UFRRJ
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
ANIMAL
DISSERTAÇÃO
Avaliação da Qualidade Ambiental da Bacia do Rio Paraíba do
Sul e Reservatório do Funil, Sudeste, Brasil, Utilizando
Biomarcadores e Bioindicadores em Peixes.
Claudio Nona Morado
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA QUALIDADE AMBIENTAL DA BACIA DO
RIO PARAÍBA DO SUL E RESERVATÓRIO DO FUNIL,
SUDESTE, BRASIL, UTILIZANDO BIOMARCADORES E
BIOINDICADORES EM PEIXES.
CLAUDIO NONA MORADO
Sob a Orientação do Professor
Francisco Gerson Araújo
Sob a Co-Orientação do Professor
Francisco José Roma Paumgartten
Dissertação
submetida
como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências, no
Programa de Pós-Graduação em
Biologia Animal.
Seropédica, RJ
Abril de 2008
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ANIMAL
CLAUDIO NONA MORADO
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências, no Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM / / 2008.
Francisco Gerson Araújo – UFRRJ (Orientador)
Francisco José Roma Paumgartten - FIOCRUZ (Co-Orientador)
Sérgio Noboru Kuriyama – FIOCRUZ
Aos meus pais Armindo e Gilca, pela minha existência nesta vida e por todo
apoio, incentivo e dedicação incondicional.
DEDICO
À minha futura esposa Juliana Ribeiro, por sua ajuda no meu processo de
autoconhecimento e busca da paz e da serenidade (ainda temos um longo
caminho a percorrer); por seu apoio e incentivo constantes, que nunca me
deixaram esmorecer; por seu entusiasmo e alegria contagiantes, poderosas
alavancas para a superação dos obstáculos surgidos. Por tudo isso, e pela
felicidade de tê-la ao meu lado.
OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
Ao meu pai Armindo por todo o apoio, dedicação e paciência. As palavras são limitadas para expressar toda minha gratidão.
Ao meu orientador Professor Francisco Gerson Araújo, co-responsável pelo meu crescimento científico. Pesquisador incansável, que exatamente por ser exigente com seus orientandos, faz com que nos superemos a cada dia. Obrigado por tudo que me ensinou e pela paciência.
Ao meu co-orientador, Francisco José Roma Paungartten, por ter aberto as portas do seu prestigiado laboratório para o desenvolvimento de parte desta pesquisa, pelas valiosas explicações dadas, e por ter me recebido tão bem durante o período em que aí estive.
À doutora Ana Cecília e ao mestrando Thiago Parente, pela aprendizagem e ajuda no desenvolvimento de todas as etapas das análises das atividades de EROD.
Ao Thiago e à sua estagiária Helen pelo desenvolvimento das análises da atividade de EROD na fração microssomal para o capítulo IV.
Aos mestres Kátia e Manoel pelas orientações para o preparo das lâminas para os testes de micronúcleo.
À Rosângela, por seu importante auxílio nas reservas do carro junto à garagem da FIOCRUZ para a realização das coletas.
À Laisa por fornecer os dados brutos para a realização do segundo capítulo. Ao Renan, pela ajuda em algumas saídas de campo.
A todos os outros membros do Laboratório de Toxicologia Ambiental da Fundação Oswaldo Cruz: Regina, Sérgio, Mara, Igor, Flávio, Karen e Márcia. Pelos momentos agradáveis e descontraídos, que ajudaram a aliviar os medos gerados pelas dificuldades que iam surgindo durante o desenvolvimento do trabalho.
À doutora Iracema, do Laboratório de Ecologia de Peixes da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, pelo treinamento referente à abertura dos peixes, retirada dos órgãos e reconhecimento dos estádios de maturação sexual para a realização dos trabalhos de campo antes do início do projeto.
Ao Antônio, Thiago, Iracema e Paulo, pela ajuda nos trabalhos de campo na Baía de Sepetiba, visando meu treinamento para a realização dos trabalhos de campo desta pesquisa.
Ao Marco, Leonardo e Hamilton, por terem me aceito em seu projeto quando iniciei meu estágio no LEP, pelo incentivo e amizade.
Ao Benjamin, por todo apoio recebido quando “migrei” para a água doce. Pela valiosa ajuda no desenvolvimento deste projeto, tanto no laboratório quanto no campo, pelas sugestões, pelo incentivo e amizade.
Ao Ruan, pela preciosa ajuda ao longo do desenvolvimento deste trabalho, pelo incentivo e amizade.
Ao Eduardo, pelas boas sugestões e ajuda prática referente ao campo e pela amizade. Ao Thiago, Paulo, José, Tatiana, Leonardo, Renata, José Fernando, Albieri, Wagner, Sérgio, André Santista, Iracema, Benjamin, Ruan e Alexandre pela ajuda nos trabalhos de campo.
Ao Vitor, pela confecção dos mapas, e pela amizade.
À noiva do Eduardo e sua família, pela amável acolhida em sua confortável pousada em uma das saídas de campo.
Ao “gambazinho”, filho do prefeito de Paraibuna (SP), que gentilmente nos ofereceu um excelente local para hospedagem. E pela ajuda constante, a ponto de ter se tornado membro temporário da equipe e se revelado um Biólogo em potencial.
Ao Charles e sua família, por terem gentilmente nos abrigado em sua casa em Volta Redonda. Obrigado por nos receberem tão bem.
E mais uma vez ao Thiago Parente, que ainda não satisfeito por toda sua ajuda tanto no campo quanto no laboratório, também emprestou seu sítio em Santa Rita do Jacutinga (MG) para ficarmos durante as coletas para a realização do bioensaio. Obrigado a você e à sua família, pela ajuda, carinho e amizade.
À EMATER de Rio das Flores, por ter conseguido um ótimo lugar para ficarmos durante as coletas no rio Preto.
Ao “Mineiro”, por ter nos guiado pelo rio Preto em direção aos “acarás” Geophagus
brasiliensis que ele sabia exatamente onde estavam. E pelo seu bom humor e amizade.
Aos ribeirinhos de São José dos Campos, por terem oferecido gentilmente suas casas para que pudéssemos desenvolver nosso trabalho com mais infra-estrutura (luz, pia, etc.) e tivéssemos um lugar para pernoitar com mais conforto. E a todos os ribeirinhos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul, sempre dispostos a ajudar de boa vontade.
À Márcia e Paulinha, pelo incentivo, carinho e amizade.
Ao Joaquim, pelas várias vezes em que me ajudou desde que entrei no laboratório, e pela amizade.
Aos demais componentes e ex-componentes da equipe do LEP, que de alguma forma também colaboraram para o desenvolvimento deste trabalho: André Pessanha, Igor, Bianca, Silvana, Débora, Camila, Alex, Fernanda, Chico, Márcio, Rosane, Deca, Jorginho e Roberto. Aos professores Francisco Manoel de Souza Braga e Afonso Celso Dias Bainy, pela gentileza e atenção de me enviar prontamente seus respectivos trabalhos quando os solicitei, o que em muito contribuiu para um melhor desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Curso de Pós-Graduação em Biologia Animal da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro e a todos os professores deste curso.
À FIOCRUZ, por ter cedido o carro para as saídas de campo.
Ao CNPq, Conselho Nacional de desenvolvimento Científico e Tecnológico, (projeto: CT-HIDRO), pela concessão da bolsa.
À tia Thomires, por ter me recebido gentilmente em sua casa durante os períodos de realização das análises de laboratório na FIOCRUZ. Por todo o carinho e dedicação.
Ao Fábio, por ter me emprestado seu computador por um tempo, seu carro para uma das saídas de campo, por ter ajudado nas anotações em uma das coletas e pela amizade.
Ao meu irmão Marco, pelo seu apoio, incentivo e amizade. À minha sobrinha Marcelli, por existir.
À minha noiva Juliana, pela felicidade de crescermos juntos. Aos meus pais, pelo dom da vida e pelo cuidado.
“O homem é parte da natureza e sua guerra contra a natureza
é
inevitavelmente
uma
guerra
contra
si
mesmo...Temos
pela
frente um desafio como nunca a humanidade teve, de provar nossa maturidade e
nosso domínio, não da natureza, mas de nós mesmos”.
Rachel Carson
“Seja a mudança que deseja ver no mundo”.
