ARTÍCULO ORIGINAL
Observação in vitro da ação dos fungos nematòfagos
Duddingtonia flagrans, Monacrosporium
thaumasium e Pochonia chlamydosporia sobre
ovos de Eurytrema coelomaticum
FÁBIO RIBEIRO BRAGA*, JACKSON VICTOR DE ARAÚJO*a, ROGÉRIO OLIVA CARVALHO*, ANDRÉ R. SILVA*, JULIANA MILANI ARAUJO* e ALEXANDRE OLIVEIRA TAVELA*
* Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG, CEP: 36570-000. a Pesquisador do CNPq.
IN VITRO EVALUATION OF THE ACTION OF THE NEMATOPHAGOUS FUNGI Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium AND Pochonia chlamydosporia
ON Eurytrema coelomaticum EGGS
The present study assessed in vitro action of nematophagous fungi species Duddingtonia flagrans (AC 001), Monacrosporium thaumasium (NF 34) and Pochonia chlamydosporia (VC1 and VC4) on eggs of Eurytrema coelomaticum. Eggs were placed on Petri dishes with fungus isolate grown in water- agar 2% and in the control (no fungus). After seven, 10 and 14 days, the eggs were removed and classified according to the following parameters: type 1, lytic effect without morphological damage to eggshell; type 2, lytic effect with morphological alteration of embryo and eggshell; and type 3, lytic effect with morphological alteration of embryo and eggshell, besides hyphal penetration and internal egg colonization. The isolate AC001 and NF34 had not demonstrated percentages to type 3 effects, however isolated VC1 presented results percentages for the type 3 effect that it determines the ovicida activity of one fungus: 27.2% to the seven days, 23.1% to the 10 days and 25.0% to the 14 days. The isolated VC4 presented: 15.0% to the seven days, 25.4% to the 10 days and, 21.8% to the 14 days. P. chlamydosporia is a promising fungus can be used in the biological control of E. coelomaticum.
Key words: Nematophagous fungi, Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium, Pochonia chlamydosporia, Eurytrema coelomaticum, biologic control.
INTRODUÇÃO
Trematódeos do gênero Eurytrema freqüen-temente são encontrados em pâncreas de bovinos abatidos durante a realização da inspeção, e nos últimos anos essa prevalência tem aumentado significativamente1. Eurytrema pancreaticum e
E. coelomaticum são parasitos que habitam
normalmente na luz dos ductos pancreáticos, observados ocasionalmente nos ductos biliares e raramente no intestino delgado de ruminantes2.
Segundo3 E. pancreaticum tem sido descrito em
bovinos, caprinos, ovinos, bubalinos, suínos, camelídeos, cervídeos e em seres humanos, enquanto que a espécie E. coelomaticum ocorre em bovinos, caprinos, ovinos, bubalinos,
leporinos e camelídeos.
No Brasil, apenas se reconhece à ocorrência de E. coelomaticum, sendo relatado em bovinos, caprinos, ovinos e bubalinos2. O problema da
euritrematose bovina está diretamente ligado às perdas econômicas quanto à produção de carne e leite, bem como à indústria extrativa de insulina devido às condenações de pâncreas parasitados. Quanto ao seu controle, alguns pesquisadores comprovaram a ineficiência dos produtos anti-helmínticos usados para combater a euritrematose em bovinos. Essa informação vem confirmar os resultados negativos que se obtêm quando se tenta tratar os animais parasitados com os produtos disponíveis4.
Dessa forma tem se buscado medidas alternativas para o controle desta e de outras parasitoses, e o controle biológico das parasitoses gastrintestinais dos animais domésticos realizado com fungos nematófagos aparece então como uma alternativa promissora e com resultados satisfatórios5-7. Dentre as várias vantagens do
controle biológico com fungos nematófagos está o seu sinergismo com o controle químico, o que proporciona uma maior e a abrangente atuação sobre as formas infectantes presentes nas fezes, bem como sobre os helmintos adultos que estão parasitando o animal8-9. Esses fungos se
comportam como antagonistas naturais promovendo a captura, a morte ou mesmo a destruição do parasito, e de acordo com a sua classificação são divididos em endoparasitas, predadores, oportunistas (parasitas de ovos e cistos). Desses o grupo dos predadores, grande maioria, e ovicidas têm sido estudados no controle biológico das helmintoses apresentando resultados promissores6, 10, 12,13.
