ISSN: 1415-6938
editora@uniderp.br
Universidade Anhanguera Brasil
Kiyomi Iseki, Kátia; Negrão, João Alberto; Lauro Castrucci, Ana Maria de
VARIAÇÕES SAZONAIS NOS NÍVEIS PLASMÁTICOS DOS ESTERÓIDES SEXUAIS (17BETA-ESTRADIOL E TESTOSTERONA) DURANTE O CICLO REPRODUTIVO DE FÊMEAS DE PACU,
PIARACTUS MESOPOTAMICUS
Ensaios e Ciência: Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde, vol. XII, núm. 2, 2008, pp. 151-162 Universidade Anhanguera
Campo Grande, Brasil
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Ciências Biológicas,
Agrárias e da Saúde
Vol. XII, Nº. 2, Ano 2008
Kátia Kiyomi Iseki
Centro Universitário Anhanguera unidade Leme
katiaiseki@yahoo.com.br
João Alberto Negrão Universidade de São Paulo jnegrao@usp.br
Ana Maria de Lauro Castrucci Universidade de São Paulo amdlcast@ib.usp.br
PLASMÁTICOS DOS ESTERÓIDES SEXUAIS
(17BETA-ESTRADIOL E TESTOSTERONA)
DURANTE O CICLO REPRODUTIVO DE FÊMEAS
DE PACU, PIARACTUS MESOPOTAMICUS
1RESUMO
Investigou-se as variações nos níveis plasmáticos do hormônio 17beta-estradiol (E2) e testosterona durante um ciclo reprodutivo de fêmeas de pacu mantidas em cativeiro sob condições ambientais naturais. Os resultados demonstraram que os níveis dos hormônios E2 e testosterona variaram de acordo com a gametogênese, apresentando os menores valores nos estágios iniciais do desenvolvimento ovariano e aumentando progressivamente com o avanço da gametogênese. Simultaneamente foi observado que o pico do E2 e da testosterona ocorreram no momento da desova. Assim, correlações significativas foram observadas entre os níveis de testosterona e E2. A testosterona apresentou correlações positivas somente com a fotofase e não foi observada correlação entre o E2 e os fatores ambientais.
Palavras-Chave: Reprodução de peixes, pacu, esteróides sexuais,
fatores ambientais.
ABSTRACT
The present study was performed to investigate reproductive physiology of female pacu, a subtropical teleost species, by monitoring variations in plasmatic 17beta-estradiol (E2) and testosterone levels. The experiment was carried out during the annual reproductive cycle under natural environmental conditions. The results show that levels of E2 and testosterone changed in accordance with the development of the ovary. In general, lower levels of E2 and testosterone were measured in the resting stage, while higher levels were measured during the maturation stage. The highest values of E2 and testosterone were observed during ovulation. Consequently, there were significant correlations between E2 and testosterone. Although testosterone was positively correlated only with length of photoperiod, there were no correlations between E2 and environmental factors.
Keywords: Fish reproduction, pacu, sexual steroids, environmental
fac-tors.
1 Este trabalho foi financiado pela FAPESP, CEPTA/IBAMA e IB/USP. Anhanguera Educacional S.A.
Correspondência/Contato Alameda Maria Tereza, 2000 Valinhos, São Paulo CEP. 13.278-181
rc.ipade@unianhanguera.edu.br Coordenação
Instituto de Pesquisas Aplicadas e Desenvolvimento Educacional - IPADE Artigo Original
Recebido em: 2/7/2008 Avaliado em: 12/8/2008
1. INTRODUÇÃO
O pacu é uma espécie de peixe subtropical de grande importância econômica. Em seu habitat natural, o pacu realiza longas migrações no sentido das cabeceiras dos rios na época de reprodução (verão). Sendo assim quando mantido em cativeiro, o pacu só atingirá a maturação final e a liberação dos gametas após a administração, em um período determinado do ano, de análogos do fator liberador de gonadotropinas (LHRH-a). Porém, o mercado consumidor e as indústrias de transformação necessitam de aprovisionamento regular com produtos de qualidade. Devido a esse interesse prático vários estudos vêm sendo conduzidos, principalmente em salmonídeos e ciprinídeos, a fim de se obter várias reproduções ao longo do ano. Atualmente, já é possível obter desovas de algumas espécies de salmonídeos em qualquer época manipulando a duração da fotofase (VAZZOLER, 1996).