RESUMO
MORADO, Claudio Nona. Avaliação da qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba do
Sul e reservatório do Funil utilizando biomarcadores e bioindicadores em peixes. 2008.
127p. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal). Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
A avaliação do uso de quatro espécies de peixes (Geophagus brasiliensis, Pimelodus
maculatus, Hypostomus affinis e Hypostomus aurogutatus) como biomarcadores e/ou
bioindicadores de exposição à xenobióticos foi estudada no rio Paraíba do Sul (RPS), em diferentes locais e períodos do ano. Adicionalmente, este estudo foi realizado com apenas uma espécie (P. maculatus) no reservatório do Funil, visando testar se gradientes de qualidade ambiental correspondem a variações nos biomarcadores/bioindicadores. No trecho médio-inferior do rio Paraíba do Sul foram utilisados como biomarcadores a atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) e Freqüências de Micronúcleos (MN) e como bioindicadores, o Índice hepato-somático (IHS), o Índice gonado-somático (IGS) e Fator de Condição (FC) em duas espécies (G. brasiliensis e P. maculatus) para a comparação de sete locais: 1 – reservatório do Funil; 2 – RPS em Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – RPS em Três Rios; 5 – rio Preto (Referência); 6 – rio Paraibuna (MG); e 7 – rio Piabanha. Com exceção do IGS, todos os biomarcadores e bioindicadores apresentaram diferenças significativas entre os locais para ambas as espécies. Os locais mais críticos foram, em ordem decrescente, 7, 6, 4 e 2, concordando com a hipótese de que locais com maior proximidade de centros urbanos que introduzem cargas de efluentes industriais, domésticos, agrícolas, bem como a proximidade de represas apresentam maiores alterações. Sazonalmente (verão/úmido versus inverno/seco), foram testados o IHS e FC em três espécies (G.
brasiliensis, H. affinis, H. aurogutatus) em dez locais: 1 – Paraitinga/Paraibuna (Referência);
2 – RPS em São José dos Campos; 3 – RPS em Barra Mansa/Volta Redonda; 4 – rio Preto (Referência); 5 – rio Paraibuna (MG); 6 – rio Piabanha; 7 – RPS em Três Rios/Anta/Sapucaia; 8 – rio Grande; 9 – rio Muriaé; 10 – RPS em Campos/São João da Barra. Os maiores IHS para as três espécies foram registrados nos locais 3 (RPS em Barra Mansa/Volta Redonda) e 6 (rio Piabanha), que são localizados próximos a grandes centros urbanos que poderiam estar contribuindo para introdução de xenobióticos. Os maiores IHS ocorreram no inverno/seco, sugerindo maiores concentrações de poluentes neste período. Os menores valores do FC ocorreram no local 1 (Referência) para G. brasiliensis, e os maiores no local 3 (RPS em Barra Mansa/Volta Redonda). Sazonalmente, maiores FC foram registrados no verão/úmido, provavelmente relacionado à maior entrada de material alóctone no período das chuvas. Tais resultados corroboram a hipótese de que o aumento tanto do IHS quanto do Fator de Condição podem indicar sinais de estresse ambiental, com o IHS refletindo melhor a avaliação ambiental nos locais estudados. No reservatório do Funil foram utilizados os biomarcadores EROD e MN e os bioindicadores IHS, IGS e FC em P. maculatus em quatro locais ao longo de um gradiente longitudinal: 1 – RPS à montante do reservatório; 2 – parte superior do reservatório; 3 – parte inferior do reservatório; 4 – RPS à jusante do reservatório. Os maiores valores de EROD e menores valores de IGS ocorreram no local 4, em relação aos locais 2 e 1, respectivamente, com diferença significativa (P<0.05), sugerindo que as águas que deixam o reservatório provávelmente possuem a maior presença de xenobióticos. Este padrão não concorda com a hipótese de que o reservatório do Funil atua como filtro para o sistema Paraíba do Sul. A avaliação das respostas de indução em Geophagus brasiliensis a poluentes ambientais através de bioensaios. A avaliação das respostas de indução a poluentes ambientais em G. brasiliensis realizadas através da exposição por três dias aos compostos de
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs) beta-naftoflavona (BNF) e dimetilbenzoantraceno (DMBA), mostraram-se significativamente aumentadas da atividade de EROD nos indivíduos tratados com BNF, e elevação na Freqüência de Micronúcleos no grupo tratado com DMBA em relação ao grupo controle. Tais resultados sugerem uma modulação da BNF no metabolismo de biotransformação (EROD) e a modulação do DMBA na genotoxicidade (MN). Concluimos que, dos locais analisados neste trabalho, os que apresentaram sinais de maior alteração devido à presença de xenobióticos foram: rio Piabanha, rio Paraibuna (MG), Três rios, Volta Redonda e São José dos Campos. O que confirma a hipótese de que locais próximos a grandes centros urbano-industriais apresentam maiores concentrações de poluentes químicos. Na bacia do rio Paraíba do Sul o período de inverno/seco parece ser o que ocorre os maiores níveis de concentração de xenobióticos, possívelmente devido ao menor volume d’água e conseqüente menor proporção de diluição dos poluentes neste período em relação ao verão úmido. O reservatório do Funil não serve como um filtro para xenobióticos das águas do rio Paraíba do Sul da região a montante para jusante da represa. Além disso, provávelmente a estrutura da barragem, assim como as operações para a produção de energia hidrelétrica podem estar liberando xenobióticos no rio Paraíba do Sul a jusante do reservatório, o que pode estar comprometendo as populações de P.
maculatus neste local, já que muitos desses compostos possuem propriedades
antiestrogênicas. O uso integrado dos diferentes biomarcadores e bioindicadores mostrou-se eficiente para a avaliação da qualidade ambiental da bacia do rio Paraíba do Sul e do reservatório do Funil, contribuindo para um diagnóstico mais completo sobre a saúde dos peixes expostos a xenobióticos nesses locais. Geophagus brasiliensis mostrou-se uma espécie adequada para a realização de estudos de biomonitoramento em países tropicais.
ABSTRACT
MORADO, Claudio Nona. Environmental qualities evaluation of the Paraíba do Sul river
bacin and Funil reservoir using biomarkers and bioindicators in fishes. 2008. 127p.
Dissertation (Master in Animal Biology). Institute of Biology, Departament of Animal Biology, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.
An evaluation of the suitability of four fish species (Geophagus brasiliensis, Pimelodus
maculatus, Hypostomus affinis e Hypostomus aurogutatus) as biomarkers and bioindicators of
xenobiotic exposure was assessed in the Paraíba do Sul river (PSR) in differente sites and seasons. Additionally, one species (P. maculatus) was used in Funil to test environmental quality gradient along the axis river – reservoir. The biomarkers activity of
ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) and Frequency of Micronuclei (MN) and the bioindicators Hepatosomatic Index (HSI), Gonadosomatic Index (GSI) and Condition Factor (CF) were used. In the middle-lower reaches of the PSR the two fish species G. brasiliensis and P.
