção permite a obtenção de NPs mais estáveis impedindo sua aglomeração (CARVALHO, 2013).

Substâncias húmicas são compostos orgânicos presentes em sedimentos, turfas e solos que possuem uma estrutura complexa e indefinida. Essas substâncias são encontradas em estágios de degradação animal e vegetal através de ações químicas ou biológicas e não possuem uma composição química definida. A classificação dessas substâncias ocorre de acordo com suas características que podem ser ácidas, hidrofílicas, amorfas e possuírem alto peso molecular. Uma classificação são os ácidos húmicos que são insolúveis em pH baixo. Algumas propriedades das substâncias húmicas são a redução e complexação dos íons metálicos, solubilização, hidrólise, adsorção e transporte. Isso ocorre devido ao caráter coloidal e à natureza anfifílica dessas substâncias (PETRONI, 2013).

Gunsolus et al. conduziram um estudo em que demonstraram que a estabilidade das NPs de prata promovida pelas substâncias húmicas depende do tipo de substância e do agente de revestimento das NPs. Nesse estudo, NPs de prata foram colocadas em contato com ácidos húmicos e fúlvicos e concluiu-se que a taxa de agregação das NPs depende da composição química dessas substâncias (GUNSOLUS; et al., 2015).

Segundo Sharma et al., em seus estudos de interação de NPs de prata com ácidos húmico e fúlvico pôde-se observar mudanças nas cargas e na estabilização dessas NPs. A liberação de prótons nas NPs de prata revestidas com citrato de sódo diminui quando foram adicionadas as soluções contendo os ácidos (SHARMA; et al., 2014).

NPs podem ser caracterizadas por meio de inúmeros métodos, entre eles, difração de raios x, microscopias, entre outros. No presente trabalho, utilizou-se a espectroscopia de absorção na região do UV-Visível e espalhamento dinâmico de luz (DLS).

A técnica de espectroscopia de absorção de UV/Vis foi utilizada com o intuito de comprovar a presença das NPs de prata e ouro nas soluções. Essa técnica consiste em quantificar a luz absorvida e que é posteriormente dispersa pela amostra. A cubeta com a amostra é posicionada entre a fonte de luz e o detector, a intensidade da luz é medida antes e

após passar pela amostra e a soma da luz absorvida e dispersa gera o espectro (CARVALHO, 2013). Já o método DLS também denominado de espalhamento dinâmico de luz, foi utilizado para medir a agregação das NPs. Este método consiste na incidência de um laser na amostra contendo NPs e de acordo com a intensidade em que o laser é dispersado pelas partículas que estão em movimento na solução, permitindo relacioná-la matematicamente com o raio da partícula (CARVALHO, 2013).

Desta forma, aplicando-se a metodologia adequada é possível sintetizar e caracterizar as NPs e estudar seu comportamento em relação a aglomeração na presença de substâncias orgânicas e com controle de força iônica através de soluções de sal, assim como sua toxicidade quando em contato com microorganismos.

3. Justificativa

Na engenharia química, a nanotecnologia pode ser aplicada em várias áreas, como por exemplo, no processo de produção de novos catalisadores nanoestruturados, membranas de separação em nanoescala, entre outros. Além disso, o presente estudo pode contribuir para inovações que levam ao surgimento de fabricações em escala manométrica em diversas áreas como química física, química computacional, engenharia de sistemas moleculares, mecânica molecular, e muitas outras.

A área da nanotecnologia cresce a cada dia, porém seu impacto no ambiente e consequentemente na saúde da população deve ser tratado com certo cuidado. A contaminação ambiental ocorre devido às características peculiares desses nanomateriais, tais como seu tamanho, sua capacidade de aglomeração e de dispersão, o que ocasiona danos, de maneira acumulativa, à cadeia alimentar (PASCHOALINO; et al., 2010).Os estudos sobre a toxicidade, a degradabilidade e também a disponibilidade das NPs já é uma necessidade. No Brasil, foi criado em 2002 o Programa Nacional de Nanotecnologia com o intuito de desenvolver o conhecimento em relação a produtos e processos que envolvam a nanotecnologia (BRASIL, 2008).

NPs de prata e ouro têm chamado a atenção devido aos perigos que apresentam quando descartadas em grande quantidade no meio ambiente. O conhecimento de seu comportamento e suas propriedades como tamanho, condições de aglomeração e dispersão pode ajudar empresas e laboratórios a tomarem um cuidado especial ao descartar essas

substâncias. Outra vantagem é o desenvolvimento de novas utilidades e aplicações dessas partículas.