Assim, para algumas espécies de peixes podemos encontrar na literatura vários trabalhos sobre a sua fisiologia reprodutiva e principalmente sobre as variações anuais e sazonais nos níveis plasmáticos dos esteróides sexuais associados à atividade reprodutiva. Para essas espécies, a vitelogênese tem sido marcada por altos níveis de 17β-estradiol (E2) e testosterona (MARCANO et al., 2007) e a ovulação precedida pelo decréscimo do E2 e da testosterona e pelo aumento da 17α,20β-dihidroxi-4-pregnen-3-ona (17α,20β-P) (SCOTT et al., 1980; SCOTT e SUMPTER, 1983).
Precedendo a aplicação desse conhecimento deve ocorrer, no entanto, a investigação dos processos fisiológicos que controlam a reprodução do pacu. Assim, este experimento teve como principal objetivo verificar o perfil do estradiol (E2) e da testosterona plasmática durante um ciclo reprodutivo e correlacioná-los com parâmetros ambientais (temperatura da água do viveiro, fotofase e regime de chuvas) e reprodutivos (estágios do desenvolvimento gonadal-EDG) de fêmeas de pacu.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Animais experimentaisForam utilizados 70 fêmeas adultas de pacu, Piaractus mesopotamicus, com cerca de 3 anos de idade, mantidos entre janeiro de 1999 e janeiro de 2000 em 2 viveiros de terra (1000 m2 cada) no Centro de Pesquisa e Treinamento em Aquicultura (CEPTA) do
(zona subtropical, 22º02’S, 47º30’W) sob condições de chuva, temperatura e fotofase na-turais.
Os peixes eram alimentados uma vez ao dia com ração balanceada na proporção de 3% do peso vivo.
Colheita de dados
Foram realizadas 7 colheitas ao longo do experimento: 12/01/1999 (verão); 29/03/99 (outono); 20/05/99 (outono); 24/08/99 (inverno); 11/10/99 (primavera); 09/12/99 (primavera) e 10/02/00 (verão). A cada colheita, 10 peixes foram capturados para coleta de sangue e gônadas.
3. AMOSTRAGEM DE SANGUE E GÔNADAS
Para a amostragem de sangue, os animais foram anestesiados por imersão em água contendo 2-fenoxietanol (Fluka) na proporção de 0,04%. Em seguida, o sangue foi coletado por punção da veia caudal, através de seringas de 5 ml previamente heparinizadas.
O sangue foi armazenado em tubos e conservado no gelo até o momento da centrifugação a 3.000 g durante 20 minutos a uma temperatura de 4ºC. Posteriormente o plasma foi mantido a -20ºC até ter os níveis hormonais determinados.
Logo após a amostragem sanguínea, os peixes foram sacrificados, pesados e suas gônadas foram observadas in situ (dentro da cavidade abdominal) quanto a seu aspecto anatômico, tamanho, coloração, transparência, irrigação sanguínea e a sua disposição com relação aos outros órgâos. Na sequência, as gônadas foram removidas e pesadas para o cálculo da relação gonadossomática (RGS1), sendo que um fragmento
do terço médio de uma das gônadas foi fixado em Bouin-Holanda para posterior análise histológica em microscopia óptica e determinação dos estágios de desenvolvimento gonadal (EDG) descritos na Tabela 1:
1 A RGS foi utilizada a fim de se determinar o grau de maturação dos indivíduos, já que existe estreita relação entre o avanço do processo de maturação e o aumento de volume e peso das gônadas. A RGS expressa a porcentagem que as gônadas representam do peso total ou do peso do corpo dos indivíduos e é obtida através da seguinte fórmula (Vazzo-ler, 1996): RGS=Wo/Wt*100; Wo=peso das gônadas e Wt=peso total.
Tabela 1. Estágios do desenvolvimento ovariano do pacu, Piaractus mesopotamicus.
EDG tipos celulares observados
repouso Oogônias e oócitos perinucleolares iniciais e avançados
maturação inicial Oogônias, oócitos perinucleolares iniciais e avançados, oócitos em estágio cortical alveolar e vitelogênicos
maturação avançada Oócitos vitelogênicos avançados
regressão Oogônias e oócitos perinucleolares iniciais
Determinação de estradiol (E2) e da testosterona plasmática pela técnica ELISA
As dosagens plasmáticas de E2 e testosterona foram realizadas com kits imunoenzimá-ticos (ELISA) da marca DSL (Diagnostic Systems Laboratoires – DSL-10-4300 para o E2 e DSL-10-4000 para a testosterona).
Característica da dosagem do E2 plasmático:
A sensibilidade1 detectada nesta dosagem foi de 8 pg/ml, a precisão2 foi de
9,2%, a reprodutibilidade3 foi de 11,3% sendo que a especificidade4 da dosagem está
demonstrada na Figura 1.