maculatus were use studied in seven sites: 1 – Funil reservoir; 2 – PSR at Volta Redonda; 3 –
Ribeirão das Lajes reservoir; 4 – RPS at Três Rios; 5 – Preto river (Reference); 6 – Paraibuna river (MG); and 7 – Piabanha river. All biomarkers and bioindicators, except GSI, showed significant differences among sites for both species. The most impaired sites, in decreasing order, were 7, 6, 4 and 2, corroborating the hypothesis that sites near to urban centers that introduce large industrial, domestic and agricultural loads into the river show higher values in biomarkers and bioindicators. Seasonally (sumer/wet versus winter/dry), HSI and CF were tested for the thre species (G. brasiliensis, H. affinis, and H. aurogutatus) at 10 sites: 1 – Paraitinga/Paraibuna (Reference); 2 – PSR at São José dos Campos; 3 – PSR at Barra Mansa/Volta Redonda; 4 – Preto river (Reference); 5 – Paraibuna river (MG); 6 – Piabanha river; 7 – PSR at Três Rios/Anta/Sapucaia; 8 – Grande river; 9 – Muriaé river; 10 – PSR at Campos/São João da Barra. Higher HSI for the three species were recorded at PSR at Barra Mansa/Volta Redonda and site 6 (Piabanha river), both located near to large urban centers that may contribute to large amont of xenobiotics into the river. Higher HSI occured in winter/dry season, suggesting higher cocnentrations os pollutants in this period. Lower CF ocorred at site 1 (Reference) for G. brasiliensis, and the higher for site 3 (PSR at Barra Mansa/Volta Redonda). Seasonally, higher CF occured in summer/wet, probably related to large amount of allocthone material brought into the river mainly in rainfall season. Such results corroborate the hypethesis that larger the HSI and CF indicate environmental stress, with HSI reflecting more consistently signals of environmental stress. In Funil reservoir the biomarkers EROD and MN and the bioindicators HSI, GSI and CF were measured in P. maculatus at four sites along na longitudinal gradient: 1 – PSR at headwates of the reservoir; 2 – upper part of the reservoir; 3 – lower part of the reservoir; 4 – PSR after the reservoir dam. Higher EROD activity and lower GSI were recorded at site 4, compared with sites 2 e 1, respectively, with signficant differences (P<0.05), suggesting that waters after the reservoir probably have presence of xenobiotics. This pattern does not confirm the hypothesis that Funil reservoir acts as a pollution filter for PSR waters. Induction of xenobiotics in Geophagus brasiliensis were tested through bioessays after three days of exposure at Hydrocarbons Policyclical Aromatic (HPAs) ß-naphthoflavone (BNF) and dimethylbenz(a)antracene (DMBA). A significant increasing in EROD activity treated with BNF, and increasing in Micronuclei Frequency (MN) with DMBA exposure were detected. Such results suggest a BNF modulation in biotransformation metabolism (EROD) and a DMBA modulation in genotoxicity (MN). We conclude that the more alterated sites due to the probable presence of xenobiotics were: Piabanha river, Paraibuna river (MG), Três Rios, Volta Redonda and São José dos Campos.
The hypothesis that sites near to large urban-industrial centers have more concentrations of chemical pollutants is confirmed. In the Paraíba do Sul basin the winter/dry season seems to present the highest xenobiotic concentration, possibly due to the lower water levels and consequently lower capacity of pollutants dillution compared with the summer/wet season. Funil reservoir did not work as a xenobiotic filter for upstreams for Paraíba do Sul river waters. Furthermore, the dam and operation procedures for power generation, may be spilling out xenobiotics for the Paraíba do Sul river downstream the dam, with effect on P. maculatus populations, since these compounds have antistrogenic proprieties. Integrated uses of biomarkers and bioindicators were efficient to assess environmetnal quality of the Paraiba do Sul river and Funil reservoir, contributing to a holist view of fish health that are exposed to xenobiotic in these systems. Geophagus brasiliensis was a suitable species to be used in biomonitoring aquatic tropical systems.
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela1. Comprimento total médio ± desvio padrão e o número de espécimes de cada espécie capturada em cada local. N= número de indivíduos... 20 Tabela 2. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em G. brasiliensis coletados em sete locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna Mineiro; 7 – rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão. ... 23 Tabela 3. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) em P. maculatus coletados em três locais da bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 1 – reservatório do Funil; 4 - Três Rios; 7 – rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão...24
Tabela 4. Freqüência de Micronúcleos (MN) no sangue de G. brasiliensis e P. maculatus nos seis locais de estudo (locais: 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 4 – Três Rios; 5 – rio Preto; 6 – rio Paraibuna; 7 – rio Piabanha). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão. ... 25 Tabela 5. Índice hepato-somático (IHS) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de coleta na bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – rio Paraibuna Mineiro; 7 – rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.26 Tabela 6. Índice gonado-somático em G. brasiliensis nos locais de coleta na bacia do rio Paraíba do Sul (locais 5 – referência; 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – reservatório de Ribeirão das Lajes - alterados). Não houve diferença significativa ... 26 Tabela 7. Fator de Condição (FC) em G. brasiliensis e P. maculatus nos locais de coleta na bacia do rio Paraíba do Sul (locais: 5 – referência; 1 – Reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – Reservatório de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 6 – Rio Paraibuna Mineiro; 7 – Rio Piabanha - alterados). N = Número de indivíduos; Valores: Média ± Desvio padrão.
... 27
CAPÍTULO II
Tabela 1. Número de peixes examinados, por local, estação do ano, tamanho e estádio de maturação sexual de Geophagus brasiliensis. N = número de indivíduos. Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M = Machos.43 Tabela 2. Hypostomus affinis nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas, número de indivíduos, faixas de comprimento, sexo e estádios de maturação sexual. N = número de indivíduos. Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M = Machos... 44
Tabela 3. Hypostomus aurogutatus nos diferentes períodos sazonais com as respectivas áreas, número de indivíduos, faixas de comprimento e estádios de maturação sexual. N = número de indivíduos. Comprimento: Min – Máx. Sexo/Estádio de maturação: F = Fêmeas; FM = Fêmeas maduras; M = Machos... 44 Tabela 4. Comparações dos valores do Índice hepato-somático entre os sites nas diferentes períodos sazonais por espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo. ... 46 Tabela 5. Comparações sazonais do Índice hepato-somático considerando-se as espécies, o sexo e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo; Períodos sazonais: 1 = Verão Úmido; 2 = Inverno Seco. ... 46 Tabela 6. Comparações dos valores do Fator de Condição entre os sites nos diferentes períodos sazonais considerando cada espécie, sexo e estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo...47 Tabela 7. Comparações sazonais do Fator de Condição, considerando-se as espécies, os sexos e o estádio de maturação sexual (para as fêmeas). **P<0.001 – Altamente significativo; *P<0.05 – Significativo; Períodos sazonais: 1 = Verão úmido; 2 = Inverno seco... 47
CAPÍTULO III
Tabela 1. Número de indivíduos, tamanho, sexo e estádio de maturação das fêmeas de P.
maculatus examinados. FM = fêmeas maduras; F = fêmeas imaturas; M = machos... 64
Tabela 2. Diferenças entre os locais para os diferentes marcadores / indicadores biológicos
... 67 CAPÍTULO IV
Tabela 1. Grupo, peso, comprimento, sexo e peso do fígado dos indivíduos...83 Tabela 2. Diferenças estatísticas dos biomarcadores e bioindicadores nos diferentes grupos. CONT = controle; BNF = tratado com beta-naftoflavona; DMBA = tratado com DMBA.
LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1. Geophagus brasiliensis...6
Figura 2. Pimelodus maculatus...6
Figura 3. Hypostomus affinis...7
Figura 4. Hypostomus aurogutatus...7
Figura 5. Bacia do rio Paraíba do Sul e represa do Funil, com destaque para os locais de coleta...8
CAPÍTULO I Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul, com destaque para os sete locais de estudo. Locais: 1 – Reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – Represa de Ribeirão das Lajes; 4 – rio Paraíba do Sul em Três Rios; 5 – rio Preto (referência); 6 – rio Paraibuna (MG); 7 – rio Piabanha. ... 17
Figura 2. Atividade EROD na fração S9 hepática em G. brasiliensis, medida em (pmoles resor/mg prot/min)... 24
Figura 3. Atividade EROD na fração S9 hepática em P. maculatus, medida em (pmoles resor/mg prot/min)... 25
CAPÍTULO II Figura 1. Bacia do rio Paraíba do Sul com os 10 locais de coleta. Locais inseridos nos círculos foram tomados em conjunto. ... 42
Figura 2. Diferenças entre os sexos para o IHS e FC para cada espécie e período sazonal. ... 48
CAPÍTULO III Figura 1. Mapa do Reservatório do Funil com os quarto locais de estudo. ... 63
Figura 2. Gráficos com os valores dos cinco marcadores / indicadores em cada local.. 68
CAPÍTULO IV Figura 1. Atividade de EROD nos diferentes grupos: controle (CONT.) e tratado com beta-naftoflavona (BNF). ... 85
Figura 2. Frequência de MN nos diferentes grupos: controle (CONT), tratado com beta-naftoflavona (BNF), e tratado com dimetilbenzoantraceno (DMBA)... 86
Lista de Abreviaturas e Siglas
ANA - Agência Nacional de Águas Ah - Aril hidrocarboneto
AhR - Receptor aril hidrocarboneto
Aw - Clima quente e úmido com verão chuvoso (classificação de Köppen) BPCs - Bifenilas policloradas
BKME - Bleached Kraft pulp Mill effluent (sistema de tratamento de efluentes) BNF - Betanaftoflavona
ß-NADP - Beta-Nicotinamida adenina dinucleotídeo BSA - Soro Albumina Bovina
CETESB - Companhia Estadual de Tecnologia e Saneamento Ambiental Cfa - Clima subtropical com verão quente (classificação de Köppen) CONAMA - Conselho Nacional de Meio Ambiente
CSN - Companhia Siderúrgica Nacional
Cwa - Clima tropical de altitude com verão quente e chuvoso (classificação de Köppen) CYP1A - Citocromo P450 isoforma 1A
DDPCs - Dibenzodioxinas policloradas DDT - diclorodifeniltricloroetano DFPCs - Dibenzofuranos policlorados DMBA - Dimetilbenzoantraceno
DNAEE - Departamento Nacional de Águas e Energia Elétrica DNA - Ácido desoxiribonucleico
DO - Densidade ótica
EDTA - Ácido etilenodiaminotetraacético Em - Emissão
ENA - Anormalidade nuclear eritrocítica EROD - Etoxiresorufina-O-desetilase
ERX - Elementos responsivos a xenobióticos Ex - Excitação
FC - Fator de condição
FEEMA - Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
FEAM - Fundação Estadual do Meio Ambiente (MG) HCH - Hexaclorociclohexano
HPAs - Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos IGS - Índice gonado-somático
IHS - Índice hepato-somático KCl - Cloreto de potássio Kg - Kilograma
K2HPO4 - Fosfato de hidrogênio dipotássio KH2PO4 - Dihidrogenofosfato de potássio MFO - Oxidases de função mixta
MG - Minas Gerais
MgCl2 - Cloreto de magnésio mg - miligrama
min - minuto ml - mililitro
µl - microlitro mM - milimolar MN - Micronúcleo NaCl - Cloreto de sódio
NADPH - Nicotinamida adenina dinucleotídeo pH - potencial hidrogenionico
pmol - picomol
POPs - Poluentes orgânicos persistentes prot - proteína
res - resorufina RJ - Rio de Janeiro RPS - Rio Paraíba do Sul SP - São Paulo
TCDD - Tetraclorodibenzo-p-dioxina VTG - Vitelogênio
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ... iv
AGRADECIMENTOS ... v
RESUMO... ix
ABSTRACT ... xi
LISTA DE TABELAS... xiii
LISTA DE FIGURAS... xv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... xv i 1 INTRODUÇÃO GERAL ... 1
1.1 Contaminação em ecossistemas aquáticos... 1
1.2 Biomarcadores e bioindicadores da qualidade ambiental ... 2
1.3 Poluentes orgânicos persistentes (POPs) ... …4
2 HIPÓTESES ... 5 3 MODELOS BIOLÓGICOS... 6 4 ÁREA DE ESTUDO... 8 CAPÍTULO I RESUMO... 10 ABSTRACT ... 11 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 OBJETIVOS ... 15 2.1 Gerais... 15 2.2 Objetivos específicos... 15 3 ÁREA DE ESTUDO... 16 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 20 4.1 COLETA ... 20 4.2 QUÍMICOS ... 21 4.3 ATIVIDADES DE LABORATÓRIO ... 21
4.3.1 Determinação da atividade enzimática – EROD ... 21
4.3.1.1 Preparação da fração citosólica (S9) hepática ... 21
4.3.1.2 Determinação da concentração de proteínas na fração S9... 21
4.3.1.3 Determinação da Atividade enzimática - EROD... 21
4.3.2 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN) ... 22
4.3.3 Bioindicadores... 22 4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 22 5 RESULTADOS ... 23 5.1 Atividade de EROD... 23 5.2 Freqüência de Micronúcleos (MN) ... 25 5.3 Índice hepato-somático ... 25 5.4 Índice gonado-somático... 26 5.5 Fator de Condição ... 26 6 DISCUSSÃO ... 28 7 CONCLUSÕES... 31 8 REFERÊNCIAS ... 32
CAPÍTULO II RESUMO... 38 ABSTRACT ... 39 1 INTRODUCÃO ... 40 2 MATERIAL E MÉTODOS ... 42 2.1 Área de estudo... 42
2.2 Coletas dos peixes ... 42
2.3 Tratamento dos dados... 44
3 RESULTADOS ... 46
3.1 Índice hepato-somático (IHS)... 46
3.2 Fator de Condição (FC) ... 47
3.3 Diferenças entre os sexos... 47
4 DISCUSSÃO ... 49 5 CONCLUSÕES... 52 6 REFERÊNCIAS ... .53 CAPÍTULO III RESUMO... 58 ABSTRACT ... 59 1 INTRODUÇÃO ... 60 2 MATERIAL E MÉTODOS ... 63 2.1 Área de estudo... 63 2.2 Coleta de dados ... 64 2.3 Químicos... 64 2.4 Trabalho de laboratório... 65 2.4.1 Biomarcadores ... 65
2.4.1.1 Determinação da Atividade Enzimática – EROD ... 65
2.4.1.2 Preparação da fração citosólica (S9) hepática ... 65
2.4.1.3 Determinação da concentração de proteínas na fração S9... 65
2.4.1.4 Determinação da Atividade enzimática - EROD... 65
2.4.1.5 Determinação da Freqüência de Micronúcleos (MN) ... 65
2.4.2 Bioindicadores... 66 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 67 4. CONCLUSÕES... 72 5 REFERÊNCIAS ... 73 CAPÍTULO IV RESUMO... 79 ABSTRACT ... 80 1 INTRODUÇÃO ... 81 2 MATERIAIS E MÉTODOS... 83 2.1 Animais teste ... 83 2.2 Tratamento... 83
2.3 Preparação da fração microssomal... 83
2.4 Determinação da concentração de proteínas na fração S9... 84
2.5 Determinação da Atividade enzimática - EROD... 84
2.6 Químicos... 84
2.7 Procedimentos para micronúcleos ... 84
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 85 4 CONCLUSÕES... 87 5 REFERÊNCIAS ... 88 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS...92 7 CONCLUSÕES GERAIS...94 8REFERÊNCIAS...95
1 INTRODUÇÃO GERAL
1.1 Contaminação em ecossistemas aquáticos
Alterações ambientais em bacias hidrográficas têm sido constantes e crescentes no Brasil. O rio Paraíba do Sul (RPS) é um dos sistemas lóticos mais usados do Brasil, por se localizar em uma das mais importantes regiões industriais do país e, conseqüentemente, não foge a esse processo de deterioração, sendo considerado um dos rios mais impactados por poluentes (PFEIFFER et al. 1986; CARVALHO & TORRES 2002). Suas águas, além do abastecimento para populações de grandes e pequenas cidades, são utilizadas para várias outras atividades, tais como: produção de energia através de barragens de hidrelétricas, navegação, pesca, resfriamento de máquinas de parques industriais, introdução e diluição de efluentes domésticos e agrícolas (Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente - FEEMA 1999; CARVALHO & TORRES 2002).
No geral a bacia do rio Paraíba do Sul recebe 207 toneladas de esgoto doméstico e industrial, sendo que quase 8 milhões de habitantes; 54 mil indústrias; 175 cidades; cerca de 33 hidrelétricas; e grandes áreas de agricultura intensiva localizadas às suas margens em alguns trechos também poluem o rio Paraíba do Sul. Contudo, de acordo com informações da Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental (CETESB 1999), apesar de toda a poluição, em apenas 2 locais (Caçapava e Aparecida) cerca de 400 km de extensão, as águas do rio Paraíba do Sul são consideradas ruins, em todo o resto é definida como “aceitável”, ou seja, que podem ser consumidos após tratamento. Essas informações necessitam ser reavaliadas e estudos de biomonitoramento devem ser realizados para que se tenha uma compreensão mais realista da presença e das alterações causadas por poluentes na bacia do rio Paraíba do Sul, diagnosticando a extensão e tendências espacias e temporais da poluição difusa por xenobióticos neste importante sistema.