Desta forma, o presente trabalho se justifica por avaliar os impactos de NPs de prata e ouro em bactérias para prever o efeito de seu descarte no meio ambiente e poder incentivar a busca por soluções de tratamento para esses efluentes.

4. Objetivo

O objetivo deste trabalho foi estudar métodos de síntese de NPs metálicas e observar sua formação e através do estudo da sua interação com as substâncias húmicas, promover resultados sobre sua relação com a agregação das NPs. Além disso, analisar o comportamento de bactérias na presença de NPs metálicas, a fim de simular o descarte destas para o ambiente.

5. Materiais e Métodos

Este tópico foi dividido em várias etapas, e está apresentado no fluxograma representado pela Figura 2. Abaixo cada procedimento será descrito com maiores detalhes.

Figura 2 - Fluxograma das etapas do projeto.

5.1. Síntese de nanopartículas

As NPs de prata e ouro foram sintetizadas pelo método bottom up que envolve a redução dos sais metálicos correspondentes, utilizando diferentes agentes redutores, tais como

citrato de sódio e borohidreto de sódio. O citrato de sódio e ácido húmico foram utilizados para estabilizar as NPs em suspensão. Abaixo serão detalhadas as metodologias das referidas sínteses.

5.1.1. Nanopartículas de prata revestidas com citrato de sódio

A preparação das NPs de prata foi feita utilizando citrato de sódio como agente estabilizante e borohidreto de sódio para a redução dos sais metálicos em solução aquosa. Foram preparadas soluções de 50 mL de citrato de sódio 0,31M, 50 mL de nitrato de prata 0,25 M e borohidreto de sódio 0,25 M. As soluções de citrato de sódio e nitrato de prata foram adicionadas em um erlenmeyer e agitadas por 30 min. Depois, 5mL da solução de borohidreto de sódio foi adicionado lentamente e a agitação foi mantida por mais 10 minutos. A solução foi aquecida até levantar fervura, permaneceu aquecida por mais 90 minutos e foi resfriada em temperatura ambiente. A concentração final de prata foi de aproximadamente 26 mg/L (CUMBERLAND; et. al., 2009).

5.1.2. Nanopartículas de prata revestidas com ácido húmico

Na presença de ácido húmico, as NPs de prata foram preparadas usando boridreto de sódio como agente redutor dos sais de prata. Uma solução de 10 mL de ácido húmico 0,001% foi preparada e misturada em um erlenmeyer com 10 mL de solução de nitrato de prata 1 M. Essa solução foi agitada por 5 minutos e, então, foram adicionados rapidamente 10 ml de solução de borohidreto de sódio 10 M mantendo a agitação até que a cor mudasse de amarelo para marrom claro (DUBAS; et. al., 2008).

5.1.3. Nanopartículas de ouro revestidas com citrato de sódio

Para a síntese de NPs de ouro, o citrato de sódio foi utilizado tanto como agente redutor quanto como agente estabilizante. Em um erlenmeyer uma solução de 100 ml de 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙4 (0,25 M) foi aquecida até ferver e o aquecimento foi mantido por mais 5 minutos. Foram adicionados 3mL de uma solução de citrato de sódio (38,8 M) preparada no mesmo momento à solução de sais de ouro, mantendo o aquecimento por mais 10 minutos até que a solução apresentasse coloração vermelha. A solução final foi resfriada a temperatura ambiente (DIEGOLI; et. al., 2008).

5.1.4. Nanopartículas de ouro revestidas com ácido húmico

Uma solução de NPs de ouro revestidas com ácido húmico foi preparada utilizando boridreto de sódio como agente redutor. Uma solução de 10 mL de ácido húmico 0,001% foi preparada e adicionada a um erlenmeyer com 10 mL de solução de 𝐻𝐴𝑢𝐶𝑙₄ (1 M). Após 5 minutos de agitação, 10 mL de borohidreto de sódio (10 M) foram adicionados rapidamente e a solução foi mantida em agitação até ocorrer mudança de cor de amarelo para azul escuro (DUBAS; et. al., 2008).