No grupo dos fungos predadores destacam-se os gêneros; Arthrobotrys, Duddingtonia e Monacrosporium, devido a sua eficácia no controle ambiental de nematóides14. A espécie D.
flagrans, considerada a mais promissora devido à abundância de clamidósporos, é também a mais estudada no controle das helmintoses dos animais domésticos, possui ação predatória formando um tipo de armadilha que se caracteriza por um sistema de hifas adesivas simples, além disso, produz dois tipos de esporos - conídios e clamidósporos - intercalados por hifas maduras que no ambiente permitem seu uso como controlador biológico15. As espécies do gênero
Monacrosporium são caracterizadas por
produzirem um único conídio em cada conidióforo e pela produção de redes adesivas, formando hifas septadas e ramificadas16-18.
Dentro do grupo dos fungos oportunistas destaca-se a espécie Verticillium chlamydosporium, atualmente, denominada de Pochonia chlamy-dosporia devido a observações e análises filogenéticas das subunidades do RDNA, sendo uma espécie formadora de clamidósporos19. O
modo de ação desse fungo baseia-se na formação de apressórios, desenvolvidos a partir de hifas indiferenciadas que permitem a colonização da superfície dos ovos e a penetração destes através da ação mecânica e enzimática11,20,21.
O presente trabalho procurou avaliar a ação in vitro de isolados brasileiros de fungos nematófagos do gênero D. flagrans, M. thaumasium e P.chlamydosporia sobre ovos de E. coelomaticum.
MATERIAL E MÉTODOS
Organismos: Quatro isolados de fungos
nematófagos, sendo um de D. flagrans, um de M. thaumasium e dois P. chlamydosporia foram mantidos em tubos de ensaio a 4º C contendo corn-meal-ágar 2% e no escuro durante 10 dias. Esses isolados foram obtidos de solo do Brasil, através da técnica de espalhamento do solo descrito por Duddington22 e modificada por
Santos23.
Discos de cultura de 4 mm de diâmetro foram extraídos de isolados fúngicos mantidos em tubos de ensaio contendo CMA 2% transferidos para placas de Petri de 9,0 cm de diâmetro contendo 20 ml de batata-dextrose-ágar 2% mantidos a 25º C, no escuro durante 10 dias. Após o crescimento dos isolados novos discos de cultura de 4 mm de diâmetro foram transferidos para placas de Petri de 9,0 cm diâmetro contendo 20 ml de ágar-água 2% durante 10 dias.
Ovos de E. coelomaticum foram analisados morfologicamente quanto a sua integridade ao microscópio de luz, em objetiva de 10x. Esses ovos foram recuperados a partir da dissecação de exemplares adultos, colhidos de pâncreas naturalmente infectados de bovinos abatidos para consumo humano.
Ensaio Experimental: Os ovos foram
vertidos sobre a superfície de placas de Petri de 9,0 cm de diâmetro contendo o meio AA 2% com os isolados fúngicos crescidos por 10 dias
e sem fungo como controle, sendo feitas 10 repetições para cada grupo. Nos tratamentos, cada placa continha mil ovos de E. coelomaticum com apenas um dos isolados fúngicos e mil ovos sem os isolados fúngicos como controle. Nos intervalos de sete, 10 e 14 dias, aproximadamente cem ovos foram retirados de cada placa contendo o isolado e do controle de acordo com a técnica descrita por Araújo10 e, colocados em lâminas de
vidro com uma gota de azul de Amam 1%, sendo então avaliados em microscópio de luz, objetiva de 10x, de acordo com os parâmetros estabelecidos por Lysek20-11: efeito do tipo 1,
efeito lítico sem prejuízo morfológico à casca do ovo, onde hifas são observadas aderidas à casca; efeito do tipo 2, efeito lítico com alteração morfológica da casca e embrião do ovo, sem penetração de hifas através da casca e efeito do tipo 3, efeito lítico com alteração morfológica do embrião e da casca, além de penetração de hifas e colonização interna do ovo.