O reservatório do Funil, situado no Município de Resende, na divisa do Estado de São Paulo com o Estado do Rio de Janeiro, construído na década de 60, com o objetivo de geração de energia hidrelétrica, devido à sua importância para a qualidade das águas do rio Paraíba do Sul à sua jusante, e de receber grande quantidade de poluentes provenientes de grandes centros urbano-industriais e áreas de agricultura intensiva das cidades do Estado de São Paulo à sua montante, também foi avaliado quanto à presença de contaminantes químicos.
O monitoramento biológico em rios é essencial para identificar as respostas do ambiente aos impactos causados pela ação antrópica, além de fornecer diretrizes que possam regulamentar o uso dos recursos hídricos, possibilitando o desenvolvimento de alternativas para minimizar a degradação dos rios (KARR et al. 2000).
Peixes são expostos a substâncias tóxicas de maneira similar a outros vertebrados, podendo ser utilizados para avaliar a presença de substâncias potencialmente teratogênicas e carcinogênicas em humanos (HARSHBARGER & CLARK 1990). A utilização de respostas biológicas para avaliação da qualidade ambiental é vantajosa em relação às medidas físicas e químicas da água, desde que estas registram apenas o momento em que foram coletadas, necessitando de muitas análises para a realização de um monitoramento temporal eficiente (METCALFE 1989). Além disso, a poluição de corpos d’água reduz sua qualidade e é estressante para a biota (GAGNÉ et al. 2002; VAN DER OOST et al. 2003). Esses eventos usualmente precedem efeitos mais sérios nas populações e/ou comunidades (ADAMS et al. 2001). Portanto, a qualidade da água também pode ser acessada usando parâmetros biológicos (ILIOPOULOU-GEORGUDAKI et al. 2003) devido aos organismos aquáticos serem os receptores, enquanto os índices químicos não incorporam todos os poluentes presentes na água nem as mixturas complexas que são formadas deles e que já são implicadas como a fonte primária de muitos problemas ambientais mostrados hoje.
A toxicocinética e a toxicodinâmica de um contaminante em uma espécie em particular determina se uma exposição é capaz de uma resposta adversa. Uma aproximação baseada em biomarcador fornece uma medida direta dos efeitos tóxicos nas espécies afetadas (DICKERSON et al. 1994).
1.2 Biomarcadores e bioindicadores da qualidade ambiental
De acordo com WALKER et al. (2001) biomarcadores ou marcadores biológicos são
alterações xenobioticamente induzidas em componentes ou processos, estruturas ou funções celulares ou bioquímicas que podem ser medidas em um sistema biológico ou amostra, tal como uma variação nos flúidos celulares corporais, tecidos, ou orgãos dentro de um organismo; respostas enzimáticas e produção de metabólitos são exemplos de biomarcadores (LAM & WU 2003; VAN DER OOST et al. 2003), que podem ser relacionados a exposição a, ou efeitos tóxicos do ambiente (ADAM et al. 2001). A presença de um xenobiótico, seu metabólito ou o produto da interação entre um agente xenobiótico e uma molécula alvo (ou célula) que é medida num compartimento de um organismo, pode ser classificada como um biomarcador de exposição. Os biomarcadores são definidos como indicadores de uma habilidade inerente ou adquirida de um organismo em responder a mudanças de exposição a xenobióticos. Estes biomarcadores ajudam a elucidar o grau de resposta relacionada à exposição. Esta divisão é algumas vezes ambígua, mas serve para agrupar biomarcadores.
O principal órgão responsável pela biotransformação é o fígado, que tem a função de receber e processar substâncias químicas absorvidas pelo trato gastrointestinal antes que elas sejam distribuídas para outros tecidos. No fígado, então, os xenobióticos são modificados quimicamente, podendo, a partir daí ser armazenados, secretados na bile ou distribuídos pela circulação para outros tecidos. O metabolismo de xenobióticos também pode ocorrer em outros tecidos ou órgãos. Por ser o sistema enzimático mais importante na catálise dessas reações, o citocromo P450, tem sua atividade metabólica aumentada quando o indivíduo está exposto a determinados xenobióticos. Como demonstrado a alguns anos atrás por PAYNE (1976) e confirmado por extensa literatura, a estimulação da atividade das enzimas do citocromo P450 no fígado representa um dos sinais biológicos mais precoces da exposição a poluentes na água. É sabido que a subfamília CYP1A está relacionada com processos da biotransformação de determinados poluentes tais como: HPAs, BPCs, e outros organoclorados. É através da reação de desalquilação da etoxiresorufina–O–desetilase (atividade de EROD) que se pode quantificar a atividade enzimática desta subfamília e inferir sobre a poluição aquática. Entre os indutores mais potentes de CYP1A estão os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), as dibenzodioxinas policloradas (DDPCs) e os dibenzofuranos policlorados (DFPCs), azobenzenos e azóxibenzenos, as bifenilas policloradas (BPCs), e os naftalenos (CASARETT 1991; SCHOLZ & SEGNER 1999). Em geral, compostos altamente clorados são resistentes a biotransformação e causam prolongada indução do citocromo P450 e de outras enzimas (CASARETT 1991). Portando, o aumento da atividade enzimática (EROD) em peixes, pode ser um indicador da presença de substâncias contaminantes indutoras, organoclorados, no rio. Assim, a determinação da atividade de EROD pode ser usada como biomarcador.
Outro biomarcador muito utilizado é a Freqüência de Micronúcleos que avalia a poluição aquática através de danos genotóxicos na célula de algumas espécies de peixes, ou seja, formações de micronúcleos no citoplasma. Os micronúcleos são formados por danos genotóxicos (clastogênicos) - fragmentos de cromossomos ou cromossomos acêntricos que não são incorporados no núcleo principal das células filhas no momento da anáfase da mitose (METCALFE 1988). Estudos de correlação entre o aparecimento de micronúcleos e a exposição a determinadas substâncias são utilizados em peixes para detectar a presença de substâncias químicas genotóxicas no sistema aquático, devido esses organismos apresentarem várias espécies com alto grau de sensibilidade mesmo quando em contato com baixas
concentrações de agentes genotóxicos (CRISOLIA 2001; HOOFTMAN & DE RAAT 1982; AL-SABTI 1994). Além disso, segundo AL-SABTI (1995) o teste de micronúcleos em eritrócitos de peixes é simples, confiável e sensível.
Bioindicadores são respostas a efeitos ambientais que ocorrem em níveis mais altos de organização biológica do que sub-organismo, e eles podem ser medidos a nível individual, populacional (sucesso reprodutivo, mortalidade, distribuição de tamanho, redução na abundância e biomassa), comunidades (produção primária, distribuição do ciclo de nutrientes) ou a níveis de ecossistemas (WALKER et al. 2001; OERTEL & SALÁNKI 2003); medidas biométricas e mudanças na composição específica podem ser considerados como bioindicadores (LAM & WU 2003). Biomarcadores e bioindicadores são largamente usados para determinar respostas de organismos a agentes estressores, biomarcadores sendo mais específicos e com maior variabilidade de respostas, comparados aos bioindicadores (ADAMS et al. 2001; WALKER et al. 2001; SCHMITT et al. 2005). O uso de ambos os tipos de respostas contribui para o diagnóstico do risco ecológico e para estabelecer estratégias adequadas de conservação para as espécies mais afetadas por poluentes.
Os bioindicadores utilizados neste trabalho foram: Índice hepato-somático (IHS), Índice gonado-somático (IGS), Fator de Condição. Devido à estocagem de energia e às funções metabólicas do fígado, alterações no tamanho do fígado devido a estressores ambientais são de grande interesse. Portanto, a avaliação do IHS deve considerar o papel tanto dos fatores endógenos quanto dos fatores exógenos. Dos índices organo-somáticos, o IHS é um dos mais freqüentemente associados a exposição a contaminantes (ADAMS & MCLEAN 1985). Vários investigadores têm sugerido que o alargamento relativo do fígado em peixe indica exposição a carcinógenos ambientais ou outros químicos tóxicos (POELS et al. 1980; FLETCHER et al. 1982; FABACHER & BAUMANN 1985; KICENIUK & KHAN 1987; GALLAGHER & DI GIULIO 1989; ADAMS et al. 1989). Por outro lado, alguns estudos em laboratório apresentaram uma diminuição do IHS em peixes expostos a químicos (CLAMBERS 1979; HICKIE & DIXON 1987).