5.2. Caracterização de nanopartículas de prata e ouro

5.2.1. Espectrofotometria de UV-visível

Para a análise das suspensões coloidais de NPs, foi utilizado um espectrofotômetro de absorção de UV-visível U-2900 da HITACHI. As amostras foram analisadas logo após a sua preparação (t = 0) e a cada 2 horas durante os primeiros dois dias. Após este período, uma análise foi realizada a cada 24 horas, a fim de investigar a estabilidade das suspensões coloidais. O intuito desta análise foi estudar a interação das NPs de prata e de ouro com ácido húmico adicionado às soluções, sob condições controladas de pH e de força iônica, em que utilizou-se uma solução de 𝐶𝑎(𝑁𝑂₃)₂.

5.2.2. Espalhamento dinâmico de luz (DLS)

O equipamento de DLS modelo Zetasizer Nano S da marca Malvern foi utilizado para medir o tamanho das partículas em amostras das suspensões de NPs. O cálculo do tamanho das partículas foi feito a partir da média de cada amostra medida incluindo todos os desvios-padrão. Todas as medições foram realizadas no tempo zero, e para as soluções misturadas com ácido húmico sob pH e força iônica controlados, as análises foram realizadas no tempo zero, depois de 24 horas e 48 horas.

5.3. Atividade antimicrobiana de nanopartículas de prata

O crescimento bacteriano: A bactéria gram-positiva Bacillus subtilis foi escolhida como o organismo de teste. A cultura foi mantida em meio Luria-Bertani de placas de ágar, e as colônias individuais foram transferidas e incubadas durante a noite a 30°C imersas em caldo nutriente.

As curvas de crescimento: Todos os testes foram realizados em triplicata. As soluções de controle foram realizadas sem a presença de NPs. As curvas de crescimento da bactéria, expostas e não expostas a NPs de prata foram determinadas com base no valor de absorção ótica durante 12 horas, utilizando um espectrofotômetro de microplacas Multiskan GO da Thermo Scientific.

6. Resultados e Discussão

6.1. Formação e Estabilidade das nanopartículas metálicas

Para a avaliação da formação das NPs de prata revestidas com citrato de sódio, as mesmas foram submetidas a análises de espectroscopia UV-Vis U-2900 da HITACHI. Observou-se um pico de absorbância no valor de 390 nm, como mostra a Figura 3 (BANKURA; et al, 2012). Este resultado indica que as NPs sintetizadas são de prata, pois essa solução apresenta uma ressonância de plasmon de superfície que é responsável pela coloração amarelada da solução. Outra característica relevante é de não haver agregação das NPs, pois pode-se observar apenas uma banda no gráfico, o que sugere a presença de partículas que absorvem o mesmo comprimento de onda.

Figura 3 - Espectro UV-Vis das NPs de prata.

O mesmo experimento foi realizado com as NPs de ouro revestidas com citrato de sódio, Figura 4. O comprimento de onda na máxima absorbância foi de 518 nm, o que comprova a presença de NPs de ouro na suspensão, pois, assim como as NPs de prata, essa

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 300 350 400 450 500 550 Abs or bâ nc ia Comprimento de onda (nm)

solução também apresenta uma ressonância de plasmon de superfície que é responsável por sua coloração avermelhada (DANKESREITER, 2011).

Figura 4 - Espectro UV-Vis das NPs de ouro.

Para determinar o tamanho das partículas, foram realizadas medidas de DLS. Com auxílio do software Minitab, construiu-se o histograma com os resultados de tamanhos apresentando valores de 5,61±1,39 nm para as NPs de prata (FIGURA 5) e 27,73±10,57nm para as NPs de ouro. O valor alto de desvio padrão das NPs de ouro sugere que essa suspensão apresenta uma heterogeneidade no tamanho das partículas.

Figura 5 - Distribuição do tamanho das NPs de prata no DLS. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 450 500 550 600 650 700 Abs or bâ nc ia Comprimento de onda (nm)

NPs de ouro revestidas com citrato de sódio

8.4 7.2 6.0 4.8 3.6 2.4 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Média 5.607 DesvPad 1.387 N 42 Tamanho (nm) Fr eq uê nc ia Histograma de NPs de prata

Figura 6 - Distribuição do tamanho das NPs de ouro no DLS.

6.2. Interação entre as nanopartículas metálicas e ácido húmico com controle de pH e força iônica

Medidas de absorbâncias suspensões de prata e ouro foram realizadas com o auxílio de um espectofotômetro de UV-visível, onde mostra a comparação entre a solução com apenas NPs e a solução com ácido húmico, Figura 7.