Figura 1. Curva padrão do 17β-E2 (n). Paralelismo obtido com diluições seriadas do plasma ( ) (1/2; 1/4; 1/8; 1/16) do pacu.
1 A sensibilidade de uma dosagem é determinada a partir da quantidade mínima de antígeno detectável. É calculada como a média da densidade ótica observada para o valor 0 pg/ml da curva padrão ou do BO menos dois desvios-padrões.
2 A precisão da dosagem foi calculada através da média dos coeficientes de variação intra-ensaio. C.V.= (100 x S)/M; onde: S = desvio padrão e M = média.
3 A reprodutibilidade da dosagem foi determinada através do coeficiente de variação inter-ensaio.
4 A especificidade da dosagem foi estimada pelo paralelismo entre a reta de regressão da curva padrão com a reta de re-gressão das diferentes diluições do plasma e da hipófise do pacu. Se as retas forem paralelas, consideramos que o anti-corpo reconhesse a melatonina do pacu.
0 1 2 3 4 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 concentração (log) logit DO
curva padrão do estradiol diluições do plasma
Característica da dosagem da testosterona plasmática:
A sensibilidade detectada na dosagem foi de 0,19 ng/mL, a precisão foi de 14,9% a reprodutibilidade foi de 6,8%, sendo que a especificidade da dosagem está demonstrada na Figura 2.
Figura 2 - Curva padrão da testosterona (n). Paralelismo obtido com diluições seriadas do plasma ( ) (1/2; 1/4; 1/8; 1/16) do pacu.
Variação dos fatores ambientais
Os valores de chuva total mensal (cm) e fotofase (em horas.min.) foram fornecidos pela Estação Meteorológica da Academia da Força Aérea – AFA de Pirassununga – SP. Os dados de temperatura de água do viveiro (ºC) foram obtidos diariamente, sempre às 8:00h e às 17:00h através de um termômetro digital (Tabela 2).
Tabela 2. Temperaturas médias mensais da água do viveiro (ºC), fotofase (em horas.min.) e chuva total mensal
(cm), para o município de Pirassununga-SP durante os anos de 1999 e 2000. Dados fornecidos pela Academia da Força Aérea – AFA (Pirassununga-SP).
1999 2000
média mensal jan fev mar abr mai jun jul ago set out nov dez jan fev
Temperatura (ºC) 27.2 28.0 26.7 23.9 19.8 18.9 20.5 19.5 21.5 23.5 26.0 28.4 27.8 27.5 Fotofase (h) 13.2 12.9 12.1 11.3 11.3 10.6 11.0 11.1 12.3 12.9 13.1 13.3 13.2 12.9 Chuvas (cm) 268 237 109 71 22 32 6.9 0 92 78 83 217 299 237 Análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada por meio do programa Minitab, onde foi feita uma análise de variância GLM seguida do teste de múltipla comparação de
-2 -1 0 1 2 3 -1,2 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 concentração (log) logit DO
curva padrão da testosterona diluições do plasma
Tukey (P<0,05). Para análise dos dados, os seguintes fatores, bem como suas intera-ções, foram levados em consideração: mês, EDG, fotofase, temperatura e regime de chuvas.
4. RESULTADOS
Desenvolvimento ovariano
As fêmeas de pacu apresentaram uma variação significativa da RGS ao longo do ano (Figura 3). As menores RGS foram observadas entre os meses de março e agosto, sendo que em maio a RGS atingiu seu valor mínimo (0,34 ± 0,09%), em seguida a RGS foi aumentando gradativamente atingindo em dezembro sua maior percentagem (11,07 ± 0,91%) e que foi diferente significativamente das demais RGS, com exceção de janeiro (8,35 ± 2,09%).
Figura 3. Distribuição mensal (%) dos estágios de desenvolvimento gonadal (EDG) e variação sazonal
da RGS (%) (média ± epm) (N=4-14) de fêmeas de pacu (Δ) durante o período experimental (1999-2000). Médias com letras diferentes indicam que apresentam diferenças estatisticamente significativas,
P<0,05.
Após a classificação das fêmeas por EDG, observamos que o estágio de repou-so reprodutivo ocorreu de março a agosto coincidindo com a menor RGS (0,34 ± 0,09%). O estágio de maturação inicial ocorreu de agosto a outubro, momento em que a RGS aumentou significativamente (4,40 ± 0,83%, P<0,05). Já o estágio de maturação a-vançada ocorreu de dezembro/1999 a fevereiro/2000 e observou-se ao mesmo tempo a maior RGS (9,71 ± 1,17%, P<0,05). A regressão ovocitária ocorreu de fevereiro a
0 20 40 60 80 100 120
janeiro março maio agosto outubro dezembro fevereiro
fêmeas (% ) regressão repouso mat.inicial mat.avançada 1999 2000 de b cd ad a ae bc 0 2 4 6 8 10 12 14 R G S (%
maio/1999, momento em que a RGS estava diminuindo (2,07 ± 0,45%, P<0,05) (Figura 4).