O Índice gonado-somático (IGS) enquadra-se em uma categoria de indicadores que fornece informação mais a nível estrutural do que funcional; informação a respeito da saúde gonadal e estágio de maturação. O Índice gonado-somático é um dos vários índices organo-somáticos, que, a exemplo do IHS, estabelece uma relação entre o órgão e o corpo inteiro. Há evidência substancial de que a maioria dos animais sofre ciclo reprodutivo e, freqüentemente, variação dramática no tamanho gonadal é observada através deste ciclo (DE VLAMING et al. 1981). Conseqüentemente, o cálculo do peso gonadal como uma percentagem do peso do corpo tem sido usado rotineiramente para determinar a maturidade reprodutiva, assim como acessar mudanças gonadais em resposta às dinâmicas ambientais (e.g. mudanças sazonais) ou estresses exógenos (e.g. exposição a contaminantes). Existem evidências significativas de que exposição a várias classes de poluentes ambientais pode resultar em alterações gonadais tais como uma diminuição no IGS, mudanças morfológicas, ou ambos (SAKAMOTO et al. 2003; PARKS et al. 2001; SEPÚLVEDA et al. 2002b).
O Fator de Condição é um reconhecido indicador de saúde de peixes (BULGER et al. 1995). Em geral, o Fator de Condição varia diretamente com a nutrição (TYLER & DUNN 1976; BRAGA 1986). Uma correlação negativa tem sido vista entre doença e condição em peixes (MÖLLER 1985). Contudo, o Fator de Condição pode variar em uma ou outra direção fora dos limites do alcance normal em resposta a exposição química. O Fator de Condição pode também variar sazonalmente, (GRIFFITHS & KIRKWOOD 1995; SABOROWSKI & BUCHHOLZ 1996; LIMA-JUNIOR & GOITEIN 2005), possívelmente devido a mudanças na disponibilidade alimentar ou metabolismo e com mudanças no estatus gonadal (CHELLAPPA et al. 1995). O Fator de Condição, assim como IHS e IGS, são indicadores da saúde do peixe; entretanto, estes índices devem ser interpretados com cautela. Fatores com
potencial para confundir necessitam ser reconhecidos quando usamos um desses índices para comparar grupos de peixes em relação aos efeitos de contaminantes. Uma restrição primária é que o Fator de Condição e índices organo-somáticos podem ser comparados apenas dentro de uma espécie ou entre espécies similares. E também o protocolo de estudo deve ser consistente e conservativo em termos de amostragem, particularmente desde que o IHS pode ser alterado dentro de minutos pelo estresse da captura.
Neste contexto, peixes vêm sendo amplamente utilizados em estudos de toxicologia e monitoramento ambiental, na avaliação da saúde dos ecossistemas aquáticos tanto com relação à presença quanto aos efeitos de poluentes, desde que estes provocam alterações no ambiente, causando estresse, que se reflete em alterações bioquímicas e fisiológicas nos organismos expostos; por isso a utilização de peixes no monitoramento e avaliação de sistemas aquáticos vem alcançando grande importância na detecção precoce de impactos de origem antrópica (GOKSØYR & FÖRLIN 1992; SWAMI et al. 1992; HAASCH et al. 1993; EGGENS et al. 1995b; STEGEMAN et al. 1997; BAINY et al. 1999; BARRA et al. 2001; KHAN 2003 a, b; GALLOWAY et al. 2003; PARENTE et al. 2004; GALLOWAY et al. 2004; ANTUNES & GIL 2004; BEHRENS & SEGNER 2005; FACEY et al. 2005; VIJAYAN et al. 2006; KIRBY et al. 2007).
1.3 Poluentes orgânicos persistentes (POPs)
Poluentes orgânicos persistentes (POPs) são substâncias químicas eminentemente produzidas pelo homem e que persistem no ambiente, por serem de difícil degradação bioacumulam através da cadeia alimentar, e possuem um risco de causar efeitos adversos à saúde humana e ao meio ambiente (FILLMAN et al. 2002). Com a evidência do transporte de longo alcance dessas substâncias para regiões onde elas nunca foram usadas ou produzidas e a conseqüente ameaça que elas representam ao ambiente de todo o globo, a comunidade internacional tem agora, em várias ocasiões, chamado a atenção para ações globais urgentes para se reduzir e eliminar o lançamento desses químicos (UNEP 2008). Poluentes orgânicos persistentes são caracterizados pela baixa solubilidade em água e alta solubilidade em lipídios, resultando em bioacumulação nos tecidos gordurosos de organismos vivos. Os compostos organoclorados persistem por longos períodos no ambiente, com isso atuam cronicamente sobre os organismos vivos sendo capazes de induzir alterações genéticas nos organismos expostos, podendo levar a alterações congênitas e neoplasias diversas (ALI & SREEKRISHNAN 2001), atuando negativamente, sobretudo como disruptor dos sistemas reprodutivo, imunológico e endócrino, além de serem carcinogênicos (SHEFFIELD et al. 1998; YOSHIDA et al. 2000; SEPÚLVEDA et al. 2004; REYNAUD et al. 2006). Tais compostos são transportados no ambiente em baixas concentrações pelos movimentos das águas continentais e marinhas e o fato de serem semi-voláteis permite moverem-se por longas distâncias na atmosfera, o que determina sua ampla distribuição através do planeta. Num esforço para proteção do ambiente aquático, agências governamentais, em diversos países, têm adotado legislação que visa reduzir ou mesmo eliminar descargas industriais tóxicas (WHITE et al. 1996).
Alguns dos principais xenobióticos são: hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), diclorodifeniltricloroetano (DDT), hexaclorocicloexano (HCH), dibenzodioxinas policloradas (DDPCs) e dibenzofuranos policlorados (DFPCs).
O presente estudo tem por objetivo a utilização de uma bateria de biomarcadores e bioindicadores de exposição a xenobióticos para detectar possíveis alterações bioquímicas e fisiológicas em algumas espécies de peixes, refletindo o nível de estresse ambiental provocado por poluentes organoclorados na bacia do rio Paraíba do Sul e reservatório do Funil. Para tanto serão testadas algumas hipóteses.
2 HIPÓTESES
• Ecossistemas aquáticos próximos a grandes centros urbano-industriais apresentam maiores concentrações de poluentes.
• Um aumento tanto do IHS, quanto do FC podem significar efeitos deletérios de um estressor.
• O nível de concentração de poluentes no rio Paraíba do Sul pode apresentar variações sazonais.
• O reservatório do Funil funciona como um filtro para poluentes das águas do rio Paraíba do Sul à montante.
• A utilização de uma bateria de biomarcadores e bioindicadores é melhor para estudos de biomonitoramento em relação à utilização de apenas uma ferramenta.
3 MODELOS BIOLÓGICOS
Geophagus brasiliensis (QUOY & GAIMARD 1824) (Figura 1) conhecido popularmente como acará. De acordo com MENEZES et al. (2007) esta espécie possui dados ecológicos semelhantes ao de Geophagus iporangensis, que são as seguintes: é encontrada em quase todos os tipos de ambientes, desde lóticos, como os riachos de altitude, até os lênticos dos rios de planície, e também nos lagos e lagoas. Alimenta-se de invertebrados, que encontram revolvendo o substrato. Apresenta dimorfismo sexual, sendo o macho maior do que a fêmea e, durante a época da reprodução, desenvolve uma protuberância acentuada na cabeça. Estado de conservação: não ameaçada ou em perigo (OYAKAWA et al. 2006).
Figura 1. Geophagus brasiliensis
Pimelodus maculatus LACÉPÈDE 1803 (Figura 2) popularmente chamado de mandi
ou bagre, vive em rios grandes, principalmente em áreas de correnteza fraca e moderada. Os espinhos das nadadeiras peitorais e dorsal são duros e pungentes. Alimenta-se de insetos aquáticos e suas larvas, procurando-os ativamente no substrato, principalmente no período noturno e no crepúsculo. Estado de conservação: não ameaçada ou em perigo (OYAKAWA et al. 2006; MENEZES et al. 2007).
Hypostomus affinis (STEINDACHNER 1865) (Figura 3) encontrada em trechos lênticos e lóticos, tanto de rios pequenos como grandes, em fundos rochosos ou arenosos. Estado de conservação: Não ameaçada ou em perigo MENEZES et al. (2007).