O pH medido da solução de NPs de prata foi de 6,91 e quando a força iônica foi controlada, adicionando uma solução de 𝐶𝑎(𝑁𝑂₃)₂, pôde-se observar uma agregação das NPs. Ainda que haja o pico de absorbância próximo ao valor de 400 nm, há uma diminuição na sua absorbância e também o surgimento de um ombro na banda, comprovando a agregação de algumas partículas. 70 60 50 40 30 20 10 30 25 20 15 10 5 0 Média 27.73 DesvPad 10.57 N 101 Tamanho (nm) Fr eq uê nc ia Histograma de NPs de ouro

Figura 7 - Comparação dos espectros UV-Vis das NPs de prata revestidas com citrato de sódio e NPs de prata com ácido humico e controle de pH e força iônica.

No caso das suspensões de ouro, o pH da suspensão apresentou valor de 6,62 e, diferentemente das NPs de prata, houve maior estabilidade das suspensões com um mínimo de agregação observado pela diminuição do pico de absorbância, Figura 8.

Figura 8 - Comparação dos espectros UV-Vis das NPs de ouro revestidas com citrato de sódio e NPs de ouro com ácido humico e controle de pH e força iônica.

Análises de DSL foram utilizadas para medir o tamanho das NPs de prata e ouro. Para esse teste foram selecionadas diferentes suspensões e condições a fim de comparar a influência da adição de um estabilizante na solução e controle de força iônica por adição de solução de sal. A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos a partir das análises de DLS.

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 300 350 400 450 500 550 Abs or bâ nc ia Comprimento de onda (nm)

AgNPs coated Sodium Citrate AgNPs + Humic Acid + Ionic Strength

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 400 450 500 550 600 650 700 As or bâ nci a Comprimento de onda (nm)

AuNPs coated with Sodium Citrate AuNPs + Humic Acid + Ionic Strength NPs de prata revestidas

comcitrato de sódio NPs de prata com controle de força iônica

NPs de ouro revestidas com citrato de sódio NPs de ourocom controle de força iônica

Tabela 1 - Tamanho médio das NPs em diferentes condições medidas no DLS.

Tamanho Médio

(nm) Desviopadrão (nm) NPs prata revestidas com citrato de

sódio 5.61 1.39

NPs prata com ácido húmico 16.69 5.41

NPs ouro revestidas com citrato de

sódio 27.73 10.57

NPs ouro com ácido húmico 19.19 6.34

NPs prata com controle de força

iônica 1370.41 721.34

NPs ouro com controle de força

iônica 1366.41 468.16

NPs prata com ácido húmico e

controle de força iônica 42.89 23.36

NPs prata com ácido húmico e

controle de força iônica (2º dia) 43.44 22.99 NPs prata com ácido húmico e

controle de força iônica (3º dia) 55.60 40.69 NPs ouro com ácido húmico e

controle de força iônica 30.23 15.67

NPs ouro com ácido húmico e

controle de força iônica (2º dia) 35.82 14.22 NPs ouro com ácido húmico e

controle de força iônica (3º dia) 36.04 14.70

Ao adicionar-se ácido húmico nas suspensões, o mesmo age como um estabilizador mantendo as NPs de prata em um tamanho de 16,69±5,41 nm e as NPs de ouro em um tamanho de 19,19±6,34 nm, diferindo dos valores obtidos anteriormente apenas com o revestimento de citrato de sódio.

Os valores obtidos foram aceitáveis exceto os das suspensões, tanto de prata quanto de ouro, em que havia apenas o controle da força iônica e nenhum estabilizador, pois nessas soluções houve aglomeração das NPs que chegaram a um tamanho muito maior que o padrão. O controle da força iônica leva à aglomeração das partículas, mas, com a presença de ácido húmico na suspensão, essa aglomeração é controlada evitando a precipitação das partículas. As medidas foram tomadas em 3 dias consecutivos e os resultados mostram que houve um leve aglomeração durante esse período porém ela foi controlada. Uma característica que não pode ser controlada foi a homogeneidade do tamanho das NPs que foi identificada pelo alto valor de desvio padrão das amostras.