Os dados de cada intervalo estudado foram submetidos ao teste não paramétrico Friedman com 5% de probabilidade25.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas Tabelas 1, 2 e 3 estão apresentados os resultados percentuais dos diversos fungos sobre os ovos de E. coelomaticum aos sete, 10 e 14 dias de interação.
O fungo D. flagrans (AC001) apresentou efeito do tipo 1, com resultados percentuais de 54,5%; 58,6% e 61,8% sobre os ovos de E.
coelomaticum nos intervalos de sete, 10 e 14 dias, respectivamente. Para os efeitos dos tipos 2 e 3 esse isolado não demonstrou atividade, sem prejuízo ao embrião20. Esses resultados
percentuais são semelhantes aos registrados por Braga12-13 que utilizaram três isolados fúngicos e
dentre eles D. flagrans sobre ovos de Ascaris lumbricoides apresentando percentuais de efeito do tipo 1 de 30%; 52,0% e 68% aos sete, 10 e 14 dias, respectivamente e, sobre ovos de Fasciola hepatica com percentuais de efeito do tipo 1 de 60,1%, 62,3% e 66,5% aos sete, 14 e 21 dias, respectivamente.
O fungo M. thaumasium (NF34), demonstrou apenas o efeito do tipo 1 de 61,9 %, 62,7% e 69,0% nos intervalos de sete, 10 e 14 dias, respectivamente. Da mesma forma, sua ação sobre os ovos de A. lumbricoides nos intervalos de sete, 10 e 14 dias foi a mesma com apresentação de efeito do tipo 1 de 48,0%, 42,0% e 62,0%12.
Comparando a ação de AC001 e NF34 sobre os ovos de E. coelomaticum observou-se que não houve diferença significativa (p > 0,01) para o efeito tipo 1, demonstrando que ambos tiveram a mesma ação. Contudo o isolado NF34 apresentou maiores percentuais para o efeito do tipo 1 em todos os intervalos estudados em relação ao isolado AC001. Além disso, foi observado que a atividade dos isolados AC001 e NF34 para os efeitos dos tipos 1 e 2, equipararam-se, também aos resultados encontrados para os isolados de Artrobotrys robusta e A. conoides, utilizados por Araújo10 na
Tabela 1. Percentual da atividade ovicida dos fungos nematófagos, Duddingtonia flagrans (AC001),
Monacrosporium thaumasium (NF34) e Pochonia chlamydosporia (VC1 e VC4) e o grupo controle sem
fungos, sobre ovos de Eurytrema coelomaticum aos sete dias
Isolados Efeitos
Efeito Tipo 1* Efeito Tipo 2** Efeito Tipo 3***
AC 001 54,5 A 0 B 0 C
NF34 61,9 A 0 B 0 C
VC 1 19,5 B 24,0A 27,2 A
VC 4 25,0 B 26,3 A 15,0 A
Controle 0 C 0 B 0 C
Valor seguido de letra maiúscula igual na coluna difere estatisticamente (P > 0,05) - teste de Friedman. *efeito lítico sem prejuízo morfológico à casca do ovo, onde as hifas são observadas aderidas à casca.
**efeito lítico com alteração morfológica da casca do ovo e do embrião, sem penetração de hifas através da casca. ***efeito lítico com alteração morfológica da casca e do embrião, além da penetração de hifas e colonização interna do ovo.
Tabela 2. Percentual da atividade ovicida dos fungos nematófagos, Duddingtonia flagrans (AC001),
Monacrosporium thaumasium (NF34) e Pochonia chlamydosporia (VC1 e VC4) e o grupo controle sem
fungos, sobre ovos de Eurytrema coelomaticum aos 10 dias.