A RGS e os fatores ambientais foram significativamente (P<0,05) e positiva-mente correlacionados ([RGS*temperatura] R=0,47; [RGS*chuva] R=0,58; [RGS*fotofase] R=0,70). Ao mesmo tempo a RGS também apresentou uma correlação significativa (P<0,05) e positiva com o EDG ([RGS*EDG] R=0,67). O EDG e os fatores ambientais também apresentaram correlações significativas (P<0,05) e positivas ([EDG*temperatura] R=0,36; [EDG*chuva] R=0,44; [EDG*fotofase] R=0,61).
Figura 4. Variação da RGS (%) de fêmeas de pacu (média ± epm) em relação aos estágios do desenvol-vimento gonadal (EDG). Médias com letras diferentes indicam que apresentam diferenças
estatisticamen-te significativas, P<0,05 (N=12-13). Níveis plasmáticos de E2 de fêmeas de pacu
Na Figura 5, observamos que não houve diferença significativa nos níveis de E2 em re-lação ao EDG apesar das fêmeas em regressão e em repouso reprodutivo apresentarem níveis de E2 numericamente inferiores (442,0 ± 67,8 e 388,9 ± 61,8pg/ml respectivamen-te) daqueles observados em maturação inicial (654,7 ± 57,9 pg/ml) e avançada (537,7± 126pg/ml). Entretanto os níveis de E2 apresentaram uma correlação significativa (P<0,05) com a RGS (R=0,42) e com o EDG (R=0,30). Porém, não foi observada correlação entre os níveis de E2 das fêmeas com os fatores ambientais.
ab a b c 0 2 4 6 8 10 12
regressão repouso mat. Inicial mat.avançada
EDG
RGS (%
Figura 5. Variação dos níveis plasmáticos médios de E2 (pg/ml) de fêmeas de pacu (média ± epm) em relação aos estágios do desenvolvimento gonadal (EDG). Médias com * indicam que não diferem
signifi-cativamente (N=4-12). Níveis plasmáticos de testosterona de fêmeas de pacu
Com relação aos níveis plasmáticos de testosterona de fêmeas em maturação avançada (71,4 ± 22,5ng/ml), verificamos que estes foram significativamente superiores aos ní-veis das fêmeas em regressão e repouso. Já fêmeas em maturação inicial, apresentavam níveis de testosterona intermediários, sendo estatisticamente semelhantes aos níveis dos animais nos demais estágios (Figura 6). Simultaneamente correlações significativas (P<0,05) foram observadas entre os níveis de testosterona com a fotofase (R=0,44) e com os parâmetros reprodutivos [testosterona*RGS] R= 0,53 e [testosterona*EDG] R= 0,56. Foram observadas, também, correlações significativas entre os níveis de testoste-rona com os níveis de E2 (R=0,43).
* * * * 0 300 600 900
regressão repouso mat.inicial mat.avançada
EDG
Figura 6. Variação dos níveis plasmáticos médios de testosterona (ng/ml) de fêmeas de pacu (média ± epm) em relação aos estágios do desenvolvimento gonadal (EDG). Médias com letras diferentes indicam
que apresentam diferenças estatisticamente significativas, P<0,05 (N=8-24).
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
Nossos resultados demonstram que os níveis plasmáticos de E2, em fêmeas de pacu, variaram durante todo o desenvolvimento ovariano.
Também observamos que baixos níveis de E2 ocorreram na época em que foram verificados as mais baixas temperaturas de água e os menores comprimentos de dia e coincidiram com a fase de regressão oocitária e repouso sexual, ou seja, época onde foi constatado o menor valor de RGS. Resultados semelhantes foram observados em fêmeas de Oncorhynchus mykiss (SCOTT e SUMPTER, 1983). De acordo com alguns autores, o E2 controla negativamente o FSH nesta fase da gametogênese, assim os baixos níveis de E2 observados permitiriam o aumento do FSH e início da vitelogênese (DICKEY e SWANSON, 1998; SALIGAUT et al.,1999).