Figura 3. Hypostomus affinis
Hypostomus aurogutatus (STEINDACHNER 1877) (Figura 4) encontrada nas correntezas de
grandes rios com fundos rochosos. Estado de conservação: Não ameaçada ou em perigo MENEZES et al. (2007).
Figura 4. Hypostomus aurogutatus
4 ÁREA DE ESTUDO
Figura 5. Bacia do rio Paraíba do Sul e represa do Funil, com destaque para os locais
Capítulo I
Biomarcadores e bioindicadores em duas espécies de
peixes do trecho médio-inferior da Bacia do rio Paraíba do
Sul, Brasil.
RESUMO
O trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul é o que apresenta maiores alterações ambientais em função da grande presença de centros urbano-industriais, amplas áreas de agricultura intensiva e muitas barragens para geração de energia hidrelétrica. O objetivo deste estudo foi o de acessar os níveis de contaminação por xenobióticos em 7 locais no trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul utilizando biomarcadores e bioindicadores em duas espécies de peixes: Geophagus brasiliensis e Pimelodus maculatus e verificar se as espécies respondem de maneira semelhante. A hipótese a ser testada neste trabalho é a de que os locais com maior entrada de efluentes urbanos, industriais e agrícolas (poluição difusa), assim como maior número de barragens apresentem maior presença de poluentes químicos xenobióticos. Neste trabalho foram usados dois biomarcadores (a atividade de etoxiresorufina–O–desetilase (EROD), medida fluorimetricamente na fração S9 hepática, e Freqüência de Micronúcleos (MN), observada no citoplasma dos eritrócitos); e três bioindicadores (Índice hepato-somático – IHS, - Índice gonado-somático - IGS -, e Fator de Condição – FC -) em G. brasiliensis e P. maculatus, espécies amplamente distribuídas no sistema. Os locais amostrados foram: 1 – reservatório do Funil; 2 – Volta Redonda; 3 – represa de Ribeirão das Lajes; 4 – Três Rios; 5 – rio Preto (Referência); 6 – rio Paraibuna (MG); 7 – rio Piabanha. Com exceção do IGS, todos os biomarcadores e bioindicadores apresentaram diferenças significativas entre os locais para ambas as espécies. De acordo com os mesmos, possivelmente os locais mais críticos quanto à presença de xenobióticos no trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul são os locais 7, 6, 4 e 2, concordando com a hipótese de que locais com maior quantidade de efluentes industriais, domésticos, agrícolas e de represas para geração de energia hidrelétrica apresentam maiores quantidades de químicos xenobióticos. As espécies responderam de maneira semelhante tanto aos biomarcadores quanto aos bioindicadores. A indução de CYP1A, apesar de ter obtido respostas semelhantes entre as espécies, apresentou maiores valores em G. brasiliensis para todos os locais onde foram realizadas atividade de EROD em ambas as espécies: 1, 4 e 7.
Palavras-chave: Biomonitoramento, peixes, poluição, rio Paraíba do Sul.
ABSTRACT
The middle-lower river Paraíba do Sul (PSR) watershed is the most alterated segment in environmental conditions due to the presence of large urban-industrial centers, with large áreas of intensive agriculture and dams obstruction for hydreletic purposes. The aim of this study was to assess xenobiotic contamination at 7 sites in the middle-lower PSR reaches using biomarkers and bioindicators in two fish species: Geophagus brasiliensis and
Pimelodus maculatus and to test wheter this two species respond in a similar way to
xenobiotic exposure. The tested hypothesis is that sites near to efluent discharges from urban, industrical and agricultural areas (difuse pollution), and near to dams have larger xenobiotic influence. Biomarkers used were ethoxyresorufin–O–deethylase activity (EROD), measured fluorimetricaly at S9 hepatic fraction, and Micronucleus Frequency (MN), observed in eritrocits in cytoplasm. The three bioindicators used were the Hepatosomatic Index (HSI), the Gonadosomatic Index (IGS) and Condition Factor (CF) in G. brasiliensis and P. maculatus, species widely distributed througout the system. The sampled sites were: 1 – Funil reservoir; 2 – PSR at Volta Redonda; 3 – Ribeirão das Lajes reservoir; 4 – PSR at Três Rios; 5 – Preto river (Reference); 6 – Paraibuna river (MG); 7 – Piabanha river. All biomarkers and bioindicator, except GSI, showed significant difference among sites for both species. The most impaired sites due to the xenobiotic presence in the middle-lower PSR reaches were probably 7, 6, 4 e 2, confirming the hypothesis that sites near to larger amount of industrial, domestic and agricultural efluents and reservoir for hydreletric purposes have large amount of xenobiotics. The species reponded similarly to biomarkes and bioindicators. Induction of CYP1A, in spite of showing similar responses between the species, showed higher values for G. brasiliensis at all sites where EROD activity occurred, mainly sites 1, 4 e 7.
1 INTRODUÇÃO
A bacia do rio Paraíba do Sul (Figura 1) vem sofrendo intensa pressão antrópica sob a forma de despejos em suas águas de xenobióticos originados principalmente através de atividades industriais, agricultura intensiva, efluentes domésticos e construção de barragens para geração de energia elétrica. Tais atividades vêm crescendo em todo mundo nas últimas décadas e vem sendo alvo de intenso debate devido aos impactos sobre a saúde dos ecossistemas (SINDERMAN 1996). O trecho médio-inferior do rio Paraíba do Sul é considerado o de maior nível de alteração devido à existência de grandes centros urbano-industriais, além da presença de represas para a obtenção de energia hidrelétrica. A começar pelo reservatório do Funil, que recebe as águas do rio Paraíba do Sul com uma grande carga de poluentes proveniente de algumas das principais cidades do Estado de São Paulo, o mais industrializado da América Latina, situadas à sua montante; mais para baixo encontram-se os pólos de Barra Mansa-Volta Redonda, no canal principal; o município de Juiz de Fora que é drenado pelo rio Paraíbuna (MG); e o município de Petrópolis, que é drenado pelo rio Piabanha, sendo este represado por duas barragens ao longo de seu curso; os dois últimos são grandes tributários do rio Paraíba do Sul, ambos encontrando-se com este na altura da cidade de Três Rios. Por outro lado, o rio Preto, tributário do Paraíbuna (MG), pode ser considerado um local pouco alterado visto não existir nenhum grande centro urbano-industrial, barragem nem agricultura intensiva em sua área de drenagem.
O acesso de poluentes xenobióticos tais como hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), e diclorofeniltricloroetano (DDT) ao meio ambiente ocorre através de derramamentos e lançamentos industriais, depósitos irregulares de produtos químicos em áreas abertas, lixo doméstico e industrial que recebe esses tipos de contaminantes, carreamento de fertilizantes, pesticidas e fungicidas pelas águas da chuva de regiões agrícolas para os rios e acidentes (vazamento, explosão ou superaquecimento de transformadores). Desde a metade da década de 80, o uso de pesticidas organoclorados tem sido restrito no Brasil. Alguns estudos durante as décadas passadas mostraram que no Brasil, como em outras partes do mundo, a contaminação por micropoluentes orgânicos deriva não apenas de campos agrícolas, mas também de áreas urbanas (TOMASI 1985; LUCHINI et al. 1981).
A utilização de peixes como parâmetro para se avaliar o nível de poluição de ecossistemas aquáticos por compostos organoclorados tem sido cada vez mais constante (STEGEMAN et al. 1997; BAINY et al. 1999; PARENTE et al. 2004; FERREIRA et al. 2004; FACEY et al. 2005; KIRBY et al. 2007). Os organismos ou compartimentos desses organismos assim utilizados recebem o nome de biomarcadores ou bioindicadores, dependendo de seu nível de organização.
Biomarcadores moleculares podem ser ferramentas de alerta inicial, prevenindo danos irreversíveis em organismos, comunidades e ecossistemas (LOPEZ-BAREA & PUEYO 1998). Um biomarcador é definido como uma mudança (molecular, bioquímica, fisiológica, estrutural ou comportamental) ou aberração em um organismo, que pode ser usado para estimar exposição a químicos, ou efeitos resultantes dessa exposição (HANDY et al. 2003).