Isolados Efeitos
Efeito Tipo 1* Efeito Tipo 2** Efeito Tipo 3***
AC001 58,6 A 0 B 0 B
NF34 62,7 A 0 B 0 B
VC1 21,8 B 23,6 A 23,1 A
VC4 24,5 B 24,5 A 25,4 A
Controle 0 C 0 B 0 B
Valor seguido de letra maiúscula igual na coluna difere estatisticamente (P > 0,05) - teste de Friedman. *efeito lítico sem prejuízo morfológico à casca do ovo, onde as hifas são observadas aderidas à casca.
**efeito lítico com alteração morfológica da casca do ovo e do embrião, sem penetração de hifas através da casca. ***efeito lítico com alteração morfológica da casca e do embrião, além da penetração de hifas e colonização interna do ovo.
Tabela 3. Percentual da atividade ovicida dos fungos nematófagos, Duddingtonia flagrans (AC001),
Monacrosporium thaumasium (NF34) e Pochonia chlamydosporia (VC1 e VC4) e o grupo controle sem
fungos, sobre ovos de Eurytrema coelomaticum aos 14 dias
Isolados Efeitos
Efeito Tipo 1* Efeito Tipo 2** Efeito Tipo 3***
AC001 61,8 A 0 B 0 B
NF34 69,0 A 0 B 0 B
VC1 19,5 B 26,8 A 25,0A
VC4 25,0 B 28,6 A 21,8 A
Controle 0 C 0 C 0 B
Valor seguido de letra maiúscula igual na coluna difere estatisticamente (P > 0,05) - teste de Friedman. *efeito lítico sem prejuízo morfológico à casca do ovo, onde as hifas são observadas aderidas à casca.
**efeito lítico com alteração morfológica da casca do ovo e do embrião, sem penetração de hifas através da casca. ***efeito lítico com alteração morfológica da casca e do embrião, além da penetração de hifas e colonização interna do ovo.
ação sobre ovos de Toxocara canis.
No trabalho de Braga12, D. flagrans (AC001)
e M. thaumasium (NF34) sobre ovos de A. lumbricoides não houve diferença (p > 0,01) nos percentuais dos efeitos 1, 2 e 3, e da mesma forma, no presente trabalho, relata-se apenas a ocorrência do efeito do tipo 1 para esses isolados, sem contudo observar os efeitos dos tipos 2 e 3. Isso indica que esses fungos não apresentam atividade ovicida, que é considerada por Lysek11
quando o fungo apresenta efeito do tipo 3 sobre os ovos parasitados. Embora os fungos D. flagrans e M. thaumasium sejam reconhecidos como fungos predadores, proporcionando o controle apenas de larvas de helmintos8-18, o
encontro de hifas de D. flagrans e M. thaumasium foram observadas apenas aderidas
à casca do ovo, sem, contudo invadir o seu interior.
Os isolados VC1 e VC4, do fungo P.
chlamydosporia, apresentaram atividade em todos
os intervalos estudados para os efeitos dos tipos 1, 2 e 3. Segundo Lysek24 o que caracteriza a
condição ovicida de um fungo é a apresentação do efeito tipo 3; efeito lítico com alteração morfológica do embrião e da casca e colonização interna do ovo e, no presente trabalho o isolado VC 1 demonstrou a partir da observação o efeito do tipo 3, com resultados de 27,2%, 23,1% e 25,0%, nos intervalos de sete, 10 e 14 dias respectivamente. Já o isolado VC 4 apresentou os percentuais para o efeito do tipo 3 de 15,0%, 25,4% e 21,8% nos mesmos intervalos. Não foi observada diferença (p>0,01) entre VC1 e VC4
em relação aos efeitos estudados. Mas, o isolado VC1 apresentou percentuais para o efeito do tipo 3 maiores no sétimo e 14° dias em comparação com a ação de VC4. Por outro lado a ação do isolado VC 4 foi maior para os efeitos dos tipos 1 e 2 no sétimo, 10º e 14º dias em relação ao VC1. Essa informação é importante do ponto de vista de se testar apenas um dos isolados de P.