Em seguida, durante o aumento da fotofase e da temperatura da água, os níveis plasmáticos de E2 aumentaram significativamente, coincidindo com o início da vitelogênese (maturação inicial) e em acordo com a principal função dos estrógenos que é promover a síntese e secreção hepática da vitelogenina (WALLACE, 1985). De fato, em fêmeas de Oncorhynchus mykiss, a vitelogênese esta relacionada à altos níveis de FSH, E2 e testosterona mas à baixos níveis de LH (SALIGAUT et al.,1998; DAVIES et al., 1999). a a ab b 0 20 40 60 80 100
regressão repouso mat.inicial mat.avançada
EDG
Ao fim da vitelogênese, quando a temperatura da água, fotofase e a precipita-ção pluviométrica estavam altas, as fêmeas estavam em maturaprecipita-ção avançada e obser-vamos que os níveis de E2 cairam ligeiramente mas ainda eram superiores aos valores no repouso, de forma semelhante ao que foi descrito inicialmente para o pacu (GAZOLA et al., 1996) e para outras espécies de peixe. Segundo alguns autores, a vari-ação nos níveis de E2 na fase final da maturvari-ação depende do tipo de desenvolvimento ovariano. Assim, normalmente fêmeas com ovários do tipo grupo sincrônico, como o pacu, apresentam um progressivo decréscimo nos níveis plasmáticos de E2 no fim da maturação (LAMBA et al., 1983; SCOTT e SUMPTER, 1983; KIME, 1993; LINARD et al., 1995). Por outro lado, para espécies que desovam várias vezes (2 a 3) em um período reprodutivo, os níveis de E2 permanecem altos durante a maturação final (KOBAYASHI et al., 1987; MATSUYAMA et al., 1988). Entretanto, foi observado que para fêmeas de Dicentrarchus labrax (ovário do tipo grupo sincrônico), uma variação nos níveis de E2 na maturação final não influenciava a desova sendo que esta ocorria tanto quando os níveis de E2 eram baixos ou altos (PRAT et al., 1999).
Com relação aos níveis de testosterona em fêmeas, foi primeiramente obser-vado um discreto aumento antes do início da vitelogênese. Aparentemente este aumen-to de tesaumen-tosterona pode estar relacionado com a função desse esteróide na formação das gotículas de lipídios nos oócitos (KOBAYASHI et al., 1987) e na liberação do FSH para a iniciação da vitelogênese (CRIM; EVANS, 1979). Durante a vitelogênese, foi ob-servado um progressivo aumento nos níveis de testosterona até atingir o pico que coin-cidiu com o período final da maturação, concordando com os resultados obtidos em outros teleósteos (SCOTT et al., 1980; VAN DEN KRAAK et al., 1984; FOSTIER; JALABERT 1986; MARCANO et al., 2007). A função exata da testosterona em fêmeas de teleósteos ainda não está totalmente clara, mas aparentemente este andrógeno teria uma função importante na maturação das fêmeas. Alguns autores relataram que o au-mento de testosterona durante a vitelogênese poderia estar relacionado à função da testosterona como precursor do E2 e a sua subsequente liberação no plasma devido a uma diminuição na atividade da aromatase (KAGAWA et al., 1983; REIS-HENRIQUES et al., 2000). Outros autores observaram que o aumento de testosterona na maturação final seria responsável pelo pico pré-ovulatório do LH e indicaria que os oócitos estão completamente maduros e prontos para ovulação (KOBAYASHI et al.,1989). Corrobo-rando com a hipótese de que a testosterona possa ser um forte indicador do estágio de desenvolvimento do oócito em pacu, foram observadas correlações positivas entre os níveis plasmáticos de testosterona e a RGS e o EDG das fêmeas. Também foram
detec-tadas correlações positivas entre a testosterona e o E2, confirmando a importância des-ses dois hormônios na gametogênese da fêmea.
Em conclusão, neste experimento verificamos que para o pacu, Piaractus
mesopotamicus, um peixe migratório subtropical, os níveis plasmáticos de testosterona
de fêmeas evoluiram concomitantemente ao desenvolvimento gonadal. Já para os níveis de E2 não houve uma diferença estatística entre os diferentes estágios de desenvolvimento gonadal, mas foi possível observar uma tendência dos níveis de E2 de fêmeas maduras serem maiores de que de fêmeas em repouso.
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Doutora em Fisiologia pelo Instituo de Biociên-cias, Universidade de São Paulo - (IB/USP). Docente do Centro Universitário Anhanguera, unidade Leme, SP.
João Alberto Negrão
Doutor em Fisiologia pelo INRA – França. Pro-fessor Doutor da FZEA, Universidade de São Paulo – USP, Pirassununga, SP.
Ana Maria de Lauro Castrucci
Doutora em Fisiologia. Professora Titular do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo - (IB/USP).