O uso de uma bateria de biomarcadores pode ser usado para avaliar as várias respostas a misturas de poluentes em organismos sob estresse (AARAB et al. 2004). Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas policloradas (BPCs), dioxinas e furanos são poluentes amplamente encontrados em ambientes aquáticos com potencial para exercer uma ampla gama de efeitos adversos sobre a biota. Devido à alta lipofilicidade característica dos compostos orgânicos de alto peso molecular, esses poluentes tendem a se acumular em
tecidos vivos (IEOPOPS 1990; MACKAY & PATERSON 1982). Dessa forma, esses poluentes são acumulados ao longo da cadeia trófica (biomagnificação). O potencial carcinogênico causado por essas moléculas estão listados pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos como poluentes prioritários. Estima-se que mais de um milhão de toneladas de BPCs tenham sido produzidas e comercializadas (WHO 1993).
A biotransformação de xenobióticos é o processo pelo qual a molécula hidrofóbica do composto parental é gradualmente transformada em outro composto mais hidrofílico para facilitar sua excreção do organismo. O processo de biotransformação ocorre principalmente no fígado e é mediado por algumas famílias de enzimas (CASARETT et al. 1991). Essas enzimas de biotransformação participam também do metabolismo endógeno e são geralmente divididas em duas fases: fase I, onde grupos funcionais são adicionados ou expostos ao composto parental, nesta fase desenvolvem-se em sua maioria reações de oxidação e hidrólise e, em alguns casos, reações de redução, e as reações de fase II, onde as moléculas endógenas são conjugadas ao produto da fase I ou diretamente ao xenobiótico. Os produtos finais são mais hidrofílicos, e menos reativos podendo ser excretados do organismo (VAN DER OOST et al. 2003). Entretanto, em alguns casos o metabólito produzido é mais reativo (tóxico) do que a substância original, sendo que o sistema enzimático citocromo P450 é o principal envolvido neste processo (STINE & BROWN 1996).
Os citocromos P450 são as principais enzimas da fase I da biotransformação. A indução de isoformas da subfamília CYP1A em fígado de peixes tem sido utilizada como biomarcador de exposição a poluentes industriais, tanto em águas continentais como em ecossistemas marinhos (HAASCH et al. 1993; BAINY et al. 1999; PARENTE et al. 2004; KIRBY et al. 2007). A indução de CYP1A ocorre pela ligação do indutor (poluente) ao receptor de hidrocarbonetos aromáticos (Receptor Aril hidrocarbon - AhR) no citoplasma dos hepatócitos, em seguida, o complexo AhR-poluente é translocado para o núcleo celular onde se liga a regiões reguladoras da expressão gênica (conhecidas como elementos responsivos a xenobióticos – ERX) induzindo a expressão de diversas proteínas, entre elas o CYP1A. A atividade catalítica do CYP1A pode ser medida pela determinação da reação de desetilação da etoxiresorufina (etoxiresorufina-O-desetilase - EROD). A determinação da atividade de EROD é um dos métodos mais utilizados para se avaliar a indução do CYP1A (GOKSOYR 1995).
Outro método utilizado para estudos de biomonitoramento ambiental em peixes é a Freqüência de Micronúcleos (MN) em eritrócitos no sangue periférico. Estudos de correlação entre o aparecimento de micronúcleos e a exposição a determinadas substâncias são atualmente realizados em várias espécies, inclusive peixes para detectar a presença de substâncias químicas genotóxicas no ambiente aquático. Apesar de mais simples do que a atividade de EROD, este método também é considerado confiável e sensível (AL-SABTI & METCALFE 1995). O teste de micronúcleo (MN), considerado como sendo um dos métodos mais usados para avaliar a genotoxicidade em sistemas aquáticos, tem sido extensivamente aplicado em espécies de peixes (AL-SABTI & METCALFE 1995; ÇARVAŞ & ERGENE GÖZÜKARA 2005a, b). Micronúcleos são formações de material nuclear que aparecem no citoplasma como pequenos núcleos satélites do núcleo principal das células filhas. Sua formação indica dano genotóxico, mais especificamente, clastogênico. Após exposição a diferentes poluentes genotóxicos, clastogênicos, tanto sob condições de laboratório quanto de campo, eritrócitos do sangue periférico em peixes apresentaram alta Freqüência de Micronúcleos (AL-SABTI 1994; CRISOLIA & STARLING 2001; RODRIGUEZ-CEA et al. 2003; ÇAVAŞ 2005a; DA SILVA SOUZA & FONTANETT 2006). A hipótese a ser testada é a de que os locais com maior entrada de efluentes urbanos, industriais e agrícolas (poluição difusa), assim como locais com maior número de barragens apresentam maior presença de poluentes químicos xenobióticos, registradas pelos maiores valores de atividade de EROD,
Freqüência de Micronúcleos (MN), Índice hepato-somático (IHS) e menores valores de Índice gonado-somático (IGS) em relação aos locais de referência. E se as espécies respondem da mesma maneira.
2 OBJETIVOS
2.1 Gerais
O presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a qualidade ambiental em locais selecionados do trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul através do uso de biomarcadores (atividade de EROD e Freqüência de Micronúcleos) e bioindicadores (Índice hepato-somático, Índice gonado-somático e Fator de Condição).
2.2 Objetivos específicos
• • •
• Avaliar a indução da atividade de EROD na fração S9 hepática de peixes coletados no trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul;
• Avaliar tendências espaciais ao longo dos locais amostrados;
• Verificar Freqüência de Micronúcleos (MN) entre os locais amostrados;
• Comparar os valores do Índice hepato-somático (IHS) entre os locais amostrados; • Comparar os valores do Índice gonado-somático (IGS) entre os locais amostrados; • Comparar os valores do Fator de Condição (FC) entre os locais amostados;
3 ÁREA DE ESTUDO
O rio Paraíba do Sul (RPS) (Figura 1) é formado pelo encontro do rio Paraitinga com o rio Paraibuna, a 1.800 m de altitude na Serra da Bocaina, no Estado de São Paulo e sua foz localiza-se na cidade de São João da Barra, no Estado do Rio de Janeiro, onde se encontra com o Oceano Atlântico. Representa o principal recurso hídrico da Região Sudeste, a mais industrializada do Brasil, banhando os Estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais. Sua bacia hidrográfica está situada entre as latitudes 20˚26' e 23˚39'Sul e as longitudes de 41˚e 46˚30'Oeste, possuindo uma área total de cerca de 55.500 km2 e uma extensão de 1.150 km. É o principal manancial de água lóticas do Estado do Rio de Janeiro, abastece cerca de 80% do suprimento de água da população de aproximadamente 10 milhões de pessoas da área metropolitana do Grande Rio, quando cerca de 40% de sua vazão é desviada para o rio Guandu após atravessar a divisa de São Paulo com o Rio de Janeiro, sendo também responsável por cerca de 20% da produção de energia hidrelétrica deste estado. Ao todo suas águas são utilizadas por mais de 20 milhões de pessoas para os mais diversos fins: indústria, agricultura, energia elétrica através da construção de várias represas ao longo do seu percurso, consumo, lazer, pesca, preservação da fauna e flora. Por tão grande importância, justifica-se a adoção de medidas de controle e ações preventivas e de acompanhamento permanente da qualidade de suas águas.
O clima é subtropical com um regime de precipitação bem caracterizado onde ocorrem chuvas entre novembro e janeiro. Essas chuvas pesadas ocasionalmente causam grandes enchentes do rio Paraíba do Sul. O período entre junho e agosto é o mais seco do ano. O fluxo máximo do rio é observado durante o verão (4380 m3 s-1) e o período de descargas mais baixas ocorre geralmente no inverno (180 m3 s-1) (DNAEE 1983; ROSSO et al. 1991). De
acordo com DNAEE (1983), que usou a classificação de Köppen, ao longo da porção média o tipo Cwa (tropical de altitude com verão quente e chuvoso) domina, e nas regiões inferiores
Cfa (subtropical com verão quente) e Aw (quente e úmido com verão chuvoso). A temperatura no trecho médio e inferior do RPS é mais alta, com máxima alcançando entre 32 e 34ºC (DNAEE 1983).