chlamydsoporia já que ambos se comportaram
da mesma maneira sobre ovos de E.
coelo-maticum ao longo do ensaio experimental13. A ação de P. chlamydosporia sobre ovos de A. lumbricoides foi maior quando comparada a D. flagrans (AC001) e M. thaumasium (NF34) nos períodos de sete, 10 e 14 dias de interação, observando que VC1 e VC4 apresentaram resultados percentuais para o efeito do tipo 3 de 20% e 18%; 25% e 22%; 30% e 26% respectivamente, enquanto AC001 e SF53 não apresentaram esse tipo de efeito12. Da mesma,
outros comprovaram que os isolados VC1 e VC4 também demonstraram maior percentual de efeito do tipo 3 sobre ovos de A. suum que foram de 13,3% e 17,3%; 13,9% e 17,9%; 19,0% e 20,0% respectivamente, em comparação com AC001 e SF53 nos mesmos intervalos estudados e que apresentaram esse tipo de efeito26. No presente
trabalho os resultados percentuais para o efeito do tipo 3 do fungo P. chlamydosporia foram maiores sobre os ovos de E. coelomaticum em relação ao efeito dos mesmos sobre os ovos de A. lumbricoides e A. suum. Esses resultados sugerem existir alguma diferença no processo de interação entre esse fungo e os diferentes tipos de ovos. Segundo outros investigadores, os ovos de A. lumbricoides e A. suum possuem cápsula espessa constituída de quitina e proteína, fato que não ocorre nos ovos de E. coelomaticum27-28.
Essa informação demonstra que P. chla-mydosporia possui ação enzimática e mecânica durante o processo de interação sobre ovos, e ovos desprovidos de cápsula espessa sofreriam maiores prejuízos quando em contato com o fungo.
Em outro trabalho13 avaliaram a ação de P.
chlamydosporia sobre ovos de F. hepatica nos intervalos de sete, 14 e 21 dias e comprovaram que esse fungo possui ação in vitro sobre ovos de trematodas.
Em relação ao fungo P. chlamydosporia sua ação pôde ser observada no presente trabalho, onde seu efeito do tipo 3, quando confrontado
com os demais isolados demonstrou ser capaz de se manter durante os intervalos de sete, 10 e 14 dias.
RESUMO
Objetivou-se a observação in vitro da ação dos fungos nematófagos Duddingtonia flagrans (AC001), Monacrosporium thaumasium (NF 34) e Pochonia chlamydosporia (VC1 e VC4) sobre ovos de Eurytrema coelomaticum. Os ovos foram vertidos em superfície de ágar-água 2% contendo os isolados fúngicos e em AA 2% sem fungo como controle. Ao completarem sete, 10 e 14 dias, aproximadamente os ovos foram removidos e classificados de acordo com os seguintes parâmetros: efeito tipo 1, efeito lítico sem prejuízo morfológico a casca do ovo; tipo 2, efeito lítico com alteração morfológica da casca e embrião e tipo 3, efeito lítico com alteração morfológica do embrião e da casca, além de penetração de hifas e colonização interna do ovo. Os isolados AC001 e NF34 não demonstraram percentuais para o efeito do tipo 3, contudo o isolado VC1 apresentou resultados percentuais para o efeito do tipo 3 que determinam a atividade ovicida de um fungo: 27,2% aos sete dias, 23,1% aos 10 dias e 25,0% aos 14 dias. Da mesma forma que isolado VC4 apresentou: 15,0% aos sete dias, 25,4% aos 10 dias e 21,8% aos 14 dias respectivamente. Pochonia chlamydosporia é um fungo promissor que pode ser usado no controle biológico de E. coelomaticum.
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Agradecimento: A CNPq pela concessão das bolsas.
Correspondencia a: Fábio Ribeiro Braga