6.3. Influência das nanopartículas de prata no crescimento de bactérias

A fim de simular o descarte de NPs ao meio ambiente e prever sua toxicidade, foram conduzidos estudos interagindo as NPs de prata com bactérias. A bactéria utilizada para o teste de toxicidade das NPs de prata foi a B. subutilis pois trata-se de uma bactéria gram-positiva. A Figura 9 apresenta o efeito bactericida de diferentes concentrações de NPs de prata revestidas com citrato de sódio quando em contato com as bactérias.

Figura 9 - Curva de crescimento da bactéria B. subtilis exposta a diferentes concentrações de NPs de prata revestidas com citrato de sódio.

A concentração mínima inibitória (em inglês, minimum inhibitory concentration ou MIC) foi definida como a menor concentração que causa uma diminuição de 80% na absorbância quando comparada com a solução controle. No estudo das curvas de crescimento, a absorbância obtida na solução controle mostrou que as bactérias atingiram a fase estacionária de crescimento após 8 horas.

A Figura 9 também apresenta dois ciclos de crescimento, indicando um crescimento bifásico. As curvas de crescimento mostraram dois ciclos em formato de s. O primeiro ciclo de crescimento foi identificado entre 4 e 8 horas e o segundo ciclo foi identificado entre 8 e 10 horas não apresentando uma fase intermediária. Crescimento bifásico ocorre quando um microorganismo apresenta duas fases de crescimento devido ao uso de dois substratos

Tempo (horas) Dens ida de óp tic a Controle NPs prata (1ppm) NPs prata (5ppm) NPs prata (10 ppm)

diferentes para seu crescimento (DE JAGER, 2009). Após redução do primeiro substrato, o microrganismo começa a utilizar o segundo substrato (MEUNIER, 1999).

As concentrações de NPs de prata utilizadas nesse estudo foram similares às concentrações esperadas na natureza, baseado no artigo publicado por Luoma, S. N (LUOMA, 2015). A concentração máxima de NPs utilizada foi baseada na concentração mínima inibitória (2,5 ppm) e na concentração mínima bactericida (10 ppm) observadas para a B. subitilis de acordo com Mirzajani et al. Mais de 80% de inibição foi observada no MIC nas amostras contendo 5 e 10 ppm de NPs de prata, Figura 9.

Após determinar os valores de MIC, uma segunda curva de crescimento foi elaborada usando as soluções de NPs com diferentes revestimentos (citrato e ácido húmico) e também as soluções com diferentes concentrações de Ag+ (1 e 5 ppm), o resultado se está apresentado na Figura 10. Obteve-se quase uma completa inibição, mais de 80%, nas amostras de NPs revestidas com citrato e com ácido húmico e concentração de 5ppm de Ag+.

Figura 10 - Curvas de crescimento da bactériaB. subtilisexposta a mesmas concentrações de NPs de prata revestidas com citrate de sódio, NPs com ácido húmico, Nps revestidas com

ácido húmico e diferentes concentrações de Ag+ livres (1 e 5 ppm).

Os mecanismos que explicam a inibição bacteriana devido a presença de NPs de prata ainda não é muito clara. Um suposto mecanismo para a atividade bactericida das NPs sugere que os íons de prata se acumulam na membrana da bactéria causando um aumento significativo na sua permeabilidade e resultando em sua morte.

Tempo (horas) Dens ida de óp tic a Controle NPs prata (5ppm)

NPs prata + força iônica (5ppm) NPs prata + ácido húmico(5 ppm) Ag+ (1ppm)

7. Conclusão

As sínteses e caracterizações das NPs de prata e de ouro foram executadas de forma apropriada. A adição de ácido húmico em soluções que apresentavam pH similar ao encontrado na natureza fez com que as NPs se estabilizassem e evitassem a perda de material por aglomeração.

O efeito bactericida das NPs de prata pode ser observado apenas em concentrações acima de 5 e 10 ppm. Abaixo desses valores, as NPs apenas diminuíram o crescimento das bactérias. As soluções com Ag+ também mostraram um inibição no crescimento das bactérias em concentrações acima de 5ppm. Portanto, para o descarte de NPs de prata na natureza, a concentração da solução deve estar abaixo de 5ppm para não interferir no crescimento de microorganismos presentes no meio ambiente.

8. Referências bibliográficas

AGNIHOTRI, S.; et al. Size-controlled silver nanoparticles synthesized over the range 5-100 nm using the same protocol and their antibacterial efficacy. RSC Adv, v. 4, p. 3974-3983, 2014.

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